Enzymatic HbA1c - Gdsrl.com

Enzymatic HbA1c
REF SA5418 00 - 2x18 + 2x8 + 2x12 ml
INTENDED USE
AMS Enzymatic HbA1c is intended for the enzymatic quantitative in
vitro determination of Hemoglobin A1c in human whole blood using the
AMS Sat-450 Chemistry System.
SUMMARY
Glycohemoglobin is produced by non-enzymatic addition of glucose to
amino groups in hemoglobin. HbA1c refers to glucose-modified
hemoglobin A (HbA) specifically at N-terminal valine residues of
hemoglobin beta chains.
This process reflects the average exposure of hemoglobin to glucose
over an extended period.
In diabetic subjects hemoglobin A1c fraction is found to be elevated 2-3
fold over the levels found in normal individuals. Several investigators
have recommended that Hemoglobin A1c serve as an indicator of
metabolic control of the diabetic, since Hemoglobin A1c levels approach
normal values for diabetics in metabolic control; in fact HbA1c is a good
indicator of glycemic control in the preceding 2-3 months. HbA1c test is
used both as an index of mean glycemia and as measure of risk for the
development of diabetes complications (1-4) .
Currently, the HbA1c is recommended for patients with diabetes every
2-3 months as part of the patient Diabetes management program.
METHOD PRINCIPLE
Lysed whole blood samples are subjected to extensive protease
digestion with Bacillus sp protease. This process releases amino acids
including glycated valines from the hemoglobin beta chains. Glycated
valines then serve as substrates for specific recombinant fructosyl
valine oxidase (FVO) enzyme, produced in E. coli. The recombinant FVO
specifically cleaves N-terminal valines and produces hydrogen
peroxidase (H2O2). This, in turn, is measured using horseradish
peroxidase (POD) catalyzed reaction and suitable chromogen. No
separate measurement for total Hemoglobin (Hb) is needed in this
direct assay.
COMPOSITION
Reagent 1
MES buffer, pH 7.0 5 mmol/l
Protease 4 KU/ml
Triton-X-100 0.5%
Redox agents >10 µmol/l
Reagent 2
MES buffer, pH 6.3 1 mmol/l
Redox agents 10 U/ml
POD 90 U/ml
Chromogenic substrate 0.8 mmol/l
Reagente C (Hemolysis reagent)
CHES buffer, pH 8.7 100 mmol/l
Triton-X-100 1%
SDS 0.45%
Redox agents 0.5 mmol/l
Preparation
The reagents are ready to use.
Storage and stability
Store at 2-8 °C. Do not freeze the reagents! The reagents are stable up
to the expiry date stated on the label when kept in closed vial.
On board stability: 30 days
SAMPLES
Anti coagulated whole blood.
Hemoglobin A1c in whole blood collected with EDTA is stable for one
week at 2-8 °C. Do not freeze samples! This may lead to a natural
hemolysis. If necessary, store lysed samples at -20 °C instead of whole
blood.
Hemolysate preparation
1. Dispense 250 µl of hemolysis reagent (Reagent C) into labeled
sample cups. Plastic or glass tubes of appropriate size are
acceptable.
2. Prior to testing, whole blood samples should be mixed by gentle
inversion at least 5 times to resuspend settled erythrocytes.
3. Place 20 µl of well-mixed, fully resuspended whole blood into the
appropriately labeled hemolysis reagent tube. Mix well the solution.
4. Allow to stand for 10 minutes or until complete lysis is evident.
Complete lysis is observed when the mixture becomes a clear dark
red solution without any particulate matter.
5. Mix well again.
6. The calibrators and controls should be treated exactly as patient
samples.
Specimen collection / Preanalytical factors
It is recommended that specimen collection should be carried out in
accordance with NCCLS protocol H11-A3.
INSTRUMENT TEST PROCEDURE
For the assay procedure refer to the Application Manual and to the
instrument Operator Manual.
CALIBRATION
Use Enzymatic HbA1c Calibrator (REF GD5420 00). See calibrator insert
sheet for lot specific concentration and traceability. Recalibrate the
instrument every 15 days or when a new lot or new bottle of reagent is
used.
QUALITY CONTROL
Normal and abnormal controls such as Enzymatic HbA1c Controls (REF
GD5422 00) are recommended. Check that the values obtained are
within the reference range provided.
AMS Enzymatic HbA1c assay is based upon redox and enzymatic
reaction. Some commercial artificially-made control materials contain
unbalanced redox component and artificially-glycated hemoglobin that
are not suitable for testing. These controls may gain abnormally higher
results. Please check the compatibility of the control material prior to
use, especially during EQA (External Quality Assessment, VEQ).
Refer to Westgard et al. (3) for identification and resolution of out of
control situations.
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CALCULATION OF RESULTS
Refer to the Application Manual and to the instrument Operator Manual.
Conversion factor
Historically, haemoglobin A1c has been reported as % of total
haemoglobin (notation used by NGSP, JDS/DSCC and Mono-S
standardizations).
Since June 2011, the way HbA1c values are reported has switched from
a percendage to a measurement in mmol/mol, due to the introduction
of a new IFCC standardization.
To make sense of the new units and compare these with old units and
vice versa, apply the below reported equations.
National DCM From IFCC to DCM
NGSP (USA) NGSP = 0.09148 IFCC + 2.152
JDS/JSCC (Japan) JDS = 0.09274 IFCC +1 .724
Mono-S (Sweden) Mono-S = 0.09890 IFCC + 0.884
National DCM From DCM to IFCC
NGSP (USA) IFCC = 10.93 NGSP - 23.50
JDS/JSCC (Japan) IFCC = 10.78 JDS - 18.59
Mono-S (Sweden) IFCC = 10.11 Mono-S - 8.94
REFERENCE INTERVALS (1)
IFCC / DCM
Upper level of nondiabetic
reference
range
Clinical Condition
ADA* target for
patients with
diabetes
IFCC 43 mmol/mol 53 mmol/mol
NGSP 6.1% 7.0%
JDS/JSCC 5.7% 6.6%
Mono-S 5.1% 6.1%
ADA*: American Diabetes Association
Each laboratory should establish reference ranges for its own patients
population.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Precision
Representative data from studies using CLSI protocol NCCLS EP5-A2
are summarized below.
Control Level 1 Level 2
Number of Observations N 80 80
Number of Runs N 40 40
Mean mmol/mol 56 85
Within Run %CV 5,1 2,9
Total %CV 6,8 4,5
Linearity
The linearity range, established using CLSI protocol NCCLS EP6-A is -
6,9 - 113,1 mmol/mol (2,8 - 12,5 %).
Minimum Detection Limit
The minimum detection limit for the assay, established using CLSI
protocol NCCLS EP17-A, is 6,9 mmol/mol (2,8 %).
Met. SA541800.0 Eng
Ed. 10/2012

Enzymatic HbA1c
REF SA5418 00 - 2x18 + 2x8 + 2x12 ml
Method Comparison
Correlation studies were performed using CLSI protocol NCCLS EP9-A2.
Serum results from this assay on Sat-450 were compared with those
from a commercially available analogous system. Results were as
follows: N = 42, y = 1,006x - 1,09 mmol/mol, r = 0,978.
Limitations / Interfering Substances
1. The following other components at the indicated concentrations do
not interfere with this analytical method:
Total Bilirubin: 15 mg/dl
Conjugated Bilirubin: 13 mg/dl
Ascorbic Acid: 12 mg/dl
Triglycerides: 4000 mg/dl
Glucose: 4000 mg/dl
Uric Acid: 30 mg/dl
Urea: 80 mg/dl
2. Stable glycated hemoglobin serves as substrate for enzymatic
reaction used by the present test. Acetylated, carbamylated and
labile HbA1c does not adversely affect the enzymatic reaction used in
this assay.
3. Variant hemoglobin S, C and E do not significantly interfere with the
assay.
For a comprehensive review of interfering substances, refer to the
publication by Young (2) .
PRECAUTIONS AND WARNINGS
The reagents contain inactive components such as preservatives
(Sodium azide or others), surfactants etc. The total concentration of
these components is lower than the limits reported by 67/548/EEC and
88/379/EEC directives about classification, packaging and labelling of
dangerous substances. However, the reagents should be handled with
caution, avoiding swallowing and contact with skin, eyes and mucous
membranes. The use of laboratory reagents according to good
laboratory practice is recommended.
Waste Management
Please refer to local legal requirements.
BIBLIOGRAPHY
1. American Diabetes Association (ADA). Clinical practice
recommendation: standards of medical care for patients with
diabetes mellitus. Diab Care 22 (supp): S32-41 (1999).
2. Young D.S., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, AACC
Press, Washington, D.C., 1990.
3. Westgard J., and Barry P., Cost- Effective Quality Control:
Managing the Quality and Productivity of Analytical Processes,
AACC Press, Washington, D.C., 1986.
4. Goldstein, D.E. et al., Diabetes Care. 27(7):1761-73 (2994).
5. United Kingdom Prospective study, Lancet 352:837-53 (1998).
6. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group, N.
Engl. J. Med. 329:977-86 (1993).
7. Little, R. et al., Clin Chemistry, 47:1985-1992 (2001).
8. American Diabetes Association (ADA). Clinical Practice
recommendation, Diab Care 16S2 (93):10-13 (1992).
9. American Diabetes Association (ADA). Clinical Practice
recommendation, Diabetes 42:1555-58 (1993).
10. NGSP, http://www.missouri.edu/∼diabetes/ngsp.html
11. Goldstein et al., Clin Chem 32:B64-B70 (1986).
12. Hoelzel, W. et al., IFCC reference system for measurement of
hemoglobin A1c in human blood and the national standardization
schemes in the United States, Japan and Sweden: a method
comparison study. Clin Chem 50:166-74 (2004).
13. Sacks, D (ed). Global Harmonization of Hemoglobin A1c. Clin
Chem 51(4):681-83 (2005).
14. NCCLS Document, “Procedures for the collection of arterial blood
specimens”, Approved Standard, 3rd Ed. (1999).
15. EU-Dir 1999/11 Commission Directive of 8 March 1999 adapting to
technical progress the principles of good laboratory practice as
specified in Council Directive 87/18/EEC.
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Met. SA541800.0 Eng
Ed. 10/2012

Enzymatic HbA1c
REF SA5418 00 - 2x18 + 2x8 + 2x12 ml
USO
Il kit AMS Enzymatic HbA1c viene impiegato per la determinazione
enzimatica quantitativa in vitro della emoglobina A1c nel sangue intero
umano con sistema AMS Sat-450.
SOMMARIO
L’emoglobina glicata è prodotta dall’aggiunta non enzimatica di glucosio
ai gruppi amminici presenti nell’emoglobina. La frazione HbA1c si
riferisce in modo specifico ai residui N-terminali della valina nelle catene
beta dell’emoglobina A (HbA).
Questo processo riflette l’esposizione media dell’emoglobina al glucosio
nel lungo periodo.
Nei soggetti diabetici la frazione A1c dell’emoglobina è 2-3 volte più
elevata rispetto a soggetti non diabetici. Parecchi studi hanno
dimostrato che il dosaggio dell’emoglobina glicata è un importante
indicatore del controllo metabolico dei diabetici, poiché i livelli di
glicoemoglobina si approssimano a quelli normali in soggetti sotto
controllo metabolico; difatti l’HbA1c è un ottimo indicatore del controllo
glicemico nei 2-3 mesi precedenti al dosaggio.
Il dosaggio dell’HbA1c è sfruttato sia come indice del valore medio della
glicemia, sia come misura del rischio di insorgenza di complicanze
diabetiche (1-4) .
Allo stato dell’arte, il dosaggio dell’HbA1c è raccomandato ai pazienti
diabetici ogni 2-3 mesi come parte del protocollo terapeutico.
PRINCIPIO
I campioni di sangue intero lisato sono sottoposti ad una estensiva
digestione enzimatica tramite proteasi da Bacillus sp. Questo processo
rilascia aminoacidi tra cui valina glicata dalle catene beta
dell’emoglobina. La valina glicata serve quindi come substrato per
l’enzima ricombinante di E. Coli fructosil-valina ossidasi (FVO). L’FVO
agisce in modo specifico sulla valina glicata producendo perossido
d’idrogeno (H2O2). Quest’ultimo viene alla fine misurato tramite l’azione
della perossidasi (POD) e un substrato cromogeno dedicato.
Il dosaggio separato dell’emoglobina totale (Hb) non è necessario.
COMPOSIZIONE
Reagente 1
Tampone MES, pH 7.0 5 mmol/l
Proteasi 4 KU/ml
Triton-X-100 0.5%
Agenti redox >10 µmol/l
Reagente 2
Tampone MES, pH 6.3 1 mmol/l
Agenti redox 10 U/ml
POD 90 U/ml
Substrato cromogeno 0.8 mmol/l
Reagente C (reagente emolizzante)
Tampone CHES, pH 8.7 100 mmol/l
Triton-X-100 1%
SDS 0.45%
Agenti redox 0.5 mmol/l
Preparazione
I reagenti sono pronti all’uso.
Conservazione e Stabilità
Conservare a 2-8 °C. Non congelare i reattivi! I reattivi sono stabili fino
alla data di scadenza riportata in etichetta, se conservati in flacone
chiuso.
Stabilità a bordo dello strumento: 30 giorni
CAMPIONI
Sangue intero anticoagulato.
L’emoglobina A1c in campioni di sangue intero EDTA è stabile per una
settimana a 2-8 °C. (5) Non congelare i campioni! Questo potrebbe
determinare una lisi naturale. Se necessario, conservare i campioni
lisati a -20 °C al posto del sangue intero.
Preparazione dell’emolisato
1. Dispensare 250 µl di reattivo emolizzante (RC) in coppette porta
campione adeguatamente identificate. Provette di plastica o di vetro
sono accettabili.
2. Prima del dosaggio, i campioni di sangue intero devono essere
miscelati invertendo delicatamente la provetta per almeno 5 volte
per risospendere gli eritrociti sedimentati.
3. Dispensare 20 µl di sangue intero ben miscelato e omogeneo nella
rispettiva coppetta porta campione. Miscelare bene la soluzione.
4. Attendere 10 minuti o fino a che la completa emolisi sia evidente. La
lisi completa si osserva quando la miscela diventa di un colore rosso
scuro senza particolato.
5. Miscelare nuovamente.
6. I calibratori e i controlli devono essere trattati esattamente come i
campioni dei pazienti.
Raccolta dei Campioni / Fattori Preanalitici
Si raccomanda di effettuare la raccolta dei campioni in conformità al
Protocollo NCCLS H11-A3.
PROCEDURA DI ANALISI
Per la procedura di analisi fare riferimento all’Application Manual e al
Manuale dell’Operatore dello strumento.
CALIBRAZIONE
Utilizzare Enzymatic HbA1c Calibrator (REF GD5420 00). Riferirsi
all’inserto del calibratore per la concentrazione specifica del lotto e la
tracciabilità.
Ricalibrare lo strumento ogni 15 giorni o quando viene utilizzato un
nuovo lotto o una nuova bottiglia di reagente.
CONTROLLO DI QUALITA’
Si consiglia l’uso di controlli Normale e Patologico come Enzymatic
HbA1c Controls (REF GD5422 00). Verificare che il valore ottenuto sia
all’interno degli intervalli di accettabilità forniti. Il presente reattivo si
basa su reazioni enzimatiche e redox. Alcuni controlli commerciali
prodotti artificialmente contengono componenti redox non bilanciati e
emoglobine artificialmente glicate che sono incompatibili con questo
reattivo. Questi controlli possono dare risultati estremamente elevati. Si
consiglia di verificare la compatibilità del materiale di controllo prima
dell’uso, soprattutto durante esercizi di programmi di qualità esterni
(VEQ).
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Far riferimento a Westgard et al. (3) per l’identificazione e la risoluzione
di problematiche legate ai controlli fuori dai limiti.
CALCOLO DEI RISULTATI
Riferirsi all’Application Manual e al Manuale dell’Operatore dello
strumento.
Fattori di Conversione
Storicamente, l’emoglobina A1c veniva riportata come % della
emoglobina totale (notazione adottata dalle standardizzazioni NGSP,
JDS/DSCC e Mono-S).
A partire da giugno 2011, il sistema di espressione dei risultati è
cambiato dalla percentuale alla misura in mmol/mol, a causa
dell’introduzione di una nuova standardizzazione IFCC.
Per potere meglio interpretare i nuovi risultati e confrontare la nuove
unità con quelle vecchie, è necessario applicare le equazioni sotto
riportate.
DCM Da IFCC a DCM
NGSP (USA) NGSP = 0.09148 IFCC + 2.152
JDS/JSCC (Japan) JDS = 0.09274 IFCC +1 .724
Mono-S (Sweden) Mono-S = 0.09890 IFCC + 0.884
DCM Da DCM a IFCC
NGSP (USA) IFCC = 10.93 NGSP - 23.50
JDS/JSCC (Japan) IFCC = 10.78 JDS - 18.59
Mono-S (Sweden) IFCC = 10.11 Mono-S - 8.94
VALORI DI RIFERIMENTO (1)
IFCC / DCM
Estremo superiore
per pazienti non
diabetici
Condizione Clinica
target ADA per
pazienti diabetici
IFCC 43 mmol/mol 53 mmol/mol
NGSP 6.1% 7.0%
JDS/JSCC 5.7% 6.6%
Mono-S 5.1% 6.1%
ADA*: American Diabetes Association
Si raccomanda ad ogni laboratorio di stabilire i propri valori normali in
funzione della popolazione su cui opera.
PRESTAZIONI ANALITICHE
Precisione
Dati rappresentativi dello studio secondo il protocollo CLSI NCCLS
EP5-A2 sono sotto riportati.
Controllo Livello 1 Livello 2
Numero di Osservazioni N 80 80
Numero di Prove N 40 40
Media mmol/mol 56 85
Nella Corsa %CV 5,1 2,9
Totale %CV 6,8 4,5
Linearità
L’intervallo di linearità, stabilito tramite il protocollo CLSI NCCLS EP6-A
è risultato pari a 6,9 - 113,1 mmol/mol (2,8 - 12,5 %).
Met. SA541800.0 Ita
Ed. 109/2012

Enzymatic HbA1c
REF SA5418 00 - 2x18 + 2x8 + 2x12 ml
Limite Minimo di Rivelabilità
Il limite minimo di rilevabilità, stabilito tramite il protocollo CLSI NCCLS
EP17-A, è 6,9 mmol/mol (2,8 %).
Comparazione fra Metodi
Studi di correlazione sono stati effettuati secondo il protocollo CLSI
NCCLS EP9-A2. I risultati dei sieri di questo dosaggio su Sat-450 sono
stati confrontati con un sistema analogo presente in commercio. I
risultati sono stati i seguenti: N = 42, y = 1,006x - 1,09 mmol/mol, r =
0,978.
Limitazioni / Sostanze Interferenti
1. Gli interferenti normalmente presenti nel sangue non
interferiscono con il dosaggio fino alle concentrazioni sotto
riportate:
Bilirubina Totale: 15 mg/dl
Bilirubina Coniugata: 13 mg/dl
Acido Ascorbico: 12 mg/dl
Trigliceridi: 4000 mg/dl
Glucosio: 4000 mg/dl
Acido Urico: 30 mg/dl
Urea: 80 mg/dl
2. Solo l’emoglobina glicata stabile serve da substrato per le reazioni
enzimatiche impiegate dal dosaggio. Le emoglobine acetilate,
carbamilate ed instabili non interferiscono nelle reazioni
enzimatiche del dosaggio.
3. Le varianti S, C e E dell’emoglobina non interferiscono
significativamente con il dosaggio.
Per una panoramica completa sulle sostanze interferenti si rimanda alla
pubblicazione di Young (2) .
PRECAUZIONI E AVVERTENZE
I reagenti contengono componenti inattivi, quali i conservanti (Sodio
azide o altri), tensioattivi ecc. La concentrazione totale di questi
componenti è inferiore ai limiti riportati dalle direttive CEE 67/548/EEC
e 88/379/EEC sulla classificazione, l’imballaggio ed etichettatura delle
sostanze pericolose. Tuttavia i reagenti devono essere trattati con
cautela, evitandone l’ingestione, il contatto con la pelle, gli occhi e le
membrane mucose.
Nell’utilizzo dei reagenti di laboratorio si raccomanda di seguire le
norme di buona pratica di laboratorio.
Gestione dei Rifiuti
Attenersi alle norme locali per quanto riguarda lo smaltimento dei
reagenti.
BIBLIOGRAFIA
1. American Diabetes Association (ADA). Clinical practice
recommendation: standards of medical care for patients with
diabetes mellitus. Diab Care 22 (supp): S32-41 (1999).
2. Young D.S., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, AACC
Press, Washington, D.C., 1990.
3. Westgard J., and Barry P., Cost- Effective Quality Control:
Managing the Quality and Productivity of Analytical Processes,
AACC Press, Washington, D.C., 1986.
4. Goldstein, D.E. et al., Diabetes Care. 27(7):1761-73 (2994).
5. United Kingdom Prospective study, Lancet 352:837-53 (1998).
6. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group, N.
Engl. J. Med. 329:977-86 (1993).
7. Little, R. et al., Clin Chemistry, 47:1985-1992 (2001).
8. American Diabetes Association (ADA). Clinical Practice
recommendation, Diab Care 16S2 (93):10-13 (1992).
9. American Diabetes Association (ADA). Clinical Practice
recommendation, Diabetes 42:1555-58 (1993).
10. NGSP, http://www.missouri.edu/∼diabetes/ngsp.html
11. Goldstein et al., Clin Chem 32:B64-B70 (1986).
12. Hoelzel, W. et al., IFCC reference system for measurement of
hemoglobin A1c in human blood and the national standardization
schemes in the United States, Japan and Sweden: a method
comparison study. Clin Chem 50:166-74 (2004).
13. Sacks, D (ed). Global Harmonization of Hemoglobin A1c. Clin
Chem 51(4):681-83 (2005).
14. NCCLS Document, “Procedures for the collection of arterial blood
specimens”, Approved Standard, 3rd Ed. (1999).
15. EU-Dir 1999/11 Commission Directive of 8 March 1999 adapting to
technical progress the principles of good laboratory practice as
specified in Council Directive 87/18/EEC.
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Ed. 109/2012