Identificazione molecolare di lieviti ricorrenti nella ... - FedOA

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3.12 Estrazione del DNA dai campioni di mosto “Tal quali” Prima di utilizzare l’analisi PCR-DGGE, è stato necessario applicare un metodo di estrazione e purificazione di DNA che eliminasse polifenoli e polisaccaridi presenti nell'uva, che, legandosi al DNA, interdicono la PCR (Wilson, 1997). L’analisi molecolare del DNA dai campioni “Tal quali” richiede, per le metodiche molecolari adoperate, che il metodo di estrazione produca del DNA libero da inibitori, e che possa essere quanto più rappresentativo dei microrganismi presenti nel campione (Yeates & Gillings, 1998). Per raggiungere tale scopo è stato utilizzato il protocollo di estrazione del DNA descritto da Cocolin et al. (2001), che prevede le seguenti fasi: 1) Prelevare 2 ml di campione, dopo averlo vortexato 2) Centrifugare a 15,000 x g per 10 min a 4 °C. Eliminare il surnatante 3) Risospendere il pellet in 1 ml di una soluzione 8 g/l NaCl e agitare 4) Centrifugare a 15,000 x g per 10 min. Eliminare il surnatante 5) Aggiungere 0.3 g di biglie di vetro di 0.5 mm di diametro e trasferire il tutto in vials 6) Aggiungere alla miscela cellule/biglie 300 _l di breaking buffer [2% Triton X-100, 1% SDS; 100 mM NaCl, 10 mM Tris pH 8; 1mM EDTA pH 8] e 300 _l di cloroformio/alcool isoamilico (24:1) 96
7) Omogeneizzare in bead beater (Fast Prep TM , Bio 101, USA) per tre volte, ciascuna di 45 secondi alla velocita di 4,5, intervallate da una sosta di 30 sec. 8) Centrifugare a 15,000 x g per 10 min a 4°C 9) Trasferire la fase acquosa in un eppendorf sterile Dopo centrifugazione, 250 µl del surnatante (fase acquosa) sono stati prelevati e impiegati per la successiva fase di purificazione del DNA usando il Dneasy Plant System (Qiagen, Qiagen Italia, Milan, Italy), seguendo le istruzioni riportate sul manuale. Protocollo purificazione del DNA con DNeasy Plant Mini Kit: 1. Addizionare ai 250 _l di fase acquosa 400 _l di Buffer AP1 e 4 _l di RnaseA dalle soluzioni stock (100 mg/ml) 2. Incubare la miscela per 10 min a 65°C. Miscelare durante l’incubazione 2-3 volte capovolgendo l’eppendorf 3. Addizionare al lisato 130 _l di Buffer AP2, miscelare, e incubare per 5 min nel congelatore 4. Trasferire il campione con il buffer nelle colonnine QIAsharedder posta su un tubo fornito dal kit e centrifugare per 2 min a 14000 rpm 5. Trasferire il filtrato in un nuovo eppendorf senza i frammenti di cellule precipitati 97
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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI NAPOLI
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l'identificazione dei lieviti vinar
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noto da tempo che, nella fermentazi
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sugli acini sani, non danneggiati e
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certamente favorisce l'ipotesi seco
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microbiologica, è oggi ancora assa
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popolazioni influenzino la composiz
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Saccharomyces, potrebbe in parte es
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• generalmente, pur in presenza d
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caso di annate cattive, nel caso di
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confronti dei lieviti starter da pa
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2. l'impiego per la fermentazione d
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o carenza ne vanifica l’impiego.
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Sviluppo a basse temperature Impieg
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presenza delle cellule. L’assenza
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vinificazione possono produrre dai
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tecnologico (Cuinier, 1978) e dal t
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asse quantità, nei mosti di Bordea
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ilevato Candida stellata predominan
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acetico ma è più resistente all'a
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Tale specie è stata rinvenuta nel
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La varietà è da sempre conosciuta
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g CO2 svolta/100 ml mosto 12 10 8 6
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dell’uva, l’età del vigneto, l
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6. BIBLIOGRAFIA • Altschul, S.F.,
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• Le Jeune, C., Erny, C., Demuyte
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• Mateo, J.J., Jiménez, M., Huer
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• Myers, R.M., Fischer, S.G., Ler
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• Peynaud, E. e Domercq S., (1956
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• Rainieri, S. e Pretorius, I.S.
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• Romano, P., Palla, G., Caligari
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• Rosi, I., Costamagna L., Bertuc
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CHEF gel electrophoresis. Letters i
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• Vincenzini, M., Romano, P., Far
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