DNA RICOMBINANTE E BIOTECNOLOGIE - anna onofri

DNA RICOMBINANTE E BIOTECNOLOGIE
INDICE
DNA ricombinante e sue applicazioni
Tecniche del DNA ricombinante
Inserzione di un gene in un plasmide
Progetto Genoma Umano
Biotecnologie e loro applicazioni
Organismi transgenici
Clonazione nei mammiferi
Ingegneria genetica in campo medico
Link a: cDNA, enzimi di restrizione e plasmidi

DNA ricombinante
Il DNA ricombinante è un
frammento di DNA che può essere
modificato e inserito in altre cellule
per essere copiato più volte
(amplificato) ed espresso
Il DNA ricombinante è ottenuto
dalla combinazione di materiale
genetico di diversa origine

Applicazioni
Il DNA ricombinante viene utilizzato per:
ottenere frammenti specifici di DNA in grandi quantità
studiare la sequenza di determinati frammenti genici
identificare particolari sequenze in un cromosoma
studiare le modalità di espressione e regolazione genica
creare piante o animali transgenici
diagnosticare e curare malattie genetiche

Tecniche del DNA ricombinante
ibridazione
↓
sequenziamento
Tecniche del DNA ricombinante
↓ ↓
↓
↓
clonazione libreria genomica
PCR

Clonazione genica
Nel 1973, con il primo esperimento di
clonazione di un segmento genico
inserito nel batterio Escherichia coli,
Stanley Cohen e Herbert Boye
dimostrarono che è possibile produrre
copie multiple di un determinato gene
La clonazione molecolare serve a produrre grandi quantità di una
specifica sequenza di DNA. La capacità di generare un numero
quasi infinito di copie (cloni) di una particolare sequenza è alla
base delle tecnologie ricombinanti del DNA

Le basi per la clonazione
I materiali necessari per il processo di clonazione sono:
un frammento di DNA, che può essere ricavato anche da un
mRNA
(in questo caso viene detto cDNA)
specifici enzimi di restrizione che servono a “tagliare” il DNA
particolari enzimi in grado di unire le estremità di nucleotidi
(DNA-ligasi)
i plasmidi, vettori in grado di inserirsi nelle cellule ospiti
cellule batteriche modificate in modo da rendere la loro membrana
permeabile al plasmide

Inserzione di un gene in un plasmide
Se trattiamo un frammento di DNA e un plasmide (anello di DNA) con
lo stesso enzima di restrizione, il frammento può integrarsi nel
plasmide, dato che le loro estremità sono complementari
L’enzima DNA-ligasi
unisce e richiude le
estremità di DNA

Clonazione di un DNA esogeno

L’esperimento di Cohen e Boyer
Nel 1973 Cohen e Boyer
combinano due
sequenze diverse di DNA
per produrre una nuova
molecola di DNA
ricombinante.

Libreria genomica
Una popolazione di cellule
batteriche che porta vettori
ricombinanti con
frammenti diversi
provenienti dallo stesso
campione di DNA è detta
libreria genomica
Le colonie sono formate da cloni
contenenti frammenti diversi del
DNA originario

PCR: reazione a catena della polimerasi
La PCR è una tecnica che permette di ottenere grandi quantità di un
determinato segmento genico grazie a cicli successivi di duplicazione
Campione
di DNA
Applicazioni della PCR

L’elettroforesi su gel

L’impronta genetica
Ogni individuo possiede la
sua impronta genetica:
frammentando il DNA e
analizzandolo su gel di
elettroforesi, ognuno di noi
può essere identificato da
una specifica combinazione
di polimorfismi della
lunghezza dei frammenti di
DNA (RFLP).

La reazione a catena della polimerasi
Nel 1983 Kary Mullis vince il premio Nobel
per aver sviluppato la tecnica della PCR.

Sequenziamento del DNA
È possibile determinare la sequenza nucleotidica di un segmento di
DNA tramite il metodo di Sanger, che permette di sequenziare al
massimo 700 coppie di basi; per porzioni più lunghe il DNA viene
tagliato in frammenti più piccoli, che sono poi analizzati separatamente
Il DNA viene tagliato con due enzimi di restrizione
diversi. I frammenti ottenuti sono sequenziati e
sovrapposti in modo da determinare l’intera sequenza
nucleotidica; questo metodo è oggi interamente
automatizzato

Progetto Genoma Umano
Frammentando il DNA con enzimi
di restrizione si ottengono segmenti
che possono essere separati
(tramite elettroforesi), clonati,
sequenziati e conservati in banche
dati informatizzate
Nel 2000, grazie alla
collaborazione fra scienziati di
varie discipline scientifiche
(soprattutto biologia e informatica),
si è concluso il Progetto Genoma
Umano che ha permesso di
mappare l’intero genoma dell’uomo

Il Progetto Genoma Umano
il corredo cromosomico
aploide di un essere umano,
che comprende oltre 3
miliardi di nucleotidi.

Il sequenziamento del DNA
Sequenziare il DNA
significa determinare
l’ordine dei nucleotidi
nella molecola
d’interesse.

Come si fa a sequenziare il DNA?

La genomica
La genomica studia
la struttura del genoma,
le informazioni in esso
contenute, il modo in cui
le sue parti interagiscono
e la sua evoluzione.
Si parla di genomica
funzionale e comparata.

Ibridazione
L’ibridazione è una tecnica utilizzata
per localizzare un segmento di DNA in
un cromosoma e si basa sull’utilizzo di
una sonda marcata di DNA
complementare alla sequenza
nucleotidica cercata
La sonda può essere marcata con
radioisotopi o con un colorante
fluorescente; se la sonda incontra
molecole di DNA complementari, si
appaia a esse, evidenziandole

Biotecnologie
Le biotecnologie prevedono l’utilizzo di organismi modificati per
migliorare le condizioni di vita umana
L’uso delle biotecnologie trova applicazioni in vari ambiti:
applicazioni
↓ ↓
↓
agroalimentare ambientale farmacologico

Applicazioni agroalimentari
Le piante GM (geneticamente modificate) presentano uno o più geni
modificati, con lo scopo di conferire loro particolari caratteristiche o
farle diventare resistenti a determinate malattie
Le fragole GM
risultano più
resistenti al
freddo
I pomodori GM
risultano più
resistenti a un
virus
In Italia le leggi vigenti non consentono di coltivare gli OGM su larga
scala

Applicazioni ambientali
Questo batterio (Sulfolobus acidicaldarious) appartiene a
una delle specie più spesso usate nella biorimediazione, in
quanto permette il passaggio in soluzione di elementi
metallici
Si possono utilizzare
microrganismi modificati
geneticamente per degradare
sostanze tossiche di rifiuto,
come metalli, idrocarburi,
pesticidi, diserbanti
In laboratorio sono stati ottenuti
batteri contenenti plasmidi
artificiali in grado di ossidare
idrocarburi più velocemente dei
batteri naturali

Applicazioni farmacologiche:
sintesi della somatostatina
I batteri possono essere utilizzati per
produrre grosse quantità di proteine
La prima proteina di sintesi
biotecnologica è stata la
somatostatina (ormone della
crescita), costituita da 14 amminoacidi
Il sequenziamento dei 600 nucleotidi
che codificano per la somatostatina ha
permesso di sintetizzare un gene
artificiale, che è stato poi fatto
esprimere

Altre applicazioni farmacologiche
Tra le sostanze che possono essere
sintetizzate mediante i processi biotecnologici
ci sono:
l’insulina, un ormone che controlla il livello
glicemico nel sangue, è somministrata ai
soggetti diabetici che presentano
alterazione delle cellule pancreatiche
l’eritropoietina, una proteina che stimola la
formazione dei globuli rossi, viene
somministrata ai soggetti che non la
producono a causa di problemi renali

Organismi transgenici
Gli organismi transgenici
possiedono nel proprio genoma
uno o più geni appartenenti a
individui di un’altra specie
Si possono ottenere isolando il
gene che si vuole trasferire e
inserendolo, mediante
microscopici aghi, in cellule
uovo fecondate; queste
verranno poi impiantate in un
organismo che genererà
individui in grado di esprimere
quel carattere

Clonazione nei mammiferi
La clonazione nei mammiferi consiste nel
trasferimento del nucleo di una cellula somatica,
prelevato da un organismo, in una cellula uovo
non fecondata privata del materiale genetico
proveniente da un altro organismo
La pecora Dolly è stato il
primo organismo nato da
un esperimento di
clonazione nei mammiferi

Ingegneria genetica in medicina
Terapia genica: le tecniche di ingegneria genetica possono essere
molto efficaci per curare alcune malattie dovute all’alterazione di un
singolo gene, mediante la sostituzione di un gene malato con un gene
sano. In questo campo ci sono ancora molti aspetti etici e tecnici
irrisolti
Diagnosi delle malattie: sono oggi disponibili test per la diagnosi
prenatale di molte malattie ereditarie che utilizzano enzimi di
restrizione e sonde di acidi nucleici per rilevare la presenza di geni
alterati. Due importanti test diagnostici prenatali riguardano l’anemia
falciforme e la corea di Hungtinton

La clonazione
La clonazione consiste nella produzione in molte copie di
una molecola di DNA ricombinante.
Per fare questo il DNA ricombinante deve essere inserito
in cellule ospiti che vengono chiamate transgeniche.
Per riconoscere le cellule contenenti DNA ricombinante si
possono usare geni reporter di cui si conosce il fenotipo,
che servono dunque da marcatori genetici.

Storia della scienza
Il famoso caso di Dolly

Le genoteche di frammenti di DNA
Dopo aver clonato il DNA
ricombinante nelle cellule
transgeniche, queste
colture cellulari diventano
degli archivi (genoteche)
di informazioni gen
etiche.

Le biblioteche di cDNA
Gli mRNA trascritti da una cellula in un determinato
momento (trascrittoma) si possono copiare in sequenze
complementari di DNA (cDNA).
Il cDNA è più stabile del filamento di mRNA e perciò viene
utilizzato per creare biblioteche contenenti l’informazione
sull’attività genica della cellula.

Per saperne di più
I microarray a DNA

cDNA
Il DNA da inserire può essere un frammento di varie dimensioni. Per
ottenerlo, si può partire da un segmento di mRNA grazie
all’intervento di un enzima, la trascrittasi inversa

Enzimi di restrizione
Gli enzimi di restrizione sono
particolari enzimi, identificati nei
batteri, che riconoscono e tagliano
le sequenze nucleotidiche in punti
specifici. Possono effettuare due
tipi di tagli:
netti
come l’enzima Hpa1
sfalsati
come gli enzimi EcoR1 e
Hind3, che tagliano in maniera
asimmetrica, creando
“estremità appiccicose”

Plasmidi
I plasmidi sono:
molecole circolari di DNA che contengono
alcuni geni (da uno a decine)
presenti naturalmente nelle cellule
batteriche, alle quali conferiscono
caratteristiche peculiari
utilizzati in natura dai batteri per
favorire il trasferimento di
informazioni da una cellula all’altra
in grado di trasportare un frammento
genetico da un organismo all’altro
(vettori)

Membrana di cellule batteriche
Per favorire l’entrata del plasmide ricombinato nella cellula ospite, è
necessario modificare la membrana batterica in modo da renderla
permeabile al plasmide. Il processo tramite il quale un frammento di
DNA estraneo entra in una cellula batterica è detto trasformazione

Farmacogenetica e farmacogenomica
Farmacogenetica: è la disciplina che studia il ruolo delle variazioni
interindividuali nella sequenza del DNA in relazione alla risposta o agli
effetti avversi dei farmaci.
Farmacogenomica: branca della farmacogenetica, che descrive l’uso
dell’informazione genetica (genotipo del paziente) nel guidare la
scelta di terapie farmacologiche personalizzate in grado di ridurre, nel
singolo paziente, i rischi ed aumentare l’efficacia terapeutica; studia,
inoltre, l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici, avvalendosi delle
conoscenze e delle
tecnologie derivate dallo studio del genoma.

Farmacogenetica e farmacogenomica
I farmaci agiscono interferendo con particolari molecole della cellula.
Si tratta spesso di proteine, la cui presenza è determinata dal patrimonio
genetico ed è fondamentale per l’azione del farmaco.
Se manca il gene che codifica per la proteina in un soggetto, questo non potrà
trarre vantaggio dal farmaco.
La risposta individuale a un farmaco è influenzata da alcuni geni coinvolti nel
metabolismo della molecola stessa. Alcune piccole variazioni su questi geni,
denominate SNP (polimorfismi a singolo nucleotide) possono determinare una
maggiore o minore capacità dell’organismo di assimilare i farmaci,
influenzando così l’attività dei principi attivi.

SNP: Single Nucleotide Polymorphism
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp

SNP: Single Nucleotide Polymorphism

All’interno di una popolazione è possibile determinare il rapporto tra la frequenza
della variante più rara e quella più comune di un determinato SNP. Solitamente si
guarda con maggiore attenzione a SNPs aventi frequenza allelica minore dell’1%
Gli SNPs possono presentarsi all’interno della sequenza codificante di un gene.
Essi all’interno di un gene,in ogni caso,non necessariamente modificano la
sequenza amminoacidica codificata , dal momento che il codice genetico è
degenerato.
Uno SNP che genera in tutte le sue forme lo stesso peptide è detto sinonimo
(synonymous);
in caso contrario è detto non sinonimo(non-synonymous).
Gli SNPs che non si trova in sequenza codificante possono presentare sequenze
negative sullo splicing o sul legame dei fattori di trascrizione.
Essi costituiscono il 90% di tutte le variazioni genetiche umane.
Lo studio degli SNP è molto utile poiché variazioni anche di singoli nucleotidi
possono influenzare lo sviluppo delle patologie o la risposta ai patogeni, agli
agenti chimici, ai farmaci.
Gli SNPs possono avere una grande importanza nello sviluppo di nuovi farmaci e
della diagnostica, in quanto, attraverso uno screening degli SNPs presenti nel
gene responsabile della metabolizzazione del farmaco stesso, consentono di
conoscere l’effetto che può avere un farmaco sull’individuo ancor prima della
somministrazione. Dal momento che gli SNPs sono per lo più ereditati da
generazione in generazione, essi vengono utilizzati in alcuni studi genetici.

Melanoma: la svolta è nella terapia personalizzata. I
pazienti: “I nuovi trattamenti siano subito disponibili”
Napoli, 10 febbraio 2012 – È necessario abbreviare i tempi: le
terapie innovative per il trattamento del melanoma devono essere
immediatamente disponibili per i pazienti. Non si può ritardare
ulteriormente l’accesso a queste armi efficaci nel combattere il
tumore. La richiesta sarà presentata il prossimo aprile a Bruxelles al
Parlamento europeo da una delegazione di pazienti, guidata dal
napoletano Antonio Brancaccio della Fondazione Melanoma. Nel
nostro Paese questa forma di cancro della pelle particolarmente
aggressiva fa registrare ogni anno 7000 nuove diagnosi e 1500
decessi. “Oggi assistiamo a una svolta nel trattamento – spiega il
prof. Paolo Ascierto, presidente della Fondazione Melanoma,
dell’Unità di Oncologia Medica e Terapie Innovative dell’Istituto
‘Pascale’ di Napoli -. Nel 50% dei casi di melanoma è presente la
mutazione di una proteina, il gene BRAF V600, che svolge un ruolo
chiave nello sviluppo del tumore. (roche)

Dal sito internet della ROCHE
"E' un dato di fatto che per circa il 50% dei pazienti, i farmaci non sono
efficaci quanto dovrebbero - e in alcuni casi questa media è ancora
più bassa.
Per questo Roche è fortemente impegnata per promuovere la
Medicina Personalizzata".
Tumore al seno: misurando la presenza di un fattore di crescita
(HER2) della patologia con test specifici, ad esempio quello fornito da
Roche Tissue Diagnostics (Ventana), è possibile individuare quali
pazienti rispondono meglio al farmaco Roche per il tumore della
mammella, specifico per il trattamento dei tumori positivi a questo
recettore.
Tumore del colon-retto: il test K-RAS individua le mutazioni tumorali
che indicano la prognosi della malattia nei pazienti con tumore
colorettale. Alcuni farmaci utilizzati per il trattamento di questa e di
altre forme tumorali sono adatti solo per i pazienti che non presentano
mutazioni. Questo test consente ai medici di individuare i pazienti cui
potrà essere somministrata una terapia antitumorale specifica sulla
base dello stato delle mutazioni.

HIV: test altamente specifici consentono ai medici di monitorare la
risposta alla terapia durante il trattamento con un farmaco
antiretrovirale, nonché l'evolvere della resistenza alla terapia e il
relativo adeguamento.
HCV: utilizzando test altamente sensibili, basati sulla tecnologia
real-time PCR, che permettono di misurare i livelli di virulenza nel
sangue, i medici possono "personalizzare" il regime terapeutico dei
pazienti sulla base della loro risposta al trattamento.
Osteoporosi: monitorando gli effetti della terapia
antiriassorbimento tramite farmaci, i medici possono prescrivere ai
pazienti trattamenti specifici a seconda delle loro esigenze
particolari.
Il test AmpliChip CYP450 analizza le variazioni in due geni
essenziali per il metabolismo di molti farmaci ampiamente prescritti.
È il primo prodotto farmacogenetico in commercio per la previsione
della risposta ai farmaci da parte dei singoli soggetti.