lezione 9a

METODI CROMATOGRAFICI
Le tecniche cromatografiche permettono la separazione e quantificazione
dei componenti di matrici complesse e trovano quindi numerosissime
applicazioni in campo alimentare, biologico, ambientale.
Nei metodi cromatografici i componenti di una miscela si separano
distribuendosi tra due fasi:
una fase stazionaria (un solido o un liquido su supporto solido
inerte)
una fase mobile (gas o liquido) che fluisce in modo continuo su
quella stazionaria.
La separazione è dovuta principalmente alle relative affinità per la fase
stazionaria.
Nella cromatografia liquida (LC) la fase mobile è un liquido, nella gas
cromatografia (GC) la fase mobile è un gas.
da integrare dai libri di testo consigliati:
D. Harris, Chimica analitica quantitativa, Cap. 23-24, Zanichelli Ed. 1991
& D.A. Skoog, J. J. Leary, Chimica analitica strumentale, EdiSes

Tecniche cromatografiche
In base alla forma del letto cromatografico
Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular)
Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)
In base allo stato fisico della fase mobile
Cromatografia Liquida (LC)
Gascromatografia (GC)
Cromatografia fluida supercritica (SFC)
In base al meccanismo di separazione
Adsorbimento
Ripartizione
Scambio ionico
Esclusione
Affinità

Tecniche cromatografiche
analiti volatili o volatilizzabili,
termicamente stabili,
non ionici
Gascromatografia
analiti non volatili o poco volatili,
termicamente instabili
ionici, ionizzabili o non ionici,
Cromatografia liquida

Interazione soluto-fasi
Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le
due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se così non fosse non
ci sarebbe trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al
contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo separativo le seguenti
interazioni:
• legami a idrogeno
• interazioni dipolo-dipolo
• interazioni dipolo-dipolo indotto
• forze di Van der Waals
• formazione di composti di interazione
• attrazione coulombiana
• interazioni steriche
In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la
polarità delle due fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di
interazione nello stesso processo cromatografico

F.S. solida fissa
F.M. liquida o gassosa
Il soluto può venire adsorbito sulla
superficie delle particelle solide
La fase stazionaria è un solido in
polvere steso su un supporto; sulla
superficie dei granuli si trovano siti
attivi che possono stabilire legami
deboli (reversibili!) con le molecole
della miscela da separare. Si parla
quindi di cromatografia di
adsorbimento, che può essere gas-
solido o liquido-solido liquido solido a seconda
della natura della fase mobile
La cromatografia di adsorbimento è
utilizzata per separare sostanze neutre
polari o non polari, di natura organica
o inorganica

F.S. solida fissa
F.M. liquida o gassosa
Il soluto può venire adsorbito sulla
superficie delle particelle solide
L'adsorbimento superficiale è il
meccanismo chimico-fisico
chimico fisico per cui
molecole, molecole atomi o ioni formano un
legame chimico oppure instaurano
un'interazione di tipo chimico-
fisico, attraverso forze di Van der
Waals, sulla superficie di interfase.
L'interfase è la superficie di
separazione tra due diverse fasi,
del tipo:
solido/liquido o
solido/gas.
solido/gas
L’adsorbimento superficiale è
diverso dall’assorbimento, che
invece riguarda la
penetrazione del soluto nel
solido.

Adsorbimento fisico
L’adsorbimento può essere fisico o
chimico.
L’adsorbimento fisico è una
interazione di van der Waals fra
adsorbato e superficie, simile alla
condensazione di un gas, con valori
di energia tipici che si aggirano sulle
20 kJ mol 1 .
L’adsorbimento chimico, chemioadsorbimento, è un vero
legame fra adsorbato e superficie, con valori di energia
intorno a 200 kJ mol 1 .

F.S liquida legata ad supporto solido
F.M. liquida o gassosa
Il soluto viene disciolto nella fase
liquida supportata
La fase stazionaria è un liquido
che impregna un solido granulare
inerte o è ad esso chimicamente
legato; in questo liquido le molecole
da separare sono solubili; la fase
stazionaria e la fase mobile devono
invece essere immiscibili.
Durante l’eluizione le molecole si
ripartiscono dinamicamente tra le
due fasi secondo la diversa
solubilità di ognuna. Si parla quindi
di cromatografia di ripartizione,
che può essere gas-liquido gas liquido o
liquido-liquido liquido liquido a seconda della
natura della fase mobile
La cromatografia di ripartizione è
chiamata in fase normale se la
fase stazionaria è più polare della
fase mobile, mentre è chiamata
fase inversa se la fase stazionaria
è meno polare della fase mobile.
Si tratta della tecnica più
comunemente impiegata per la
separazione di sostanze organiche

F.S solida (resina derivatizzata)
F.M. liquida (elettrolita)
Gli ioni di soluto vengono attratti dai gruppi
funzionali come –SO 3 - o –NR3 + legati covalentemente
alla resina
La fase stazionaria è costituita
da un polimero inerte contenente
siti attivi ionizzati o ionizzabili, i
cui controioni possono essere
scambiati con altri ioni aventi
carica dello stesso segno. Il
meccanismo di separazione è
basato sulla competizione per i
siti di scambio tra gli ioni
presenti nella fase mobile e
quelli presenti nel campione. Si
parla di cromatografia di
scambio ionico (IEC)
La cromatografia a scambio
ionico è impiegata per la
separazione di sostanze ioniche
o ionizzabili

F.S gel poroso
F.M. liquida o gassosa
Assenza di interazioni tra fasi
La fase stazionaria è un
solido poroso o un gel.
Le molecole dell’analita,
disciolte nella fase mobile,
penetrano nei pori se le loro
dimensioni sono compatibili e
vi rimangono per un certo
tempo; le molecole più
grandi sono invece escluse
dai pori ed escono dalla
colonna in tempi brevi.
Si parla di cromatografia di
esclusione dimensionale (SEC)
1) Gel permeazione per la
separazione di sostanze
insolubili in acqua
2) Gel filtrazione per la
separazione di sostanze solubili
in acqua
La tecnica è impiegata per la
separazione di molecole di
grandi dimensioni

F.S molecole immobilizzate su
supporto solido (enzimi, anticorpi)
F.M. liquida
Si sfrutta un'interazione
altamente specifica
In questo caso si utilizzano
reazioni di tipo biochimico,
reversibili e molto specifiche, in
modo che le molecole da separare
interagiscano con la fase
stazionaria e si ottenga così
l’eluizione selettiva di alcuni
componenti della miscela. Si parla
di cromatografia di affinità
(AFC). (AFC).
La cromatografia di affinità è
impiegata nella separazione di
molecole di interesse
prevalentemente biochimico

PRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIA
Esempio: separazione di un campione a tre componenti in una
colonna chiusa. La fase stazionaria consiste di particelle solide solide
porose contenute all’interno di un tubo lungo e sottile
(colonna). Nel passaggio attraverso la colonna ogni componente
si distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la mobile (m). (m).
Il coefficiente di ripartizione (o di distribuzione) di ciascun
componente è definito come il rapporto delle due
concentrazioni relative alle due fasi:
fasi
K
[C]
[C]
s
m
A: il campione viene iniettato
all’entrata della colonna
B D: la fase mobile fa spostare
il campione attraverso la fase
stazionaria A B C D
Flusso del solvente

PRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIA

PRINCIPI
TEORICI
DELLA
CROMATOGRAFIA

Cromatogramma
Tempo di ritenzione (t ( R): ): tempo necessario alla sostanza iniettata per essere eluita
dall’inizio all’uscita della colonna.
Tempo morto (t ( M): ): tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto e che passa
attraverso la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase fase
mobile lungo la colonna. colonna
Volume di ritenzione (V R): ): volume di fase mobile necessario ad eluire l’analita dall’inizio dall’inizio
all’uscita della colonna.
Volume morto (V M): ): il volume di ritenzione di un composto che non è trattenuto
(corrisponde al volume di fase mobile che occupa la colonna).

Fattore di capacità
f è tanto più elevato quanto più a lungo è trattenuto il soluto.
f grandi favoriscono una buona separazione MA aumentano il tempo richiesto per
l'eluizione
f
t
R
t
t
M
M

Parametri che descrivono quantitativamente
l’efficienza di una colonna
1) Altezza equivalente di piatto teorico, H.E.T.P. (H)
2) Numero di piatti teorici N
L = lunghezza colonna
Sebbene la cromatografia sia un processo continuo, è possibile immaginare che la
colonna sia suddivisa in N segmenti o piatti teorici, ovvero sezioni della colonna che
consentono di realizzare un equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra
le fasi. Poiché in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di equilibrio e
non vi è possibilità di realizzare una singola separazione, N ha un significato
puramente matematico.
Più elevato è il numero di piatti teorici, più è alta la probabilità di una separazione
(migliore è la capacità di separazione della colonna). N è proporzionale alla
lunghezza della colonna.
Si può dimostrare che
N
t R
16
W
W = larghezza del picco
2
t R
16
W
L’altezza equivalente al piatto teorico (H = L/N) consente di
confrontare l’efficienza di colonne di differente lunghezza.
N
L
H
2

Variabili che influenzano l’efficienza di una colonna
La principale variabile che influenza l’efficienza di una colonna è la velocità di
flusso lineare (cm/s) della fase mobile. Questa infatti influenza il tempo di
contatto tra fase mobile e fase stazionaria.
L’altezza equivalente del piatto teorico, H, il
parametro che descrive l’efficienza della
colonna, dipende proprio dalla velocità di flusso
della fase mobile (vedere Figura a lato).
Quella ottimale della LC è inferiore a quella
ottimale della GC. Per evitare tempi di analisi
troppo elevati, in LC si usano velocità un po’
maggiori di quella ottimale.
La LC è caratterizzata da valori di H inferiori
alla GC.
In considerazione della lunghezza delle colonne (GC: > 50 m; LC: < 50 cm), la GC è
comunque caratterizzata da valori più elevati di N, e quindi da migliore efficienza.

Le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con la
stessa velocità: la loro dispersione ha generalmente un profilo
gaussiano. Il centro del profilo (banda di eluizione) rappresenta la
velocità media.
I fattori che provocano deviazioni dal valore medio sono:
1. diffusione longitudinale (diffusione delle molecole dalla
zona a maggiore concentrazione verso quella a minore c in
direzione parallela all’asse della colonna);
2. trasferimento di massa tra fase
mobile e fase stazionaria;
3. percorsi multipli
Teoria della velocità cromatografica

1
Diffusione longitudinale

1
Diffusione longitudinale

1
Diffusione longitudinale
Meccanismi di
estensione della banda
Se la permanenza del soluto
nella colonna non è
sufficientemente breve,
procederà una diffusione
longitudinale parallela alla
direzione del flusso, la cui
entità verso le estremità della
banda è maggiore quanto
minore la velocità di flusso.
Da qui, si intuisce l'inversa
proporzionalità del termine
Bu x
u x = velocità flusso

2
Meccanismi di
estensione della banda
Il termine Cu x deriva dal
tempo finito che è necessario
al soluto per entrare in
equilibrio tra le due fasi
(velocità di equilibrazione).
La fase mobile si muove
comunque più velocemente
del soluto che tende ad essere
trattenuto dalla stazionaria.
Di conseguenza, la zona di
soluto nella fase mobile si
sposta più avanti rispetto
quella nella fase stazionaria.
Più è elevata la velocità di
flusso u x , più aumenta il gap
come allargamento espresso
da Cu x

3
Diffusione vorticosa
t 1
ordine di eluizione
II III
Il temine A dell'equazione esprime la diffusione vorticosa dovuta ai diversi
percorsi seguiti in modo casuale dalle particelle di soluto. L'esistenza di
percorsi multipli tende ad allargare la banda (zona di soluto) e l'effetto che ne
deriva è indipendente dalla velocità del flusso. Dalla banda stretta al tempo t 1
si passa a quella slargata al tempo t 2 : delle molecole di soluto vengono eluite
prima perchè hanno seguito un percorso più breve delle altre!
I
t 2

Equazione di Van Deemter
HETP
B
A Cu
u
u x velocità flusso
La velocità di flusso ottimale
è più pratica da individuare su
curve con il ramo destro meno
inclinato, perchè ci permette
di spingere il flusso a valori
elevati senza compromettere
il valore di HETP.

Efficienza in funzione della
velocità di flusso
EFFICIENZA = picchi
molto stretti
1) elevato numero di piatti
teorici
2) velocità di flusso ottimale
3) gradienti opportuni

Efficienza e Selettività
Efficienza: capacità di un sistema
cromatografico di eluire tutte le particelle
della stessa specie alla stessa velocità in
modo da formare in colonna bande strette
da cui picchi stretti
Selettività: capacità di un sistema
cromatografico di eluire specie diverse a
velocità il più possibile diverse, da cui fattori
di separazione ottimali

Risoluzione
La risoluzione, R, è una misura quantitativa della
capacità di separare due analiti.
R
2
( t ) ( t )
R
W
A
B
W
R
B
A
W A
(t R ) A
(t R ) B

Risoluzione
=
efficienza + selettività
La risoluzione caratterizza la bontà di separazione fra due
picchi sia con riferimento alla differenza fra i tempi di
ritenzione (numeratore) sia riguardo all’efficienza di
separazione (denominatore).
R
( t ) ( t )
Una buona risoluzione può derivare da
2
R
W
A
• una buona efficienza (picchi molto stretti, elevato numero
di piatti teorici)
• una buona differenziazione del comportamento dei soluti
(selettività)
(selettività
B
W
R
B
A

Effetto della selettività, dell’efficienza e del fattore di capacità
sulla risoluzione
risoluzione scarsa
buona risoluzione dovuta a
buona efficienza
picchi stretti
buona risoluzione dovuta
a buona selettività
picchi distanti
risoluzione scarsa dovuta ad
un basso fattore di capacità

Forme di banda
Si ha la banda a forma gaussiana quando il coefficiente di
ripartizione è costante, indipendentemente dalla
concentrazione di soluto sulla colonna.
In realtà, tale coefficiente varia all'aumentare della quantità
totale di soluto e l'andamento che deriva di C s vs C m prende
il nome di isoterma (ad una data T).
K
[C]
[C]
s
m

Forme di banda
1. Colonna sovraccarica: se si carica troppo soluto la FS
tende a saturarsi, e C s aumenta di più rispetto la C m in
relazione al caso ideale , per cui il grosso del soluto viene
eluito in ritardo rispetto il tempo medio.
K
[C]
[C]
s
m
1

K
[C]
[C]
s
m
1

Forme di banda
2. Siti a diversa affinità: la presenza di alcuni siti
particolarmente più affini al soluto si traduce nella tendenza
della F.S. a rilasciare alcune molecole di soluto molto più
lentamente della massa del soluto che invece esce in
anticipo rispetto il tempo medio (codatura)
K
[C]
[C]
s
m
1

K
[C]
[C]
s
m
1

A bassi valori di C s e C m si resta nei limiti della linearità (primo
tratto delle curve).
Alternativa: cambiare FS o iniettare un volume minore!
Capacità di carico: quantità massima di campione che la fase
stazionaria può supportare senza compromettere la separazione.

OH
Si
O Si
OH
Silanizzazione della silice
Per ridurre la possibilità di formazione di bande codate
si impegnano i siti più attivi con composti polari
derivatizzandoli stabilmente con legami covalenti
esametil disilazina
+ Me 2 SiNHSiMe 2
– NH 3
OSiMe 2
Si
O Si
OSiMe2
FS con gruppi OH esposti FS con superficie protetta

Applicazioni
Le applicazioni della cromatografia vanno dall’analisi qualitativa a
quella quantitativa di miscele anche molto complesse.
L’analisi quantitativa sfrutta la misurazione dell’altezza o
dell’area dei picchi. La misurazione dell’area è più affidabile in
quanto non risente dell’eventuale allargamento dei picchi in
seguito a variazione delle condizioni di lavoro.
I metodi di analisi sono tutti indiretti. Si costruisce prima una
curva di calibrazione per ciascun analita e poi si ricava la
concentrazione dell’analita nella miscela in esame mediante
interpolazione.
Il metodo dello standard interno è il più affidabile: una
quantità nota di standard viene introdotta nelle soluzioni
standard e nel campione in esame; il parametro analitico è
quindi costituito dal rapporto tra le aree dello standard e
dell’analita.
C
C
soluto
standard
A
A
soluto
standard

1. Si misurano le quantità degli altri
soluti in relazione a quelle dello
standard interno usato.
2. Il metodo funziona se il picco dello
standard è separato da quello
dell’analita.
3. Va considerato il fattore di risposta
f: la risposta dei rivelatori spesso
non è aspecifica, cioè varia con la
natura del soluto a parità di
concentrazione. Il fattore f è
empirico
C
C
soluto
standard
f
A
A
soluto
standard

Metodo dello standard interno
1) Si individua una specie chimica molto simile all’analita per
proprietà chimico-fisiche (standard interno).
2) Si prepara un campione (standard 1) contenente quantità
note di analita e di standard interno, indicate con x A e x Z
rispettivamente.
3) Si sottopone lo standard 1 alla misura strumentale. Si
rileverà un segnale S Z per lo standard interno e un segnale S A
per l’analita. Sarà:
S A : S Z = x A : x Z
assumendo che il rivelatore presenti la stessa risposta sia per lo standard interno che per l’analita

Metodo dello standard interno
Applicabilità del metodo dello standard interno
Le condizioni necessarie per poter applicare il metodo sono:
• disporre di uno standard interno molto simile all’analita.
• lavorare all’interno dell’intervallo lineare.
• verificare che il recupero analitico relativo di analita e
standard interno sia 100%.
Vantaggi del metodo dello standard interno
• è applicabile anche laddove una retta di taratura darebbe
scarsa precisione
• rende possibile una determinazione quantitativa anche
quando non si disponga di uno standard puro di analita ma si
conoscono i fattori di risposta
• più rapido rispetto gli altri

A 4
A x
A 3
A 2
A 1
Metodo della curva di taratura
Area del picco
C 1
C 2
C 3
C x
C 4
concentrazione