Modelli in vitro per la predizione dei rischi da contaminanti ... - Arpa
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<strong>Modelli</strong> <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> <strong>per</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>predizione</strong> <strong>dei</strong> <strong>rischi</strong> <strong>da</strong><br />
contam<strong>in</strong>azioni ambientali<br />
Monica Vaccari<br />
Area Tossicologia S<strong>per</strong>imentale<br />
CTR Cancerogenesi Ambientale e Valutazione del<br />
Rischio
STIMOLO<br />
ESTERNO<br />
CONTAMINANTE<br />
AMBIENTALE<br />
DOSE<br />
risposta<br />
a<strong>da</strong>ttativa<br />
CAMBIAMENTI<br />
PRECOCI<br />
DANNO<br />
NORMALI<br />
FUNZIONI<br />
BIOLOGICHE<br />
MORTE
TEST DI TOSSICITA’<br />
Osservazione del<strong>la</strong> comparsa di effetti<br />
avversi dopo esposizione nell’animale<br />
Incertezze nell’estrapo<strong>la</strong>zione<br />
Dalle alte dosi ai livelli ambientali<br />
Dall’animale all’uomo<br />
Dall’esposizione s<strong>per</strong>imentale (1 composto, 1<br />
via di esposizione) ad esposizioni aggregate (1<br />
composto, + vie di esposizione) o cumu<strong>la</strong>tive<br />
(+ composti, + vie di esposizione)
Le 3R<br />
REPLACE<br />
sostituire l’uso di animali con tecniche alternative o<br />
evitarne completamente l’uso<br />
REDUCE<br />
ridurre al m<strong>in</strong>imo il numero di animali utilizzati <strong>per</strong><br />
ottenere le <strong>in</strong>formazioni <strong>da</strong> meno animali o piu’<br />
<strong>in</strong>formazioni <strong>da</strong>llo stesso numero di animali<br />
REFINE<br />
aff<strong>in</strong>are il modo <strong>in</strong> cui gli es<strong>per</strong>imenti sono condotti<br />
<strong>per</strong> essere certi che gli animali soffrano il meno<br />
possibile (migliore stabu<strong>la</strong>zione, procedure che<br />
m<strong>in</strong>imizz<strong>in</strong>o le sofferenze o aument<strong>in</strong>o il benessere<br />
animale)
VANTAGGI<br />
Rapidità, economicità,<br />
riproducibilità<br />
Valutazione delle<br />
re<strong>la</strong>zioni dose-risposta<br />
Identificazione <strong>dei</strong><br />
meccanismi moleco<strong>la</strong>ri<br />
al<strong>la</strong> base degli effetti<br />
biologici<br />
Utilizzo come screen<strong>in</strong>g<br />
prelim<strong>in</strong>are <strong>per</strong> nuovi<br />
materiali, miscele<br />
complesse di orig<strong>in</strong>e<br />
ambientale, ecc<br />
MODELLI IN VITRO<br />
LIMITI<br />
Non sono valutabili parametri<br />
fon<strong>da</strong>mentali nel<strong>la</strong> azione<br />
biologica del cancerogeno<br />
nell’organismo <strong>in</strong> toto<br />
(metabolismo, trasporto e<br />
distribuzione, elim<strong>in</strong>azione)<br />
Possibilità di falsi positivi e falsi<br />
negativi<br />
<strong>Modelli</strong> non sempre<br />
direttamente corre<strong>la</strong>bili con<br />
l’organo target<br />
Non sono valutabili parametri<br />
di <strong>in</strong>teresse ambientale<br />
(biodisponibilità,<br />
bioaccumulo/biomagnificazione)
TOXICITY TESTING IN THE 21° CENTURY:<br />
A VISION AND A STRATEGY<br />
US National Academy of Science report, 2007<br />
“… not –so-distant future <strong>in</strong> which virtually all rout<strong>in</strong>e<br />
toxicity test<strong>in</strong>g would be conducted <strong>in</strong> human cells or cell<br />
l<strong>in</strong>es <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> by evaluat<strong>in</strong>g cellu<strong>la</strong>r responses <strong>in</strong> a suite of<br />
toxicity pathways assays us<strong>in</strong>g high-throughput tests…”<br />
<strong>da</strong>ll’animale a metodi <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> basati su cellule, l<strong>in</strong>ee<br />
cellu<strong>la</strong>ri o componenti cellu<strong>la</strong>ri, preferibilmente di orig<strong>in</strong>e<br />
umana<br />
modelli che mirano al<strong>la</strong> valutazione <strong>dei</strong> processi biologici<br />
di risposta cellu<strong>la</strong>ri <strong>la</strong> cui significativa alterazione può<br />
portare a effetti avversi <strong>per</strong> <strong>la</strong> salute (“toxicity<br />
pathways”)
pro-cancerogeno<br />
ATTIVAZIONE<br />
METABOLICA<br />
INIZIAZIONE<br />
(1-2 giorni)<br />
cancerogeno<br />
cellu<strong>la</strong> normale<br />
cellu<strong>la</strong> <strong>in</strong>iziata<br />
DETOSSIFICAZIONE<br />
PROMOZIONE<br />
(> 10 anni)<br />
DETOSSIFICAZIONE<br />
cellu<strong>la</strong><br />
preneop<strong>la</strong>stica<br />
PROGRESSIONE<br />
(> 1 anno)<br />
ESCREZIONE<br />
cellu<strong>la</strong><br />
tumorale
MODELLI IN VITRO DI<br />
TRASFORMAZIONE CELLULARE<br />
Test considerati come possibile<br />
alternativa ai saggi a lungo term<strong>in</strong>e<br />
nell’animale <strong>per</strong> <strong>la</strong> <strong>predizione</strong> del<br />
<strong>rischi</strong>o cancerogeno nell’uomo<br />
mimano alcune tappe del processo di cancerogenesi<br />
multifasica<br />
<strong>per</strong>mettono lo studio del potenziale cancerogeno di<br />
agenti fisici e chimici<br />
sono proposti come screen<strong>in</strong>g di secondo livello <strong>per</strong><br />
cancerogeni e come test di screen<strong>in</strong>g di elezione <strong>per</strong><br />
cancerogeni non genotossici
MODELLI IN VITRO DI<br />
TRASFORMAZIONE CELLULARE<br />
AnnexV toDirective67/548/EEC<br />
Part B: Methods for the determ<strong>in</strong>ation of toxicity
MODELLI IN VITRO DI<br />
TRASFORMAZIONE CELLULARE
MODELLI IN VITRO DI<br />
TRASFORMAZIONE CELLULARE
MODELLI IN VITRO DI<br />
TRASFORMAZIONE CELLULARE<br />
SHE<br />
BALB/c 3T3<br />
C3H10T1/2<br />
cellule con cariotipo<br />
normale<br />
effetti su fasi precoci<br />
del<strong>la</strong> cancerogenesi<br />
cellule immortalizzate<br />
aneuploidi<br />
effetti su fasi più tardive<br />
del<strong>la</strong> cancerogenesi
CELLULE BALB/c 3T3<br />
BALB/c 3T3 A31<br />
BALC/3T3 A31-1-1
ALTERAZIONI NEL<br />
RITMO<br />
PROLIFERATIVO<br />
ALTERAZIONI<br />
MORFOLOGICHE<br />
PERDITA<br />
DELL’INIBIZIONE<br />
DA CONTATTO<br />
TUMORIGENICITÀ<br />
IN VIVO
TEST DI CITOTOSSICITA’<br />
-48hr<br />
0<br />
sem<strong>in</strong>a<br />
(250 cellule)<br />
48 hr<br />
trattamento<br />
48 ore<br />
96 hr<br />
cancerogeno<br />
cambio terreno<br />
TEST DI TRASFORMAZIONE<br />
-48hr<br />
0<br />
sem<strong>in</strong>a<br />
(3 x 10 4 cellule)<br />
48 hr<br />
96 hr<br />
cancerogeno<br />
trattamento 48 ore<br />
cambi terreno (2 v/settimana)<br />
10-12 d<br />
fissare<br />
colorare<br />
28-35 d<br />
fissare<br />
colorare<br />
FREQUENZA DI<br />
TRASFORMAZIONE
COMPOSTI SINGOLI<br />
Solventi<br />
Pesticidi<br />
Farmaci<br />
Biotoss<strong>in</strong>e algali<br />
ASSOCIAZIONI<br />
BINARIE<br />
MISCELE<br />
COMPLESSE<br />
CAMPIONI<br />
AMBIENTALI<br />
AMIANTO<br />
MMF<br />
RADIAZIONI<br />
IONIZZANTI
VALUTAZIONE DEGLI EFFETTI CITOTOSSICI E<br />
TRASFORMANTI INDOTTI DA FIBRE CERAMICHE<br />
REFRATTARIE E FIBRE POLICRISTALLINE NEL<br />
MODELLO IN VITRO BALB/c 3T3<br />
Gruppo Interregionale Fibre<br />
Coord<strong>in</strong>amento Tecnico Interregionale<br />
del<strong>la</strong> Prevenzione nei Luoghi di Lavoro<br />
C.T.I.P.L.L.<br />
Monica Vaccari, Wolfango Horn, Pao<strong>la</strong> Sil<strong>in</strong>gardi, Annamaria Co<strong>la</strong>cci<br />
Eccellenza Cancerogenesi Ambientale, Laboratorio Meccanismi di Cancerogenesi<br />
e Anticancerogenesi, ARPA-Emilia Romagna, Sezione Prov<strong>in</strong>ciale di Bologna<br />
Tiziana Bacci, Orietta Sa<strong>la</strong>, Giovanni Pecch<strong>in</strong>i<br />
Eccellenza Amianto Polveri e Fibre, ARPA-Emilia Romagna, Sezione Prov<strong>in</strong>ciale di<br />
Reggio Emilia<br />
Stefania Perdichizzi, Maria Grazia Mascolo, Sandro Grilli<br />
Dipartimento di Patologia S<strong>per</strong>imentale, Sezione Cancerologia, Università di<br />
Bologna
FIBRE POLICRISTALLINE<br />
c<strong>la</strong>ssificate nel<br />
2002 <strong>da</strong>l<strong>la</strong> IARC<br />
nel<strong>la</strong> categoria 2B<br />
“possibili<br />
cancerogeni <strong>per</strong><br />
l’uomo” <strong>in</strong>sieme<br />
alle FCR<br />
non <strong>in</strong>cluse nel<strong>la</strong><br />
Direttiva UE<br />
97/69/EC<br />
2 KX<br />
400 X
SPETTRI EDX<br />
A – Fibra ceramica refrattaria<br />
B – Fibra policristall<strong>in</strong>a<br />
SEM<br />
DLG - 2ES (µm)<br />
FCR = 1.60<br />
FPC = 2.71<br />
FPC<br />
FCR<br />
n° fibre/mg<br />
FCR = 0.399 x 106 FPC = 0.786 x 106
TEST DI CITOTOSSICITÀ<br />
citotossicità del<strong>la</strong> fibra policristall<strong>in</strong>a<br />
confronto con <strong>la</strong> tossicità <strong>in</strong>dotta <strong>da</strong> FCR e<br />
crocidolite<br />
scelta delle dosi <strong>da</strong> utilizzare nel saggio di<br />
trasformazione<br />
TEST DI TRASFORMAZIONE<br />
Valutazione del<strong>la</strong> potenziale cancerogenicità<br />
Comparazione degli effetti trasformanti delle fibre<br />
policristall<strong>in</strong>e e delle FCR con un controllo positivo<br />
(crocidolite)<br />
RELAZIONI DOSE-RISPOSTA<br />
Stima di una curva di risposta<br />
Estrapo<strong>la</strong>zione del <strong>da</strong>to <strong>per</strong> una stima quantitativa<br />
del <strong>rischi</strong>o e/o identificazione di una dose soglia
EFFETTI CITOTOSSICI:<br />
confronto <strong>in</strong> base al n° fibre/cm 2<br />
% crescita<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
*<br />
**<br />
**<br />
* *<br />
**<br />
**<br />
FCR FPC CROCIDOLITE<br />
**<br />
**<br />
**<br />
**<br />
0 5 10 15 20<br />
RANKING DI POTENZA CITOTOSSICA<br />
**<br />
fibre/cm 2 (x 10 3 )<br />
**<br />
**<br />
crocidolite >> FCR > FCP
TRASFORMAZIONE: confronto <strong>in</strong> base al n°<br />
fibre/cm 2<br />
TF (x 10 -4 )<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
**<br />
*<br />
0<br />
**<br />
**<br />
* **<br />
* **<br />
RCF<br />
PCF<br />
CROCIDOLITE<br />
0 2 4 6 8 10 12<br />
fibers/cm 2 (x 10 3 )<br />
crocidolite >> FCR > FCP<br />
**
gelificazione<br />
<strong>in</strong>cubazione<br />
(2 settimane)<br />
Test di crescita <strong>in</strong> soft agar<br />
Agar 0.5%<br />
sospensione<br />
cellu<strong>la</strong>re<br />
+<br />
agar 0.3%<br />
colonie<br />
La capacità di crescita<br />
<strong>in</strong>dipendente <strong>da</strong>ll’ancoraggio<br />
è un marker di trasformazione<br />
neop<strong>la</strong>stica corre<strong>la</strong>to al<strong>la</strong><br />
tumorigenicità
MIGRAZIONE<br />
i filtri sono rivestiti con<br />
GELATINA (5 µg/filtro)<br />
Trattamento con il<br />
composto chimico<br />
Sem<strong>in</strong>a <strong>in</strong> camere <strong>da</strong><br />
chemiotassi a fondo cieco<br />
Incubazione<br />
(6 ore, 37°C, 5% CO 2 )<br />
Fissazione e colorazione<br />
Valutazione del numero delle cellule<br />
sul<strong>la</strong> su<strong>per</strong>ficie <strong>in</strong>feriore del filtro<br />
(5-10 campi/filtro, <strong>in</strong>grandimento<br />
200x)<br />
INVASIONE<br />
i filtri sono rivestiti con<br />
MATRIGEL (12.5 µg/filtro)
crescita (% vs DMSO)<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
-100<br />
-150<br />
TEST DI VITALITA’<br />
valutazione di<br />
tossicità/efficacia<br />
calcolo di GI 50<br />
0 20 40 60 80 100<br />
-50<br />
A1260 (µM)<br />
24h<br />
48h<br />
72h<br />
6gg<br />
Lettura a 540 nm<br />
trattamento<br />
<strong>in</strong>cubazione<br />
con MTT<br />
solubilizzazione
INTERFERENZA ENDOCRINA<br />
endpo<strong>in</strong>t funzionali<br />
<strong>in</strong> l<strong>in</strong>ee cellu<strong>la</strong>ri<br />
rappresentative di<br />
organi target<br />
E-SCREEN<br />
ASSAY<br />
REPORTER<br />
GENE<br />
ASSAYS<br />
effetti sull’espressione<br />
genica di molecole ad<br />
attività estrogenica<br />
e/o dioss<strong>in</strong>o-simile<br />
Real Time PCR
E-SCREEN ASSAY<br />
lo stimolo estrogenico<br />
<strong>in</strong>duce proliferazione <strong>in</strong><br />
cellule ER+<br />
valutazione funzionale<br />
dell’ attività estrogenica<br />
di A1260 e PCB118 <strong>in</strong><br />
cellule T47D<br />
(T-C)/(E2-C)<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8<br />
1.500<br />
1.000<br />
0.500<br />
0.000<br />
-0.500<br />
ESTRADIOLO (log conc)<br />
-8.0 -7.0 -6.0 -5.0 -4.0<br />
log conc<br />
A1260<br />
PCB118<br />
DMSO<br />
E2
REAL-TIME PCR<br />
Valutazione del<strong>la</strong> attivazione del<strong>la</strong><br />
pathway degli estrogeni<br />
esposizione di cellule<br />
T47D a PCB118<br />
espressione di PDZK<br />
2^-ΔΔCt<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
4 h<br />
16 h<br />
DMSO E2 PCB 118<br />
**
REAL-TIME PCR<br />
Valutazione del<strong>la</strong> attivazione del<strong>la</strong><br />
pathway del recettore Ah<br />
esposizione di cellule<br />
T47D a partico<strong>la</strong>to<br />
urbano<br />
espressione di CYP1A1<br />
2^-ΔΔCt<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
**<br />
0.198<br />
1.000<br />
**<br />
397.093<br />
**<br />
326.288<br />
**<br />
374.806<br />
NT DMSO 2.4 mc 6 mc 12 mc
SVILUPPO NUOVI TEST<br />
Messa a punto di una metodica di<br />
citotossicità secondo un protocollo<br />
vali<strong>da</strong>to (Neutral Red Uptake)<br />
Acquisizione di un protocollo di<br />
trasformazione <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> su cellule<br />
bersaglio umane<br />
Utilizzo del protocollo CALUX <strong>per</strong> <strong>la</strong><br />
valutazione dell’attività di <strong>in</strong>terferenza<br />
endocr<strong>in</strong>a
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