Regolazione dell'espressione
Regolazione dell'espressione
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•Procarioti concetto di operone<br />
•<strong>Regolazione</strong> positiva “attivatori”<br />
•<strong>Regolazione</strong> negativa “repressori”<br />
•<strong>Regolazione</strong> inducibile<br />
• regolazione reprimibile<br />
• gene regolatore
L’espressione dei geni sono controllati da<br />
segnali extracellulari<br />
•In assenza di regolazione i geni hanno<br />
una trascrizione minima o basale<br />
•Reclutamento della RNA polimerasi<br />
•Legame cooperativo
•RNA
Assenza di lattosio
Presenza di lattosio
• IPTG induttore artificiale (isopropil-1-tiob-D-galattoside)<br />
inattiva il repressore<br />
lac e consente l'espressione del<br />
frammento clonato nel vettore<br />
• Xgal (5-Bromo-4-cloro-3-indolil-b-Dgalattoside)<br />
che viene metabolizzato a<br />
composto blu dalla b-galattosidasi.
L’attenuazione<br />
1) la terminazione è regolata dalla velocità di traduzione dell’attenuatore al 5’<br />
“regione leader”.<br />
2) i livelli di tTNA-Trp controllano la velocità di traduzione. Abbondante tRNA-<br />
Trp determina la formazione di forcine sull’attenuatore con il rilascio della<br />
polimerasi.<br />
3) la struttura dell’RNA sull’attenuatore “forcina” causa la terminazione in<br />
presenza di tRNA-Trp
<strong>Regolazione</strong> post-<br />
trascrizionale o a livello della<br />
• 5’-UTR dell’mRNA<br />
traduzione<br />
• Concentrazione di specifici tRNA<br />
• Repressori che inibiscono il legame del<br />
ribosoma al codone d’inizio<br />
• Cambiamenti di struttura dell’RNA
CAP o CRP lega il DNA come dimero<br />
mentre il repressore LacI come tetramero
Elementi di riconoscimento dei fattori di trascrizione
1. Riconosce un DNA a doppio filamento<br />
2. sequenze palindromiche con ripetizioni invertite<br />
3. Ciascun “emisito” lega una subunità del<br />
repressore
• N-terminale<br />
• C-terminale<br />
Repressore Lac
CAP o CRP
Fagi
Ciclo dei fagi<br />
genoma di 50 Kb e 50 geni<br />
lisogenico
Geni precoci sono necessari per la fase<br />
tardiva
Antiterminazione
Antiterminazione
•Geni precoci immediati e tardivi (N, CRO) sono necessari sia per il ciclo<br />
litico che per la lisogenia
1) due geni repressori (cI e CRO) e tre promotori<br />
2) la lisogenia è mantenuta dal repressore cI il quale<br />
lega gli operatori OR ed OL bloccando PL e PR ed i<br />
geni precoci immediati<br />
3)<br />
• PRM repressor maintenance<br />
• cI lambda repressor<br />
• CRO control of repressor<br />
X<br />
• Forte<br />
• Non hanno bisogno<br />
• di attivatori<br />
• Debole<br />
ha bisogno<br />
di attivatori
Mappa di regolazione
1) Controllo autogeno di mantenimento del repressore<br />
auto-repressione dovuto all’aumento di concentrazione<br />
2) i dimeri interagiscono tra loro formando un ottamero
1) I geni cII e cIII sono necessari ad attivare la trascrizione a livello PRE<br />
1) La presenza del repressore mantiene la propria sintesi<br />
2) i prodotti dei geni cII e cIII del gene precoce ritardato sono necessari alla RNA<br />
polimerasi per iniziare la trascrizione a livello di PRE (right establishment)<br />
3) cII attiva promotori deboli come PRE e cIII ne inibisce la sua degradazione<br />
4) la trascrizione a partire da PRE porta alla trascrizione del repressore cI il quale<br />
blocca CRO instaurando la lisogenia
1) i dimeri si legano in modo cooperativo<br />
2) i siti di legame degli operatori sono separati da spaziatori<br />
3) i siti sono numerati da “1” più vicini al sito d’inizio, a “3” a monte<br />
del promotore come (OR1-OR3)<br />
4) il sito 1 è quello con maggiore affinità gli altri minore affinità e<br />
legano con minore concentrazione del fattore
• Enhancer attiva il promotore<br />
più vicino a qualunque<br />
distanza<br />
• Porta alla formazione di<br />
complessi che interagiscono<br />
direttamente o<br />
indirettamente con il<br />
promotore<br />
• Agiscono in modo<br />
bidirezionale in qualunque<br />
orientamento<br />
• Elemento CAAT<br />
• Spesso si trovano più copie<br />
di questi elementi<br />
“modulari”, perciò legano<br />
vari tipi di fattori di<br />
trascrizione<br />
• Agiscono in cis
• Aumentare la concentrazione di attivatori vicino al promotore<br />
• Aumentano la frequenza della trascrizione<br />
• Funzionano stabilendo interazioni proteina-proteina con i fattori<br />
basali<br />
• La repressione è raggiunta influenzando la struttura della<br />
cromatina o legando o nascondendo gli attivatori<br />
• Lo stimolo della trascrizione da parte degli enhancer è<br />
indipendente dall’orientamento e dalla posizione
Enhancer di SV40 agisce sui geni precoci e<br />
tardivi in entrambe le direzioni
• 1) struttura della cromatina<br />
• 2) Enhancer generale e siti di legame del repressore Mig1<br />
“indotto dal glucosio” regolano l’induzione o repressione<br />
• 3) GAL4 è regolato negativamente da GAL80 che si sposta tra<br />
nucleo e citoplasma<br />
• 4) Gal80 è regolato negativamente nel citoplasma da Gal 3 che<br />
è attivato dall’induttore galattosio<br />
•
Tre classi di attivatori<br />
• 1) veri attivatori (formano contatti diretti col DNA<br />
ed agiscono formando contatti con l’apparato basale<br />
di trascrizione) o mediati “indiretti” da un coattivatore.<br />
• a) fattore tessuto specifico;<br />
• b) attivazione mediata da modificazioni chimiche “fosforilazione”;<br />
• c) attivazione mediata da un ligando (recettori steroidei);<br />
• d) la disponibilità dell’attivatore può dipendere dal legame al<br />
repressore (NF-kB)<br />
• e) partner alternativi possono determinare attività o inattività; esempio<br />
“HLH”<br />
• f) attivazione da taglio proteolitico da un precursore inattivo<br />
• 2) antirepressori agiscono solo su stampi di<br />
cromatina e reclutano enzimi e/o complessi di<br />
rimodellamento della cromatina<br />
• 3) proteine architettoniche regolano la<br />
struttura del DNA curvandolo e riunendo le proteine<br />
legate
Attiva i geni k delle Ig nei linfociti B
Omeodominio geni omeobox<br />
e geni umani Hox
1) Forma un ansa di circa 23 aa<br />
che sporge dal sito di legame dello<br />
zinco che viene chiamata Cys2/His2<br />
2) recettori steroidei hanno<br />
Cys2/Cys2. Si legano al DNA come<br />
dimeri omo o eterodimeri<br />
il primo dito controlla quale sequenza<br />
viene legata ed il secondo controlla la<br />
distanza tra le posizioni “viola e<br />
verde”
Recettore degli estrogeni
Cerniera di leucina alfa elica con leucina ogni sette posizioni, i<br />
gruppi idrofobici interagiscono mentre sull’altra faccia si<br />
trovano quelli carichi. Adiacente ad ogni cerniera c’è un altro<br />
dominio di legame al DNA carico denominato bZIP zipper<br />
basico
Formano sia omo che eterodimeri
HLH Helix-loop-Helix si trova generalmente in<br />
geni che regolano lo sviluppo<br />
Ogni elica interagisce attraverso residui<br />
idrofobici da un lato e carichi dall’altro<br />
No tutte hanno un dominio di legame al<br />
DNA la specificità di legame dipende dal<br />
dimero
1) Scivolamento dell’ottamero<br />
2) Trasferimento<br />
3) Rimozione completa del DNA dall’ottamero<br />
4) rimozione di H2A-H2B
1) Switch mating type/sucrose non fermenting<br />
2) CHD chromodomain elicase DNA-binding o NuRD sono repressori<br />
3) alcuni fanno scivolare il DNA<br />
4) altri possono rimuovere l’ottamero<br />
2) ISWI influenza il posizionamento legando il DNA linker e la coda di H4