cache
cache
cache
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
วิทยานิพนธ<br />
เรื่อง<br />
ลักษณะลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อแบคทีเรีย<br />
Ralstonia solanacearum ไบโอวาร 3 ใน<br />
ประเทศไทยโดยเทคนิค Pulsed-Field Gel Electrophoresis<br />
Genomic DNA Fingerprinting of Ralstonia solanacearum Biovar 3 in Thailand<br />
by Pulsed-Field Gel Electrophoresis<br />
โดย<br />
นางสาวทิพวรรณ กันหาญาติ<br />
เสนอ<br />
บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร<br />
เพื่อความสมบูรณแหงปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต<br />
(เทคโนโลยีชีวภาพเกษตร)<br />
พ.ศ. 2547<br />
ISBN 974-274-916-7
กิตติกรรมประกาศ<br />
ขอขอบพระคุณ ผศ. ดร. วิชัย โฆสิตรัตน ประธานกรรมการที่ปรึกษาในความกรุณาใหคํา<br />
ปรึกษาและแกไขขอบกพรองตางๆ ในการทําวิทยานิพนธ ขอขอบพระคุณ ผศ. ดร. อรรัตน มงคล<br />
พร กรรมการที่ปรึกษาวิชาเอก<br />
รศ. ดร. นิพนธ ทวีชัย กรรมการที่ปรึกษาวิชารอง<br />
และ รศ. ดร. วันชัย<br />
จันทรประเสริฐ ผูแทนบัณฑิตวิทยาลัย<br />
ที่ไดกรุณาใหคําแนะนํา<br />
และตรวจแกไขวิทยานิพนธใหมี<br />
ความสมบูรณยิ่งขึ้น<br />
วิทยานิพนธนี้ไดรับการสนับสนุนจากศูนยเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร<br />
โดยงบประมาณของ<br />
โครงการยอยบัณฑิตศึกษาและวิจัย สาขาเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร ภายใตโครงการบัณฑิตศึกษา<br />
และวิจัย สาขาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี สํานักงานคณะกรรมการการอุดมศึกษา กระทรวง<br />
ศึกษาธิการ<br />
ขอขอบพระคุณ รศ. ดร. นิพนธ ทวีชัย ผศ. ดร. เพชรรัตน ธรรมเบญจพล และคุณณัฏฐิมา<br />
โฆษิตเจริญกุล ที่ไดกรุณาใหตัวอยางเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum รวมทั้งขอมูลตางๆ<br />
ของเชื้อที่ใช<br />
ในการวิจัยนี้<br />
ขอขอบคุณ คุณจุฑาเทพ วัชระไชยคุปต และคุณปทุมพร พุทธา ที่คอยชวยเหลือเปนอยางดี<br />
ตลอดการวิจัย ขอบคุณพี่ๆ<br />
เพื่อนๆ<br />
นองๆ ในหองปฏิบัติการและนิสิตศูนยเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร<br />
ที่ใหความชวยเหลือและใหกําลังใจเสมอ<br />
สุดทายนี้ขอกราบขอบพระคุณ<br />
คุณพอ คุณแม และขอบคุณทุกคนในครอบครัวที่ใหกําลัง<br />
ใจและสนับสนุนในเรื่องการศึกษาตลอดมา<br />
ทิพวรรณ กันหาญาติ<br />
ตุลาคม 2547
สารบัญ<br />
สารบัญ (1)<br />
สารบัญตาราง (2)<br />
สารบัญภาพ (3)<br />
คํานํา 1<br />
วัตถุประสงค 2<br />
การตรวจเอกสาร 3<br />
อุปกรณและวิธีการ 17<br />
ผลการทดลอง 25<br />
วิจารณผลการทดลอง 44<br />
สรุปผลการทดลอง 48<br />
เอกสารและสิ่งอางอิง<br />
50<br />
ภาคผนวก 60<br />
หนา<br />
(1)
สารบัญตาราง<br />
ตารางที่<br />
หนา<br />
1 การจัดจําแนกไบโอวารของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum 7<br />
2 เชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum จํานวน 86 สายพันธุ ที่แยกจาก<br />
พืชอาศัยและแหลงปลูกพืชแหลงตางๆ ในประเทศไทย 28<br />
ตารางผนวกที่<br />
่<br />
1 ขอมูล similarity matrix จากการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิค<br />
ดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum สายพันธุตางๆ<br />
ที<br />
ตัดดวยเอนไซม XbaI 62<br />
่<br />
2 ขอมูล similarity matrix จากการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิค<br />
ดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum สายพันธุตางๆ<br />
ที<br />
ตัดดวยเอนไซม SpeI 76<br />
(2)
สารบัญภาพ<br />
ภาพที่<br />
หนา<br />
1 หลักการทํางานของ Pulsed-field gel electrophoresis ระบบ<br />
Contour-clamped homogeneous electric field ประกอบดวยชุด<br />
ขั้วไฟฟา<br />
A และ B โดยเมื่อใหกระแสไฟฟาที่ชุดขั้วไฟฟา<br />
A<br />
ดีเอ็นเอจะเคลื่อนที่จากขั้วลบไปทางดานขวาซึ่งเปนขั้วบวกดัง<br />
แสดงในลูกศรแรก เมื่อหยุดใหกระแสไฟฟาที่ชุดขั้วไฟฟา<br />
A<br />
และใหกระแสไฟฟาที่ชุดขั้วไฟฟา<br />
B ดีเอ็นเอจะกลับทิศทางและ<br />
เคลื่อนที่จากขั้วลบไปขั้วบวก<br />
สลับทิศทางสนามไฟฟาเชนนี้ไป<br />
เรื่อยๆ<br />
9<br />
2 ขั้นตอนในการเตรียมเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum ไบโอวาร 3<br />
เพื่อแยกลักษณะลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอโดยเทคนิค<br />
Pulsed-field<br />
gel electrophoresis 22<br />
3 ขั้นตอนในการศึกษาวิเคราะหลักษณะลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอ<br />
ของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum ไบโอวาร 3 โดยใชโปรแกรม<br />
คอมพิวเตอรสําเร็จรูป Syngene software package 23<br />
4 การจัดจําแนกและตรวจสอบเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum 27<br />
5 ลักษณะลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum<br />
ไบโอวาร 3 สายพันธุตางๆ<br />
ที่ไดจากการตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI และ<br />
แยกขนาดดวยเทคนิค Pulsed-field gel electrophoresis โดยมี<br />
lambda ladder PFG marker (M) เปนดีเอ็นเอมาตรฐานใช<br />
เปรียบเทียบขนาด 36<br />
(3)
สารบัญภาพ (ตอ)<br />
ภาพที่<br />
หนา<br />
6 Dendogram จากการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum ที่ตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI และนํามาแยก<br />
ขนาดโดยเทคนิค Pulsed-field gel electrophoresis แสดงความ<br />
สัมพันธระหวางเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum สายพันธุตางๆ<br />
37<br />
7 ลักษณะลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum<br />
ไบโอวาร 3 สายพันธุตางๆ<br />
ที่ไดจากการตัดดวยเอนไซม<br />
SpeI และ<br />
แยกขนาดดวยเทคนิค Pulsed-field gel electrophoresis โดยมี<br />
lambda ladder PFG marker (M) เปนดีเอ็นเอมาตรฐานใช<br />
เปรียบเทียบขนาด 39<br />
8 Dendogram จากการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ.<br />
Ralstonia solanacearum ที่ตัดดวยเอนไซม<br />
SpeI และนํามาแยก<br />
ขนาดโดยเทคนิค Pulsed-field gel electrophoresis แสดงความ<br />
สัมพันธระหวางเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum สายพันธุตางๆ<br />
40<br />
9 Dendogram จากการวิเคราะหรวมกันระหวางลายพิมพจีโนมิค<br />
ดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum ที่ตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI<br />
และ SpeI แสดงความสัมพันธระหวางเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum<br />
สายพันธุตางๆ<br />
42<br />
(4)
ลักษณะลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อแบคทีเรีย<br />
Ralstonia solanacearum<br />
ไบโอวาร 3 ในประเทศไทยโดยเทคนิค Pulsed-Field Gel Electrophoresis<br />
Genomic DNA Fingerprinting of Ralstonia solanacearum Biovar 3 in Thailand by<br />
Pulsed-Field Gel Electrophoresis<br />
คํานํา<br />
โรคเหี่ยวของพืชที่เกิดจากเชื้อแบคทีเรีย<br />
Ralstonia solanacearum จัดเปนโรคพืชที่มีความ<br />
สําคัญมากชนิดหนึ่ง<br />
เนื่องจากพืชเศรษฐกิจหลายชนิดในพื้นที่ตางๆ<br />
ทั่วโลกที่เปนโรคนี้แลวสวน<br />
ใหญเกิดความเสียหายอยางรุนแรงแกพืชจนไมสามารถเก็บผลผลิตได นอกจากนี้การที่เชื้อสามารถ<br />
ติดไปกับเมล็ด ทอนพันธุ<br />
และหัวพันธุได<br />
จึงเปนปญหาสําคัญของเกษตรกรหรือผูสงออกสินคา<br />
เกษตรที่ไมสามารถสงสินคาไปยังตางประเทศได<br />
เพราะเชื้อชนิดนี้เปนศัตรูสําคัญกับพืชมากกวา<br />
200 ชนิด (species) และอยูในรายชื่อการกักกันเชื้อโรคพืชระหวางประเทศ<br />
ดวยเหตุนี้<br />
R.<br />
solanacearum จึงเปนเชื้อแบคทีเรียอีกชนิดหนึ่งที่มีการศึกษากันมาก<br />
เพื่อหาวิธีการในการควบคุม<br />
โรคที่เกิดจากเชื้อนี้<br />
ในประเทศไทยพบวาเชื้อชนิดนี้เปนสาเหตุโรคเหี่ยวของพืชหลายชนิดในวงศ<br />
Solanaceae เชน มะเขือเทศ มันฝรั่ง<br />
พริก ยาสูบ และพืชในวงศอื่น<br />
เชน ถั่วลิสง<br />
ขิง งา ปทุมมา และ<br />
ดาวเรือง จัดจําแนกเชื้ออยูใน<br />
race 1 ไบโอวาร 3 และ 4 โดยพบเชื้อไบโอวาร<br />
3 มากกวาไบโอวาร 4<br />
(ศุทธนา, 2543)<br />
การจัดจําแนกเชื้อที่ใชกันมากในปจจุบันคือ<br />
การจัดแบงกลุมเปน<br />
5 races ตามชนิดของพืช<br />
อาศัย และ 5 ไบโอวาร (biovar) ตามความสามารถในการใชน้ําตาลของเชื้อ<br />
(Buddenhagen et al.,<br />
1962; Hayward, 1964) แตเนื่องจากการจัดแบงเชื้อเปนไบโอวารซึ่งเปนลักษณะทางดานสรีรวิทยามี<br />
ความผันแปรงายในการทดสอบและใชเวลานาน จึงมีการนําเอาเทคนิคทางดานอณูชีววิทยามาใชใน<br />
การศึกษาลักษณะทางพันธุกรรมซึ่งมีความผันแปรนอยกวา<br />
ทําใหจําแนกเชื้อไดแมนยํายิ่งขึ้น<br />
นอก<br />
จากนี้ยังใชประโยชนในการศึกษาความผันแปรทางพันธุกรรมของเชื้อซึ่งเปนปญหาสําคัญตอการ<br />
จัดการโรคและการปรับปรุงพืชพันธุตานทาน<br />
1
จากการศึกษาความผันแปรทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R. solanacearum ในประเทศไทยดวย<br />
เทคนิค repetitive sequence PCR และ PCR-RFLP พบวาการจัดกลุมเชื้อไมมีความสัมพันธกับการ<br />
จําแนกไบโอวาร พืชอาศัย และแหลงที่มาของเชื้อ<br />
(ศุทธนา, 2543; Thammakijjawat et al., 2001)<br />
ดังนั้นวัตถุประสงคในการทดลองนี้คือ<br />
เพื่อประเมินความผันแปรทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R.<br />
solanacearum ไบโอวาร 3 ซึ่งพบมากกวาไบโอวารอื่นๆ<br />
ในประเทศไทย โดยคาดหวังวาการ<br />
วิเคราะหลักษณะลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อที่ไดจากการตัดจีโนมิคดีเอ็นเอดวยเอนไซมตัด<br />
จําเพาะที่มีความถี่ในการตัดต่ํา<br />
แลวแยกขนาดโดยใชเทคนิค Pulsed-field gel electrophoresis<br />
(PFGE) จะสามารถจัดจําแนกเชื้อ<br />
สามารถประเมินความผันแปรทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
และนําขอ<br />
มูลการจัดแบงกลุมเชื้อมาใชประโยชนในการพัฒนาพืชพันธุตานทานตอโรคนี้ได<br />
วัตถุประสงค<br />
1. เพื่อศึกษาความผันแปรทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum ไบโอวาร 3<br />
สายพันธุในประเทศไทยโดยใชเทคนิค<br />
Pulsed-field gel electrophoresis<br />
2. เพื่อศึกษาความสัมพันธของลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่ไดจากเทคนิค<br />
Pulsed-field gel<br />
electrophoresis ของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum กับพืชอาศัย แหลงที่มา<br />
และการจัดแบงสายพันธุ<br />
เชื้อเปนไบโอวารในกลุมที่<br />
3<br />
2
การตรวจเอกสาร<br />
ลักษณะและคุณสมบัติของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum<br />
R. solanacearum เปนแบคทีเรียแกรมลบ รูปรางเปนทอนสั้นๆ<br />
ขนาดประมาณ 0.5-0.7 x<br />
1.5-2.0 ไมโครเมตร ตองการอากาศในการเจริญเติบโต ไมสรางสปอรและแคปซูล (capsule) เคลื่อน<br />
ที่ดวยหางที่อยูขางใดขางหนึ่ง<br />
(polar flagella) จํานวน 1-4 หาง ภายในเซลลมีการสรางสาร poly-βhydroxybutyrate<br />
ทําใหติดสีน้ําเงินหรือดําเมื่อยอมดวย<br />
Sudan Black B สรางเอนไซม catalase และ<br />
oxidase สามารถเปลี่ยนไนเตรทเปนไนไตรทได<br />
แตไมสามารถเจริญไดในอาหารที่มีความเขมขน<br />
ของโซเดียมคลอไรด 2% ขึ้นไป<br />
เชื้อไมเจริญที่อุณหภูมิ<br />
40 o ซ ไมยอยแปงและเจลาติน ไมสราง<br />
เอนไซม arginine dihydrolase และไมสราง indole โคโลนีของเชื้อไมเรืองแสงแตสามารถสรางเม็ด<br />
สีน้ําตาลละลายไดในอาหารเลี้ยงเชื้อ<br />
ลักษณะโคโลนีบนอาหาร tetrazolium medium<br />
(Kelman,1954) มี 2 ชนิดคือ โคโลนีของเชื้อสายพันธุที่รุนแรง<br />
(virulent) มีสีชมพูตรงกลาง ขอบสี<br />
ขาวขุน<br />
รูปรางโคโลนีไมแนนอน และโคโลนีของเชื้อสายพันธุที่ไมรุนแรง<br />
(avirulent) มีรูปรางกลม<br />
สีแดงเขม ขอบใสแตแคบ (Jones et al., 1991; Schaad et al., 2000)<br />
ในป 2002 Salanoubat et al. ศึกษาลําดับเบสของจีโนม R. solanacearum พบวาแบคทีเรีย<br />
ชนิดนี้มีจีโนมขนาด<br />
5.8 Mb ประกอบดวยดีเอ็นเอในสวนของโครโมโซม (chromosome) ขนาด 3.7<br />
Mb และสวนของพลาสมิด (megaplasmid) ขนาด 2.1 Mb โดยมีองคประกอบ G+C เทากับ 67.04%<br />
และ 66.86% ตามลําดับ ในสวนของจีโนมประกอบดวยยีนที่สามารถแปลรหัสเปนโปรตีนได<br />
5,129<br />
ชนิด โดยโครโมโซมของเชื้อ<br />
R. solanacearum แปลรหัสไดเปนกลุมของ<br />
housekeeping genes ได<br />
แก ยีนที่เกี่ยวของกับการจําลองตัวเองของดีเอ็นเอ<br />
การซอมแซมดีเอ็นเอและการแบงเซลล การแปล<br />
รหัสและถอดรหัสดีเอ็นเอ ดังนั้นยีนในโครโมโซมจึงเปนยีนที่เกี่ยวของกับกลไกพื้นฐานเพื่อการอยู<br />
รอดของเชื้อ<br />
สวน megaplasmid ประกอบดวยยีนที่เกี่ยวของกับเมตาบอลิซึมเชนเดียวกับที่พบใน<br />
โครโมโซม นอกจากนี้ยังพบเอนไซมที่ควบคุม<br />
primary metabolism หลายๆ ชนิดไดแก การ<br />
สังเคราะหกรดอะมิโน และ cofactor ซึ่งพบเฉพาะใน<br />
megaplasmid เทานั้น<br />
รวมทั้งยีน<br />
hrp ซึ่งมี<br />
ความสําคัญในกระบวนการเกิดโรค ยีนที่เกี่ยวของกับการสราง<br />
flagellum และการสังเคราะห<br />
exopolysaccharide ดังนั้นยีนใน<br />
megaplasmid จึงมีหนาที่เกี่ยวของกับการปรับตัวของแบคทีเรียใน<br />
หลายๆ สภาพแวดลอม<br />
3
ลักษณะอาการของโรค<br />
อาการของโรคในพืชวงศ Solanaceae เชน พริก มะเขือ มะเขือเทศ มันฝรั่ง<br />
และวงศอื่น<br />
เชน<br />
ขิง เริ่มแรกใบแกสวนลางของตนเหี่ยว<br />
ปลายลูลงในตอนกลางวันที่อากาศรอนและกลับเปนดังเดิม<br />
ในเวลากลางคืน อาการเหี่ยวจะรุนแรงมากขึ้นจนในที่สุดจะเหี่ยวอยางถาวรและแหงตาย<br />
ในตนที่<br />
ออนแอพืชจะตายทั้งๆ<br />
ที่ยังเขียวอยู<br />
สวนในพืชที่แข็งแรงหรือมีความตานทานตอโรคอาจแสดง<br />
อาการเหี่ยวเล็กนอยหรือแคระแกร็นเจริญเติบโตชาลงเทานั้น<br />
และพบวาในมะเขือเทศที่เปนโรคมี<br />
การสรางรากลอย (adventitious root) จํานวนมากบริเวณโคนตน อาการที่เหมือนกันในพืชที่เปน<br />
โรคเหี่ยวคือเมื่อตัดลําตนบริเวณโคนออกดูจะเห็นสวนทอน้ําทออาหารเนาเปนวงสีน้ําตาลทําให<br />
เรียกโรคเหี่ยวอีกชื่อคือ<br />
โรคเนาสีน้ําตาล<br />
(brown rot) ปลอยไวสักครูจะมีเมือกเหนียวของแบคทีเรีย<br />
(bacterial ooze) สีขาวขุนซึมออกมาตรงรอยตัด<br />
(ศักดิ์,<br />
2537) สําหรับพืชหัวบางชนิด เชน มันฝรั่ง<br />
ปทุมมา เมื่อเชื้อเขาทําลายหัวพันธุอาการที่เกิดบนหัวมันฝรั่งและหัวปทุมมาจะนิ่มในระยะแรก<br />
หลัง<br />
จากเชื้อเขาทําลายเนื้อเยื่อภายในแลวจะเกิดอาการเนาขึ้น<br />
เมื่อผาหัวมันฝรั่งตามขวางจะเห็นสวนที่<br />
เปนทอน้ําทออาหารมีสีน้ําตาลเขมและมีเมือกของแบคทีเรียไหลซึมออกมารอบๆ<br />
บริเวณทอน้ําทอ<br />
อาหารเปนสีขาวขุนคลายน้ํานม<br />
(ปยรัตน, 2541; วนิดา, 2542)<br />
พืชอาศัยของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum<br />
พืชที่เชื้อ<br />
R. solanacearum สามารถเขาทําลายและกอใหเกิดโรคไดมีมากกวา 200 ชนิด<br />
และพบวาพืชที่เปนโรคเหี่ยวงายและรุนแรงคือพืชในวงศ<br />
Solanaceae เชน มะเขือเทศ มันฝรั่ง<br />
ยาสูบ<br />
และพริก นอกจากนี้ยังมีพืชวงศถั่ว<br />
(Leguminosae) เชน ถั่วลิสง<br />
ถั่วพุม<br />
ในพืชใบเลี้ยงเดี่ยว<br />
เชน ขิง<br />
กลวย เปนตน (Hayward, 1994a) สําหรับประเทศไทยพืชอาศัยของเชื้อ<br />
R. solanacearum ในกลุม<br />
พืชผัก ไดแก มะเขือเทศ มะเขือยาว มะเขือพวง มะเขือไขนก มะเขือมวง พริกขี้หนู<br />
พริกหยวก พริก<br />
ชี้ฟา<br />
พริกหนุม<br />
พริกเหลือง ถั่วพู<br />
ผักชีฝรั่ง<br />
ขิง และผักบุงจีน<br />
พืชอาศัยในกลุมพืชน้ํามัน<br />
ไดแก ถั่ว<br />
ลิสง งา ละหุง<br />
และพืชอาศัยในกลุมของไมดอกไมประดับ<br />
ไดแก ปทุมมา (บัวสวรรค) ธรรมรักษา<br />
(เฮลิโคเนีย) ดาวเรือง และฤาษีผสม (วนิดา, 2542)<br />
4
การแพรระบาดและการดํารงชีพของเชื้อ<br />
เชื้อ<br />
R. solanacearum เปนแบคทีเรียที่อาศัยอยูในดิน<br />
(soil borne) และเขาทําลายพืชทาง<br />
บาดแผลซึ่งอาจเกิดจากการเขตกรรมหรือชองเปดธรรมชาติ<br />
เชน ชวงที่พืชงอกรากใหม<br />
หลังจากเชื้อ<br />
เขาไปในตนพืชแลวจะทวีจํานวนขึ้นในทอน้ําทออาหารและแพรไปตามสวนตางๆ<br />
ของพืชไดอยาง<br />
รวดเร็ว ในพืชที่ออนแอตอเชื้อจะแสดงอาการเหี่ยวภายใน<br />
4 วัน เชื้อแบคทีเรียจะเริ่มออกมาสูดิน<br />
หลังจากพืชเริ่มแสดงอาการแลวและสามารถเขาทําลายพืชตนขางเคียงไดใหม<br />
การแพรระบาดของ<br />
โรคนี้ไปไดไมไกล<br />
นอกจากจะมีการใหน้ําแบบไหลตามรองหรือสภาพที่ฝนตกหนักจนมีน้ําไหลไป<br />
ตามที่ตางๆ<br />
(ประสาทพร, 2527) นอกจากนี้ปจจัยอื่นที่มีผลตอการแพรระบาดของเชื้อ<br />
ไดแก การ<br />
เคลื่อนยายเมล็ดหรือสวนขยายพันธุ<br />
แมลงพาหะ ไสเดือนฝอย เปนตน เชื้อ<br />
R. solanacearum อยูขาม<br />
ฤดูในดินไดเปนเวลานานถึง 4 ป โดยปราศจากพืชอาศัยในสภาพ saprophyte เมื่อมีพืชอาศัยที่เหมาะ<br />
สมสามารถปรับตัวเขาทําลายพืชตอไป (McCarter, 1976) โดยเชื้อมีชีวิตอยูรอดขามฤดูไดในบริเวณ<br />
รากพืช (rhizosphere) ของวัชพืช (Hayward, 1991) รายงานของวนิดาและคณะ (2534) พบวาเชื้อมี<br />
ชีวิตอยูรอดในดินเหนียวที่มีสภาพความเปนกรด-ดาง<br />
6.9 ไดนาน 12 สัปดาห สวนในดินรวนเหนียว<br />
สภาพดินเปนดาง เชื้ออยูในดินไดนาน<br />
10 สัปดาห แตในดินรวนเหนียวปนทรายมีอินทรียวัตถุสูง<br />
และความเปนกรด-ดางปานกลาง เชื้ออยูไดนาน<br />
8 สัปดาห และพบวาเชื้ออยูไดในระดับลึก<br />
30<br />
เซนติเมตร ปริมาณของเชื้อนอยลงในระดับ<br />
60-75 เซนติเมตร สวนในระดับ 15 เซนติเมตร ไมพบ<br />
เชื้อเนื่องจากความแหงของดินเชนเดียวกับ<br />
Moffett et al. (1983) ซึ่งพบวาในสภาพดินที่แหงแลง<br />
ปริมาณประชากรของเชื้อไบโอวาร<br />
2 และ 3 ลดลง<br />
การจัดจําแนกเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum<br />
เชื้อ<br />
R. solanacearum เดิมชื่อ<br />
Pseudomonas solanacearum E.F. Smith (Smith, 1896) แต<br />
ตอมาในป 1992 Yabuuchi et al. ไดจัดเชื้ออยูในสกุลใหมคือ<br />
Burkholderia โดยใชผลการศึกษา<br />
เปรียบเทียบลักษณะทางฟโนไทป (Phenotype) องคประกอบของไขมัน (cellular lipid) และกรดไข<br />
มัน (fatty acid) การเขาคูกันของสายดีเอ็นเอโดยเทคนิคไฮบริไดเซชัน<br />
(DNA-DNA hybridization)<br />
และลําดับเบสของยีน 16S rRNA แลวเสนอตั้งชื่อใหมเปน<br />
Burkholderia solanacearum จากนั้นใน<br />
ป 1995 Yabuuchi et al. ไดเสนอใหแยก B. solanacearum ออกมาอยูในสกุลใหมคือ<br />
Ralstonia หลัง<br />
จากศึกษาลักษณะของฟโนไทป การวิเคราะหองคประกอบของไขมันและกรดไขมัน การศึกษา<br />
phylogenetic analysis ของลําดับเบสยีน 16S rDNA และ การใชเทคนิคนิวคลีอิคแอซิด ไฮบริไดเซ<br />
5
ชันของสายดีเอ็นเอของโครโมโซม แลวเปลี่ยนชื่อใหมเปน<br />
Ralstonia solanacearum เชื้อ<br />
R.<br />
solanacearum มีความหลากหลายทั้งลักษณะทางฟโนไทปและจีโนไทป<br />
(Genotype) การจัดแบงที่<br />
นิยมใชกันอยูทั่วไปคือ<br />
race และไบโอวาร โดยสามารถจัดจําแนกเชื้อเปน<br />
5 races ตามการเขา<br />
ทําลายชนิดของพืชอาศัย (Buddenhagen et al., 1962; He et al., 1983) ดังนี้<br />
ชนิดอื่น<br />
race 1 ทําลายพืชในวงศ Solanaceae และวัชพืช<br />
race 2 ทําลายพืชวงศ Musaceae (triploid banana) และเฮลิโคเนีย<br />
race 3 ทําลายมันฝรั่งและมะเขือเทศแตไมกอใหเกิดโรครุนแรงกับพืชในวงศ<br />
Solanaceae<br />
race 4 ทําลายพืชในวงศ Zingiberaceae<br />
race 5 ทําลายหมอน (mulberry)<br />
และจัดจําแนกเชื้อเปน<br />
5 ไบโอวาร ตามความสามารถในการใชน้ําตาลไดแซคคาไรด<br />
และ<br />
น้ําตาลเฮกโซสแอลกอฮอล<br />
(Hayward, 1964) ดังแสดงในตารางที่<br />
1 สําหรับเชื้อ<br />
R. solanacearum ที่<br />
พบในประเทศไทยจัดจําแนกเชื้ออยูใน<br />
race 1 ไบโอวาร 3 และ 4 มีอัตราสวนของเชื้อไบโอวาร<br />
3<br />
มากกวาไบโอวาร 4 (ศุทธนา, 2543)<br />
6
ตารางที่<br />
1 การจัดจําแนกไบโอวารของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum 1<br />
Utilization of Biovars<br />
1 2 3 4 5<br />
Mannitol - - + + +<br />
Sorbitol - - + + -<br />
Dulcitol - - + + -<br />
Lactose - + + - +<br />
Maltose - + + - +<br />
Cellobiose - + + - +<br />
1 Based on the data of Hayward (1964), Palleroni and Doudoroff (1971), He et al. (1983)<br />
and Hayward et al. (1990)<br />
ที่มา:<br />
Hayward (1994b)<br />
เทคนิค Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)<br />
เทคนิคทางดานอณูชีววิทยาเขามามีบทบาทในการศึกษาวิจัยดานโรคพืชอยางมากโดยใช<br />
ประโยชนในการตรวจวินิจฉัย การจําแนกเชื้อ<br />
ตลอดจนการศึกษาความผันแปรทางพันธุกรรมของ<br />
ประชากรเชื้อ<br />
PFGE เปนอีกเทคนิคหนึ่งที่ใชในการจําแนกเชื้อไดเปนอยางดีในแบคทีเรียหลายๆ<br />
ชนิด โดยวิธีนี้จีโนมของแบคทีเรียซึ่งมีขนาดประมาณ<br />
5,000 Kb เมื่อตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะที่มี<br />
ตําแหนงจดจํานอยจะใหแถบดีเอ็นเอประมาณ 10-30 แถบ ขนาดอยูในชวง<br />
10-800 Kb ซึ่งไม<br />
สามารถแยกขนาดไดดวยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสทั่วไป<br />
เพื่อใหสามารถแยกชิ้นดีเอ็นเอที่มีขนาดใหญ<br />
PFGE จึงพัฒนาขึ้นครั้งแรกโดย<br />
Schwartz and Cantor (1984)<br />
7
PFGE มีการออกแบบและพัฒนาขึ้นมาใหมหลายระบบดวยกัน<br />
สําหรับระบบที่ทําเปนการ<br />
คาและนิยมใชกันมี 4 แบบ ไดแก vertical pulsed field system ปจจุบันเรียกวา transverse<br />
alternating field electrophoresis (TAFE) (Gardiner and Patterson, 1986), Field inversion gel<br />
electrophoresis (FIGE) (Carle et al., 1986), Rotating gel (Southern et al., 1987) และ Contourclamped<br />
homogeneous electric field (CHEF) ซึ่งเปนระบบที่นิยมใชกันมากที่สุดและใชในการ<br />
ทดลองครั้งนี้<br />
ระบบพัฒนาขึ้นโดย<br />
Chu et al. (1986) ซึ่งใชสนามไฟฟาที่มีความสม่ําเสมอจากขั้ว<br />
ไฟฟาจํานวน 24 ขั้ว<br />
ที่เรียงอยูโดยรอบกลองรูปหกเหลี่ยม<br />
ศักยไฟฟาที่ผานเจลมีคาคงที่ตลอดเจล<br />
และสามารถกําหนดมุมหักเหระหวางสนามไฟฟาได CHEF มีประโยชนอยางมากในการแยก<br />
โมเลกุลดีเอ็นเอที่มีขนาดใหญ<br />
PFGE ตางจากเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสทั่วไปคือ<br />
สามารถใชสนามไฟฟามากกวาหนึ่งสนาม<br />
สลับไปมาในทิศทางที่ตางกันได<br />
ทําใหโมเลกุลดีเอ็นเอเปลี่ยนรูปรางเปนเสนตรงและเคลื่อนที่คลาย<br />
กับการเลื้อยของงู<br />
(ภาพที่<br />
1)<br />
8
A B<br />
ภาพที่<br />
1 หลักการทํางานของ Pulsed-field gel electrophoresis ระบบ Contour-clamped<br />
homogeneous electric field ประกอบดวยชุดขั้วไฟฟา<br />
A และ B โดยเมื่อใหกระแสไฟฟาที่<br />
ชุดขั้วไฟฟา<br />
A ดีเอ็นเอจะเคลื่อนที่จากขั้วลบไปทางดานขวาซึ่งเปนขั้วบวกดังแสดงในลูก<br />
ศรแรก เมื่อหยุดใหกระแสไฟฟาที่ชุดขั้วไฟฟา<br />
A และใหกระแสไฟฟาที่ชุดขั้วไฟฟา<br />
B<br />
ดีเอ็นเอจะกลับทิศทางและเคลื่อนที่จากขั้วลบไปขั้วบวก<br />
สลับทิศทางสนามไฟฟาเชนนี้ไป<br />
เรื่อยๆ<br />
ที่มา:<br />
Anonymous (1997)<br />
9
PFGE ทุกระบบมีหลักการทํางานเหมือนกันแตออกแบบใหมีจํานวนและการจัดเรียงตัว<br />
ของขั้วไฟฟาแตกตางกันทั้งนี้เพื่อใหสามารถแยกแถบดีเอ็นเอที่มีขนาดใหญได<br />
การแยกและการ<br />
เคลื่อนที่ของโมเลกุลดีเอ็นเอในเทคนิค<br />
PFGE ขึ้นอยูกับปจจัยหลายอยาง<br />
ดังนี้<br />
ระยะเวลาในการสลับทิศทางสนามไฟฟา (switching time หรือ pulse time) เนื่องจากการ<br />
แยกตัวออกของโมเลกุลดีเอ็นเอเปนสัดสวนโดยตรงกับเวลาที่ใชในการสลับทิศทางของสนามไฟ<br />
ฟากลาวคือ ดีเอ็นเอที่มีโมเลกุลขนาดใหญจะเคลื่อนที่ชากวาโมเลกุลขนาดเล็กเพราะตองใชเวลา<br />
นานเพื่อหมุนและยืดสายดีเอ็นเอภายใตสนามไฟฟา<br />
ดีเอ็นเอโมเลกุลใหญจึงใชเวลาในการสลับทิศ<br />
ทางมากกวาโมเลกุลขนาดเล็ก ดังนั้นการเลือกใชเวลาในการสลับทิศทางของสนามไฟฟาจึงควร<br />
พิจารณาใหเหมาะสมกับขนาดของโมเลกุลดีเอ็นเอ<br />
ระดับความตางศักย (voltage gradients) ระดับความตางศักย หมายถึง ระดับความแตกตาง<br />
ของศักยไฟฟาระหวางขั้วไฟฟาในกลองเจลทําใหเกิดการขับเคลื่อนของโมเลกุลดีเอ็นเอ<br />
ในการ<br />
เลือกใชระดับความตางศักยที่เหมาะสมนั้นควรทราบขนาดดีเอ็นเอโดยคราวๆ<br />
กอน ดีเอ็นเอที่มี<br />
ขนาดใหญไมสามารถแยกขนาดไดในสภาวะที่มีความตางศักยไฟฟาสูง<br />
ทั้งนี้ควรพิจารณาให<br />
สัมพันธกับเวลาที่ใชในการสลับทิศทางสนามไฟฟาดวย<br />
กลาวคือหากใชความตางศักยไฟฟาต่ําควร<br />
ใชเวลาในการสลับทิศทางสนามไฟฟาใหนานขึ้น<br />
ความเขมขนของเจล (agarose concentration) ความเขมขนของเจลเปนอีกปจจัยหนึ่งที่มีผล<br />
ตอความเร็วในการเคลื่อนที่และการแยกตัวของโมเลกุลดีเอ็นเอ<br />
การใชเจลอะกาโรสที่มีความเขมขน<br />
สูงทําใหขนาดรูพรุน (pore) ภายในเจลเล็กลงกวาเจลอะกาโรสความเขมขนต่ํา<br />
โมเลกุลของดีเอ็นเอ<br />
จึงเคลื่อนที่ผานรูพรุนไดชา<br />
ดังนั้นเมื่อเปลี่ยนความเขมขนของเจลอะกาโรสจึงควรเปลี่ยนเวลาที่ใช<br />
ในการสลับทิศทางสนามไฟฟาดวย โดยทั่วไปหากตองการแยกดีเอ็นเอขนาด<br />
1-2,500 kb จะใชเจล<br />
อะกาโรสความเขมขน 1% แตหากตองการแยกดีเอ็นเอขนาดใหญกวานี้ควรใชเจลอะกาโรสความ<br />
เขมขน 0.7% หรือ 0.8%<br />
อุณหภูมิ (running temperature) การทํางานของเครื่อง<br />
PFGE นั้น<br />
ตองมีการไหลเวียนของ<br />
บัฟเฟอรตลอดเวลาเพื่อรักษาอุณหภูมิทั้งระบบใหเทากันตลอด<br />
โดยทั่วไป<br />
PFGE จะทําที่อุณหภูมิต่ํา<br />
ในชวง 4-15 o ซ ดีเอ็นเอจะเคลื่อนที่ไดเร็วที่อุณหภูมิสูงแตการกระจายตัวในการแยกขนาดของ<br />
โมเลกุล (resolution) จะลดลงตรงกันขามกับอุณหภูมิต่ําที่ดีเอ็นเอจะเคลื่อนที่ชาแตการแยกขนาด<br />
10
ของดีเอ็นเอจะดี ดังนั้นอัตราการเคลื่อนที่ของโมเลกุลดีเอ็นเอจึงขึ้นอยูกับอุณหภูมิดวย<br />
หากเปลี่ยน<br />
แปลงอุณหภูมิที่ใชก็ตองเปลี่ยนเวลาในการสลับทิศทางสนามไฟฟาดวย<br />
นั่นคือ<br />
ถาลดอุณหภูมิที่ใช<br />
ในระบบลงจะตองเพิ่มเวลาที่ใชในการสลับทิศทางสนามไฟฟา<br />
อุณหภูมิที่เหมาะสมระหวาง<br />
ความเร็วในการเคลื่อนที่และการหมุนตัวของโมเลกุลดีเอ็นเอคือ<br />
14 o ซ นอกจากนี้อุณหภูมิหองก็มี<br />
ผลตอการแยกขนาดดีเอ็นเอเชนเดียวกันโดยอุณหภูมิหองที่เหมาะสมอยูในชวง<br />
18-24 o ซ ซึ่ง<br />
สามารถลดปญหาความรอนที่เกิดขึ้นในระหวางการไหลเวียนของบัฟเฟอรได<br />
บัฟเฟอร (running buffer) สวนประกอบของบัฟเฟอรมีผลตอการเคลื่อนที่และการกระจาย<br />
ตัวของโมเลกุลดีเอ็นเอ โดยดีเอ็นเอเคลื่อนตัวไดเร็วในบัฟเฟอรที่ความเขมขนของประจุไฟฟา<br />
(ionic strength) ต่ํา<br />
การเลือกบัฟเฟอรจึงควรคํานึงถึงความเร็วในการแยกตัวของโมเลกุลดีเอ็นเอ<br />
และความจุของบัฟเฟอร (buffer capacity) ดวย นิยมใช 1X TAE (Tris-acetate EDTA) สําหรับแยก<br />
ดีเอ็นเอที่มีขนาดใหญกวา<br />
2 Mb และใช 1X TBE (Tris-borate EDTA) แยกดีเอ็นเอที่มีขนาดเล็กกวา<br />
2 Mb<br />
มุมในการกลับทิศทางการเคลื่อนที่ของดีเอ็นเอ<br />
(reorientation angles) มุมที่ใชในการกลับ<br />
ทิศทางการเคลื่อนที่ของดีเอ็นเอควรมากกวา<br />
100 องศา มุมมาตรฐานที่ใชคือ<br />
120 องศา สําหรับ<br />
ดีเอ็นเอที่มีขนาดเล็กกวา<br />
2 Mb ควรใชมุม 120 องศา สวนดีเอ็นเอที่มีขนาดใหญกวา<br />
2 Mb ตองลด<br />
มุมในการกลับทิศทางการเคลื่อนที่ของดีเอ็นเอลงเนื่องจากดีเอ็นเอเคลื่อนที่ในมุมแคบไดดีกวามุม<br />
กวาง<br />
ระยะเวลาที่ใช<br />
(duration of gel runs) การเพิ่มเวลาในการทดลองทําใหสามารถแยกโมเลกุล<br />
ดีเอ็นเอออกจากกันและเห็นแถบดีเอ็นเอไดชัดเจนขึ้น<br />
แตมักไมชวยใหเกิดการแยกตัวของแถบดีเอ็น<br />
เอที่มีขนาดใหญที่อยูตรงสวนบนของเจล<br />
ปญหานี้แกไขไดโดยเปลี่ยนแปลงเวลาที่ใชในการสลับ<br />
ทิศทางสนามไฟฟา (Birren and Lai, 1993)<br />
ในปจจุบันมีการนําเทคนิค PFGE มาใชประโยชนในการกําหนดจํานวนและขนาดของ<br />
โครโมโซม นอกจากนี้มีหลายรายงานดวยกันที่นํามาใชในการศึกษาการจัดเรียงตัวของจีโนม<br />
การ<br />
จําแนกสายพันธุ<br />
และความหลากหลายทางพันธุกรรมเพื่อใชในการวินิจฉัยการแพรระบาดซึ่ง<br />
สามารถใชไดดีในแบคทีเรียทั่วๆ<br />
ไปรวมทั้งแบคทีเรียสาเหตุโรคพืช<br />
ตัวอยางเชน<br />
11
ในป 1989 Cooksey and Graham ศึกษาความสัมพันธทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
Pseudomonas<br />
syringae และ Xanthomonas campestris โดยใชขอมูลลายพิมพดีเอ็นเอที่ไดจาก<br />
field inversion gel<br />
electrophoresis พบวาสามารถแบง P. s. tomato ออกเปน 2 กลุม<br />
และลายพิมพดีเอ็นเอที่ไดแตกตาง<br />
จาก P. syringae pathovar อื่นๆ<br />
ในขณะที่<br />
X. c. vesicatoria ใหลายพิมพดีเอ็นเอเหมือนกันทั้งหมด<br />
นอกจากนี้<br />
Romling and Tummler (1991) ยังใชประโยชนจาก two-directional pulsed-field gel<br />
electrophoresis ในการทําแผนที่จีโนมของเชื้อ<br />
Pseudomonas aeruginosa สายพันธุ<br />
PAO เชนเดียว<br />
กันกับ Tseng et al. (1999) ที่ใช<br />
PFGE ในการทําแผนที่โครโมโซมของเชื้อ<br />
Xanthomonas<br />
campestris pv. campestris<br />
เชื้อแบคทีเรียสาเหตุโรคพืชที่มีรายงานการใชเทคนิค<br />
PFGE เพื่อจําแนกสายพันธุคือ<br />
Erwinia amylovora โดย Zhang and Guider (1997) กับ Coplin et al. (2002) ที่สามารถแยกความ<br />
แตกตางของ Pantoea stewartii จาก Erwinia และ Pantoea spp. อื่นๆ<br />
ได ในขณะที่<br />
Davis et al.<br />
(1997) ไดศึกษาความผันแปรทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
Xanthomonas albilineans สาเหตุโรคใบลวก<br />
ของออยจํานวน 218 ไอโซเลต จากแหลงปลูกออย 31 แหลง โดยดูจากลายพิมพดีเอ็นเอของเชื้อที่<br />
เกิดจากการตัดจีโนมิคดีเอ็นเอดวยเอนไซมตัดจําเพาะ SpeI แลวแยกวิเคราะหดวยเทคนิค PFGE พบ<br />
วาโรคใบลวกที่พบแพรระบาดในรัฐฟลอริดาเกิดจากการนําเขาเชื้อจากแหลงอื่น<br />
นอกจากนี้เทคนิค<br />
PFGE ยังถูกนําไปใชในการศึกษาความสัมพันธของเชื้อ<br />
X. campestris สายพันธุที่ทําใหเกิดโรคกับ<br />
สม (Egel et al., 1991) รวมทั้งการประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมของ<br />
Acidovorax avenae<br />
subsp. citrulli โดย Walcott et al. (2000) ซึ่งพบวา<br />
สามารถแบงเชื้อออกเปน<br />
2 กลุม<br />
ไดแก กลุมที่<br />
1<br />
ประกอบดวยสายพันธุที่แยกไดจากแคนตาลูปและฟกทอง<br />
และกลุมที่<br />
2 ประกอบดวยสายพันธุที่<br />
แยกไดจากแตงโม<br />
ความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum<br />
การประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R. solanacearum ในระดับโมเลกุลทํา<br />
ใหสามารถเขาใจถึงวิวัฒนาการและการแพรกระจายของเชื้อในสภาพภูมิประเทศตางๆ<br />
(geographical distribution) ไดดี ดังนั้นในปจจุบันจึงมีรายงานการใชเทคนิคทางอณูชีววิทยาในการ<br />
ศึกษาแบคทีเรียสาเหตุโรคพืชเปนจํานวนมาก<br />
12
สําหรับเชื้อ<br />
R. solanacearum มีรายงานการใชเทคนิค restriction fragment length<br />
polymorphism (RFLP) ในการศึกษาวิวัฒนาการและวิเคราะหความสัมพันธทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R. solanacearum โดยใชดีเอ็นเอตัวตรวจที่มีความจําเพาะตอยีนที่เกี่ยวของกับความรุนแรงและการ<br />
ตอบสนองแบบเฉียบพลัน (virulence and the hypersensitive response) พบวาสามารถแบงเชื้อออก<br />
เปน 2 ดิวิชั่น<br />
(division) ตามแหลงที่มาคือ<br />
division I Asiaticum ประกอบดวยไบโอวาร 3, 4 และ 5<br />
ซึ่งพบในแถบทวีปเอเชีย<br />
และ division II Americanum ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
1, 2 และ N2 ซึ่ง<br />
พบในแถบทวีปอเมริกา (Cook et al., 1989; Cook and Sequeira, 1994) ตอมามีการศึกษาโดยใชขอ<br />
มูลลําดับเบสของยีน 16S rRNA ในการจัดกลุม<br />
พบวาใหผลสอดคลองกับการจัดแบงกลุมของ<br />
Cook<br />
et al. (1989) (Li et al., 1993; Seal et al., 1993; Tagavi et al., 1996) นอกจากนี้ยังมีรายงานการออก<br />
แบบไพรเมอร (primer) จากลําดับเบสของยีนตางๆ เพื่อใชในการวิเคราะหความสัมพันธทาง<br />
พันธุกรรมของเชื้อ<br />
R. solanacearum เชน ไพรเมอรที่ออกแบบจากลําดับเบสที่อยูระหวางยีน<br />
(intergenic spacer region; ITS) 16S rRNA และ 23S rRNA ลําดับเบสของยีนโพลีกาแลคตูโรเนส<br />
(polygalacturonase) และเอ็นโดกลูคาเนส (endoglucanase) พบวาสามารถจัดแบงเชื้อออกเปน<br />
2<br />
ดิวิชั่น<br />
เชนเดียวกับ Cook et al. (1989) และแบงเปนดิวิชั่นยอย<br />
(subdivision) ที่ประกอบดวยเชื้อ<br />
R. solanacearum สายพันธุจากประเทศอินโดนีเซีย<br />
(Gillings and Fahy, 1993; Fegan et al., 1998)<br />
การศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R. solanacearum สายพันธุจากประเทศ<br />
แถบแอฟริกา อเมริกา และเอเชีย ดวยเทคนิค AFLP และ PCR-RFLP โดยใชไพรเมอรที่ออกแบบ<br />
จากลําดับเบสของยีน hrp ของ Poussier et al. (1999, 2000) ยืนยันผลการจัดแบงกลุมของ<br />
Cook et<br />
al. (1989) ซึ่งแบงเชื้อออกเปน<br />
2 ดิวิชั่น<br />
และในการทดลองนี้สามารถจัดเชื้อไบโอวาร<br />
1 สายพันธุ<br />
จากแอฟริการวมอยูในดิวิชั่น<br />
Asiaticum ดังนั้นเชื้อสายพันธุจากแอฟริกานาจะมีการแยกสาย<br />
วิวัฒนาการมาจากเชื้อไบโอวาร<br />
1 อื่นๆ<br />
ซึ่งมีสายพันธุดั้งเดิมมาจากอเมริกา<br />
รายงานการศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R. solanacearum race 1 ใน<br />
ไตหวัน โดย Jaunet and Wang (1999) ใชเทคนิค rep-PCR และ random amplified polymorphic<br />
DNA (RAPD) จัดกลุมเชื้อได<br />
14 และ 13 กลุม<br />
ตามลําดับ การจัดกลุมเชื้อไมมีความสัมพันธกับ<br />
ไบโอวาร แหลงที่มา<br />
และ aggressiveness ในป 2001 Lee et al. ใชเทคนิค RFLP ศึกษาความหลาก<br />
หลายทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
โดยใช insertion sequence เปนตัวตรวจ พบวา R. solanacearum<br />
race 1 ในไตหวันมีความผันแปรทางพันธุกรรมสูง<br />
13
ในประเทศญี่ปุน<br />
Tsuchiya and Horita (1998) ใชเทคนิค RFLP และ PCR-RFLP โดยใช<br />
ไพรเมอรที่เปนลําดับเบสของ<br />
16S และ/หรือ 23S rDNA ศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของ<br />
เชื้อ<br />
R. solanacearum พบวาเชื้อ<br />
race 1 ไบโอวาร 1-4 ของประเทศญี่ปุนมีลายพิมพดีเอ็นเอเหมือน<br />
กับเชื้อ<br />
R. solanacearum ไบโอวาร 3, 4 และ 5 ที่มาจากประเทศอื่นๆ<br />
ในเอเชีย และ R.<br />
solanacearum race 3 ไบโอวาร 2 ของญี่ปุนมีลายพิมพดีเอ็นเอเหมือนกับเชื้อไบโอวาร<br />
1 จาก<br />
ประเทศสหรัฐอเมริกาและเชื้อสาเหตุโรค<br />
BDB ที่แยกจากกลวย<br />
ทั้ง<br />
2 เทคนิคสามารถจัดแบงเชื้อได<br />
เปน 2 กลุมใหญคือ<br />
กลุมที่<br />
1 ประกอบดวยเชื้อ<br />
race 1 ไบโอวาร 1-4 กลุม<br />
2 ประกอบดวย race 3 ไบ<br />
โอวาร 2 โดยเทคนิค RFLP และ rep-PCR แบงกลุมที่<br />
1 เปนกลุมยอยไดอีก<br />
7 และ 4 กลุม<br />
ตามลําดับ<br />
การแบงกลุมมีความสัมพันธกับ<br />
race ไบโอวาร การเกิด HR บนยาสูบ และแหลงที่มา<br />
นอกจากนี้ราย<br />
งานของ Horita and Tsuchiya (2001) ในการประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R.<br />
solanacearum ในญี่ปุนดวยการทดสอบความสามารถในการทําใหเกิดโรค<br />
(pathogenicity test) และ<br />
rep-PCR สามารถแบงกลุมของเชื้อตามลายพิมพดีเอ็นเอไดดังนี้<br />
ไบโอวาร N2 แบงเปน 2 กลุม<br />
กลุม<br />
ที่<br />
1 ประกอบดวยเชื้อ<br />
race 3 ซึ่งแยกไดจากมันฝรั่ง<br />
และกลุมที่<br />
2 ประกอบดวยเชื้อ<br />
race 1 ซึ่งแยกได<br />
จากมะเขือเทศ มะเขือยาว พริก และมันฝรั่ง<br />
เชื้อไบโอวาร<br />
3 แบงไดเปน 5 กลุม<br />
และเชื้อไบโอวาร<br />
4<br />
มีเพียงกลุมเดียว<br />
เมื่อวิเคราะหความสัมพันธทางพันธุกรรมสามารถแบงออกเปน<br />
2 กลุมคือ<br />
กลุมที่<br />
1<br />
ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
3, 4 และ 5 เชื้อไบโอวาร<br />
1 จาก Reunion และไบโอวาร N2 บางสาย<br />
พันธุจากญี่ปุน<br />
กลุมที่<br />
2 ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
1, 2 และ N2<br />
การศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R. solanacearum race 3 ไบโอวาร 2 ใน<br />
เคนยา โดย Smith et al. (1995) ดวยเทคนิค rep-PCR และ rare-cutting restriction enzyme pulsed<br />
field gel electrophoresis (RC-PFGE) พบวาเมื่อวิเคราะหดวยเทคนิค<br />
RC-PFGE เชื้อจากเคนยาให<br />
ลายพิมพดีเอ็นเอได 10 รูปแบบ ในขณะที่เชื้ออางอิงจากตางประเทศ<br />
19 ประเทศ ผลิตลายพิมพดี<br />
เอ็นเอได 27 รูปแบบ เมื่อใช<br />
ไพรเมอร ERIC และ BOX พบวาไมเห็นความแตกตางภายในประชา<br />
กรของเชื้อจากเคนยาแตสามารถแยกความแตกตางในเชื้ออางอิงโดยใหลายพิมพ<br />
2 แบบแตกตางกัน<br />
ในปตอมา Frey et al. (1996) ศึกษา Burkholderia solanacearum race 1 จากแหลงตางๆ ใน French<br />
West Indies ประเทศฝรั่งเศสดวยเทคนิค<br />
RC-PFGE, rep-PCR และชนิดของ bacteriocin พบวา RC-<br />
PFGE ใหความแตกตางของเชื้อดีที่สุดโดยใหลายพิมพดีเอ็นเอถึง<br />
17 รูปแบบ ในขณะที่<br />
rep-PCR<br />
ใหลายพิมพดีเอ็นเอเพียง 9 รูปแบบ และ bacteriocin 9 กลุม<br />
เมื่อวิเคราะหความสัมพันธทางพันธุ<br />
กรรมทั้ง<br />
RC-PFGE และ rep-PCR สามารถจัดแบงเชื้อออกเปน<br />
6 กลุม<br />
ที่มีความสัมพันธกับไบโอ<br />
วารและกลุมของ<br />
bacteriocin<br />
14
Smith et al. (1998) รายงานการศึกษาลายพิมพดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
R. solanacearum สายพันธุ<br />
จากมาเลเซีย โบลิเวีย และอเมริกาใต ดวยเทคนิค macro-restriction pulsed-field gel electrophoresis<br />
(MR-PFGE) และ rep-PCR พบวาลายพิมพดีเอ็นเอของ R. solanacearum ไบโอวาร 3 และ 4 ที่แยก<br />
ไดจากถั่วลิสงในมาเลเซียและ<br />
R. solanacearum ไบโอวาร 1 กับ 2A ที่แยกไดจากมันฝรั่งในโบลิเวีย<br />
ใหผลเหมือนกันคือ มีความผันแปรทางพันธุกรรมสูงโดยเทคนิค MR-PFGE ใหลายพิมพดีเอ็นเอ<br />
หลากหลายมากกวาเทคนิค rep-PCR ในขณะที่ลายพิมพดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
R. solanacearum ที่แยกได<br />
จากมันฝรั่งในอเมริกาใตที่ไดจากเทคนิค<br />
rep-PCR แสดงความหลากหลายมากกวา MR-PFGE ในป<br />
เดียวกัน Van Der Wolf et al. (1998) ไดศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R.<br />
solanacearum race 3 สาเหตุโรค brown rot สายพันธุจากประเทศฝรั่งเศส<br />
เนเธอรแลนด และ<br />
ประเทศสหราชอาณาจักร ดวยเทคนิค AFLP, RC-PFGE และ rep-PCR การวิเคราะหผลดวยไพร<br />
เมอร ERIC และ BOX ใหความแตกตางของแตละสายพันธุที่นํามาทดสอบนอย<br />
สวนเทคนิค AFLP<br />
และ RC-PFGE สามารถแยกเชื้อ<br />
race 3 และ race 1 ออกจากกันไดอยางชัดเจน ลายพิมพดีเอ็นเอที่<br />
ไดไมมีความสัมพันธกับแหลงที่มา<br />
การศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของ R. solanacearum ซึ่งแยกไดจากขิงในฮาวาย<br />
ดวยเทคนิค AFLP โดย Yu et al. (2003) พบวา R. solanacearum สายพันธุที่แยกไดจากเฮลิโคเนีย<br />
และขิง มีคา similarity เทากับ 0.165 และมีคา similarity นอยเมื่อเทียบกับสายพันธุที่แยกจากพืช<br />
อาศัยอื่น<br />
โดย R. solanacearum ทั้ง<br />
55 สายพันธุซึ่งแยกไดจากขิงหลายๆ<br />
ฟารมในฮาวายมีความแตก<br />
ตางจากสายพันธุทองถิ่นคือ<br />
race 1 ที่แยกไดจากมะเขือเทศ<br />
และ race 2 ที่แยกไดจากเฮลิโคเนีย<br />
โดย<br />
R. solanacearum สายพันธุที่แยกไดจากขิงในฟารมที่มีการนําเขาขิงมีความหลากหลายมากที่สุด<br />
สําหรับในประเทศไทยมีรายงานการประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R.<br />
solanacearum ซึ่งจัดจําแนกอยูในไบโอวาร<br />
3 และ 4 ดวยเทคนิค rep-PCR โดยใชไพรเมอรที่เปน<br />
repetitive sequences 3 ชนิด คือ BOX, ERIC และ REP ผลการวิเคราะหขอมูลลายพิมพดีเอ็นเอที่<br />
ผลิตไดจากไพรเมอรทั้ง<br />
3 ชนิด แสดงใหเห็นวาเชื้อ<br />
R. solanacearum สายพันธุตางๆ<br />
ในประเทศ<br />
ไทยมีความผันแปรทางพันธุกรรมสูง เชื้อไบโอวาร<br />
3 และ 4 จัดอยูในกลุมเดียวกันที่คา<br />
similarity<br />
มากกวา 0.40 และที่คา<br />
similarity 0.80 สามารถแยกสายพันธุที่แยกไดจากงาและปทุมมาออกมาจาก<br />
กลุมของพืชอาศัยอื่นๆ<br />
และจัดสายพันธุจากปทุมมารวมกลุมกับเชื้อบางสายพันธุที่แยกไดจากขิง<br />
ไม<br />
พบวามีความสัมพันธของลายพิมพดีเอ็นเอกับแหลงที่มาและพืชอาศัย<br />
(ศุทธนา, 2543)<br />
15
ในป 2001 Thammakijjawat et al. ทําการศึกษาความสัมพันธทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R.<br />
solanacearum ซึ่งแยกไดจากพืชอาศัยหลายชนิดในประเทศไทยและตางประเทศดวยเทคนิค<br />
PCR-<br />
RFLP สามารถแบงเชื้อออกเปน<br />
2 กลุม<br />
ที่คา<br />
similarity 13 % โดยกลุมที่<br />
1 ประกอบดวยกลุมยอยคือ<br />
กลุม<br />
A (ไบโอวาร 1/ race 1), กลุม<br />
B (ไบโอวาร 2/ race 3) และกลุม<br />
C (ไบโอวาร 1/ race 1 และ 2)<br />
ในขณะที่กลุม<br />
2 ประกอบดวยกลุม<br />
D (ไบโอวาร 3, 4/ race 1, ไบโอวาร N2 และ blood disease<br />
bacterium), กลุม<br />
E (ไบโอวาร 1/ race 1) และกลุม<br />
F (ไบโอวาร 1, 3, 4/ race 1 และ ไบโอวาร 5/<br />
race 5) โดย R. solanacearum ในไทย ไดแก race 1 ไบโอวาร 3 จัดอยูใน<br />
2 กลุม<br />
คือ กลุม<br />
D ซึ่ง<br />
ประกอบดวยสายพันธุจากพริก<br />
มะเขือเทศ และดาวเรือง และกลุม<br />
F ประกอบดวยสายพันธุจากงา<br />
สวนเชื้อ<br />
race 1 ไบโอวาร 4 จากขิงและปทุมมา จัดอยูในกลุม<br />
D และ race 3 ไบโอวาร 2 จากมันฝรั่ง<br />
จัดอยูในกลุม<br />
B การศึกษาตอมาใน R. solanacearum สายพันธุที่แยกไดจากพริกและพืชอาศัยอื่นๆ<br />
โดย Thammakijjawat et al. (2002) ดวยเทคนิค AFLP พบวาสามารถแยกเชื้อสายพันธุจากประเทศ<br />
ไทยออกจากสายพันธุจากมาเลเซียและไตหวันที่คา<br />
similarity 30 % โดยแบงสายพันธุจากประเทศ<br />
ไทยออกเปน 3 กลุม<br />
มีความสัมพันธกับไบโอวาร คือ กลุมที่<br />
1 ประกอบดวยไบโอวาร 3 ซึ่งแบง<br />
ออกเปน 2 กลุมยอย<br />
ไดแก 1a ประกอบดวยสายพันธุที่แยกจากพริก<br />
มะเขือเทศ มันฝรั่ง<br />
ยาสูบ<br />
ถั่วลิสง<br />
ดาวเรือง และ 1b ประกอบดวยสายพันธุที่แยกจากงา<br />
กลุมที่<br />
2 ประกอบดวยไบโอวาร 4 สาย<br />
พันธุที่แยกจากขิงและปทุมมา<br />
ในขณะที่กลุมที่<br />
3 ประกอบดวยไบโอวาร 2 ที่แยกจากมันฝรั่ง<br />
กลุมที่<br />
1 (ไบโอวาร 3) และ 2 (ไบโอวาร 4) มีความคลายคลึงกันกับกลุมที่<br />
3 ที่คา<br />
similarity นอยกวา 10 %<br />
16
อุปกรณและวิธีการ<br />
1. การตรวจสอบเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum และการจัดจําแนกไบโอวารของเชื้อ<br />
1.1 การเตรียมเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum และการเจริญเติบโตบนอาหารกึ่งจําเพาะ<br />
เชื้อ<br />
R. solanacearum ที่ใชในการศึกษาไดรับความอนุเคราะหจาก<br />
รศ. ดร. นิพนธ<br />
ทวีชัย ภาควิชาโรคพืช คณะเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร คุณณัฎฐิมา โฆษิตเจริญกุล กลุมงาน<br />
บักเตรีวิทยา กรมวิชาการเกษตร และ ผศ. ดร. เพชรรัตน ธรรมเบญจพล ภาควิชาโรคพืชวิทยา คณะ<br />
เกษตรศาสตร มหาวิทยาลัยขอนแกน ซึ่งแยกไดจากพืชอาศัยจากแหลงตางๆ<br />
ในประเทศไทยและ<br />
เก็บในรูปแชแข็งแหง (lyophilization) และในสารละลายกลีเซอรอล เชื้อที่เก็บไวในรูปแชแข็งแหง<br />
นํามาเลี้ยงในอาหารเหลว<br />
CPG (0.01% Casamino acid, 0.1% Peptone, 0.05% Glucose) เขยาที่<br />
อุณหภูมิ 28 O ซ นาน 24 ชั่วโมง<br />
จากนั้น<br />
streak บนอาหาร TZC (0.01% Casamino acid, 0.1%<br />
Peptone, 0.05% Glucose, 1% 2, 3, 5-triphenyl tetrazolium chloride) (Kelman, 1954) ซึ่งเปนอาหาร<br />
กึ่งจําเพาะของเชื้อ<br />
เพื่อยืนยันวาเปนเชื้อ<br />
R. solanacearum สังเกตลักษณะโคโลนีของเชื้อที่เจริญบน<br />
อาหาร สวนเชื้อที่เก็บในสารละลายกลีเซอรอล<br />
นํามา streak บนอาหาร TZC เชนเดียวกัน<br />
1.2 การจัดจําแนกไบโอวาร<br />
จัดจําแนกไบโอวารของเชื้อ<br />
โดยเลี้ยงเชื้อบนอาหาร<br />
CPG บมเชื้อนาน<br />
48 ชั่วโมง<br />
แลว<br />
ยายเชื้อลงเลี้ยงในอาหารที่มีสวนผสมของน้ําตาลความเขมขน<br />
10 % น้ําตาลที่ใชทดสอบมี<br />
6 ชนิด<br />
ไดแก maltose, lactose, cellobiose, dulcitol, mannitol และ sorbitol สังเกตการเปลี่ยนสีของ<br />
bromthymol blue ซึ่งเปนอินดิเคเตอรในอาหารเปนเวลา<br />
1-3 สัปดาห ถาเชื้อสามารถใชน้ําตาลไดจะ<br />
เปลี่ยนสีอาหารจากสีน้ําเงินอมเขียวเปนสีเหลือง<br />
เปรียบเทียบผลที่ไดตามวิธีการของ<br />
Hayward<br />
(1964)<br />
1.3 การทดสอบปฏิกิริยาการตอบสนองแบบเฉียบพลัน<br />
เลี้ยงเชื้อที่ใชในการทดสอบบนอาหาร<br />
CPG แลวบมไวที่อุณหภูมิ<br />
28 O ซ นาน 24<br />
ชั่วโมง<br />
จากนั้นเตรียมสารละลายเชื้อในน้ํากลั่นนึ่งฆาเชื้อ<br />
ปรับระดับความเขมขนของเชื้อ<br />
โดยใช<br />
17
Spectrophotometer ใหมีคาดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น<br />
600 นาโนเมตร เทากับ 0.2 ซึ่งมีเชื้อ<br />
ประมาณ 1x10 8 cfu./ml (จุฑาเทพ, 2544) แลวใชเข็มฉีดยาขนาด 1 มิลลิลิตร ฉีด (infiltrate) สาร<br />
ละลายเชื้อที่ไดเขาสูใบยาสูบอยางชาๆ<br />
ทางดานใตใบ ทําการทดลองเปรียบเทียบ (control) ตามวิธี<br />
ดังกลาวขางตน โดยใชน้ํากลั่นนึ่งฆาเชื้อฉีดแทนสารละลายเชื้อ<br />
สังเกตการเกิดปฏิกิริยาตอบสนอง<br />
อยางเฉียบพลัน (hypersensitive reaction, HR) ของยาสูบโดยลักษณะอาการของ HR คือ เกิดการ<br />
แหงตายของเนื้อเยื่อรอบบริเวณที่ฉีดสารละลายเชื้อภายใน<br />
24-48 ชั่วโมง<br />
ตามวิธีการของ Klement<br />
et al. (1990)<br />
2. การศึกษาความผันแปรทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum ดวยเทคนิค Pulsedfield<br />
gel electrophoresis<br />
2.1 การเตรียมจีโนมิคดีเอ็นเอ (genomic DNA)<br />
การเตรียมจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
R. solanacearum ดัดแปลงจากวิธีการของ Smith et<br />
al. (1995) โดยเลี้ยงเชื้อในอาหารเหลว<br />
CPG ปริมาตร 30 มิลลิลิตร เขยาที่อุณหภูมิ<br />
28 O ซ จากนั้นนํา<br />
มาวัดคาดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น<br />
600 นาโนเมตร เทากับ 0.2 แลวเติมคลอแรมฟนิคอล<br />
(chloramphenicol) ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร เพื่อขัดขวางการเริ่มจําลองตัวเองในรอบ<br />
ใหมของเชื้อ<br />
(Bruce and Lai, 1993) เขยาที่<br />
37 O ซ เปนเวลา 1 ชั่วโมง<br />
จากนั้นนําไปปนเหวี่ยงที่<br />
ความเร็ว 10,000 g นาน 5 นาที เพื่อเก็บตะกอนเซลล<br />
ลางตะกอนดวยบัฟเฟอร SE (75 mM NaCl,<br />
25 mM EDTA, pH 8.0) ปริมาตร 5 มิลลิลิตร 3 ครั้ง<br />
ละลายตะกอนดวยบัฟเฟอร SE ปริมาตร 300<br />
ไมโครลิตร แลวผสมกับอะกาโรสชนิดหลอมตัวที่อุณหภูมิต่ําความเขมขน<br />
2 % ในปริมาตรเทากัน<br />
ดูดสวนผสมที่เตรียมไดใสลงไปในแมพิมพ<br />
(mold) นําไปแชเย็นที่อุณหภูมิ<br />
4 O ซ นาน 15 นาที เพื่อ<br />
ใหเจลอะกาโรสแข็งตัว จากนั้นแชชิ้นอะกาโรสที่แข็งตัวแลว<br />
(plug) ใน lysis solution ปริมาตร 2<br />
มิลลิลิตร ซึ่งประกอบดวย<br />
proteinase K ความเขมขน 1.0 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร, 1% N-laurylsarcosine<br />
และ 100 mM EDTA pH 9.5 บมไวที่อุณหภูมิ<br />
56 O ซ ขามคืน แลวลางชิ้นอะกาโรสดวย<br />
TE (10 mM<br />
Tris, pH 8.0; 1 mM EDTA) ปริมาตร 10 มิลลิลิตร จํานวน 4 ครั้งๆ<br />
ละ 1 ชั่วโมง<br />
ที่อุณหภูมิหอง<br />
ถา<br />
หากตองการนําชิ้นอะกาโรสไปใชในการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะตอไป<br />
จะลางดวย TE ที่มี<br />
0.1<br />
mM phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) ในครั้งที่<br />
2 ของการลางเพื่อยับยั้งการทํางานของ<br />
proteinase K แชชิ้นอะกาโรสใน<br />
TE แลวเก็บรักษาไวที่อุณหภูมิ<br />
4 O ซ เพื่อใชในการทดลองตอไป<br />
ขั้นตอนการเตรียมจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
R. solanacearum แตละสายพันธุ<br />
เตรียมใหมทั้งหมด<br />
3<br />
18
ครั้ง<br />
และในการเตรียมแตละครั้งนํามาแยกขนาดดีเอ็นเอดวยเทคนิค<br />
Pulsed-field gel electrophoresis<br />
3 ซ้ํา<br />
2.2 การตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ<br />
การเลือกเอนไซมตัดจําเพาะที่เหมาะสมสําหรับศึกษาลักษณะลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอ<br />
ของเชื้อ<br />
R. solanacearum มีเกณฑที่ใชในการคัดเลือกคือ<br />
เปนเอนไซมตัดจําเพาะที่มีความถี่ในการ<br />
ตัดต่ําและเลือกใชเอนไซมที่มีตําแหนงจดจําเปน<br />
AT มาก (AT rich) สําหรับแบคทีเรียที่จีโนมมีองค<br />
ประกอบของ G+C สูง เนื่องจากจีโนมเชื้อ<br />
R. solanacearum มีองคประกอบของ G+C สูง (67%) ดัง<br />
นั้นเอนไซมตัดจําเพาะที่ใชในการคัดเลือกเบื้องตนจึงเปนเอนไซมที่มีตําแหนงจดจําเปน<br />
AT มาก<br />
ไดแก XbaI (TCTAGA), DraI (TTTAAA), SpeI (ACTAGT) และ SspI (AATATT) (Promega,<br />
Wisconsin, USA) โดยพบวาเอนไซม XbaI และ SpeI ใหผลดีที่สุด<br />
สามารถใหความแตกตางของ<br />
แถบดีเอ็นเอหรือเกิดโพลีมอรฟซึม (polymorphism) ของเชื้อแตละสายพันธุได<br />
ในขณะที่เอนไซม<br />
อื่นๆ<br />
ใหแถบดีเอ็นเอนอยและเกิดความแตกตางนอยกวาเอนไซม XbaI และ SpeI (ไมไดแสดงขอ<br />
มูล) จึงไดนําเอนไซมทั้งสองมาใชในการศึกษาลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
R. solanacearum<br />
ตอไป<br />
ขั้นตอนการตัดชิ้นอะกาโรสดวยเอนไซมตัดจําเพาะทําไดโดยแชชิ้นอะกาโรสจํานวน<br />
1 ชิ้นใน<br />
restriction buffer ที่แนะนําโดยบริษัทผูผลิตปริมาตร<br />
200 ไมโครลิตร ซึ่งมีเอนไซมตัด<br />
จําเพาะ XbaI 10 units บมไวที่อุณหภูมิ<br />
37 O ซ ขามคืน หลังจากนั้นลางชิ้นอะกาโรสดวย<br />
TE<br />
ปริมาตร 1 มิลลิลิตร นาน 30 นาที กอนนําไปทํา PFGE ตอไป และใชชิ้นอะกาโรสที่เตรียมไดในชุด<br />
เดียวกันนี้ในการศึกษาลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
R. solanacearum โดยตัดดวยเอนไซม SpeI<br />
ตามขั้นตอนของการตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI<br />
2.3 Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)<br />
ขั้นตอนของ<br />
PFGE ดัดแปลงจากวิธีการของ Smith et al. (1995) โดยนําชิ้นอะกาโรส<br />
ที่ตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะแลวใสในชองเจลซึ่งเตรียมโดยใชเจลอะกาโรสความเขมขน<br />
1% ใน<br />
1X TBE (88.9 mM Tris, 8.9 mM boric acid, 2.5 mM EDTA) และใช lambda ladder PFG marker<br />
(New England Biolabs, USA) เปนดีเอ็นเอมาตรฐาน จากนั้นปดทับชองเจลดวยเจลอะกาโรสชนิด<br />
19
หลอมตัวที่อุณหภูมิต่ําความเขมขน<br />
2% แลวนํามาแยกขนาดดีเอ็นเอดวยเครื่อง<br />
Gene Navigator TM<br />
System (Amersham Bioscience, USA) ระบบ CHEF ที่บรรจุบัฟเฟอร<br />
1X TBE 2.5 ลิตร รักษา<br />
อุณหภูมิใหคงที่ที่<br />
14 O ซ และใชความตางศักยไฟฟา 200 โวลต ตลอดการทดลอง เลือกใชการเชื่อม<br />
ตอของระบบการทํางาน (connection) แบบ interpolation ภายใต 3 ขั้นตอน<br />
คือ ขั้นที่<br />
1 ระยะเวลาที่<br />
ใชสลับทิศทางกระแสไฟฟา 3-15 วินาที เปนเวลา 8 ชั่วโมง<br />
ขั้นที่<br />
2 ระยะเวลาที่ใชสลับทิศทาง<br />
กระแสไฟฟา 15-30 วินาที เปนเวลา 8 ชั่วโมง<br />
และขั้นที่<br />
3 ระยะเวลาที่ใชสลับทิศทางกระแสไฟฟา<br />
30-60 วินาที เปนเวลา 8 ชั่วโมง<br />
จากนั้นยอมสีแถบดีเอ็นเอดวยเอธิเดียมโบรไมดนาน<br />
30 นาที แลว<br />
ลางเอธิเดียมโบรไมดสวนเกินออกดวยน้ํากลั่นนาน<br />
1 ชั่วโมง<br />
ตรวจดูแถบดีเอ็นเอภายใตแสงอุลตรา<br />
ไวโอเลตดวยเครื่อง<br />
Gene Genius Bio Imaging System (Syngene, Cambridge, UK) โดยใช<br />
โปรแกรม Gene Snap ขั้นตอนในการเตรียมจีโนมิคดีเอ็นเอเพื่อใชในการศึกษาลักษณะลายพิมพ<br />
จีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
R. solanacearum ไบโอวาร 3 ดังสรุปในภาพที่<br />
2<br />
2.4 การวิเคราะหผลลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่ไดจากเทคนิค<br />
Pulsed-field gel<br />
electrophoresis<br />
หลังจากแยกขนาดดีเอ็นเอดวยเทคนิค Pulsed-field gel electrophoresis แลวทําการ<br />
ตรวจดูแถบดีเอ็นเอภายใตแสงอุลตราไวโอเลตดวยเครื่อง<br />
Gene Genius Bio Imaging System<br />
(Syngene, Cambridge, UK) โดยใช Syngene Software Package (Syngene, Cambridge, UK) ซึ่ง<br />
ประกอบดวยโปรแกรม Gene Snap, Gene Tool และ Gene Directory โดยโปรมแกรมที่ใชในขั้น<br />
ตอนแรกคือ โปรแกรม Gene Snap ซึ่งเปนโปรแกรมสําหรับการบันทึกภาพ<br />
จากนั้นนําภาพที่ไดไป<br />
เปรียบเทียบหาคาขนาดโมเลกุลกับขนาดโมเลกุลมาตรฐานที่นํามาแยกบนเจลเดียวกันดวย<br />
โปรแกรม Gene Tool และนําไปวิเคราะหผลลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่ไดดวยโปรแกรม<br />
คอมพิวเตอรสําเร็จรูป Gene Directory โดยเลือกใช Dice’s similarity coefficients (Dice, 1945)<br />
สราง dendrograms ดวย unweighted pair group method with arithmetic averages clustering<br />
(UPGMA) (Sokal and Michener, 1985) และเลือกใช percentage tolerance เทากับ 1% ซึ่งหมาย<br />
ความวาใหแถบดีเอ็นเอที่มีขนาดดีเอ็นเอแตกตางกัน<br />
1% เปนแถบเดียวกัน โดยวิเคราะหรวมกับขอ<br />
มูลของชนิดไบโอวาร พืชอาศัย และแหลงที่ตรวจพบโรค<br />
(ภาพที่<br />
3)<br />
20
สําหรับการวิเคราะหความสัมพันธรวมระหวางลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอจากการตัดดวย<br />
เอนไซม XbaI และ SpeI จะพิจารณาลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นดวยสายตาเพียงอยางเดียว<br />
โดยกําหนดแถบดีเอ็นเอที่ปรากฏใหเปน<br />
“1” ไมปรากฏเปน “0” แลวจึงนําผลมาวิเคราะหดวย<br />
โปรแกรมคอมพิวเตอรสําเร็จรูป Numerical taxonomy and multivariate analysis system (NTSYS)<br />
(Rohlf, 1994) โดยเลือกใช Dice’s similarity coefficient (Dice, 1945) และสราง dendogram ดวย<br />
โปรแกรม UPGMA (Sokal and Michener, 1985) วิเคราะหคา bootstrap ดวยโปรแกรม Winboot<br />
(Yap and Nelson, 1996) จํานวน 1,000 ซ้ํา<br />
แลวพิจารณาความสัมพันธระหวางสายพันธุเชื้อกับชนิด<br />
ไบโอวาร แหลงที่มา<br />
และพืชอาศัย<br />
21
1. นําชิ้นอะกาโรสออกจากแมพิมพแลวแชใน<br />
lysis solution หลังจากนั้นจึงตัดดวยเอนไซม<br />
ตัดจําเพาะ<br />
2. นําชิ้นอะกาโรสที่ตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ<br />
แลวใสในชองเจลอะกาโรสความเขมขน 1%<br />
3. แยกขนาดดีเอ็นเอดวยเครื่อง<br />
Gene<br />
Navigator TM System<br />
4. ตรวจดูแถบดีเอ็นเอภายใตแสงอุลตราไวโอเลต<br />
ดวยเครื่อง<br />
Gene Genius Bio Imaging System<br />
ภาพที่<br />
2 ขั้นตอนในการเตรียมเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum ไบโอวาร 3 เพื่อแยกลักษณะ<br />
ลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอโดยเทคนิค Pulsed-field gel electrophoresis<br />
22
Gene Directory<br />
1. โปรแกรม Gene Snap ใชสําหรับการ<br />
บันทึกภาพ<br />
2. ใชโปรแกรม Gene Tool เพื่อเปรียบเทียบ<br />
หาคาขนาดโมเลกุลกับขนาดโมเลกุล<br />
มาตรฐาน<br />
3. เลือก Parameter ในการวิเคราะหลายพิมพ<br />
จีโนมิคดีเอ็นเอ ไดแก<br />
- Matching type เลือก Match all tracks<br />
to all tracks<br />
- Match basis เลือก Molecular weight<br />
- Percentage tolerance เลือกใช 1%<br />
- Similarity Coefficient เลือก Dice<br />
- Dendrogram เลือก UPGMA<br />
4. วิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอโดยใช<br />
โปรแกรม Gene Directory<br />
ภาพที่<br />
3 ขั้นตอนในการศึกษาวิเคราะหลักษณะลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum ไบโอวาร 3 โดยใชโปรแกรมคอมพิวเตอรสําเร็จรูป<br />
Syngene software package<br />
23
สถานที่ทําการทดลอง<br />
หองปฏิบัติการศูนยเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขต<br />
กําแพงแสน จังหวัดนครปฐม<br />
ระยะเวลาทําการทดลอง<br />
ระยะเวลาดําเนินการทดลองระหวางเดือนกรกฏาคม พ.ศ. 2544 ถึง เดือนพฤษภาคม<br />
พ.ศ. 2547<br />
24
ผลการทดลอง<br />
1. การตรวจสอบและจัดจําแนกเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum<br />
เชื้อ<br />
R. solanacearum ที่ใชในการศึกษาเปนเชื้อบริสุทธิ์ที่เก็บรักษาไวที่กรมวิชาการเกษตร<br />
กระทรวงเกษตรและสหกรณ ภาควิชาโรคพืช คณะเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร และภาควิชา<br />
โรคพืชวิทยา คณะเกษตรศาสตร มหาวิทยาลัยขอนแกน โดยที่เชื้อเหลานี้ไดรับการทดสอบการเกิด<br />
โรคและการจําแนกเชื้อมากอนแลว<br />
ดังนั้นในการศึกษาครั้งนี้จึงทําการทดสอบบางลักษณะ<br />
โดยมีจุด<br />
ประสงคเพื่อตรวจสอบเชื้อใหแนนอนกอนนํามาใชในการศึกษาความแตกตางของลายพิมพดีเอ็นเอ<br />
ตอไป โดยมีเชื้อที่นํามาศึกษาจํานวน<br />
86 สายพันธุ<br />
(ตารางที่<br />
2)<br />
1.1 การเจริญของเชื้อบนอาหารกึ่งจําเพาะ<br />
เชื้อแบคทีเรียทุกสายพันธุ<br />
เมื่อนํามาเลี้ยงบนอาหารกึ่งจําเพาะ<br />
TZC พบวาเชื้อมีลักษณะ<br />
โคโลนีเปนเมือกเยิ้ม<br />
ขนาดและรูปรางโคโลนีไมแนนอน ตรงกลางโคโลนีสีชมพูออน ขอบโคโลนี<br />
สีขาวขุนซึ่งเปนลักษณะของเชื้อ<br />
R. solanacearum สายพันธุรุนแรงที่เจริญบนอาหารกึ่งจําเพาะชนิด<br />
นี้<br />
(ภาพที่<br />
4ก)<br />
1.2 การทดสอบปฏิกิริยาการตอบสนองแบบเฉียบพลัน<br />
หลังจากปลูกเชื้อ<br />
R. solanacearum บนใบยาสูบพบวา ภายใน 24-48 ชั่วโมง<br />
ใบยาสูบ<br />
เกิดอาการแหงตายของเนื้อเยื่อบริเวณที่ฉีดสารละลายเชื้อ<br />
ในขณะที่ใบยาสูบซึ่งฉีดดวยน้ํากลั่นนึ่ง<br />
ฆาเชื้อไมแสดงอาการดังกลาว<br />
(ภาพที่<br />
4ข) แสดงวาเชื้อแบคทีเรียทุกสายพันธุที่นํามาทดสอบมีคุณ<br />
สมบัติในการเกิดโรค (pathogenicity) เนื่องจากเชื้อสามารถชักนําใหเกิดปฏิกิริยาตอบสนองอยาง<br />
เฉียบพลันบนยาสูบซึ่งจัดเปนปฏิกิริยาอยางหนึ่งในการตานทานตอการเขาทําลายของเชื้อสาเหตุ<br />
โรคพืช (pathogen) เพื่อปองกันการลุกลามของเชื้อไปยังเซลลขางเคียง<br />
ซึ่งในแบคทีเรียที่ไมใช<br />
สาเหตุโรคพืช (saprophytes) จะไมทําใหเกิดปฏิกิริยานี้<br />
25
1.3 การจัดจําแนกไบโอวาร<br />
ผลการทดสอบการใชน้ําตาลทั้ง<br />
6 ชนิด คือ น้ําตาลไดแซคคาไรด<br />
maltose, lactose<br />
cellobiose และน้ําตาลแอลกอฮอล<br />
dulcitol, mannitol และ sorbitol ของเชื้อ<br />
R. solanacearum พบวา<br />
เชื้อที่นํามาศึกษาจํานวน<br />
86 สายพันธุ<br />
จัดเปนไบโอวาร 3 ซึ่งสามารถใชน้ําตาลทดสอบไดทั้ง<br />
6 ชนิด<br />
สังเกตไดจากเชื้อเปลี่ยนสีอาหารจากสีน้ําเงินอมเขียวเปนสีเหลือง<br />
(ภาพที่<br />
4ค) สวนเชื้อ<br />
R.<br />
solanacearum ที่นํามาศึกษาเปรียบเทียบไดแก<br />
เชื้อไบโอวาร<br />
2 สายพันธุ<br />
NA5 ใชเฉพาะน้ําตาลได<br />
แซคคาไรด และเชื้อไบโอวาร<br />
4 สายพันธุ<br />
Gi211, Gi1107, Pat1512 และ Pat9810 ใชเฉพาะน้ําตาล<br />
แอลกอฮอล (ตารางที่<br />
2)<br />
จากการตรวจสอบลักษณะโคโลนีของเชื้อบนอาหาร<br />
TZC การทดสอบปฏิกิริยาตอบ<br />
สนองแบบเฉียบพลันบนยาสูบ และการจําแนกไบโอวาร พบวาเชื้อ<br />
R. solanacearum ทั้ง<br />
86 สาย<br />
พันธุ<br />
ที่นํามาศึกษาเปนเชื้อ<br />
R. solanacearum ไบโอวาร 3<br />
26
1<br />
C 4<br />
2 3<br />
ก<br />
ข<br />
dul man sor mal lac cel<br />
Biovar 2<br />
- - - + + +<br />
Biovar 3<br />
+ + + + + +<br />
Biovar 4<br />
+ + + - - -<br />
ค<br />
ภาพที่<br />
4 การจําแนกและตรวจสอบเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum<br />
ก. ลักษณะโคโลนีของเชื้อ<br />
R. solanacearum สายพันธุรุนแรงบนอาหาร<br />
tetrazolium agar<br />
ข. ลักษณะอาการของปฏิกิริยาตอบสนองอยางเฉียบพลัน (hypersensitive<br />
reaction) ของเชื้อ<br />
R. solanacearum บนใบยาสูบ ซึ่งจะแสดงอาการแผลไหม<br />
หลังจากปลูกเชื้อภายใน<br />
24-48 ชั่วโมง<br />
โดยตัวอักษร C คือ ฉีดดวยน้ํากลั่นนึ่ง<br />
ฆาเชื้อ<br />
(ตัวเปรียบเทียบ) หมายเลข 1, 2, 3 และ 4 คือ ฉีดดวยสารละลายเชื้อ<br />
ค. การจัดจําแนกเชื้อ<br />
R. solanacearum เปนไบโอวาร โดยทดสอบการใชน้ําตาล<br />
6<br />
ชนิด คือ dulcitol (dul), mannitol (man), sorbitol (sor), maltose (mal), lactose<br />
(lac) และ cellobiose (cel) ถาปฏิกิริยาเปนบวกจะเปลี่ยนสีอินดิเคเตอรจากสี<br />
เขียวเปนสีเหลือง<br />
27
ตารางที่<br />
2 เชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum จํานวน 86 สายพันธุ<br />
ที่แยกจากพืชอาศัยและแหลงปลูก<br />
ตางๆ ในประเทศไทย<br />
สายพันธุ<br />
พืชอาศัย สถานที่<br />
การเกิด HR2/ ไบโอวาร แหลงที่มา1/<br />
Solanum tuberosum<br />
Po2311 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 ภรพ1<br />
Po2314 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 ภรพ1<br />
Po2315 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 ภรพ1<br />
Po2316 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 ภรพ1<br />
Po2321 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 ภรพ1<br />
Po2322 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 ภรพ1<br />
Po2323 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 ภรพ1<br />
Po2332 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 ภรพ1<br />
Po336 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 กบว<br />
Po1161 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 กบว<br />
Po1162 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 กบว<br />
Po1163 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 กบว<br />
Po1256 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 กบว<br />
Po1264 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 กบว<br />
Po1266 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 กบว<br />
Po1267 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 กบว<br />
Po555 มันฝรั่ง<br />
เชียงใหม + 3 กบว<br />
Po1253 มันฝรั่ง<br />
ลําพูน + 3 กบว<br />
Po1254 มันฝรั่ง<br />
ลําพูน + 3 กบว<br />
Po1472 มันฝรั่ง<br />
ตาก + 3 ภรพ1<br />
Po1191 มันฝรั่ง<br />
เลย + 3 กบว<br />
Lycopersicon esculentum<br />
To999 มะเขือเทศ กาฬสินธุ<br />
+ 3 กบว<br />
To1388 มะเขือเทศ หนองคาย + 3 กบว<br />
To1391 มะเขือเทศ ขอนแกน + 3 กบว<br />
ToSK3 มะเขือเทศ ขอนแกน + 3 ภรพ2<br />
28
ตารางที่<br />
2 (ตอ)<br />
สายพันธุ<br />
พืชอาศัย สถานที่<br />
การเกิด HR2/ ไบโอวาร แหลงที่มา1/<br />
Lycopersicon esculentum<br />
ToSK4 มะเขือเทศ ขอนแกน + 3 ภรพ2<br />
ToSK5 มะเขือเทศ ขอนแกน + 3 ภรพ2<br />
To1575 มะเขือเทศ ขอนแกน + 3 กบว<br />
To1402 มะเขือเทศ นครพนม + 3 กบว<br />
To1403 มะเขือเทศ นครพนม + 3 กบว<br />
To1404 มะเขือเทศ นครพนม + 3 กบว<br />
To1406 มะเขือเทศ นครพนม + 3 กบว<br />
To991 มะเขือเทศ สกลนคร + 3 กบว<br />
To1397 มะเขือเทศ สกลนคร + 3 กบว<br />
To1399 มะเขือเทศ สกลนคร + 3 กบว<br />
To1453 มะเขือเทศ เลย + 3 กบว<br />
ToUD1 มะเขือเทศ อุดรธานี + 3 ภรพ1<br />
Toudk1 มะเขือเทศ อุดรธานี + 3 ภรพ1<br />
Toudk2 มะเขือเทศ อุดรธานี + 3 ภรพ1<br />
Toudk3 มะเขือเทศ อุดรธานี + 3 ภรพ1<br />
To102 มะเขือเทศ อุดรธานี + 3 ภรพ1<br />
To7 มะเขือเทศ อุดรธานี + 3 ภรพ2<br />
To908 มะเขือเทศ พิจิตร + 3 กบว<br />
To1342 มะเขือเทศ เชียงใหม + 3 ภรพ1<br />
To1421 มะเขือเทศ ตาก + 3 กบว<br />
Capsicum annuum<br />
Pe104 พริก อุดรธานี + 3 ภรพ1<br />
Pe105 พริก อุดรธานี + 3 ภรพ1<br />
Pe107 พริก อุดรธานี + 3 ภรพ1<br />
Pe108 พริก อุดรธานี + 3 ภรพ1<br />
Pe109 พริก อุดรธานี + 3 ภรพ1<br />
Pe212 พริก อุดรธานี + 3 ภรพ1<br />
Pe214 พริก อุดรธานี + 3 ภรพ1<br />
Pe216 พริก อุดรธานี + 3 ภรพ1<br />
Pe209 พริก นครพนม + 3 ภรพ1<br />
29
ตารางที่<br />
2 (ตอ)<br />
สายพันธุ<br />
พืชอาศัย สถานที่<br />
การเกิด HR2/ ไบโอวาร แหลงที่มา1/<br />
Pe211 พริก นครพนม + 3 ภรพ1<br />
Pe201 พริก นครปฐม + 3 ภรพ1<br />
Pe202 พริก นครปฐม + 3 ภรพ1<br />
Pe204 พริก นครปฐม + 3 ภรพ1<br />
PeMu พริก มุกดาหาร + 3 ภรพ2<br />
Pe1105 พริก ประจวบคีรีขันธ + 3 กบว<br />
Pe1473 พริก เชียงราย + 3 กบว<br />
Pe1474 พริก เชียงราย + 3 กบว<br />
Pe1496 พริก เชียงราย + 3 กบว<br />
Tagetes patula<br />
MG1387 ดาวเรือง กรุงเทพฯ + 3 กบว<br />
MG0001 ดาวเรือง กรุงเทพฯ + 3 ภพร1<br />
MG0022 ดาวเรือง นครนายก + 3 ภรพ1<br />
MG0024 ดาวเรือง นครนายก + 3 ภรพ1<br />
Coleus atropurpureus<br />
Co1456 ฤาษีผสม กรุงเทพฯ + 3 กบว<br />
Solanum melongena<br />
Sm1099 มะเขือยาว สงขลา + 3 กบว<br />
Sm1218 มะเขือยาว สงขลา + 3 กบว<br />
Sm1011 มะเขือยาว ตรัง + 3 กบว<br />
Sm1506 มะเขือยาว สุราษฏรธานี + 3 กบว<br />
S. aculeatissimum<br />
Sa1407 มะเขือเปราะ นครพนม + 3 กบว<br />
Sa1491 มะเขือเปราะ เชียงราย + 3 กบว<br />
Sa1495 มะเขือเปราะ เชียงราย + 3 กบว<br />
Sa1508 มะเขือเปราะ สุราษฏรธานี + 3 กบว<br />
Nicotiana tabacum<br />
Tb525 ยาสูบ สงขลา + 3 กบว<br />
Tb1401 ยาสูบ นครพนม + 3 กบว<br />
Tb1405 ยาสูบ นครพนม + 3 กบว<br />
30
ตารางที่<br />
2 (ตอ)<br />
สายพันธุ<br />
พืชอาศัย สถานที่<br />
การเกิด HR2/ ไบโอวาร แหลงที่มา1/<br />
Se1287<br />
Sesamum indicum<br />
งา เชียงใหม + 3 กบว<br />
Se1423 งา<br />
Ocimum basilicum<br />
อุบลราชธานี + 3 กบว<br />
Oc1489 โหระพา<br />
Zinnia elegans<br />
นนทบุรี + 3 กบว<br />
Zi1479 บานชื่น<br />
Ageratum conyzoides<br />
กรุงเทพฯ + 3 กบว<br />
Ac1475 สาบแรงสาบกา<br />
Eucalyptus pilolaria<br />
เชียงราย + 3 กบว<br />
Eu1372 ยูคาลิปตัส ฉะเชิงเทรา + 3 กบว<br />
Eu1374 ยูคาลิปตัส<br />
Zingiber officinale<br />
ฉะเชิงเทรา + 3 กบว<br />
Gi1107 ขิง ประจวบคีรีขันธ + 4 กบว<br />
Gi211 ขิง<br />
Curcuma alismatifolia<br />
เพชรบูรณ + 4 ภรพ1<br />
Pat9810 ปทุมมา นครนายก + 4 ภรพ1<br />
Pat1512 ปทุมมา เชียงราย + 4 กบว<br />
NA5 มันฝรั่ง<br />
เนปาล + 2 ภรพ1<br />
หมายเหตุ 1/ กบว คือ กลุ<br />
มงานบักเตรีวิทยา กองโรคพืชและจุลชีววิทยา กรมวิชาการเกษตร<br />
ภรพ1 คือ ภาควิชาโรคพืช คณะเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร<br />
ภรพ2 คือ ภาควิชาโรคพืชวิทยา คณะเกษตรศาสตร มหาวิทยาลัยขอนแกน<br />
2/ HR คือ hypersensitive reaction<br />
31
2. การศึกษาความผันแปรทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum<br />
การศึกษาความผันแปรทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R. solanacearum ไบโอวาร 3 จํานวน 86<br />
สายพันธุ<br />
โดยดูจากลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อที่เกิดจากการตัดจีโนมิคดีเอ็นเอดวยเอนไซมตัด<br />
จําเพาะที่มีความถี่ในการตัดต่ําไดแก<br />
XbaI และ SpeI แลวแยกวิเคราะหดีเอ็นเอดวยเทคนิค Pulsedfield<br />
gel electrophoresis พบวาสามารถแยกขนาดดีเอ็นเอได 8-16 แถบ ซึ่งมีขนาดในชวง<br />
50-630<br />
kb โดยรูปแบบดีเอ็นเอที่ไดเมื่อตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI และ SpeI มีทั้งหมด<br />
47 และ 46 รูปแบบ ตาม<br />
ลําดับ หลังจากนั้นนําขอมูลลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอมาวิเคราะหและสราง<br />
dendogram ดวย<br />
โปรแกรมสําเร็จรูป Gene Tools และ Gene Directory เพื่อดูความสัมพันธระหวางสายพันธุเชื้อกับ<br />
ชนิดไบโอวาร พืชอาศัย และแหลงที่มา<br />
โดยเกณฑที่ใชในการจัดกลุมพิจารณาจากคา<br />
similarity ที่<br />
สามารถจัดกลุมตามชนิดของไบโอวาร<br />
พืชอาศัย และแหลงที่มาไดดีที่สุด<br />
ไดผลดังนี้<br />
2.1 Dendogram จากการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่ตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI<br />
ลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
R. solanacearum สายพันธุตางๆ<br />
ที่แยกไดจากพืช<br />
อาศัยแตละชนิดเมื่อตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI สวนใหญมีรูปแบบแตกตางกัน (ภาพที่<br />
5) เชื้อสายพันธุที่<br />
แยกจากมะเขือเทศมีรูปแบบแตกตางกัน 19 รูปแบบ ยกเวนสายพันธุ<br />
Toudk1, Toudk2, Toudk3 ซึ่ง<br />
แยกไดจากมะเขือเทศที่มาจากจังหวัดอุดรธานีมีรูปแบบเหมือนกัน<br />
สายพันธุ<br />
To1453 จากจังหวัด<br />
เลยมีรูปแบบลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอเหมือนกับสายพันธุ<br />
ToSK3, ToSK4, ToSK5 จากจังหวัด<br />
ขอนแกน เชื้อ<br />
R. solanacearum สายพันธุที่แยกจากพริกมีรูปแบบแตกตางกัน<br />
10 รูปแบบ ลายพิมพ<br />
ของเชื้อสายพันธุ<br />
Pe202 จากนครปฐมเหมือนลายพิมพของเชื้อสายพันธุ<br />
Pe209 และPe211 จาก<br />
อุดรธานี เชื้อสายพันธุ<br />
Pe104 เหมือนกับ Pe105 (อุดรธานี) สายพันธุ<br />
Pe107, Pe108, Pe109 จาก<br />
อุดรธานีมีลายพิมพเหมือนกัน และเชื้อสายพันธุ<br />
Pe212 เหมือนกับ Pe214, Pe216 จากสกลนคร เชื้อ<br />
สายพันธุที่แยกจากมันฝรั่งมีลายพิมพแตกตางกัน<br />
5 รูปแบบ โดยเชื้อสายพันธุ<br />
Po2321 กับ Po2323<br />
จากเชียงใหมมีลายพิมพเหมือนกัน สายพันธุ<br />
Po2311, Po2314, Po2315, Po2316, Po2322, Po2332<br />
จากเชียงใหมมีลายพิมพเหมือนกัน เชื้อสายพันธุ<br />
Po1161, Po1162, Po1163, Po336 ซึ่งแยกไดจาก<br />
มันฝรั่งที่มาจากเชียงใหมมีลายพิมพเหมือนกับสายพันธุ<br />
To1421 ซึ่งเปนเชื้อที่แยกไดจากมะเขือเทศ<br />
ที่มาจากจังหวัดตาก<br />
เชื้อสายพันธุ<br />
Po1256, Po1264, Po1266, Po1267 ซึ่งแยกไดจากมันฝรั่งที่มาจาก<br />
จังหวัดเชียงใหม มีรูปแบบลายพิมพเหมือนกับสายพันธุ<br />
Po1253, Po1254 ซึ่งแยกไดจากมันฝรั่งที่มา<br />
จากลําพูน สายพันธุ<br />
Pe1473, Pe1474 ซึ่งแยกไดจากพริกของเชียงราย<br />
และสายพันธุที่แยกมาจาก<br />
32
มะเขือยาว ไดแก Sm1011 (ตรัง), Sm1506 (สุราษฎรธานี) นอกจากนี้ยังมีเชื้อ<br />
R. solanacearum จาก<br />
พืชอาศัยอื่นๆ<br />
ที่มีรูปแบบลายพิมพที่เหมือนกัน<br />
ไดแก เชื้อที่แยกไดจากดาวเรืองที่มาจากจังหวัด<br />
นครนายกสายพันธุ<br />
MG0022 เหมือนกับ MG0024 เชื้อสายพันธุ<br />
Tb1405 ซึ่งแยกไดจากยาสูบ<br />
จังหวัดนครพนมมีลายพิมพเหมือนกับสายพันธุที่แยกมะเขือเทศคือ<br />
To1402 (นครพนม) และ<br />
To991 (สกลนคร)<br />
ผลการจัดกลุมเมื่อพิจารณาความสัมพันธของสายพันธุเชื้อกับชนิดไบโอวารที่คา<br />
similarity 0.20 สามารถแยกเชื้อในกลุมไบโอวาร<br />
3 และ 4 ออกจากเชื้อไบโอวาร<br />
2 สายพันธุจากเน<br />
ปาลได การจัดกลุมที่คา<br />
similarity 0.40 พบวาสามารถแบงเชื้อ<br />
R. solanacearum ไดเปน 3 กลุมสอด<br />
คลองกับการจําแนกไบโอวาร (ภาพที่<br />
6) คือ กลุมที่<br />
1 ประกอบดวยเชื้อในกลุมไบโอวาร<br />
3 กลุมที่<br />
2<br />
ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
4 (สายพันธุ<br />
Gi1107, Gi211, Pat1512 และPat9801) และกลุมที่<br />
3 ไดแก<br />
เชื้อ<br />
R. solanacearum ไบโอวาร 2 สายพันธุ<br />
NA5 ซึ่งเปนเชื้อจากมันฝรั่งของเนปาล<br />
และเมื่อ<br />
พิจารณาที่คา<br />
similarity 0.50 สามารถจัดแบงเชื้อออกเปน<br />
8 กลุม<br />
คือ กลุมที่<br />
1 ประกอบดวยเชื้อ<br />
ไบโอวาร 3 ซึ่งแยกไดจากพืชในวงศ<br />
Solanaceae และดาวเรือง กลุมที่<br />
2 เปนเชื้อไบโอวาร<br />
3 ซึ่งแยก<br />
ไดจากดาวเรือง สาบแรงสาบกา พริก และมะเขือเทศ กลุมที่<br />
3 ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
3 ซึ่งแยก<br />
ไดจากมะเขือเทศเปนสวนใหญ นอกจากนี้ยังมีเชื้อจากพืชอาศัยอื่น<br />
ไดแก โหระพา ยูคาลิปตัส<br />
บานชื่น<br />
และดาวเรือง กลุมที่<br />
4 ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
3 ซึ่งแยกไดจากพืชในวงศ<br />
Solanaceae<br />
โดยเฉพาะเชื้อที่แยกไดจากมันฝรั่งจัดอยูในกลุมนี้ทั้งหมด<br />
กลุมที่<br />
5 เปนเชื้อไบโอวาร<br />
3 สายพันธุที่<br />
แยกไดจากงา (Se1423 และ Se1287) กลุมที่<br />
6 เปนเชื้อไบโอวาร<br />
3 สายพันธุที่แยกไดจากพืชอาศัย<br />
ในวงศ Solanaceae ซึ่งมีแหลงที่มาจากภาคตะวันออกเฉียงเหนือทั้งหมด<br />
กลุมที่<br />
7 ประกอบดวยเชื้อ<br />
ไบโอวาร 4 จากพืชอาศัยในวงศ Zingiberaceae ไดแก ขิงและปทุมมา และกลุมที่<br />
8 เปนเชื้อไบโอ<br />
วาร 2 ซึ่งแยกไดจากมันฝรั่งของเนปาล<br />
และเมื่อพิจารณาความสัมพันธของเชื้อกับชนิดพืชอาศัยและ<br />
แหลงที่มาของเชื้อจากจังหวัดตางๆ<br />
ของประเทศไทยที่คา<br />
similarity เดียวกันนี้<br />
พบวาไมมีความ<br />
สัมพันธระหวางสายพันธุเชื้อกับชนิดพืชอาศัยและแหลงที่มา<br />
ยกเวนเชื้อที่แยกไดจากงา<br />
2 สายพันธุ<br />
ที่สามารถแยกกลุมออกจากเชื้อสายพันธุอื่นๆ<br />
ได<br />
33
2.2 Dendogram จากการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่ตัดดวยเอนไซม<br />
SpeI<br />
ลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
R. solanacearum ที่ตัดดวยเอนไซม<br />
SpeI (ภาพที่<br />
7)<br />
สวนใหญใหรูปแบบที่แตกตางกันในแตละพืชอาศัยเชนเดียวกับเมื่อตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI เชื้อบาง<br />
สายพันธุที่มาจากพืชอาศัยและแหลงที่มาตางกันแตมีรูปแบบลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอเหมือนกัน<br />
เชน สายพันธุ<br />
To1342 (เชียงราย) ซึ่งแยกไดจากมะเขือเทศมีลายพิมพเหมือนกับสายพันธุ<br />
Pe1496<br />
(เชียงราย) จากพริก และสายพันธุ<br />
MG1387 (กรุงเทพฯ) ซึ่งแยกไดจากดาวเรือง<br />
เปนตน<br />
ผลการจัดกลุมเมื่อพิจารณาที่คา<br />
similarity 0.14 (ภาพที่<br />
8) พบวาสามารถแยกเชื้อใน<br />
กลุมไบโอวาร<br />
3 และ 4 ออกจากเชื้อไบโอวาร<br />
2 จากเนปาลได การจัดกลุมที่คา<br />
similarity 0.30<br />
สามารถแบงเชื้อไดเปน<br />
3 กลุม<br />
สอดคลองกับการจัดแบงเชื้อเปนไบโอวาร<br />
โดยกลุมที่<br />
1 ประกอบ<br />
ดวยเชื้อ<br />
ไบโอวาร 3 กลุมที่<br />
2 ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
4 และกลุมที่<br />
3 ประกอบดวยเชื้อที่จัดอยู<br />
ในไบโอวาร 2 จาก dendogram จะเห็นไดวาเชื้อ<br />
R. solanacearum ไบโอวาร 3 ในกลุมที่<br />
1 นั้นมี<br />
ความหลากหลายของรูปแบบลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอมาก และสามารถแยกเปนกลุมยอยไดอีก<br />
หลายกลุม<br />
โดยเมื่อพิจารณาที่คา<br />
similarity 0.50 พบวาสามารถแบงเชื้อออกเปน<br />
7 กลุม<br />
ในกลุมที่<br />
1<br />
เปนเชื้อที่จัดอยูในไบโอวาร<br />
3 ประกอบดวยเชื้อสายพันธุที่แยกไดจากยูคาลิปตัส<br />
ดาวเรือง และพืช<br />
อาศัยในวงศ Solanaceae โดยเฉพาะเชื้อสายพันธุที่แยกไดจากมันฝรั่งเปนสวนใหญ<br />
กลุมที่<br />
2<br />
ประกอบดวยเชื้อ<br />
ไบโอวาร 3 สายพันธุที่แยกไดจากพืชในวงศ<br />
Solanaceae และโหระพา โดยสวน<br />
ใหญเชื้อสายพันธุที่แยกไดจากพริกจัดอยูในกลุมนี้<br />
กลุมที่<br />
3 ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
3 สายพันธุ<br />
ที่แยกไดจากพืชในวงศ<br />
Solanaceae และพืชอื่นๆ<br />
ไดแก ดาวเรืองและฤาษีผสม กลุมที่<br />
4 เปนเชื้อไบ<br />
โอวาร 3 ที่แยกจากมะเขือยาว<br />
ยาสูบ ดาวเรือง บานชื่น<br />
และสาบแรงสาบกา กลุมที่<br />
5 เปนเชื้อไบโอ<br />
วาร 3 สายพันธุจากงา<br />
กลุมที่<br />
6 ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
4 สายพันธุที่แยกจากพืชวงศ<br />
Zingiberaceae และกลุมที่<br />
7 ไดแก เชื้อไบโอวาร<br />
2 ซึ่งแยกไดจากมันฝรั่ง<br />
จะเห็นไดวาที่คา<br />
similarity<br />
เดียวกันนี้เมื่อพิจารณาความสัมพันธระหวางสายพันธุของเชื้อกับชนิดพืชอาศัยและแหลงที่มาของ<br />
เชื้อแลว<br />
พบวาไมมีความสัมพันธระหวางชนิดพืชอาศัยและแหลงที่มา<br />
ยกเวนเชื้อสายพันธุที่แยกได<br />
จากงา อยางไรก็ตามการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่ไดจากการตัดดวยเอนไซม<br />
SpeI ใหผล<br />
การจัดกลุมที่สอดคลองกับไบโอวาร<br />
ชนิดพืชอาศัย และแหลงที่มาของเชื้อไดดีกวาการวิเคราะหลาย<br />
พิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่ไดจากการตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI<br />
34
2.3 Dendogram จากการวิเคราะหรวมกันของลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่ตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI และเอนไซม SpeI<br />
เมื่อนําผลของลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อที่ตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI และ SpeI มา<br />
วิเคราะหรวมกัน พบวาที่คา<br />
similarity 0.20 สามารถแยกเชื้อในของกลุมไบโอวาร<br />
3 และ 4 ออกจาก<br />
เชื้อไบโอวาร<br />
2 จากเนปาลได เมื่อพิจารณาการจัดกลุมที่คา<br />
similarity 0.40 สามารถแบงเชื้อไดเปน<br />
3<br />
กลุม<br />
สอดคลองกับการจัดแบงเชื้อเปนไบโอวาร<br />
โดยกลุมที่<br />
1 ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
3 กลุมที่<br />
2<br />
ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
4 และกลุมที่<br />
3 เปนเชื้อที่จัดอยูในไบโอวาร<br />
2 ผลการจัดกลุมที่คา<br />
similarity 0.50 สามารถแบงเชื้อออกเปน<br />
8 กลุม<br />
(ภาพที่<br />
9) ไดแก กลุม<br />
1 ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
3 ที่แยกไดจากพืชในวงศ<br />
Solanaceae ยูคาลิปตัส และดาวเรือง โดยเชื้อสายพันธุจากมันฝรั่งสวน<br />
ใหญจัดอยูในกลุมนี้<br />
กลุมที่<br />
2 ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
3 ที่แยกไดจากพืชในวงศ<br />
Solanaceae และ<br />
พืชอื่นๆ<br />
ไดแก ดาวเรือง โหระพา ฤาษีผสม โดยที่เชื้อสายพันธุจากพริกสวนใหญจัดอยูในกลุมนี้<br />
กลุมที่<br />
3 เปนเชื้อไบโอวาร<br />
3 ที่แยกไดจากพืชในวงศ<br />
Solanaceae ดาวเรือง บานชื่น<br />
และสาบแรง<br />
สาบกา เชื้อในกลุมนี้ประกอบดวยเชื้อที่แยกไดจากมะเขือเทศเปนสวนใหญ<br />
กลุมที่<br />
4 ประกอบดวย<br />
เชื้อไบโอวาร<br />
3 สายพันธุที่แยกไดจากพริกและมะเขือเทศ<br />
กลุมที่<br />
5 ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
3 ที่<br />
แยกไดจากยาสูบ มะเขือเทศ และมะเขือยาว กลุมที่<br />
6 ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
3 ที่แยกไดจากงา<br />
กลุมที่<br />
7 เปนเชื้อไบโอวาร<br />
4 ที่แยกไดจากขิงกับปทุมมา<br />
และกลุมที่<br />
8 เปนเชื้อไบโอวาร<br />
2 จากมัน<br />
ฝรั่ง<br />
(เนปาล) และเมื่อพิจารณาความสัมพันธระหวางสายพันธุของเชื้อกับชนิดพืชอาศัยและแหลงที่<br />
มาของเชื้อที่คา<br />
similarity เดียวกันนี้แลว<br />
พบวาไมมีความสัมพันธระหวางชนิดพืชอาศัยและแหลงที่<br />
มา ยกเวนเชื้อสายพันธุที่แยกไดจากงา<br />
อยางไรก็ตาม จากการนําลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อที่<br />
ตัดดวยเอนไซม XbaI และ SpeI มาวิเคราะหรวมกัน พบวาผลการจัดกลุมโดยสวนใหญสอดคลอง<br />
กับการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่ตัดดวยเอนไซม<br />
SpeI<br />
35
Size (kb)<br />
679<br />
630<br />
582<br />
533<br />
485<br />
436<br />
388<br />
339<br />
291<br />
242<br />
194<br />
145<br />
97<br />
48<br />
Size (kb)<br />
679<br />
630<br />
582<br />
533<br />
485<br />
436<br />
388<br />
339<br />
291<br />
242<br />
194<br />
145<br />
97<br />
48<br />
1163<br />
To1402<br />
Sa1508<br />
PeMu<br />
Po1264<br />
M<br />
Po<br />
M<br />
Po2321<br />
Po2311<br />
To1403<br />
ToUd1<br />
Se1287<br />
Oc1489<br />
Pe1474<br />
ToSk5<br />
Pe204<br />
Pe201<br />
To1342<br />
To102<br />
Sa1508<br />
ภาพที่<br />
5 ลักษณะลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum ไบโอวาร 3<br />
สายพันธุตางๆ<br />
ที่ไดจากการตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI และแยกขนาดดวยเทคนิค<br />
Pulsed-field gel electrophoresis โดยมี lambda ladder PFG marker (M) เปน<br />
ดีเอ็นเอมาตรฐานใชเปรียบเทียบขนาด<br />
To1399<br />
Pe107<br />
To1391<br />
Sa1407<br />
Pe1496<br />
Eu3741<br />
Eu1372<br />
Pe202<br />
To7<br />
Pe108<br />
Zi1479<br />
Ac1475<br />
36
37<br />
ภาพที่<br />
6 Dendogram จากการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia<br />
solanacearum ที่ตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI และนํามาแยกขนาดโดยเทคนิค Pulsed-field<br />
gel electrophoresis แสดงความสัมพันธระหวางเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum สาย<br />
พันธุตางๆ<br />
โดยคา similarity คํานวณดวยคา Dice’s coefficient จัดกลุมดวยโปรแกรม<br />
UPGMA และวิเคราะหคา bootstrap 1000 ซ้ํา<br />
[ไบโอวาร 2 ,ไบโอวาร 3 <br />
<br />
<br />
<br />
และไบโอวาร 4 ; To=มะเขือเทศ, Tb=ยาสูบ, Po=มันฝรั่ง,<br />
Pe=พริก, Co=<br />
ฤาษีผสม, MG=ดาวเรือง, Ac=สาบแรงสาบกา, Zi=บานชื่น,<br />
Eu=ยูคาลิปตัส, Oc=<br />
โหระพา, Sa= มะเขือเปราะ, Sm=มะเขือยาว, Gi=ขิง, Pat=ปทุมมา; ภาคกลาง (C),<br />
ภาคเหนือ (N), ภาคใต (S), ภาคตะวันตก (W), ภาคตะวันออกเฉียงเหนือ (NE),<br />
เนปาล (NP)]
54<br />
100<br />
99<br />
99<br />
100<br />
100<br />
78<br />
100<br />
94<br />
0.20 0.60 1.00<br />
Similarity Coefficient<br />
38<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
7<br />
8
Size (kb)<br />
630<br />
582<br />
533<br />
485<br />
436<br />
388<br />
339<br />
291<br />
242<br />
194<br />
145<br />
97<br />
48<br />
Size (kb)<br />
630<br />
582<br />
533<br />
485<br />
436<br />
388<br />
339<br />
291<br />
242<br />
194<br />
145<br />
97<br />
48<br />
M<br />
Po1163<br />
M<br />
Po2321<br />
To1402<br />
Po2311<br />
Sa1508<br />
PeMu<br />
Po1264<br />
To1403<br />
ToUd1<br />
Se1287<br />
Oc1489<br />
Pe1474<br />
ToSk5<br />
Pe204<br />
Pe201<br />
To1342<br />
To102<br />
Sa1508<br />
ภาพที่<br />
7 ลักษณะลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum ไบโอวาร 3<br />
สายพันธุตางๆ<br />
ที่ไดจากการตัดดวยเอนไซม<br />
SpeI และแยกขนาดดวยเทคนิค<br />
Pulsed-field gel electrophoresis โดยมี lambda ladder PFG marker (M) เปน<br />
ดีเอ็นเอมาตรฐานใชเปรียบเทียบขนาด<br />
To1399<br />
Pe107<br />
To1391<br />
Sa1407<br />
Pe1496<br />
Eu3741<br />
Eu1372<br />
Pe202<br />
To7<br />
Pe108<br />
Zi1479<br />
Ac1475<br />
39
40<br />
ภาพที่<br />
8 Dendogram จากการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia<br />
solanacearum ที่ตัดดวยเอนไซม<br />
SpeI และนํามาแยกขนาดโดยเทคนิค Pulsed-field<br />
gel electrophoresis แสดงความสัมพันธระหวางเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum สาย<br />
พันธุตางๆ<br />
โดยคา similarity คํานวณดวยคา Dice’s coefficient <br />
จัดกลุมดวยโปรแกรม<br />
<br />
UPGMA และวิเคราะหคา bootstrap 1000 ซ้ํา<br />
[ไบโอวาร 2 <br />
,ไบโอวาร 3<br />
<br />
และไบโอวาร 4 ; To=มะเขือเทศ, Tb=ยาสูบ, Po=มันฝรั่ง,<br />
Pe=พริก, Co=<br />
ฤาษีผสม, MG=ดาวเรือง, Ac=สาบแรงสาบกา, Zi=บานชื่น,<br />
Eu=ยูคาลิปตัส, Oc=<br />
โหระพา, Sa= มะเขือเปราะ, Sm=มะเขือยาว, Gi=ขิง, Pat=ปทุมมา; ภาคกลาง (C),<br />
ภาคเหนือ (N), ภาคใต (S), ภาคตะวันตก (W), ภาคตะวันออกเฉียงเหนือ (NE),<br />
เนปาล (NP)]
53<br />
100<br />
99<br />
96<br />
73<br />
98<br />
99<br />
100<br />
100<br />
71<br />
100<br />
0.14 036 0.57 0.79 1.00<br />
Similarity Coefficient<br />
83<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
7<br />
41
42<br />
ภาพที่<br />
9 Dendogram จากการวิเคราะหรวมกันระหวางลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum ที่ตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI และ SpeI แสดงความสัมพันธ<br />
ระหวางเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum สายพันธุตางๆ<br />
โดยคา similarity คํานวณดวยคา<br />
Dice’s coefficient จัดกลุมดวยโปรแกรม<br />
UPGMA และวิเคราะหคา bootstrap <br />
1000 <br />
ซ้ํา<br />
<br />
<br />
[ไบโอวาร 2 ,ไบโอวาร 3 และไบโอวาร 4 ; To=มะเขือเทศ, Tb=<br />
ยาสูบ, Po=มันฝรั่ง,<br />
Pe=พริก, Co=ฤาษีผสม, MG=ดาวเรือง, Ac=สาบแรงสาบกา, Zi=<br />
บานชื่น,<br />
Eu=ยูคาลิปตัส, Oc=โหระพา, Sa= มะเขือเปราะ, Sm=มะเขือยาว, Gi=ขิง,<br />
Pat=ปทุมมา; ภาคกลาง (C), ภาคเหนือ (N), ภาคใต (S), ภาคตะวันตก (W), ภาคตะวัน<br />
ออกเฉียงเหนือ (NE), เนปาล (NP)]
0.20 0.60 1.00<br />
Similarity Coefficient<br />
97<br />
100<br />
94<br />
100<br />
100<br />
100<br />
100<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
7<br />
8<br />
43
วิจารณผลการทดลอง<br />
ในการศึกษาครั้งนี้ไดทําการทดลองเพื่อคัดเลือกเอนไซมตัดจําเพาะที่เหมาะสมสําหรับทํา<br />
Pulsed-field gel electrophoresis หลายชนิดไดแก XbaI, SpeI, DraI และ SspI พบวาเอนไซม XbaI<br />
และ SpeI เหมาะสมที่สุดสอดคลองกับรายงานของ<br />
Smith et al. (1995) ซึ่งไดทดลองใชเอนไซม<br />
หลายชนิดเชนกันไดแก BglI, SacII, NotI, SmaI, PvuII, ApaI, LspI, HinfI, MluI, XbaI และ DraI<br />
พบวา XbaI และ DraI เหมาะสมที่สุดเนื่องจากสามารถแยกแถบดีเอ็นเอได<br />
10-15 แถบ ขนาด 30-<br />
800 Kb แตในการศึกษาครั้งนี้ไมไดเลือกใชเอนไซม<br />
DraI เพราะจาก condition ที่เลือกใชเอนไซม<br />
DraI ใหแถบดีเอ็นเอนอยและมีแถบดีเอ็นเอขนาดเล็กบางสวนที่ตกเจลไปเนื่องจากใชเวลาในการทํา<br />
PFGE มากกวา Smith et al. (1995) ถึง 3 ชั่วโมง<br />
นอกจากนี้อาจเปนเพราะ<br />
DraI (TTTAAA) ไมมี<br />
ลําดับเบส CTAG ในตําแหนงจดจําทําใหไดแถบดีเอ็นเอที่มีขนาดเล็กเมื่อเทียบกับเอนไซมที่เลือก<br />
ใชในการศึกษาครั้งนี้ไดแก<br />
XbaI (TCTAGA) และ SpeI (ACTAGT) สอดคลองกับการศึกษาของ<br />
McClelland et al. (1987) ในการเลือกใชเอนไซมตัดจําเพาะโดยพบวามีลําดับเบส CTAG จํานวน<br />
นอยในจีโนมของแบคทีเรียที่มีองคประกอบของ<br />
G+C (G+C content) มากกวา 45% ซึ่งเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum มี G+C อยูในระดับถึง<br />
67% (Salanoubat et al., 2002)<br />
ผลการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่คา<br />
similarity นอยกวา 0.20 สามารถแยกเชื้อใน<br />
กลุมของไบโอวาร<br />
3 และ 4 ออกจากเชื้อไบโอวาร<br />
2 สายพันธุจากตางประเทศไดอยางชัดเจนสอด<br />
คลองกับรายงานของ Cook et al. (1989) ในการศึกษาความสัมพันธทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R.<br />
solanacearum ดวยเทคนิค RFLP ซึ่งสามารถแบงเชื้อออกเปน<br />
2 ดิวิชั่น<br />
ไดแก ดิวิชั่น<br />
1 เปนกลุมของ<br />
เชื้อที่มาจากทวีปเอเชีย<br />
ประกอบดวยกลุมเชื้อไบโอวาร<br />
3, 4 และ 5 และดิวิชั่น<br />
2 เปนกลุมเชื้อที่มา<br />
จากแถบอเมริกา ประกอบดวยเชื้อในกลุมไบโอวาร<br />
1 และ 2 นอกจากนี้เมื่อพิจารณาผลการ<br />
วิเคราะหลักษณะลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อที่ตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI และ SpeI ที่คา<br />
similarity<br />
0.40 และ 0.30 ตามลําดับ สามารถแยกกลุมเชื้อไดสอดคลองกับการจําแนกไบโอวารไดแก<br />
กลุมของ<br />
ไบโอวาร 3 กลุมของไบโอวาร<br />
4 และไบโอวาร 2 สายพันธุจากเนปาล<br />
เชนเดียวกับการศึกษาของ<br />
Frey et al. (1996) ที่การวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อที่ไดจากเทคนิค<br />
RC-PFGE<br />
สามารถแบงกลุมเชื้อ<br />
R. solanacearum race 1 จาก French West Indies ไดสอดคลองกับการจัดแบง<br />
ไบโอวาร และการศึกษาในครั้งนี้ยังใหผลสอดคลองกับรายงานของ<br />
Thammakijjawat et al. (2002)<br />
ซึ่งใชเทคนิค<br />
AFLP ในการศึกษาความผันแปรทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R. solanacearum โดยพบวาที่<br />
คา similarity 0.50 สามารถแบงเชื้อออกเปน<br />
3 กลุม<br />
สอดคลองกับการจัดแบงไบโอวาร ไดแก กลุม<br />
44
ที่<br />
1 ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
3 สายพันธุที่แยกไดจากพืชในวงศ<br />
Solanaceae และพืชชนิดอื่นๆ<br />
กลุมที่<br />
2 ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
4 สายพันธุที่แยกไดจากพืชในวงศ<br />
Zingiberaceae (ขิงกับปทุม<br />
มา) และกลุมที่<br />
3 ประกอบดวยเชื้อไบโอวาร<br />
2 ในขณะที่ที่คา<br />
similarity ดังกลาวการวิเคราะหลาย<br />
พิมพดีเอ็นเอดวยเทคนิค repetitive sequence PCR (rep-PCR) ไมสามารถแยกเชื้อไบโอวาร<br />
3 และ 4<br />
ออกจากกันได (ศุทธนา, 2543) เมื่อพิจารณาความสัมพันธระหวางลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
ที่ไดจากการตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI และ SpeI กับพืชอาศัยและแหลงที่มา<br />
ที่คา<br />
similarity เดียวกัน พบ<br />
วาสามารถจัดกลุมเชื้อได<br />
8 และ 7 กลุม<br />
ตามลําดับ เชื้อในกลุมไบโอวาร<br />
3 แบงเปนกลุมยอยหลาย<br />
กลุม<br />
โดยสามารถแยกกลุมเชื้อจากงา<br />
2 สายพันธุออกจากเชื้อสายพันธุจากพืชอาศัยชนิดอื่นๆ<br />
ได<br />
และที่คา<br />
similarity เดียวกันนี้การจัดกลุมเชื้อไมมีความสัมพันธกับแหลงที่ตรวจพบโรค<br />
การที่เชื้อ<br />
สายพันธุจากงาแยกกลุมออกจากพืชอาศัยชนิดอื่นๆ<br />
นั้น<br />
ปยรัตน (2541) ไดทําการปลูกเชื้อสายพันธุ<br />
จากปทุมมา ขิง มะเขือเทศ มันฝรั่ง<br />
และพริก กับพืชทดสอบคืองา พบวาแบคทีเรียทุกสายพันธุไมทํา<br />
ใหเกิดโรคเหี่ยวกับงา<br />
มีเพียงเชื้อสายพันธุจากงาเทานั้นที่ทําใหเกิดโรคในระดับรุนแรงซึ่งแสดงให<br />
เห็นความจําเพาะของเชื้อสายพันธุจากงากับพืชอาศัย<br />
การวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
R. solanacearum ไบโอวาร 3 ดวยเทคนิค<br />
PFGE พบวาเชื้อในกลุมไบโอวาร<br />
3 ของประเทศไทยมีคา similarity ต่ํา<br />
และมีความผันแปรทาง<br />
พันธุกรรมสูงมากสอดคลองกับงานวิจัยที่ทํากอนหนานี้โดยใชเทคนิค<br />
repetitive sequence PCR<br />
และ AFLP ซึ่งพบวาเชื้อในกลุมนี้มีความผันแปรสูงมากเชนกัน<br />
(ศุทธนา, 2543; Thammakijjawat et<br />
al., 2002) สาเหตุที่เชื้อ<br />
R. solanacearum ที่พบในประเทศไทยเปนเชื้อไบโอวาร<br />
3 ในอัตราสวนที่<br />
มากกวาไบโอวาร 4 และมีความผันแปรทางพันธุกรรมมากกวาเชนเดียวกับที่พบในพื้นที่ตางๆ<br />
ทั่ว<br />
โลก ทั้งนี้อาจเปนเพราะเชื้อไบโอวาร<br />
3 มีพืชอาศัยกวางกวาในขณะที่เชื้อไบโอวาร<br />
4 สวนใหญมี<br />
พืชอาศัยจํากัดอยูในพืชวงศ<br />
Zingiberaceae (Hayward, 1991) ความผันแปรทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
อาจเกิดขึ้นไดจากหลายปจจัย<br />
เชน การกลายพันธุของเชื้อโดยการเปลี่ยนแปลงลําดับเบสเพียงเบส<br />
เดียวที่ตําแหนงจดจําทําใหสูญเสียหรือเกิดตําแหนงตัดจําเพาะใหมไดซึ่งผลก็คือเกิดรูปแบบลาย<br />
พิมพดีเอ็นเอที่แตกตางกันขึ้น<br />
(Cook and Sequeira, 1994) และจากการศึกษาลําดับเบสจีโนมของ<br />
เชื้อ<br />
R. solanacearum โดย Salanoubat et al. (2002) พบบริเวณที่เรียกวา<br />
Alternative Codon Usage<br />
Regions (ACURs) ซึ่งเมื่อวิเคราะหองคประกอบเบสพบวา<br />
สวนใหญมี %GC แตกตางจากที่พบใน<br />
จีโนมทั้งหมด<br />
และ codon usage ในบริเวณนี้แตกตางจาก<br />
codon usage ในบริเวณจีโนมที่เหลือ<br />
นอกจากนี้ยังพบ<br />
candidate gene ประมาณ 50% ที่แปลรหัสเปน<br />
type III secretion system (TTSSdependent<br />
effectors) ซึ่งมีความสําคัญในกระบวนการเกิดโรคในบริเวณนี้ดวย<br />
และคาดวา ACURs<br />
45
บางสวนอาจเปน pathogenicity island (PAI) เนื่องจากพบลําดับเบสของ<br />
gene mobility ไดแก<br />
insertion sequences transposases หรือการเกิด recombination โดยที่เชื้ออาจไดรับยีนเหลานี้ผาน<br />
กระบวนการ horizontal gene transfer จะเห็นไดจากเชื้อ<br />
R. solanacearum สามารถเกิดขบวนการ<br />
transformation ในสภาพธรรมชาติได (Bertolla et al., 1997) ซึ่งอาจสงผลใหเกิดลักษณะทางพันธุ<br />
กรรมใหมๆ ของเชื้อได<br />
เชน การเกิด virulence gene หรือยีนที่เกี่ยวของกับความจําเพาะตอพืชอาศัย<br />
(host specificity) และพบวาโปรตีน PopP ซึ่งประกอบดวยโปรตีน<br />
PopP1, PopP2 และ PopP3 ทํา<br />
หนาที่เปน<br />
effector ในกระบวนการเกิดโรค โดยที่โปรตีน<br />
PopP1 มีบทบาทตอความจําเพาะของเชื้อ<br />
ตอพิทูเนีย (Petunia) (Lavie et al., 2002, 2004) การที่พบยีน<br />
TTSS effector ทั้งในสวนของ<br />
chromosomal DNA และ megaplasmid โดยที่ใน<br />
megaplasmid นั้น<br />
TTSS effector แปลรหัสไดจาก<br />
สวนของยีน hrp ซึ่งมีสวนสําคัญตอกระบวนการเกิดโรคของ<br />
R. solanacearum เชนเดียวกันกับ PAI<br />
แตยีน hrp ไมมีลักษณะของ PAI สันนิษฐานวายีน hrp อาจเปนกลุมหลัก<br />
(core group) ของ<br />
ancestral pathogenicity gene ที่มีวิวัฒนาการรวมกันมานานกับจีโนมของ<br />
R. solanacearum จากขอ<br />
มูลดังกลาวทําใหกลาวไดวา megaplasmid มีสวนสําคัญอยางยิ่งตอกระบวนการเกิดโรค<br />
ดังจะเห็น<br />
ไดจากการคนพบยีน TTSS effector (26 ยีน) มากกวาที่พบใน<br />
chromosomal DNA (20 ยีน) และยีน<br />
สวนใหญที่พบในสวนของ<br />
megaplasmid นั้นลวนมีหนาที่เกี่ยวของกับการปรับตัวของแบคทีเรียใน<br />
หลายๆ สภาพแวดลอม นอกจากนี้ยังพบวา<br />
R. solanacearum มียีนและ candidate gene อีกจํานวน<br />
มากที่มีความสําคัญและสงเสริมกระบวนการเกิดโรคของเชื้อ<br />
เชน ยีนที่แปลรหัสเปน<br />
hydrolytic<br />
enzymes ซึ่งเกี่ยวของกับการยอยผนังเซลลพืช<br />
การคนพบยีนที่เกี่ยวของกับการสราง<br />
type IV pilus<br />
ที่มีโครงสรางแตกตางกันเพื่อเอื้อประโยชนตอการเขาทําลายพืชไดหลายชนิด<br />
เปนตน (Arnold et<br />
al., 2003; Genin and Boucher, 2004; Salanoubat et al., 2002)<br />
การจัดแบงเชื้อโดยใชลักษณะทางสรีรวิทยาของเชื้อ<br />
ไดแก การจัดแบงเชื้อออกเปนไบโอ<br />
วารตามความสามารถในการใชน้ําตาลเปนวิธีที่มีความผันแปรงายในการทดสอบ<br />
เพื่อแกปญหาดัง<br />
กลาวการนําเทคนิคทางดานอณูชีววิทยามาใชในการศึกษาลักษณะทางพันธุกรรม (genotype) ซึ่งมี<br />
ความผันแปรนอยกวาจึงเริ่มมีบทบาทมากขึ้น<br />
PFGE เปนเทคนิคทางดานอณูชีววิทยาอีกเทคนิคหนึ่ง<br />
ที่นํามาใชในการจัดจําแนกและศึกษาความผันแปรทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R. solanacearum ไบโอ<br />
วาร 3 ไดเปนอยางดี เนื่องจาก<br />
PFGE สามารถผลิตลายพิมพดีเอ็นเอไดหลายรูปแบบแตกตางกัน<br />
สอดคลองกับการศึกษาของศุทธนา (2543) กับ Thammakijjawat et al. (2002) ที่พบวา<br />
R.<br />
solanacearum ไบโอวาร 3 มีความผันแปรทางพันธุกรรมมากกวาไบโอวาร 4 และการวิเคราะหลาย<br />
พิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่ไดจากเทคนิค<br />
PFGE ก็สามารถแยกความแตกตางระหวางเชื้อไบโอวาร<br />
3 กับ<br />
46
4 และแยกกลุมออกจากไบโอวาร<br />
2 ไดอยางชัดเจน เนื่องจากเทคนิค<br />
PFGE เปนวิธีที่งายมีขั้นตอน<br />
ไมซับซอน สามารถผลิตลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอจากการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะที่มีความถี่ใน<br />
การตัดต่ําไดหลายรูปแบบ<br />
ทําใหแยกความแตกตางระหวางแบคทีเรียที่มีความสัมพันธใกลชิดกันได<br />
เมื่อทําซ้ําไดผลเหมือนเดิม<br />
และจํานวนแถบดีเอ็นเอไมนอยหรือมากจนเกินไปทําใหวิเคราะหผลได<br />
งายขึ้น<br />
อยางไรก็ตาม PFGE ก็มีขอจํากัดเชนเดียวกัน ในกรณีที่เปรียบเทียบแบคทีเรียที่มีความ<br />
สัมพันธใกลชิด การเคลื่อนที่พรอมกันของแถบดีเอ็นเอ<br />
(co-migrating DNA band) อาจเกิดขึ้นได<br />
ดังนั้นเพื่อยืนยันผลวาแถบดีเอ็นเอดังกลาวเปน<br />
homologous จําเปนตองใชวิธี hybridization ในการ<br />
ทดสอบเพิ่มเติม<br />
จากการทดลองไมสามารถจัดกลุมเชื้อ<br />
R. solanacearum ไดตามพืชอาศัยหรือแหลงที่ตรวจ<br />
พบเชื้อเชนเดียวกับรายงานของศุทธนา<br />
(2543) และ Thammakijjawat et al. (2002) ถึงแมจะมีการ<br />
แบงเชื้อออกเปนกลุมยอยๆ<br />
ก็ตาม ทั้งนี้เพราะเทคนิค<br />
PFGE เปนการวิเคราะหทั้งจีโนมของเชื้อซึ่ง<br />
ประกอบดวยสวนของ chromosomal DNA ขนาด 3.7 Mb (64% ของจีโนม) และ megaplasmid<br />
ขนาด 2.1 Mb (36% ของจีโนม) อีกทั้งจากขอมูลการศึกษาลําดับเบสจีโนมของเชื้อ<br />
R.<br />
solanacearum ทําใหทราบวาการเกิดโรคขึ้นอยูกับยีนที่อยูบน<br />
megaplasmid ซึ่งคิดเปนอัตราสวน<br />
นอยในจีโนม ทําใหคา similarity ที่ไดมีคานอยกวาเทคนิค<br />
AFLP ดังนั้นการศึกษาตอไปนาจะไดมี<br />
การนําเอาเฉพาะสวนของ megaplasmid โดยเฉพาะยีนในบริเวณ ACURs ซึ่งเกี่ยวของโดยตรงกับ<br />
การเขาทําลายพืชอาศัยมาใชในการวิเคราะห ซึ่งนาจะใหความสัมพันธกับแหลงที่ตรวจพบโรค<br />
และพืชอาศัยได<br />
47
สรุปผลการทดลอง<br />
1. ผลการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum ที่เกิดจาก<br />
การตัดดวยเอนไซม XbaI และ SpeI ที่คา<br />
similarity นอยกวา 0.20 สามารถแยกเชื้อในกลุมของ<br />
ไบโอวาร 3 และ 4 ออกจากเชื้อไบโอวาร<br />
2 สายพันธุจากตางประเทศไดอยางชัดเจนสอดคลองกับ<br />
รายงานของ Cook et al. (1989)<br />
2. ลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
R. solanacearum ไบโอวาร 3 ที่ตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI<br />
และ SpeI แสดงใหเห็นความผันแปรทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
โดยพบวามีรูปแบบลายพิมพจีโนมิค<br />
ดีเอ็นเอแตกตางกันถึง 47 และ 46 รูปแบบ ตามลําดับ ผลการวิเคราะหลักษณะลายพิมพจีโนมิคดีเอ็น<br />
เอของเชื้อที่ตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI และ SpeI ที่คา<br />
similarity 0.40 และ 0.30 ตามลําดับ สามารถแยก<br />
กลุมเชื้อไดสอดคลองกับการจําแนกไบโอวารไดแก<br />
กลุมของไบโอวาร<br />
3 กลุมของไบโอวาร<br />
4 และ<br />
ไบโอวาร 2 สายพันธุจากเนปาล<br />
สอดคลองกับการศึกษาของ Frey et al. (1996) กับ<br />
Thammakijjawat et al. (2002)<br />
3. เมื่อพิจารณาความสัมพันธระหวางลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อที่ไดจากการตัดดวย<br />
เอนไซม XbaI และ SpeI กับพืชอาศัยและแหลงที่ตรวจพบโรค<br />
ที่คา<br />
similarity 0.50 พบวาสามารถ<br />
จัดกลุมเชื้อได<br />
8 และ 7 กลุม<br />
ตามลําดับ เชื้อในกลุมไบโอวาร<br />
3 แบงเปนกลุมยอยหลายกลุม<br />
โดย<br />
สามารถแยกกลุมเชื้อจากงา<br />
2 สายพันธุออกจากเชื้อสายพันธุจากพืชอาศัยชนิดอื่นๆ<br />
ได และที่คา<br />
similarity เดียวกันนี้การจัดกลุมเชื้อไมมีความสัมพันธกับแหลงที่ตรวจพบโรค<br />
4. การวิเคราะหรวมกันของลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่ไดจากการตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI<br />
และ SpeI พบวาที่คา<br />
similarity เทากับ 0.40 สามารถแยกกลุมเชื้อไดสอดคลองกับการจําแนกไบโอ<br />
วาร การจัดแบงกลุมเชื้อสวนใหญคลายคลึงกับการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่ตัดดวย<br />
เอนไซม SpeI<br />
5. การวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่ไดจากการตัดดวยเอนไซม<br />
SpeI สามารถแบง<br />
กลุมของสายพันธุเชื้อมีความสัมพันธกับชนิดไบโอวาร<br />
พืชอาศัย และแหลงที่มา<br />
ดีกวาการวิเคราะห<br />
ลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอที่ตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI<br />
48
6. การวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
R. solanacearum ไบโอวาร 3 ดวยเทคนิค<br />
PFGE พบวาเชื้อในกลุมไบโอวาร<br />
3 ของประเทศไทยมีคา similarity ต่ํา<br />
และมีความผันแปรทาง<br />
พันธุกรรมสูงมาก สอดคลองกับงานวิจัยที่ทํากอนหนานี้โดยใชเทคนิค<br />
repetitive sequence PCR<br />
และ AFLP ซึ่งพบวาเชื้อในกลุมนี้มีความผันแปรสูงมากเชนกัน<br />
(ศุทธนา, 2543; Thammakijjawat et<br />
al., 2002)<br />
7. เทคนิค Pulsed-field gel electrophoresis เปนวิธีที่มีขั้นตอนไมสลับซับซอน<br />
สามารถใช<br />
ในการศึกษาความผันแปรทางพันธุกรรมของเชื้อ<br />
R. solanacearum ไดดีเนื่องจากสามารถผลิตลาย<br />
พิมพดีเอ็นเอที่ทําใหเกิดความแตกตางระหวางเชื้อในแตละสายพันธุได<br />
และแยกความแตกตาง<br />
ระหวางเชื้อในกลุมไบโอวาร<br />
3 กับไบโอวาร 4 ซึ่งเปนกลุมที่พบในประเทศไทยไดอยางชัดเจน<br />
โดย<br />
ขอมูลจากการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอสามารถใชเปนขอมูลโครงสรางประชากรของเชื้อ<br />
เพื่อประโยชนในการวางแผนปองกันกําจัด<br />
การเฝาระวังเชื้อสายพันธุใหมที่นําเขาจากตางประเทศ<br />
ตลอดจนการใชในการปรับปรุงพันธุพืชที่ตานทานตอเชื้อนี้อยางยั่งยืน<br />
49
เอกสารและสิ่งอางอิง<br />
จุฑาเทพ วัชระไชยคุปต. 2544. การศึกษากลไกการตานทานโรคเหี่ยวของพริกจากเชื้อ<br />
Ralstonia<br />
solanaceaeum. วิทยานิพนธปริญญาโท. มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ.<br />
ประสาทพร สมิตะมาน. 2527. โรคพืชที่เกิดจากเชื้อแบคทีเรีย.<br />
น. 203-257. ใน ประสาทพร สมิ<br />
ตะมาน (ผูรวบรวม).<br />
โรคพืชวิทยา. คณะเกษตรศาสตร มหาวิทยาลัยเชียงใหม, เชียงใหม.<br />
ปยรัตน ธรรมกิจวัฒน. 2541. โรคเหี่ยวจากแบคทีเรียของปทุมมา<br />
(Curcuma alismatifolia) และ<br />
การปองกันกําจัด. วิทยานิพนธปริญญาโท. มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ.<br />
วนิดา ฐิตะฐาน, สุทธิพงษ ญาณวารี และสุเนตรา ภาวิจิตร. 2534. การมีชีวิตอยูรอดของเชื้อ<br />
Pseudomonas solanacearum biovar 3 สาเหตุโรคเหี่ยวของมะเขือเทศในดินและเศษพืช.<br />
รายงานการประชุมวิชาการพืชผักแหงชาติ ครั้งที่<br />
10 ณ วิทยาลัยเกษตรกรรมอุดรธานี<br />
จังหวัดอุดรธานี ระหวางวันที่<br />
19-22 มีนาคม 2534. สํานักงานคณะกรรมการวิจัยแหงชาติ.<br />
____________. 2542. โรคเหี่ยวของพืชที่เกิดจากแบคทีเรีย<br />
Ralstonia solanacearum. กรมวิชา<br />
การเกษตร, กรุงเทพฯ.<br />
ศักดิ์<br />
สุนทรสิงห. 2537. โรคของผักและการปองกันกําจัด. ภาควิชาโรคพืช คณะเกษตร มหาวิทยาลัย<br />
เกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ.<br />
ศุทธนา คลายมงคล. 2543. การประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อแบคทีเรีย<br />
Ralstonia solanacearum ในประเทศไทยจากลายพิมพดีเอ็นเอดวยเทคนิค Rep-PCR.<br />
วิทยานิพนธปริญญาโท. มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ.<br />
Anonymous. 1997. Gene Navigator ® System: User Manual. Pharmacia Biotech AB, Uppsala,<br />
Sweden.<br />
50
Arnold, D. L., A. Pitman and R. W. Jackson. 2003. Pathogenicity and other genomic islands in<br />
plant pathogenic bacteria. Mol. Plant Pathol. 4: 407-420.<br />
Bertolla, F., F. V. Gijsegem, X. Nesme and P. Simonet. 1997. Conditions for natural<br />
transformation of Ralstonia solanacearum. Appl. Environ. Microbiol. 63: 4965-4968.<br />
Bruce, B. and E. Lai. 1993. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Academic Press, Inc.,<br />
California.<br />
Buddenhagen, I., L. Sequeira and A. Kelman. 1962. Designation of races in Pseudomonas<br />
solanacearum. Phytopathology 52: 726.<br />
Carle, G. F., M. Frank and M. V. Olson. 1986. Electrophoretic separation of large DNA<br />
molecules by periodic inversion of the electric field. Science 232: 65-68.<br />
Chu, G., O. Vollrath and R. W. Davis. 1986. Separation of large DNA molecules by contourclamped<br />
homogeneous electric fields. Science 234: 1582-1585.<br />
Cook, D., E. Barlow and L. Sequeira. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solancearum<br />
detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify<br />
virulence and the hypersensitivity response. Mol. Plant-Microbe Interact. 2: 113-121.<br />
_______ , E. Barlow and L. Sequeira. 1991. DNA probes as tools for the study of host-pathogen<br />
evolution : the example of Pseudomonas solanacearum, pp. 103-108. In H. Hennecke<br />
and D. P. Verma, eds. Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interaction,<br />
Vol. 1. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands.<br />
________ and L. Sequeira. 1994. Strain differentiation of Pseudomonas solanacearum by<br />
molecular genetic methods, pp. 77-93. In A. C. Hayward and G. L. Hartman, eds.<br />
51
Bacterial Wilt, the Disease and Its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum.<br />
CAB International, Wallingford, United Kingdom.<br />
Cooksey, D. A. and J. H. Graham. 1989. Genomic fingerprinting of two pathovars of<br />
phytopathogenic bacteria by rare-cutting restriction enzymes and field inversion gel<br />
electrophoresis. Phytopathology 79: 745-750.<br />
Coplin, D. L. and D. R. Majerczak. 2000. Identification of Pantoea stewartii subsp. stewartii by<br />
PCR and strain differentiation by PFGE. Plant Dis. 86: 304-311.<br />
Davis, M. J., P. Rott, C. J. Warmuth, M. Chatenet and P. Baudin. 1997. Intraspecific genomic<br />
variation within Xanthomonas albilineans, the sugarcane leaf scald pathogen.<br />
Phytopathology 87: 316-324.<br />
Dice, L. R. 1945. Measurement of the amount of ecological association between species.<br />
Ecology 26: 297-302.<br />
Egel, D. S., J. H. Graham and R. E. Stall. 1991. Genomic relatedness of Xanthomonas<br />
campestris strains causing disease of citrus. Appl. Environ. Microbiol. 57: 2724-2730.<br />
Frey, P., J. J. Smith, L. Albar, P. Prior, G. S. Saddler, D. Trigalet-Demery and A. Trigalet. 1996.<br />
Bacteriocin typing of Burkholderia (Pseudomonas) solanacearum race 1 of the French<br />
West Indies and correlation with genomic variation of the pathogen. Mol. Plant Pathol.<br />
3: 111-118.<br />
Gardiner, K., W. Laas and W. Patterson. 1986. Fractionation of large mammalian DNA<br />
restriction fragments using vertical pulsed-field gradient gel electrophoresis. Somatic<br />
Cell Mol. Genet. 12: 185-195.<br />
52
Genin, S and C. Boucher. 2002. Ralstonia solanacearum: secrets of a major pathogen unveiled<br />
by analysis of its genome. Mol. Plant Pathol. 3: 111-118.<br />
___________________. 2004. Lessons learned from the genome analysis of Ralstonia<br />
solanacearum. Annu. Rev. Phytopathol. 42: 107-134.<br />
Gillings, M. and P. Fahy. 1993. Genomic fingerprinting and PCR analysis: rapid, sensitive and<br />
inexpensive means of differenting strains of Pseudomonas solanacearum, pp. 85-92. In<br />
G. L. Hartman and A. C. Hayward, eds. Bacterial Wilt. ACIAR Proceeding. No. 45.<br />
Australian Center for International Agriculture Research, Canberra.<br />
Hayward, A. C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. J. Appl. Bacteriol. 27:<br />
265-277.<br />
____________ , H. M. El-Nashaar, U. Nydegger and L. De Lindo. 1990. Variation in nitrate<br />
metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. J. Appl. Bacteriol. 69: 269-280.<br />
____________. 1991. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas<br />
solanacearum. Annu. Rev. Phytopathol. 29: 67-87.<br />
____________. 1994a. The host of Pseudomonas solanacearum. pp. 9-24 In A. C. Hayward<br />
and G. L. Hartman, eds. Bacterial Wilt: The Disease and its Causative Agent,<br />
Pseudomonas solanacearum. CAB International, Wallingford, United Kingdom.<br />
____________. 1994b. Systematics and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related<br />
bacteria, pp. 123-135. In A. C. Hayward and G. L. Hartman, eds. Bacterial Wilt: The<br />
Disease and its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum. CAB International,<br />
Wallingford, United Kingdom.<br />
53
He, L. Y., L. Sequeira and A. Kelman. 1983. Characteristics of strains of Pseudomonas<br />
solanacearum from China. Plant Disease 67: 1357-1361.<br />
Horita, M. and K. Tsuchiya. 2001. Genetic diversity of Japanese strains of Ralstonia<br />
solanacearum. Phytopathology 91: 339-407.<br />
Jaunet, T. X. and J. F. Wang. 1999. Variation in genotype and aggressiveness of Ralstonia<br />
solanacearum race 1 isolated from tomato in Taiwan. Phytopathology 89: 320-327.<br />
Jones, J. B., J. P. Jones, R. E. Stall and T. A. Zilter. 1991. Compendium of Tomato Disease.<br />
The American Phytopathological Society, St. Paul, Minnesota.<br />
Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony<br />
appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44: 693-695.<br />
Klement, Z., R. E. Stall, A. J. Novacky, T. Ersek, W. F. Fett, J. S. Huang and C. H. Beckman.<br />
1990. Mechanism of resistance, pp. 469-493. In Z. Klement, K. Rudolph and D. C.<br />
Sands, eds. Method in Phytobacteriology. Akademiai Kiado, Budapest.<br />
Lavie M., E. Shillington, C. Eguiluz, N. Grimsey and C. Boucher. 2002. PopP1, a new member<br />
of the YopJ/AvrRxv family of type III effector proteins, acts as a host-specificity factor<br />
and modulates aggressiveness of Ralstonia solanacearum. Mol. Plant-Microbe<br />
Interact. 15: 1058-1068.<br />
Lavie M., B. Seunes, P. Prior and C. Boucher. 2004. Distribution and sequence analysis of a<br />
family of type III –dependent effectors correlate with the phylogeny of Ralstonia<br />
solanacearum strains. Mol. Plant-Microbe Interact. 17: 931-940.<br />
54
Lee, Y. A., S. C. Fan, L. Y. Chiu and K. C. Hsia. 2001. Isolation of an insertion sequence from<br />
Ralstonia solanacearum race 1 and its potential use for strain characterization and<br />
detection. Appl. Environ. Microbiol. 67: 3943-3950.<br />
Li, X., M. Dorsch, D. T. Del, L. I. Sly, E. Stackebrandt and A. C. Hayward. 1993. Phytogenetic<br />
studies of the rRNA group II pseudomonads based on 16S rRNA sequences. J. Appl.<br />
Microbiol. 74: 324-329.<br />
McCarter, S. M. 1976. Persistence of Pseudomonas solanacearum in artificially infested soil.<br />
Phytopathology 66: 998-1000.<br />
Moffett, M. L., J. B. Giles and B. A. Wood. 1983. Survival of Pseudomonas solanacearum<br />
biovar 2 and 3 in soil: effect of moisture and soil type. Soil Biol. Biochem. 15: 587-591.<br />
Palleroni, N. J. and M. Doudoroff. 1971. Phenotypic characterization and deoxyribonucleic acid<br />
homologies of Pseudomonas solanacearum. J. Bacteriol. 107: 960-969.<br />
Poussier, S., D. Trigalet-Demery, P. Vandewelle, B. Goffinet, J. Luisetti and A. Trigalet. 2000.<br />
Genetic diversity of Ralstonia solanacearum as assessed by PCR-RFLP of the hrp gene<br />
region, AFLP and 16S rRNA sequence analysis, and identification of an African<br />
subdivision. Microbiology 146: 1679-1692.<br />
Poussier, S., P. Vandewelle and J. Luisetti. 1999. Genetic diversity of African and worldwide<br />
strains of Ralstonia solanacearum as determined by PCR-restriction fragment length<br />
polymorphism analysis of the hrp gene region. Appl. Environ. Microbiol. 65: 2184-<br />
2194.<br />
Rohlf, F. J. 1994. NTSYS-PC Numerical Taxonomy and Multivariation System Version<br />
2.01d. Applied Biostatistic Inc, New York.<br />
55
Romling, U. and B. Tummler. 1991. The impact of two-dimensional pulsed-field gel<br />
electrophoresis techniques for the consistent and complete mapping of bacterial genomes:<br />
refined physical map of Pseudomonas aeruginosa PAO. Nucleic Acids Res. 19: 3199-<br />
3206.<br />
Salanoubat, M., S. Genin, F. Artiguenave, J. Gouzy, S. Manfenot, M. Arlat, A. Billault, P.<br />
Brottier, J. C. Camus, L. Cattolico, M. Chandler, N. Choisne, C. Claudel-Renard, S.<br />
Cunnac, N. Demange, C. Gaspin, M. Lavie, A. Robert, W. Saurin, T. Schiex, P. Siguier, P.<br />
Thebault, M. Whalen, P. Wincker, M. Levy, J. Weissenbach and C. A. Boucher. 2002.<br />
Genome sequence of the plant pathogen Ralstonia solanacearum. Nature 415: 497-502.<br />
Sambrook, J. and D. W. Russell. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol. 1.<br />
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York.<br />
Schaad, N. W., J. W. Jones and W. Chun. 2000. Laboratory Guide for Plant Pathogenic<br />
Bacteria. American Phytopathological Society Press, St Paul, Minnessota.<br />
Schwartz, D. C. and C. R. Cantor. 1984. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed<br />
field gradient gel electrophoresis. Cell 37: 67-75.<br />
Seal, S., L. Jackson and M. Daniels. 1993. Development of molecular diagnostic technique for<br />
detection of Pseudomonas solanacearum and identification of subgroups within species,<br />
pp. 97-105. In G. L. Hartman and A. C. Hayward, eds. Bacterial Wilt. ACIAR<br />
Proceeding. No. 45. Australian Center for International Agriculture Research, Canberra.<br />
Smith, J. J., G.N. Kibatta, Z. K. Murimi, K. Y. Lum, E. Fernandez-Northcoto, L. C. Offord and<br />
G. S. Saddler. 1998. Biogeographic studies on Ralstonia solanacearum race 1 and 3 by<br />
genomic fingerprinting, pp. 50-55. In P. H. Prior, C. Allen and J. Elphinstone, eds.<br />
Bacterial Wilt Disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer-Verlag,<br />
Germany.<br />
56
Smith, J. J., L. C. Offord, M. Holderness and G. S. Saddler. 1995. Genetic diversity of<br />
Burkholderia solanacearum (syn. Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Appl.<br />
Environ. Microbiol. 61: 4263-4268.<br />
Smith, J. J., L. C. Offord, M. Holderness and G. S. Saddler. 1995. Pulsed-field gel<br />
electrophoresis analysis of Pseudomonas solanacearum. Eur. Plant Protect. Org. Bull.<br />
25: 163-167.<br />
Sokal, R. R. and C. D. Michener. 1985. A statistical method for evaluating systematic<br />
relationships. Univ. Kans. Sci. Bull. 28: 1409-1438.<br />
Southern, E. M., R. Anand, W. R. Brown and D. S. Fretcher. 1987. A model for the separation<br />
of large DNA molecules by crossed field gel electrophoresis. Nucleic Acid Res. 15:<br />
5925-5943.<br />
Taghavi, M., C. Hayward, L. I. Sly and M. Fegan. 1996. A nalysis of the phylogenetic<br />
relationship of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii and the blood<br />
disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. Int. J. Syst. Bacteriol.<br />
46: 10-15.<br />
Thammakijjawat, P., N. Thaveechai, W. Kositratana, J. Chunwongse, R. D. Frederick and N. W.<br />
Schaad. 2001. Genetic analysis of Ralstonia solanacearum strains from different hosts in<br />
Thailand using PCR-restriction fragment length polymorphism. Kasetsart J. (Nat. Sci.)<br />
35: 397-408.<br />
Thammakijjawat, P., N. Thaveechai, W. Kositratana, J. Chunwongse, R. D. Frederick and N. W.<br />
Schaad. 2002. Genetic variability of Ralstonia solanacearum strains from pepper<br />
(Capsicum annuum) in Thailand and their genetic relationship to strains from other hosts.<br />
Thai. J. Agric. Sci. 35: 415-426.<br />
57
Tseng, Y.-H, K.-T. Choy, C.-H. Hung, N.-T. Lin, J.-Y. Liu, C.-H. Lou, B.-Y. Yang, S.-F. Weng<br />
and J.-R. Wu. 1999. Chromosome map of Xanthomonas campestris pv. campestris 17<br />
with locations of gene involved in xantan gum synthesis and yellow pigmentation. J.<br />
Bacteriol. 181: 117-125.<br />
Tsuchiya, K. and M. Horita. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum in Japan, pp.<br />
61-73. In P. H. Prior, C. Allen and J. Elphinstone, eds. Bacterial Wilt Disease:<br />
Molecular and Ecological Aspects. Proceedings of the second International Bacterial<br />
Wilt Symposium. Springer-Verlag, Berlin.<br />
Van Der Wolf, J. M., P. J. M. Bonants, J. J. Smith, M. Hagenaar, E. Nijhuis, J. R. C. M. Van<br />
Beckhoven, G. S. Saddler, A. Trigalet and R. Feuillade. 1998. Genetic diversity of<br />
Ralstonia solanacearum race 3 in Western Europe determined by AFLP, RC-PFGE and<br />
Rep-PCR, pp. 44-49. In P. H. Prior, C. Allen and J. Elphinstone, eds. Bacterial Wilt<br />
Disease : Molecular and Ecological Aspects. Proceedings of the second International<br />
Bacterial Wilt Symposium. Springer-Verlag, Berlin.<br />
Walcott, R. R., Jr. D. B. Langston, Jr. F. H. Sanders and R. D. Gitaitis. 2000. Investigating<br />
intraspecific variation of Acidovorax avenae subsp. citrulli using DNA fingerprinting and<br />
whole cell fatty acid analysis. Phytopathology 90: 191-196.<br />
Yabuuchi, E., Y. Kosako, H. Oyaizu, I. Yano, H. Hotta, Y. Hashimoto, T. Ezaki, and M.<br />
Arakawa. 1992. Proposal of Burkholderia gen. nov. and transfer of seven species of the<br />
genus Pseudomonas homology group II to the new genus, with the type species<br />
Burkholderia cepacia (Palleroni and Holmes, 1981) comb. nov. Microbiol. Immunol.<br />
36: 1251-1275.<br />
Yabuuchi, E., Y. Kosako, I. Yano, H. Hotta and Y. Nishiuchi. 1995. Transfer of two<br />
Burkholderia and an Alcaligenes species to Ralstonia pickettii (Ralston, Palleroni and<br />
58
Douoroff, 1973), comb. nov. and Ralstonia eutropha (Davis, 1969) comb. nov.<br />
Microbiol. Immunol. 39: 897-904.<br />
Yap, I. V. and R. J. Nelson. 1996. Winboot a program for performing bootstrap analysis of<br />
binary data to determine the confidence limits of UPGMA based dendograms. IRRI<br />
discussion paper series 14. International Rice Research Institute, Manila, The<br />
Philippines.<br />
Yu, Q., A. M. Alvarez, P. H. Moore, F. Zee, M. S. Kim, A. de Silva, P. R. Hepperly and R. Ming.<br />
2003. Molecular diversity of Ralstonia solanacearum isolated from ginger in Hawaii.<br />
Phytopathology 93: 1124-1130.<br />
Zhang, Y. and K. Guider. 1997. Differentiation of Erwinia amylovora strains by pulsed-field gel<br />
electrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 63: 4421-4426.<br />
59
ภาคผนวก<br />
60
สูตรการคํานวณคา Dice’s Similarity Coefficient (Dice, 1945)<br />
S ij =<br />
2A<br />
2A + B + C<br />
เมื่อ<br />
Sij คือ คา similarity ระหวางตัวอยาง i และ j<br />
A คือ จํานวนแถบดีเอ็นเอทั้งหมดที่ปรากฏทั้งตัวอยาง<br />
i และ j<br />
B คือ จํานวนแถบดีเอ็นเอที่ปรากฏในตัวอยางที่<br />
i แตไมปรากฏที่<br />
j<br />
C คือ จํานวนแถบดีเอ็นเอที่ปรากฏในตัวอยางที่<br />
j แตไมปรากฏที่<br />
i<br />
61
ตารางผนวกที่<br />
1 ขอมูล similarity matrix จากการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum สายพันธุตางๆ<br />
ที่ตัดดวยเอนไซม<br />
XbaI<br />
Index (No) 1/ . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16<br />
1 1.00 1.00 0.69 0.64 0.40 0.54 0.52 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.64 0.57<br />
2 1.00 1.00 0.69 0.64 0.40 0.54 0.52 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.64 0.57<br />
3 0.69 0.69 1.00 0.52 0.43 0.58 0.64 0.64 0.64 0.64 0.70 0.70 0.70 0.70 0.62 0.62<br />
4 0.64 0.64 0.52 1.00 0.27 0.52 0.50 0.42 0.42 0.42 0.55 0.55 0.55 0.55 0.48 0.40<br />
5 0.40 0.40 0.43 0.27 1.00 0.87 0.83 0.58 0.58 0.58 0.64 0.64 0.64 0.64 0.48 0.56<br />
6 0.54 0.54 0.58 0.52 0.87 1.00 0.96 0.64 0.64 0.64 0.70 0.70 0.70 0.70 0.69 0.62<br />
7 0.52 0.52 0.64 0.50 0.83 0.96 1.00 0.69 0.69 0.69 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
8 0.59 0.59 0.64 0.42 0.58 0.64 0.69 1.00 1.00 1.00 0.75 0.75 0.75 0.75 0.67 0.74<br />
9 0.59 0.59 0.64 0.42 0.58 0.64 0.69 1.00 1.00 1.00 0.75 0.75 0.75 0.75 0.67 0.74<br />
10 0.59 0.59 0.64 0.42 0.58 0.64 0.69 1.00 1.00 1.00 0.75 0.75 0.75 0.75 0.67 0.74<br />
11 0.56 0.56 0.70 0.55 0.64 0.70 0.67 0.75 0.75 0.75 1.00 1.00 1.00 1.00 0.64 0.64<br />
12 0.56 0.56 0.70 0.55 0.64 0.70 0.67 0.75 0.75 0.75 1.00 1.00 1.00 1.00 0.64 0.64<br />
13 0.56 0.56 0.70 0.55 0.64 0.70 0.67 0.75 0.75 0.75 1.00 1.00 1.00 1.00 0.64 0.64<br />
14 0.56 0.56 0.70 0.55 0.64 0.70 0.67 0.75 0.75 0.75 1.00 1.00 1.00 1.00 0.64 0.64<br />
15 0.64 0.64 0.62 0.48 0.48 0.69 0.67 0.67 0.67 0.67 0.64 0.64 0.64 0.64 1.00 0.71<br />
16 0.57 0.57 0.62 0.40 0.56 0.62 0.67 0.74 0.74 0.74 0.64 0.64 0.64 0.64 0.71 1.00<br />
17 0.57 0.57 0.62 0.40 0.56 0.62 0.67 0.74 0.74 0.74 0.64 0.64 0.64 0.64 0.71 1.00<br />
18 0.57 0.57 0.62 0.40 0.56 0.62 0.67 0.74 0.74 0.74 0.64 0.64 0.64 0.64 0.71 1.00<br />
19 0.48 0.48 0.70 0.45 0.55 0.70 0.67 0.50 0.50 0.50 0.64 0.64 0.64 0.64 0.40 0.48<br />
20 0.44 0.44 0.48 0.50 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.67<br />
21 0.44 0.44 0.48 0.50 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.67<br />
22 0.55 0.55 0.52 0.38 0.46 0.44 0.43 0.64 0.64 0.64 0.46 0.46 0.46 0.46 0.55 0.69<br />
23 0.55 0.55 0.52 0.38 0.46 0.44 0.43 0.64 0.64 0.64 0.46 0.46 0.46 0.46 0.55 0.69<br />
24 0.38 0.38 0.58 0.43 0.43 0.50 0.56 0.56 0.56 0.56 0.61 0.61 0.61 0.61 0.54 0.62<br />
25 0.54 0.54 0.50 0.35 0.61 0.58 0.64 0.64 0.64 0.64 0.52 0.52 0.52 0.52 0.54 0.69<br />
26 0.54 0.54 0.50 0.35 0.61 0.50 0.48 0.40 0.40 0.40 0.52 0.52 0.52 0.52 0.54 0.54<br />
27 0.35 0.35 0.48 0.20 0.60 0.48 0.55 0.55 0.55 0.55 0.40 0.40 0.40 0.40 0.52 0.61<br />
28 0.50 0.50 0.62 0.56 0.56 0.62 0.67 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.50 0.50<br />
29 0.37 0.37 0.48 0.58 0.58 0.64 0.69 0.62 0.62 0.62 0.58 0.58 0.58 0.58 0.52 0.44<br />
30 0.37 0.37 0.48 0.58 0.58 0.64 0.69 0.62 0.62 0.62 0.58 0.58 0.58 0.58 0.52 0.44<br />
31 0.37 0.37 0.48 0.58 0.58 0.64 0.69 0.62 0.62 0.62 0.58 0.58 0.58 0.58 0.52 0.44<br />
32 0.37 0.37 0.64 0.42 0.50 0.56 0.62 0.54 0.54 0.54 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.59<br />
33 0.43 0.43 0.62 0.40 0.56 0.54 0.59 0.44 0.44 0.44 0.40 0.40 0.40 0.40 0.43 0.64<br />
34 0.55 0.55 0.52 0.38 0.54 0.44 0.50 0.64 0.64 0.64 0.54 0.54 0.54 0.54 0.48 0.69<br />
35 0.52 0.52 0.48 0.33 0.67 0.48 0.54 0.69 0.69 0.69 0.58 0.58 0.58 0.58 0.52 0.59<br />
36 0.45 0.45 0.41 0.43 0.64 0.55 0.60 0.53 0.53 0.53 0.50 0.50 0.50 0.50 0.52 0.58<br />
37 0.52 0.52 0.48 0.58 0.58 0.48 0.46 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50 0.50 0.50 0.67 0.44<br />
38 0.36 0.36 0.54 0.56 0.56 0.54 0.52 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.50 0.36<br />
39 0.40 0.40 0.70 0.45 0.45 0.52 0.58 0.50 0.50 0.50 0.64 0.64 0.64 0.64 0.48 0.48<br />
40 0.38 0.38 0.50 0.35 0.52 0.58 0.64 0.40 0.40 0.40 0.35 0.35 0.35 0.35 0.46 0.54<br />
41 0.57 0.57 0.69 0.48 0.48 0.54 0.59 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.64 0.64<br />
62
ตารางผนวกที่<br />
1 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32<br />
1 0.57 0.57 0.48 0.44 0.44 0.55 0.55 0.38 0.54 0.54 0.35 0.5 0.37 0.37 0.37 0.37<br />
2 0.57 0.57 0.48 0.44 0.44 0.55 0.55 0.38 0.54 0.54 0.35 0.5 0.37 0.37 0.37 0.37<br />
3 0.62 0.62 0.70 0.48 0.48 0.52 0.52 0.58 0.50 0.50 0.48 0.62 0.48 0.48 0.48 0.64<br />
4 0.40 0.40 0.45 0.50 0.50 0.38 0.38 0.43 0.35 0.35 0.20 0.56 0.58 0.58 0.58 0.42<br />
5 0.56 0.56 0.55 0.58 0.58 0.46 0.46 0.43 0.61 0.61 0.60 0.56 0.58 0.58 0.58 0.50<br />
6 0.62 0.62 0.70 0.64 0.64 0.44 0.44 0.50 0.58 0.50 0.48 0.62 0.64 0.64 0.64 0.56<br />
7 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62 0.43 0.43 0.56 0.64 0.48 0.55 0.67 0.69 0.69 0.69 0.62<br />
8 0.74 0.74 0.50 0.46 0.46 0.64 0.64 0.56 0.64 0.40 0.55 0.59 0.62 0.62 0.62 0.54<br />
9 0.74 0.74 0.50 0.46 0.46 0.64 0.64 0.56 0.64 0.40 0.55 0.59 0.62 0.62 0.62 0.54<br />
10 0.74 0.74 0.50 0.46 0.46 0.64 0.64 0.56 0.64 0.40 0.55 0.59 0.62 0.62 0.62 0.54<br />
11 0.64 0.64 0.64 0.42 0.42 0.46 0.46 0.61 0.52 0.52 0.40 0.56 0.58 0.58 0.58 0.42<br />
12 0.64 0.64 0.64 0.42 0.42 0.46 0.46 0.61 0.52 0.52 0.40 0.56 0.58 0.58 0.58 0.42<br />
13 0.64 0.64 0.64 0.42 0.42 0.46 0.46 0.61 0.52 0.52 0.40 0.56 0.58 0.58 0.58 0.42<br />
14 0.64 0.64 0.64 0.42 0.42 0.46 0.46 0.61 0.52 0.52 0.40 0.56 0.58 0.58 0.58 0.42<br />
15 0.71 0.71 0.40 0.44 0.44 0.55 0.55 0.54 0.54 0.54 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
16 1.00 1.00 0.48 0.67 0.67 0.69 0.69 0.62 0.69 0.54 0.61 0.50 0.44 0.44 0.44 0.59<br />
17 1.00 1.00 0.48 0.67 0.67 0.69 0.69 0.62 0.69 0.54 0.61 0.50 0.44 0.44 0.44 0.59<br />
18 1.00 1.00 0.48 0.67 0.67 0.69 0.69 0.62 0.69 0.54 0.61 0.50 0.44 0.44 0.44 0.59<br />
19 0.48 0.48 1.00 0.75 0.75 0.46 0.46 0.43 0.61 0.52 0.50 0.48 0.58 0.58 0.58 0.58<br />
20 0.67 0.67 0.75 1.00 1.00 0.71 0.71 0.64 0.64 0.56 0.45 0.44 0.46 0.46 0.46 0.69<br />
21 0.67 0.67 0.75 1.00 1.00 0.71 0.71 0.64 0.64 0.56 0.45 0.44 0.46 0.46 0.46 0.69<br />
22 0.69 0.69 0.46 0.71 0.71 1.00 1.00 0.67 0.67 0.59 0.50 0.69 0.64 0.64 0.64 0.57<br />
23 0.69 0.69 0.46 0.71 0.71 1.00 1.00 0.67 0.67 0.59 0.50 0.69 0.64 0.64 0.64 0.57<br />
24 0.62 0.62 0.43 0.64 0.64 0.67 0.67 1.00 0.75 0.58 0.57 0.46 0.64 0.64 0.64 0.64<br />
25 0.69 0.69 0.61 0.64 0.64 0.67 0.67 0.75 1.00 0.58 0.67 0.54 0.48 0.48 0.48 0.56<br />
26 0.54 0.54 0.52 0.56 0.56 0.59 0.59 0.58 0.58 1.00 0.67 0.54 0.72 0.72 0.72 0.56<br />
27 0.61 0.61 0.50 0.45 0.45 0.50 0.50 0.57 0.67 0.67 1.00 0.43 0.55 0.55 0.55 0.64<br />
28 0.50 0.50 0.48 0.44 0.44 0.69 0.69 0.46 0.54 0.54 0.43 1.00 0.81 0.81 0.81 0.67<br />
29 0.44 0.44 0.58 0.46 0.46 0.64 0.64 0.64 0.48 0.72 0.55 0.81 1.00 1.00 1.00 0.77<br />
30 0.44 0.44 0.58 0.46 0.46 0.64 0.64 0.64 0.48 0.72 0.55 0.81 1.00 1.00 1.00 0.77<br />
31 0.44 0.44 0.58 0.46 0.46 0.64 0.64 0.64 0.48 0.72 0.55 0.81 1.00 1.00 1.00 0.77<br />
32 0.59 0.59 0.58 0.69 0.69 0.57 0.57 0.64 0.56 0.56 0.64 0.67 0.77 0.77 0.77 1.00<br />
33 0.64 0.64 0.48 0.67 0.67 0.55 0.55 0.54 0.54 0.69 0.61 0.79 0.67 0.67 0.67 0.81<br />
34 0.69 0.69 0.46 0.71 0.71 0.47 0.47 0.67 0.52 0.52 0.58 0.62 0.64 0.64 0.64 0.71<br />
35 0.59 0.59 0.50 0.54 0.54 0.57 0.57 0.64 0.64 0.64 0.73 0.59 0.62 0.62 0.62 0.62<br />
36 0.58 0.58 0.64 0.67 0.67 0.56 0.56 0.41 0.55 0.55 0.46 0.58 0.53 0.53 0.53 0.60<br />
37 0.44 0.44 0.50 0.69 0.69 0.57 0.57 0.64 0.56 0.56 0.45 0.52 0.54 0.54 0.54 0.46<br />
38 0.36 0.36 0.48 0.52 0.52 0.48 0.48 0.38 0.38 0.46 0.43 0.57 0.74 0.74 0.74 0.67<br />
39 0.48 0.48 0.64 0.42 0.42 0.38 0.46 0.43 0.52 0.43 0.60 0.64 0.58 0.58 0.58 0.42<br />
40 0.54 0.54 0.43 0.40 0.40 0.37 0.37 0.50 0.58 0.50 0.57 0.62 0.56 0.56 0.56 0.48<br />
41 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.48 0.48 0.54 0.62 0.69 0.70 0.64 0.59 0.59 0.59 0.44<br />
42 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50 0.47 0.47 0.44 0.52 0.59 0.50 0.62 0.50 0.50 0.50 0.36<br />
63
ตารางผนวกที่<br />
1 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48<br />
1 0.43 0.55 0.52 0.45 0.52 0.36 0.40 0.38 0.57 0.62 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57<br />
2 0.43 0.55 0.52 0.45 0.52 0.36 0.40 0.38 0.57 0.62 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57<br />
3 0.62 0.52 0.48 0.41 0.48 0.54 0.70 0.50 0.69 0.67 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54<br />
4 0.40 0.38 0.33 0.43 0.58 0.56 0.45 0.35 0.48 0.46 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40<br />
5 0.56 0.54 0.67 0.64 0.58 0.56 0.45 0.52 0.48 0.54 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56<br />
6 0.54 0.44 0.48 0.55 0.48 0.54 0.52 0.58 0.54 0.59 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62<br />
7 0.59 0.50 0.54 0.60 0.46 0.52 0.58 0.64 0.59 0.64 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
8 0.44 0.64 0.69 0.53 0.46 0.59 0.50 0.40 0.59 0.71 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
9 0.44 0.64 0.69 0.53 0.46 0.59 0.50 0.40 0.59 0.71 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
10 0.44 0.64 0.69 0.53 0.46 0.59 0.50 0.40 0.59 0.71 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
11 0.40 0.54 0.58 0.50 0.50 0.56 0.64 0.35 0.56 0.62 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56<br />
12 0.40 0.54 0.58 0.50 0.50 0.56 0.64 0.35 0.56 0.62 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56<br />
13 0.40 0.54 0.58 0.50 0.50 0.56 0.64 0.35 0.56 0.62 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56<br />
14 0.40 0.54 0.58 0.50 0.50 0.56 0.64 0.35 0.56 0.62 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56<br />
15 0.43 0.48 0.52 0.52 0.67 0.50 0.48 0.46 0.64 0.55 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57<br />
16 0.64 0.69 0.59 0.58 0.44 0.36 0.48 0.54 0.64 0.62 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64<br />
17 0.64 0.69 0.59 0.58 0.44 0.36 0.48 0.54 0.64 0.62 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64<br />
18 0.64 0.69 0.59 0.58 0.44 0.36 0.48 0.54 0.64 0.62 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64<br />
19 0.48 0.46 0.50 0.64 0.50 0.48 0.64 0.43 0.56 0.62 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56<br />
20 0.67 0.71 0.54 0.67 0.69 0.52 0.42 0.40 0.59 0.50 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
21 0.67 0.71 0.54 0.67 0.69 0.52 0.42 0.40 0.59 0.50 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
22 0.55 0.47 0.57 0.56 0.57 0.48 0.38 0.37 0.48 0.47 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55<br />
23 0.55 0.47 0.57 0.56 0.57 0.48 0.46 0.37 0.48 0.47 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55<br />
24 0.54 0.67 0.64 0.41 0.64 0.38 0.43 0.50 0.54 0.44 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54<br />
25 0.54 0.52 0.64 0.55 0.56 0.38 0.52 0.58 0.62 0.52 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54<br />
26 0.69 0.52 0.64 0.55 0.56 0.46 0.43 0.50 0.69 0.59 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62<br />
27 0.61 0.58 0.73 0.46 0.45 0.43 0.60 0.57 0.70 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
28 0.79 0.62 0.59 0.58 0.52 0.57 0.64 0.62 0.64 0.62 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50<br />
29 0.67 0.64 0.62 0.53 0.54 0.74 0.58 0.56 0.59 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
30 0.67 0.64 0.62 0.53 0.54 0.74 0.58 0.56 0.59 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
31 0.67 0.64 0.62 0.53 0.54 0.74 0.58 0.56 0.59 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
32 0.81 0.71 0.62 0.60 0.46 0.67 0.42 0.48 0.44 0.36 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44<br />
33 1.00 0.69 0.67 0.65 0.52 0.64 0.40 0.54 0.57 0.48 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50<br />
34 0.69 1.00 0.79 0.69 0.64 0.62 0.46 0.52 0.62 0.47 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55<br />
35 0.67 0.79 1.00 0.67 0.69 0.67 0.58 0.56 0.67 0.57 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
36 0.65 0.69 0.67 1.00 0.73 0.65 0.64 0.62 0.58 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
37 0.52 0.64 0.69 0.73 1.00 0.74 0.42 0.40 0.44 0.29 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44<br />
38 0.64 0.62 0.67 0.65 0.74 1.00 0.40 0.38 0.50 0.48 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57<br />
39 0.40 0.46 0.58 0.64 0.42 0.40 1.00 0.78 0.80 0.77 0.72 0.72 0.72 0.72 0.72 0.72<br />
40 0.54 0.52 0.56 0.62 0.40 0.38 0.78 1.00 0.69 0.59 0.69 0.69 0.69 0.69 0.69 0.69<br />
41 0.57 0.62 0.67 0.58 0.44 0.50 0.80 0.69 1.00 0.83 0.79 0.79 0.79 0.79 0.79 0.79<br />
42 0.48 0.47 0.57 0.50 0.29 0.48 0.77 0.59 0.83 1.00 0.83 0.83 0.83 0.83 0.83 0.83<br />
64
ตารางผนวกที่<br />
1 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64<br />
1 0.57 0.57 0.44 0.48 0.48 0.48 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.59 0.64 0.64 0.64 0.44<br />
2 0.57 0.57 0.44 0.48 0.48 0.48 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.59 0.64 0.64 0.64 0.44<br />
3 0.54 0.54 0.56 0.59 0.59 0.59 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.69 0.69 0.69 0.40<br />
4 0.40 0.40 0.33 0.46 0.46 0.46 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.50 0.48 0.48 0.48 0.42<br />
5 0.56 0.56 0.42 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.58 0.56 0.56 0.56 0.50<br />
6 0.62 0.62 0.48 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.64 0.69 0.69 0.69 0.48<br />
7 0.59 0.59 0.54 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.69 0.74 0.74 0.74 0.46<br />
8 0.52 0.52 0.54 0.50 0.50 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.31<br />
9 0.52 0.52 0.54 0.50 0.50 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.31<br />
10 0.52 0.52 0.54 0.50 0.50 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.31<br />
11 0.56 0.56 0.58 0.54 0.54 0.54 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.50 0.56 0.56 0.56 0.42<br />
12 0.56 0.56 0.58 0.54 0.54 0.54 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.50 0.56 0.56 0.56 0.42<br />
13 0.56 0.56 0.58 0.54 0.54 0.54 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.50 0.56 0.56 0.56 0.42<br />
14 0.56 0.56 0.58 0.54 0.54 0.54 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.50 0.56 0.56 0.56 0.42<br />
15 0.57 0.57 0.52 0.55 0.55 0.55 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.57 0.57 0.57 0.44<br />
16 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.50 0.50 0.50 0.37<br />
17 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.50 0.50 0.50 0.37<br />
18 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.50 0.50 0.50 0.37<br />
19 0.56 0.56 0.58 0.54 0.54 0.54 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.50 0.48 0.48 0.48 0.42<br />
20 0.59 0.59 0.54 0.57 0.57 0.57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.62 0.52 0.52 0.52 0.62<br />
21 0.59 0.59 0.54 0.57 0.57 0.57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.62 0.52 0.52 0.52 0.62<br />
22 0.55 0.55 0.43 0.47 0.47 0.47 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.41 0.41 0.41 0.43<br />
23 0.55 0.55 0.43 0.47 0.47 0.47 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.50 0.41 0.41 0.41 0.43<br />
24 0.54 0.54 0.56 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.62 0.62 0.62 0.64<br />
25 0.54 0.54 0.56 0.59 0.59 0.59 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.56 0.54 0.54 0.54 0.40<br />
26 0.62 0.62 0.56 0.59 0.59 0.59 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.40 0.54 0.54 0.54 0.40<br />
27 0.52 0.52 0.55 0.58 0.58 0.58 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.45 0.52 0.52 0.52 0.27<br />
28 0.50 0.50 0.59 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.67 0.50 0.50 0.50 0.52<br />
29 0.52 0.52 0.54 0.71 0.71 0.71 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.62<br />
30 0.52 0.52 0.54 0.71 0.71 0.71 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.62<br />
31 0.52 0.52 0.54 0.71 0.71 0.71 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.62<br />
32 0.44 0.44 0.38 0.50 0.50 0.50 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.54 0.67 0.67 0.67 0.46<br />
33 0.50 0.50 0.44 0.48 0.48 0.48 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.64 0.64 0.64 0.44<br />
34 0.55 0.55 0.50 0.60 0.60 0.60 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.55 0.55 0.55 0.57<br />
35 0.59 0.59 0.62 0.71 0.71 0.71 0.69 0.69 0.69 0.69 0.69 0.54 0.59 0.59 0.59 0.54<br />
36 0.52 0.52 0.53 0.63 0.63 0.63 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.53 0.52 0.52 0.52 0.60<br />
37 0.44 0.44 0.38 0.57 0.57 0.57 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.59 0.59 0.59 0.62<br />
38 0.57 0.57 0.52 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.64 0.64 0.64 0.67<br />
39 0.72 0.72 0.67 0.77 0.77 0.77 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.58 0.56 0.56 0.56 0.33<br />
40 0.69 0.69 0.56 0.67 0.67 0.67 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.56 0.62 0.62 0.62 0.40<br />
41 0.79 0.79 0.81 0.83 0.83 0.83 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.67 0.64 0.64 0.64 0.44<br />
42 0.83 0.83 0.79 0.87 0.87 0.87 0.86 0.86 0.86 0.86 0.86 0.71 0.62 0.62 0.62 0.43<br />
65
ตารางผนวกที่<br />
1 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80<br />
1 0.44 0.44 0.44 0.44 0.46 0.40 0.59 0.59 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.48 0.48<br />
2 0.44 0.44 0.44 0.44 0.46 0.40 0.59 0.59 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.48 0.48<br />
3 0.40 0.40 0.40 0.40 0.42 0.43 0.56 0.56 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.37 0.37<br />
4 0.42 0.42 0.42 0.42 0.35 0.18 0.25 0.25 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.38 0.38<br />
5 0.50 0.50 0.50 0.50 0.52 0.55 0.67 0.67 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.54 0.54<br />
6 0.48 0.48 0.48 0.48 0.58 0.61 0.72 0.72 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.59 0.59<br />
7 0.46 0.46 0.46 0.46 0.56 0.58 0.77 0.77 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.57 0.57<br />
8 0.31 0.31 0.31 0.31 0.40 0.42 0.62 0.62 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50<br />
9 0.31 0.31 0.31 0.31 0.40 0.42 0.62 0.62 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50<br />
10 0.31 0.31 0.31 0.31 0.40 0.42 0.62 0.62 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50<br />
11 0.42 0.42 0.42 0.42 0.43 0.36 0.42 0.42 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.46 0.46<br />
12 0.42 0.42 0.42 0.42 0.43 0.36 0.42 0.42 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.46 0.46<br />
13 0.42 0.42 0.42 0.42 0.43 0.36 0.42 0.42 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.46 0.46<br />
14 0.42 0.42 0.42 0.42 0.43 0.36 0.42 0.42 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.46 0.46<br />
15 0.44 0.44 0.44 0.44 0.54 0.48 0.52 0.52 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.48 0.48<br />
16 0.37 0.37 0.37 0.37 0.54 0.56 0.59 0.59 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.62 0.62<br />
17 0.37 0.37 0.37 0.37 0.54 0.56 0.59 0.59 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.62 0.62<br />
18 0.37 0.37 0.37 0.37 0.54 0.56 0.59 0.59 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.62 0.62<br />
19 0.42 0.42 0.42 0.42 0.43 0.55 0.50 0.50 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.23 0.23<br />
20 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.67 0.38 0.38 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.43 0.43<br />
21 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.67 0.38 0.38 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.43 0.43<br />
22 0.43 0.43 0.43 0.43 0.52 0.54 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.60 0.60<br />
23 0.43 0.43 0.43 0.43 0.52 0.54 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.67 0.67<br />
24 0.64 0.64 0.64 0.64 0.67 0.52 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.44 0.44<br />
25 0.40 0.40 0.40 0.40 0.58 0.61 0.64 0.64 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.44 0.44<br />
26 0.40 0.40 0.40 0.40 0.33 0.35 0.32 0.32 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.44 0.44<br />
27 0.27 0.27 0.27 0.27 0.29 0.40 0.45 0.45 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.42 0.42<br />
28 0.52 0.52 0.52 0.52 0.31 0.24 0.59 0.59 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.62 0.62<br />
29 0.62 0.62 0.62 0.62 0.40 0.25 0.46 0.46 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.43 0.43<br />
30 0.62 0.62 0.62 0.62 0.40 0.25 0.46 0.46 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.43 0.43<br />
31 0.62 0.62 0.62 0.62 0.40 0.25 0.46 0.46 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.43 0.43<br />
32 0.46 0.46 0.46 0.46 0.56 0.50 0.46 0.46 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.43 0.43<br />
33 0.44 0.44 0.44 0.44 0.54 0.48 0.52 0.52 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.41 0.41<br />
34 0.57 0.57 0.57 0.57 0.52 0.38 0.43 0.43 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.53 0.53<br />
35 0.54 0.54 0.54 0.54 0.48 0.42 0.46 0.46 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.50 0.50<br />
36 0.60 0.60 0.60 0.60 0.41 0.36 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53 0.50 0.50<br />
37 0.62 0.62 0.62 0.62 0.48 0.33 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.50 0.50<br />
38 0.67 0.67 0.67 0.67 0.54 0.40 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.55 0.55<br />
39 0.33 0.33 0.33 0.33 0.26 0.36 0.50 0.50 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.31 0.31<br />
40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.42 0.52 0.64 0.64 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.37 0.37<br />
41 0.44 0.44 0.44 0.44 0.38 0.40 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.34 0.34<br />
42 0.43 0.43 0.43 0.43 0.37 0.38 0.57 0.57 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.53 0.53<br />
66
ตารางผนวกที่<br />
1 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91<br />
1 0.31 0.48 0.67 0.56 0.50 0.50 0.48 0.48 0.48 0.48 0.24<br />
2 0.31 0.48 0.67 0.56 0.50 0.50 0.48 0.48 0.48 0.48 0.24<br />
3 0.33 0.52 0.48 0.52 0.45 0.45 0.59 0.59 0.59 0.59 0.17<br />
4 0.43 0.46 0.58 0.55 0.48 0.48 0.54 0.54 0.54 0.54 0.09<br />
5 0.43 0.54 0.58 0.55 0.57 0.57 0.46 0.46 0.46 0.46 0.45<br />
6 0.58 0.74 0.64 0.61 0.64 0.64 0.44 0.44 0.44 0.44 0.17<br />
7 0.56 0.71 0.62 0.58 0.61 0.61 0.50 0.50 0.50 0.50 0.17<br />
8 0.32 0.57 0.46 0.58 0.52 0.52 0.50 0.50 0.50 0.50 0.08<br />
9 0.32 0.57 0.46 0.58 0.52 0.52 0.50 0.50 0.50 0.50 0.08<br />
10 0.32 0.57 0.46 0.58 0.52 0.52 0.50 0.50 0.50 0.50 0.08<br />
11 0.52 0.62 0.50 0.55 0.48 0.48 0.54 0.54 0.54 0.54 0.27<br />
12 0.52 0.62 0.50 0.55 0.48 0.48 0.54 0.54 0.54 0.54 0.27<br />
13 0.52 0.62 0.50 0.55 0.48 0.48 0.54 0.54 0.54 0.54 0.27<br />
14 0.52 0.62 0.50 0.55 0.48 0.48 0.54 0.54 0.54 0.54 0.27<br />
15 0.54 0.55 0.37 0.48 0.50 0.50 0.41 0.41 0.41 0.41 0.16<br />
16 0.46 0.55 0.59 0.64 0.58 0.58 0.41 0.41 0.41 0.41 0.16<br />
17 0.46 0.55 0.59 0.64 0.58 0.58 0.41 0.41 0.41 0.41 0.16<br />
18 0.46 0.55 0.59 0.64 0.58 0.58 0.41 0.41 0.41 0.41 0.16<br />
19 0.35 0.62 0.58 0.55 0.48 0.48 0.46 0.46 0.46 0.46 0.27<br />
20 0.40 0.57 0.54 0.50 0.43 0.43 0.50 0.50 0.50 0.50 0.25<br />
21 0.40 0.57 0.54 0.50 0.43 0.43 0.50 0.50 0.50 0.50 0.25<br />
22 0.44 0.60 0.64 0.46 0.48 0.48 0.40 0.40 0.40 0.40 0.23<br />
23 0.44 0.60 0.64 0.46 0.48 0.48 0.40 0.40 0.40 0.40 0.23<br />
24 0.50 0.59 0.48 0.61 0.45 0.45 0.30 0.30 0.30 0.30 0.43<br />
25 0.58 0.59 0.64 0.61 0.55 0.55 0.30 0.30 0.30 0.30 0.35<br />
26 0.50 0.67 0.64 0.52 0.55 0.55 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
27 0.57 0.58 0.45 0.40 0.42 0.42 0.50 0.50 0.50 0.50 0.40<br />
28 0.38 0.55 0.67 0.56 0.50 0.50 0.41 0.41 0.41 0.41 0.24<br />
29 0.48 0.57 0.54 0.58 0.52 0.52 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
30 0.48 0.57 0.54 0.58 0.52 0.52 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
31 0.48 0.57 0.54 0.58 0.52 0.52 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
32 0.40 0.71 0.62 0.50 0.52 0.52 0.36 0.36 0.36 0.36 0.25<br />
33 0.46 0.69 0.67 0.48 0.50 0.50 0.34 0.34 0.34 0.34 0.24<br />
34 0.52 0.53 0.36 0.54 0.48 0.48 0.40 0.40 0.40 0.40 0.38<br />
35 0.56 0.50 0.54 0.42 0.35 0.35 0.50 0.50 0.50 0.50 0.42<br />
36 0.34 0.44 0.47 0.36 0.30 0.30 0.50 0.50 0.50 0.50 0.36<br />
37 0.40 0.50 0.46 0.42 0.26 0.26 0.50 0.50 0.50 0.50 0.17<br />
38 0.46 0.48 0.37 0.40 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.08<br />
39 0.43 0.38 0.33 0.55 0.38 0.38 0.69 0.69 0.69 0.69 0.27<br />
40 0.42 0.52 0.32 0.35 0.36 0.36 0.59 0.59 0.59 0.59 0.35<br />
41 0.54 0.62 0.52 0.48 0.50 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.32<br />
42 0.52 0.47 0.50 0.54 0.40 0.40 0.67 0.67 0.67 0.67 0.23<br />
67
ตารางผนวกที่<br />
1 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16<br />
42 0.62 0.62 0.67 0.46 0.54 0.59 0.64 0.71 0.71 0.71 0.62 0.62 0.62 0.62 0.55 0.62<br />
43 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
44 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
45 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
46 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
47 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
48 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
49 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
50 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
51 0.44 0.44 0.56 0.33 0.42 0.48 0.54 0.54 0.54 0.54 0.58 0.58 0.58 0.58 0.52 0.59<br />
52 0.48 0.48 0.59 0.46 0.46 0.52 0.57 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.55 0.62<br />
53 0.48 0.48 0.59 0.46 0.46 0.52 0.57 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.55 0.62<br />
54 0.48 0.48 0.59 0.46 0.46 0.52 0.57 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.55 0.62<br />
55 0.52 0.52 0.64 0.42 0.50 0.56 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.67<br />
56 0.52 0.52 0.64 0.42 0.50 0.56 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.67<br />
57 0.52 0.52 0.64 0.42 0.50 0.56 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.67<br />
58 0.52 0.52 0.64 0.42 0.50 0.56 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.67<br />
59 0.52 0.52 0.64 0.42 0.50 0.56 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.67<br />
60 0.59 0.59 0.64 0.50 0.58 0.64 0.69 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50 0.50 0.50 0.59 0.59<br />
61 0.64 0.64 0.69 0.48 0.56 0.69 0.74 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.50<br />
62 0.64 0.64 0.69 0.48 0.56 0.69 0.74 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.50<br />
63 0.64 0.64 0.69 0.48 0.56 0.69 0.74 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.50<br />
64 0.44 0.44 0.40 0.42 0.50 0.48 0.46 0.31 0.31 0.31 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.37<br />
65 0.44 0.44 0.40 0.42 0.50 0.48 0.46 0.31 0.31 0.31 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.37<br />
66 0.44 0.44 0.40 0.42 0.50 0.48 0.46 0.31 0.31 0.31 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.37<br />
67 0.44 0.44 0.40 0.42 0.50 0.48 0.46 0.31 0.31 0.31 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.37<br />
68 0.44 0.44 0.40 0.42 0.50 0.48 0.46 0.31 0.31 0.31 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.37<br />
69 0.46 0.46 0.42 0.35 0.52 0.58 0.56 0.40 0.40 0.40 0.43 0.43 0.43 0.43 0.54 0.54<br />
70 0.40 0.40 0.43 0.18 0.55 0.61 0.58 0.42 0.42 0.42 0.36 0.36 0.36 0.36 0.48 0.56<br />
71 0.59 0.59 0.56 0.25 0.67 0.72 0.77 0.62 0.62 0.62 0.42 0.42 0.42 0.42 0.52 0.59<br />
72 0.59 0.59 0.56 0.25 0.67 0.72 0.77 0.62 0.62 0.62 0.42 0.42 0.42 0.42 0.52 0.59<br />
73 0.52 0.52 0.40 0.17 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.33 0.33 0.33 0.33 0.44 0.52<br />
74 0.52 0.52 0.40 0.17 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.33 0.33 0.33 0.33 0.44 0.52<br />
75 0.52 0.52 0.40 0.17 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.33 0.33 0.33 0.33 0.44 0.52<br />
76 0.52 0.52 0.40 0.17 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.33 0.33 0.33 0.33 0.44 0.52<br />
77 0.52 0.52 0.40 0.17 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.33 0.33 0.33 0.33 0.44 0.52<br />
78 0.52 0.52 0.40 0.17 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.33 0.33 0.33 0.33 0.44 0.52<br />
79 0.48 0.48 0.37 0.38 0.54 0.59 0.57 0.50 0.50 0.50 0.46 0.46 0.46 0.46 0.48 0.62<br />
80 0.48 0.48 0.37 0.38 0.54 0.59 0.57 0.50 0.50 0.50 0.46 0.46 0.46 0.46 0.48 0.62<br />
81 0.31 0.31 0.33 0.43 0.43 0.58 0.56 0.32 0.32 0.32 0.52 0.52 0.52 0.52 0.54 0.46<br />
82 0.48 0.48 0.52 0.46 0.54 0.74 0.71 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.55 0.55<br />
83 0.67 0.67 0.48 0.58 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50 0.50 0.50 0.37 0.59<br />
68
ตารางผนวกที่<br />
1 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32<br />
43 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
44 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
45 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
46 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
47 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
48 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
49 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
50 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
51 0.59 0.59 0.58 0.54 0.54 0.43 0.43 0.56 0.56 0.56 0.55 0.59 0.54 0.54 0.54 0.38<br />
52 0.62 0.62 0.54 0.57 0.57 0.47 0.47 0.59 0.59 0.59 0.58 0.62 0.71 0.71 0.71 0.50<br />
53 0.62 0.62 0.54 0.57 0.57 0.47 0.47 0.59 0.59 0.59 0.58 0.62 0.71 0.71 0.71 0.50<br />
54 0.62 0.62 0.54 0.57 0.57 0.47 0.47 0.59 0.59 0.59 0.58 0.62 0.71 0.71 0.71 0.50<br />
55 0.67 0.67 0.58 0.54 0.54 0.50 0.57 0.56 0.64 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
56 0.67 0.67 0.58 0.54 0.54 0.50 0.57 0.56 0.64 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
57 0.67 0.67 0.58 0.54 0.54 0.50 0.57 0.56 0.64 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
58 0.67 0.67 0.58 0.54 0.54 0.50 0.57 0.56 0.64 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
59 0.67 0.67 0.58 0.54 0.54 0.50 0.57 0.56 0.64 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
60 0.59 0.59 0.50 0.62 0.62 0.50 0.50 0.56 0.56 0.40 0.45 0.67 0.62 0.62 0.62 0.54<br />
61 0.50 0.50 0.48 0.52 0.52 0.41 0.41 0.62 0.54 0.54 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
62 0.50 0.50 0.48 0.52 0.52 0.41 0.41 0.62 0.54 0.54 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
63 0.50 0.50 0.48 0.52 0.52 0.41 0.41 0.62 0.54 0.54 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
64 0.37 0.37 0.42 0.62 0.62 0.43 0.43 0.64 0.40 0.40 0.27 0.52 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
65 0.37 0.37 0.42 0.62 0.62 0.43 0.43 0.64 0.40 0.40 0.27 0.52 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
66 0.37 0.37 0.42 0.62 0.62 0.43 0.43 0.64 0.40 0.40 0.27 0.52 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
67 0.37 0.37 0.42 0.62 0.62 0.43 0.43 0.64 0.40 0.40 0.27 0.52 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
68 0.37 0.37 0.42 0.62 0.62 0.43 0.43 0.64 0.40 0.40 0.27 0.52 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
69 0.54 0.54 0.43 0.72 0.72 0.52 0.52 0.67 0.58 0.33 0.29 0.31 0.40 0.40 0.40 0.56<br />
70 0.56 0.56 0.55 0.67 0.67 0.54 0.54 0.52 0.61 0.35 0.40 0.24 0.25 0.25 0.25 0.50<br />
71 0.59 0.59 0.50 0.38 0.38 0.50 0.50 0.48 0.64 0.32 0.45 0.59 0.46 0.46 0.46 0.46<br />
72 0.59 0.59 0.50 0.38 0.38 0.50 0.50 0.48 0.64 0.32 0.45 0.59 0.46 0.46 0.46 0.46<br />
73 0.52 0.52 0.58 0.54 0.54 0.50 0.50 0.48 0.56 0.40 0.36 0.44 0.38 0.38 0.38 0.38<br />
74 0.52 0.52 0.58 0.54 0.54 0.50 0.50 0.48 0.56 0.40 0.36 0.44 0.38 0.38 0.38 0.38<br />
75 0.52 0.52 0.58 0.54 0.54 0.50 0.50 0.48 0.56 0.40 0.36 0.44 0.38 0.38 0.38 0.38<br />
76 0.52 0.52 0.58 0.54 0.54 0.50 0.50 0.48 0.56 0.40 0.36 0.44 0.38 0.38 0.38 0.38<br />
77 0.52 0.52 0.58 0.54 0.54 0.50 0.50 0.48 0.56 0.40 0.36 0.44 0.38 0.38 0.38 0.38<br />
78 0.52 0.52 0.58 0.54 0.54 0.50 0.50 0.48 0.56 0.40 0.36 0.44 0.38 0.38 0.38 0.38<br />
79 0.62 0.62 0.23 0.43 0.43 0.60 0.67 0.44 0.44 0.44 0.42 0.62 0.43 0.43 0.43 0.43<br />
80 0.62 0.62 0.23 0.43 0.43 0.60 0.67 0.44 0.44 0.44 0.42 0.62 0.43 0.43 0.43 0.43<br />
81 0.46 0.46 0.35 0.40 0.40 0.44 0.44 0.50 0.58 0.50 0.57 0.38 0.48 0.48 0.48 0.40<br />
82 0.55 0.55 0.62 0.57 0.57 0.60 0.60 0.59 0.59 0.67 0.58 0.55 0.57 0.57 0.57 0.71<br />
83 0.59 0.59 0.58 0.54 0.54 0.64 0.64 0.48 0.64 0.64 0.45 0.67 0.54 0.54 0.54 0.62<br />
84 0.64 0.64 0.55 0.50 0.50 0.46 0.46 0.61 0.61 0.52 0.40 0.56 0.58 0.58 0.58 0.50<br />
69
ตารางผนวกที่<br />
1 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48<br />
43 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
44 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
45 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
46 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
47 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
48 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
49 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
50 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
51 0.44 0.50 0.62 0.53 0.38 0.52 0.67 0.56 0.81 0.79 0.81 0.81 0.81 0.81 0.81 0.81<br />
52 0.48 0.60 0.71 0.63 0.57 0.62 0.77 0.67 0.83 0.87 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90<br />
53 0.48 0.60 0.71 0.63 0.57 0.62 0.77 0.67 0.83 0.87 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90<br />
54 0.48 0.60 0.71 0.63 0.57 0.62 0.77 0.67 0.83 0.87 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90<br />
55 0.52 0.57 0.69 0.60 0.46 0.59 0.75 0.64 0.89 0.86 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89<br />
56 0.52 0.57 0.69 0.60 0.46 0.59 0.75 0.64 0.89 0.86 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89<br />
57 0.52 0.57 0.69 0.60 0.46 0.59 0.75 0.64 0.89 0.86 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89<br />
58 0.52 0.57 0.69 0.60 0.46 0.59 0.75 0.64 0.89 0.86 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89<br />
59 0.52 0.57 0.69 0.60 0.46 0.59 0.75 0.64 0.89 0.86 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89<br />
60 0.52 0.57 0.54 0.53 0.46 0.59 0.58 0.56 0.67 0.71 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74<br />
61 0.64 0.55 0.59 0.52 0.59 0.64 0.56 0.62 0.64 0.62 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71<br />
62 0.64 0.55 0.59 0.52 0.59 0.64 0.56 0.62 0.64 0.62 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71<br />
63 0.64 0.55 0.59 0.52 0.59 0.64 0.56 0.62 0.64 0.62 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71<br />
64 0.44 0.57 0.54 0.60 0.62 0.67 0.33 0.40 0.44 0.43 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
65 0.44 0.57 0.54 0.60 0.62 0.67 0.33 0.40 0.44 0.43 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
66 0.44 0.57 0.54 0.60 0.62 0.67 0.33 0.40 0.44 0.43 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
67 0.44 0.57 0.54 0.60 0.62 0.67 0.33 0.40 0.44 0.43 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
68 0.44 0.57 0.54 0.60 0.62 0.67 0.33 0.40 0.44 0.43 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
69 0.54 0.52 0.48 0.41 0.48 0.54 0.26 0.42 0.38 0.37 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54<br />
70 0.48 0.38 0.42 0.36 0.33 0.40 0.36 0.52 0.40 0.38 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56<br />
71 0.52 0.43 0.46 0.53 0.31 0.44 0.50 0.64 0.52 0.57 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
72 0.52 0.43 0.46 0.53 0.31 0.44 0.50 0.64 0.52 0.57 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
73 0.44 0.36 0.38 0.53 0.31 0.44 0.42 0.56 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
74 0.44 0.36 0.38 0.53 0.31 0.44 0.42 0.56 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
75 0.44 0.36 0.38 0.53 0.31 0.44 0.42 0.56 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
76 0.44 0.36 0.38 0.53 0.31 0.44 0.42 0.56 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
77 0.44 0.36 0.38 0.53 0.31 0.44 0.42 0.56 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
78 0.44 0.36 0.38 0.53 0.31 0.44 0.42 0.56 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
79 0.41 0.53 0.50 0.50 0.50 0.55 0.31 0.37 0.34 0.53 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62<br />
80 0.41 0.53 0.50 0.50 0.50 0.55 0.31 0.37 0.34 0.53 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62<br />
81 0.46 0.52 0.56 0.34 0.40 0.46 0.43 0.42 0.54 0.52 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62<br />
82 0.69 0.53 0.50 0.44 0.50 0.48 0.38 0.52 0.62 0.47 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55<br />
83 0.67 0.36 0.54 0.47 0.46 0.37 0.33 0.32 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
84 0.48 0.54 0.42 0.36 0.42 0.40 0.55 0.35 0.48 0.54 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48<br />
70
ตารางผนวกที่<br />
1 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64<br />
43 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
44 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
45 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
46 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
47 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
48 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
49 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
50 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
51 0.81 0.81 1.00 0.86 0.86 0.86 0.92 0.92 0.92 0.92 0.92 0.69 0.67 0.67 0.67 0.62<br />
52 0.90 0.90 0.86 1.00 1.00 1.00 0.93 0.93 0.93 0.93 0.93 0.79 0.69 0.69 0.69 0.57<br />
53 0.90 0.90 0.86 1.00 1.00 1.00 0.93 0.93 0.93 0.93 0.93 0.79 0.69 0.69 0.69 0.57<br />
54 0.90 0.90 0.86 1.00 1.00 1.00 0.93 0.93 0.93 0.93 0.93 0.79 0.69 0.69 0.69 0.57<br />
55 0.89 0.89 0.92 0.93 0.93 0.93 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.77 0.74 0.74 0.74 0.54<br />
56 0.89 0.89 0.92 0.93 0.93 0.93 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.77 0.74 0.74 0.74 0.54<br />
57 0.89 0.89 0.92 0.93 0.93 0.93 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.77 0.74 0.74 0.74 0.54<br />
58 0.89 0.89 0.92 0.93 0.93 0.93 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.77 0.74 0.74 0.74 0.54<br />
59 0.89 0.89 0.92 0.93 0.93 0.93 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.77 0.74 0.74 0.74 0.54<br />
60 0.74 0.74 0.69 0.79 0.79 0.79 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 1.00 0.81 0.81 0.81 0.69<br />
61 0.71 0.71 0.67 0.69 0.69 0.69 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74 0.81 1.00 1.00 1.00 0.67<br />
62 0.71 0.71 0.67 0.69 0.69 0.69 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74 0.81 1.00 1.00 1.00 0.67<br />
63 0.71 0.71 0.67 0.69 0.69 0.69 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74 0.81 1.00 1.00 1.00 0.67<br />
64 0.59 0.59 0.62 0.57 0.57 0.57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.69 0.67 0.67 0.67 1.00<br />
65 0.59 0.59 0.62 0.57 0.57 0.57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.69 0.67 0.67 0.67 1.00<br />
66 0.59 0.59 0.62 0.57 0.57 0.57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.69 0.67 0.67 0.67 1.00<br />
67 0.59 0.59 0.62 0.57 0.57 0.57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.69 0.67 0.67 0.67 1.00<br />
68 0.59 0.59 0.62 0.57 0.57 0.57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.69 0.67 0.67 0.67 1.00<br />
69 0.54 0.54 0.48 0.52 0.52 0.52 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.64 0.69 0.69 0.69 0.72<br />
70 0.56 0.56 0.50 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.58 0.56 0.56 0.56 0.58<br />
71 0.59 0.59 0.54 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.77 0.67 0.67 0.67 0.54<br />
72 0.59 0.59 0.54 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.77 0.67 0.67 0.67 0.54<br />
73 0.67 0.67 0.62 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.62<br />
74 0.67 0.67 0.62 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.62<br />
75 0.67 0.67 0.62 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.62<br />
76 0.67 0.67 0.62 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.62<br />
77 0.67 0.67 0.62 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.62<br />
78 0.67 0.67 0.62 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.62<br />
79 0.62 0.62 0.50 0.47 0.47 0.47 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.57 0.55 0.55 0.55 0.57<br />
80 0.62 0.62 0.50 0.47 0.47 0.47 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.57 0.55 0.55 0.55 0.57<br />
81 0.62 0.62 0.64 0.59 0.59 0.59 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.40 0.62 0.62 0.62 0.32<br />
82 0.55 0.55 0.43 0.47 0.47 0.47 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.55 0.55 0.55 0.43<br />
83 0.52 0.52 0.46 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.62 0.59 0.59 0.59 0.38<br />
84 0.48 0.48 0.50 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.48 0.48 0.48 0.25<br />
71
ตารางผนวกที่<br />
1 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80<br />
43 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
44 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
45 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
46 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
47 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
48 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
49 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
50 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
51 0.62 0.62 0.62 0.62 0.48 0.50 0.54 0.54 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50<br />
52 0.57 0.57 0.57 0.57 0.52 0.46 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.47 0.47<br />
53 0.57 0.57 0.57 0.57 0.52 0.46 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.47 0.47<br />
54 0.57 0.57 0.57 0.57 0.52 0.46 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.47 0.47<br />
55 0.54 0.54 0.54 0.54 0.48 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50<br />
56 0.54 0.54 0.54 0.54 0.48 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50<br />
57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.48 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50<br />
58 0.54 0.54 0.54 0.54 0.48 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50<br />
59 0.54 0.54 0.54 0.54 0.48 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50<br />
60 0.69 0.69 0.69 0.69 0.64 0.58 0.77 0.77 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.57 0.57<br />
61 0.67 0.67 0.67 0.67 0.69 0.56 0.67 0.67 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.55 0.55<br />
62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.69 0.56 0.67 0.67 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.55 0.55<br />
63 0.67 0.67 0.67 0.67 0.69 0.56 0.67 0.67 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.55 0.55<br />
64 1.00 1.00 1.00 1.00 0.72 0.58 0.54 0.54 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.57 0.57<br />
65 1.00 1.00 1.00 1.00 0.72 0.58 0.54 0.54 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.57 0.57<br />
66 1.00 1.00 1.00 1.00 0.72 0.58 0.54 0.54 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.57 0.57<br />
67 1.00 1.00 1.00 1.00 0.72 0.58 0.54 0.54 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.57 0.57<br />
68 1.00 1.00 1.00 1.00 0.72 0.58 0.54 0.54 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.57 0.57<br />
69 0.72 0.72 0.72 0.72 1.00 0.87 0.64 0.64 0.72 0.72 0.72 0.72 0.72 0.72 0.37 0.37<br />
70 0.58 0.58 0.58 0.58 0.87 1.00 0.75 0.75 0.83 0.83 0.83 0.83 0.83 0.83 0.38 0.38<br />
71 0.54 0.54 0.54 0.54 0.64 0.75 1.00 1.00 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.43 0.43<br />
72 0.54 0.54 0.54 0.54 0.64 0.75 1.00 1.00 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.43 0.43<br />
73 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.83 0.85 0.85 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.36 0.36<br />
74 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.83 0.85 0.85 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.36 0.36<br />
75 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.83 0.85 0.85 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.36 0.36<br />
76 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.83 0.85 0.85 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.36 0.36<br />
77 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.83 0.85 0.85 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.36 0.36<br />
78 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.83 0.85 0.85 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.36 0.36<br />
79 0.57 0.57 0.57 0.57 0.37 0.38 0.43 0.43 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 1.00 1.00<br />
80 0.57 0.57 0.57 0.57 0.37 0.38 0.43 0.43 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 1.00 1.00<br />
81 0.32 0.32 0.32 0.32 0.42 0.43 0.32 0.32 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.52 0.52<br />
82 0.43 0.43 0.43 0.43 0.44 0.46 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.53 0.53<br />
83 0.38 0.38 0.38 0.38 0.48 0.50 0.46 0.46 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.50 0.50<br />
84 0.25 0.25 0.25 0.25 0.35 0.36 0.42 0.42 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.54 0.54<br />
72
ตารางผนวกที่<br />
1 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91<br />
43 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
44 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
45 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
46 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
47 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
48 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
49 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
50 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
51 0.64 0.43 0.46 0.50 0.35 0.35 0.43 0.43 0.43 0.43 0.25<br />
52 0.59 0.47 0.50 0.46 0.48 0.48 0.60 0.60 0.60 0.60 0.31<br />
53 0.59 0.47 0.50 0.46 0.48 0.48 0.60 0.60 0.60 0.60 0.31<br />
54 0.59 0.47 0.50 0.46 0.48 0.48 0.60 0.60 0.60 0.60 0.31<br />
55 0.64 0.50 0.54 0.50 0.43 0.43 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
56 0.64 0.50 0.54 0.50 0.43 0.43 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
57 0.64 0.50 0.54 0.50 0.43 0.43 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
58 0.64 0.50 0.54 0.50 0.43 0.43 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
59 0.64 0.50 0.54 0.50 0.43 0.43 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
60 0.40 0.50 0.62 0.50 0.52 0.52 0.50 0.50 0.50 0.50 0.08<br />
61 0.62 0.55 0.59 0.48 0.50 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.24<br />
62 0.62 0.55 0.59 0.48 0.50 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.24<br />
63 0.62 0.55 0.59 0.48 0.50 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.24<br />
64 0.32 0.43 0.38 0.25 0.26 0.26 0.36 0.36 0.36 0.36 0.33<br />
65 0.32 0.43 0.38 0.25 0.26 0.26 0.36 0.36 0.36 0.36 0.33<br />
66 0.32 0.43 0.38 0.25 0.26 0.26 0.36 0.36 0.36 0.36 0.33<br />
67 0.32 0.43 0.38 0.25 0.26 0.26 0.36 0.36 0.36 0.36 0.33<br />
68 0.32 0.43 0.38 0.25 0.26 0.26 0.36 0.36 0.36 0.36 0.33<br />
69 0.42 0.44 0.48 0.35 0.36 0.36 0.07 0.07 0.07 0.07 0.17<br />
70 0.43 0.46 0.50 0.36 0.38 0.38 0.15 0.15 0.15 0.15 0.18<br />
71 0.32 0.50 0.46 0.42 0.43 0.43 0.36 0.36 0.36 0.36 0.25<br />
72 0.32 0.50 0.46 0.42 0.43 0.43 0.36 0.36 0.36 0.36 0.25<br />
73 0.40 0.50 0.38 0.33 0.35 0.35 0.21 0.21 0.21 0.21 0.42<br />
74 0.40 0.50 0.38 0.33 0.35 0.35 0.21 0.21 0.21 0.21 0.42<br />
75 0.40 0.50 0.38 0.33 0.35 0.35 0.21 0.21 0.21 0.21 0.42<br />
76 0.40 0.50 0.38 0.33 0.35 0.35 0.21 0.21 0.21 0.21 0.42<br />
77 0.40 0.50 0.38 0.33 0.35 0.35 0.21 0.21 0.21 0.21 0.42<br />
78 0.40 0.50 0.38 0.33 0.35 0.35 0.21 0.21 0.21 0.21 0.42<br />
79 0.52 0.53 0.50 0.54 0.56 0.56 0.47 0.47 0.47 0.47 0.15<br />
80 0.52 0.53 0.50 0.54 0.56 0.56 0.47 0.47 0.47 0.47 0.15<br />
81 1.00 0.74 0.48 0.61 0.64 0.64 0.30 0.30 0.30 0.30 0.43<br />
82 0.74 1.00 0.64 0.62 0.64 0.64 0.40 0.40 0.40 0.40 0.23<br />
83 0.48 0.64 1.00 0.75 0.70 0.70 0.50 0.50 0.50 0.50 0.17<br />
84 0.61 0.62 0.75 1.00 0.95 0.95 0.46 0.46 0.46 0.46 0.27<br />
73
ตารางผนวกที่<br />
1 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16<br />
84 0.56 0.56 0.52 0.55 0.55 0.61 0.58 0.58 0.58 0.58 0.55 0.55 0.55 0.55 0.48 0.64<br />
85 0.50 0.50 0.45 0.48 0.57 0.64 0.61 0.52 0.52 0.52 0.48 0.48 0.48 0.48 0.50 0.58<br />
86 0.50 0.50 0.45 0.48 0.57 0.64 0.61 0.52 0.52 0.52 0.48 0.48 0.48 0.48 0.50 0.58<br />
87 0.48 0.48 0.59 0.54 0.46 0.44 0.50 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.41 0.41<br />
88 0.48 0.48 0.59 0.54 0.46 0.44 0.50 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.41 0.41<br />
89 0.48 0.48 0.59 0.54 0.46 0.44 0.50 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.41 0.41<br />
90 0.48 0.48 0.59 0.54 0.46 0.44 0.50 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.41 0.41<br />
91 0.24 0.24 0.17 0.09 0.45 0.17 0.17 0.08 0.08 0.08 0.27 0.27 0.27 0.27 0.16 0.16<br />
Index (No) 1/ . 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32<br />
85 0.58 0.58 0.48 0.43 0.43 0.48 0.48 0.45 0.55 0.55 0.42 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
86 0.58 0.58 0.48 0.43 0.43 0.48 0.48 0.45 0.55 0.55 0.42 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
87 0.41 0.41 0.46 0.50 0.50 0.40 0.40 0.30 0.30 0.52 0.50 0.41 0.57 0.57 0.57 0.36<br />
88 0.41 0.41 0.46 0.50 0.50 0.40 0.40 0.30 0.30 0.52 0.50 0.41 0.57 0.57 0.57 0.36<br />
89 0.41 0.41 0.46 0.50 0.50 0.40 0.40 0.30 0.30 0.52 0.50 0.41 0.57 0.57 0.57 0.36<br />
90 0.41 0.41 0.46 0.50 0.50 0.40 0.40 0.30 0.30 0.52 0.50 0.41 0.57 0.57 0.57 0.36<br />
91 0.16 0.16 0.27 0.25 0.25 0.23 0.23 0.43 0.35 0.52 0.40 0.24 0.25 0.25 0.25 0.25<br />
Index (No) 1/ . 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48<br />
85 0.50 0.48 0.35 0.30 0.26 0.42 0.38 0.36 0.50 0.40 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42<br />
86 0.50 0.48 0.35 0.30 0.26 0.42 0.38 0.36 0.50 0.40 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42<br />
87 0.34 0.40 0.50 0.50 0.50 0.48 0.69 0.59 0.62 0.67 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48<br />
88 0.34 0.40 0.50 0.50 0.50 0.48 0.69 0.59 0.62 0.67 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48<br />
89 0.34 0.40 0.50 0.50 0.50 0.48 0.69 0.59 0.62 0.67 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48<br />
90 0.34 0.40 0.50 0.50 0.50 0.48 0.69 0.59 0.62 0.67 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48<br />
91 0.24 0.38 0.42 0.36 0.17 0.08 0.27 0.35 0.32 0.23 0.32 0.32 0.32 0.32 0.32 0.32<br />
Index (No) 1/ . 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64<br />
85 0.42 0.42 0.35 0.48 0.48 0.48 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.52 0.50 0.50 0.50 0.26<br />
86 0.42 0.42 0.35 0.48 0.48 0.48 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.52 0.50 0.50 0.50 0.26<br />
87 0.48 0.48 0.43 0.60 0.60 0.60 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.50 0.62 0.62 0.62 0.36<br />
88 0.48 0.48 0.43 0.60 0.60 0.60 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.50 0.62 0.62 0.62 0.36<br />
89 0.48 0.48 0.43 0.60 0.60 0.60 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.50 0.62 0.62 0.62 0.36<br />
90 0.48 0.48 0.43 0.60 0.60 0.60 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.50 0.62 0.62 0.62 0.36<br />
91 0.32 0.32 0.25 0.31 0.31 0.31 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.08 0.24 0.24 0.24 0.33<br />
74
ตารางผนวกที่<br />
1 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80<br />
85 0.26 0.26 0.26 0.26 0.36 0.38 0.43 0.43 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.56 0.56<br />
86 0.26 0.26 0.26 0.26 0.36 0.38 0.43 0.43 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.56 0.56<br />
87 0.36 0.36 0.36 0.36 0.07 0.15 0.36 0.36 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.47 0.47<br />
88 0.36 0.36 0.36 0.36 0.07 0.15 0.36 0.36 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.47 0.47<br />
89 0.36 0.36 0.36 0.36 0.07 0.15 0.36 0.36 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.47 0.47<br />
90 0.36 0.36 0.36 0.36 0.07 0.15 0.36 0.36 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.47 0.47<br />
91 0.33 0.33 0.33 0.33 0.17 0.18 0.25 0.25 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.15 0.15<br />
Index (No) 1/ . 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91<br />
85 0.64 0.64 0.70 0.95 1.00 1.00 0.40 0.40 0.40 0.40 0.29<br />
86 0.64 0.64 0.70 0.95 1.00 1.00 0.40 0.40 0.40 0.40 0.29<br />
87 0.30 0.40 0.50 0.46 0.40 0.40 1.00 1.00 1.00 1.00 0.31<br />
88 0.30 0.40 0.50 0.46 0.40 0.40 1.00 1.00 1.00 1.00 0.31<br />
89 0.30 0.40 0.50 0.46 0.40 0.40 1.00 1.00 1.00 1.00 0.31<br />
90 0.30 0.40 0.50 0.46 0.40 0.40 1.00 1.00 1.00 1.00 0.31<br />
91 0.43 0.23 0.17 0.27 0.29 0.29 0.31 0.31 0.31 0.31 1.00<br />
หมายเหตุ 1/ Index (No.) คือ หมายเลขการเรียงลําดับของสายพันธุเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum ดัง<br />
แสดงในภาพที่<br />
6<br />
75
ตารางผนวกที่<br />
2 ขอมูล similarity matrix จากการวิเคราะหลายพิมพจีโนมิคดีเอ็นเอของเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum สายพันธุตางๆ<br />
ที่ตัดดวยเอนไซม<br />
SpeI<br />
Index (No) 1/ . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16<br />
1 1.00 1.00 0.69 0.64 0.40 0.54 0.52 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.64 0.57<br />
2 1.00 1.00 0.69 0.64 0.40 0.54 0.52 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.64 0.57<br />
3 0.69 0.69 1.00 0.52 0.43 0.58 0.64 0.64 0.64 0.64 0.70 0.70 0.70 0.70 0.62 0.62<br />
4 0.64 0.64 0.52 1.00 0.27 0.52 0.50 0.42 0.42 0.42 0.55 0.55 0.55 0.55 0.48 0.40<br />
5 0.40 0.40 0.43 0.27 1.00 0.87 0.83 0.58 0.58 0.58 0.64 0.64 0.64 0.64 0.48 0.56<br />
6 0.54 0.54 0.58 0.52 0.87 1.00 0.96 0.64 0.64 0.64 0.70 0.70 0.70 0.70 0.69 0.62<br />
7 0.52 0.52 0.64 0.5 0.83 0.96 1.00 0.69 0.69 0.69 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
8 0.59 0.59 0.64 0.42 0.58 0.64 0.69 1.00 1.00 1.00 0.75 0.75 0.75 0.75 0.67 0.74<br />
9 0.59 0.59 0.64 0.42 0.58 0.64 0.69 1.00 1.00 1.00 0.75 0.75 0.75 0.75 0.67 0.74<br />
10 0.59 0.59 0.64 0.42 0.58 0.64 0.69 1.00 1.00 1.00 0.75 0.75 0.75 0.75 0.67 0.74<br />
11 0.56 0.56 0.70 0.55 0.64 0.70 0.67 0.75 0.75 0.75 1.00 1.00 1.00 1.00 0.64 0.64<br />
12 0.56 0.56 0.70 0.55 0.64 0.70 0.67 0.75 0.75 0.75 1.00 1.00 1.00 1.00 0.64 0.64<br />
13 0.56 0.56 0.70 0.55 0.64 0.70 0.67 0.75 0.75 0.75 1.00 1.00 1.00 1.00 0.64 0.64<br />
14 0.56 0.56 0.70 0.55 0.64 0.70 0.67 0.75 0.75 0.75 1.00 1.00 1.00 1.00 0.64 0.64<br />
15 0.64 0.64 0.62 0.48 0.48 0.69 0.67 0.67 0.67 0.67 0.64 0.64 0.64 0.64 1.00 0.71<br />
16 0.57 0.57 0.62 0.40 0.56 0.62 0.67 0.74 0.74 0.74 0.64 0.64 0.64 0.64 0.71 1.00<br />
17 0.57 0.57 0.62 0.40 0.56 0.62 0.67 0.74 0.74 0.74 0.64 0.64 0.64 0.64 0.71 1.00<br />
18 0.57 0.57 0.62 0.40 0.56 0.62 0.67 0.74 0.74 0.74 0.64 0.64 0.64 0.64 0.71 1.00<br />
19 0.48 0.48 0.70 0.45 0.55 0.70 0.67 0.50 0.50 0.50 0.64 0.64 0.64 0.64 0.40 0.48<br />
20 0.44 0.44 0.48 0.50 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.67<br />
21 0.44 0.44 0.48 0.50 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.67<br />
22 0.55 0.55 0.52 0.38 0.46 0.44 0.43 0.64 0.64 0.64 0.46 0.46 0.46 0.46 0.55 0.69<br />
23 0.55 0.55 0.52 0.38 0.46 0.44 0.43 0.64 0.64 0.64 0.46 0.46 0.46 0.46 0.55 0.69<br />
24 0.38 0.38 0.58 0.43 0.43 0.50 0.56 0.56 0.56 0.56 0.61 0.61 0.61 0.61 0.54 0.62<br />
25 0.54 0.54 0.50 0.35 0.61 0.58 0.64 0.64 0.64 0.64 0.52 0.52 0.52 0.52 0.54 0.69<br />
26 0.54 0.54 0.50 0.35 0.61 0.50 0.48 0.40 0.40 0.40 0.52 0.52 0.52 0.52 0.54 0.54<br />
27 0.35 0.35 0.48 0.20 0.60 0.48 0.55 0.55 0.55 0.55 0.40 0.40 0.40 0.40 0.52 0.61<br />
28 0.50 0.50 0.62 0.56 0.56 0.62 0.67 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.50 0.50<br />
29 0.37 0.37 0.48 0.58 0.58 0.64 0.69 0.62 0.62 0.62 0.58 0.58 0.58 0.58 0.52 0.44<br />
30 0.37 0.37 0.48 0.58 0.58 0.64 0.69 0.62 0.62 0.62 0.58 0.58 0.58 0.58 0.52 0.44<br />
31 0.37 0.37 0.48 0.58 0.58 0.64 0.69 0.62 0.62 0.62 0.58 0.58 0.58 0.58 0.52 0.44<br />
32 0.37 0.37 0.64 0.42 0.50 0.56 0.62 0.54 0.54 0.54 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.59<br />
33 0.43 0.43 0.62 0.40 0.56 0.54 0.59 0.44 0.44 0.44 0.40 0.40 0.40 0.40 0.43 0.64<br />
34 0.55 0.55 0.52 0.38 0.54 0.44 0.50 0.64 0.64 0.64 0.54 0.54 0.54 0.54 0.48 0.69<br />
35 0.52 0.52 0.48 0.33 0.67 0.48 0.54 0.69 0.69 0.69 0.58 0.58 0.58 0.58 0.52 0.59<br />
36 0.45 0.45 0.41 0.43 0.64 0.55 0.60 0.53 0.53 0.53 0.50 0.50 0.50 0.50 0.52 0.58<br />
37 0.52 0.52 0.48 0.58 0.58 0.48 0.46 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50 0.50 0.50 0.67 0.44<br />
38 0.36 0.36 0.54 0.56 0.56 0.54 0.52 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.50 0.36<br />
39 0.40 0.40 0.70 0.45 0.45 0.52 0.58 0.50 0.50 0.50 0.64 0.64 0.64 0.64 0.48 0.48<br />
40 0.38 0.38 0.50 0.35 0.52 0.58 0.64 0.40 0.40 0.40 0.35 0.35 0.35 0.35 0.46 0.54<br />
41 0.57 0.57 0.69 0.48 0.48 0.54 0.59 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.64 0.64<br />
76
ตารางผนวกที่<br />
2 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32<br />
1 0.57 0.57 0.48 0.44 0.44 0.55 0.55 0.38 0.54 0.54 0.35 0.50 0.37 0.37 0.37 0.37<br />
2 0.57 0.57 0.48 0.44 0.44 0.55 0.55 0.38 0.54 0.54 0.35 0.50 0.37 0.37 0.37 0.37<br />
3 0.62 0.62 0.70 0.48 0.48 0.52 0.52 0.58 0.50 0.50 0.48 0.62 0.48 0.48 0.48 0.64<br />
4 0.40 0.40 0.45 0.50 0.50 0.38 0.38 0.43 0.35 0.35 0.20 0.56 0.58 0.58 0.58 0.42<br />
5 0.56 0.56 0.55 0.58 0.58 0.46 0.46 0.43 0.61 0.61 0.60 0.56 0.58 0.58 0.58 0.50<br />
6 0.62 0.62 0.70 0.64 0.64 0.44 0.44 0.50 0.58 0.50 0.48 0.62 0.64 0.64 0.64 0.56<br />
7 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62 0.43 0.43 0.56 0.64 0.48 0.55 0.67 0.69 0.69 0.69 0.62<br />
8 0.74 0.74 0.50 0.46 0.46 0.64 0.64 0.56 0.64 0.40 0.55 0.59 0.62 0.62 0.62 0.54<br />
9 0.74 0.74 0.50 0.46 0.46 0.64 0.64 0.56 0.64 0.40 0.55 0.59 0.62 0.62 0.62 0.54<br />
10 0.74 0.74 0.50 0.46 0.46 0.64 0.64 0.56 0.64 0.40 0.55 0.59 0.62 0.62 0.62 0.54<br />
11 0.64 0.64 0.64 0.42 0.42 0.46 0.46 0.61 0.52 0.52 0.40 0.56 0.58 0.58 0.58 0.42<br />
12 0.64 0.64 0.64 0.42 0.42 0.46 0.46 0.61 0.52 0.52 0.40 0.56 0.58 0.58 0.58 0.42<br />
13 0.64 0.64 0.64 0.42 0.42 0.46 0.46 0.61 0.52 0.52 0.40 0.56 0.58 0.58 0.58 0.42<br />
14 0.64 0.64 0.64 0.42 0.42 0.46 0.46 0.61 0.52 0.52 0.40 0.56 0.58 0.58 0.58 0.42<br />
15 0.71 0.71 0.40 0.44 0.44 0.55 0.55 0.54 0.54 0.54 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
16 1.00 1.00 0.48 0.67 0.67 0.69 0.69 0.62 0.69 0.54 0.61 0.50 0.44 0.44 0.44 0.59<br />
17 1.00 1.00 0.48 0.67 0.67 0.69 0.69 0.62 0.69 0.54 0.61 0.50 0.44 0.44 0.44 0.59<br />
18 1.00 1.00 0.48 0.67 0.67 0.69 0.69 0.62 0.69 0.54 0.61 0.50 0.44 0.44 0.44 0.59<br />
19 0.48 0.48 1.00 0.75 0.75 0.46 0.46 0.43 0.61 0.52 0.50 0.48 0.58 0.58 0.58 0.58<br />
20 0.67 0.67 0.75 1.00 1.00 0.71 0.71 0.64 0.64 0.56 0.45 0.44 0.46 0.46 0.46 0.69<br />
21 0.67 0.67 0.75 1.00 1.00 0.71 0.71 0.64 0.64 0.56 0.45 0.44 0.46 0.46 0.46 0.69<br />
22 0.69 0.69 0.46 0.71 0.71 1.00 1.00 0.67 0.67 0.59 0.50 0.69 0.64 0.64 0.64 0.57<br />
23 0.69 0.69 0.46 0.71 0.71 1.00 1.00 0.67 0.67 0.59 0.50 0.69 0.64 0.64 0.64 0.57<br />
24 0.62 0.62 0.43 0.64 0.64 0.67 0.67 1.00 0.75 0.58 0.57 0.46 0.64 0.64 0.64 0.64<br />
25 0.69 0.69 0.61 0.64 0.64 0.67 0.67 0.75 1.00 0.58 0.67 0.54 0.48 0.48 0.48 0.56<br />
26 0.54 0.54 0.52 0.56 0.56 0.59 0.59 0.58 0.58 1.00 0.67 0.54 0.72 0.72 0.72 0.56<br />
27 0.61 0.61 0.50 0.45 0.45 0.50 0.50 0.57 0.67 0.67 1.00 0.43 0.55 0.55 0.55 0.64<br />
28 0.50 0.50 0.48 0.44 0.44 0.69 0.69 0.46 0.54 0.54 0.43 1.00 0.81 0.81 0.81 0.67<br />
29 0.44 0.44 0.58 0.46 0.46 0.64 0.64 0.64 0.48 0.72 0.55 0.81 1.00 1.00 1.00 0.77<br />
30 0.44 0.44 0.58 0.46 0.46 0.64 0.64 0.64 0.48 0.72 0.55 0.81 1.00 1.00 1.00 0.77<br />
31 0.44 0.44 0.58 0.46 0.46 0.64 0.64 0.64 0.48 0.72 0.55 0.81 1.00 1.00 1.00 0.77<br />
32 0.59 0.59 0.58 0.69 0.69 0.57 0.57 0.64 0.56 0.56 0.64 0.67 0.77 0.77 0.77 1.00<br />
33 0.64 0.64 0.48 0.67 0.67 0.55 0.55 0.54 0.54 0.69 0.61 0.79 0.67 0.67 0.67 0.81<br />
34 0.69 0.69 0.46 0.71 0.71 0.47 0.47 0.67 0.52 0.52 0.58 0.62 0.64 0.64 0.64 0.71<br />
35 0.59 0.59 0.50 0.54 0.54 0.57 0.57 0.64 0.64 0.64 0.73 0.59 0.62 0.62 0.62 0.62<br />
36 0.58 0.58 0.64 0.67 0.67 0.56 0.56 0.41 0.55 0.55 0.46 0.58 0.53 0.53 0.53 0.60<br />
37 0.44 0.44 0.50 0.69 0.69 0.57 0.57 0.64 0.56 0.56 0.45 0.52 0.54 0.54 0.54 0.46<br />
38 0.36 0.36 0.48 0.52 0.52 0.48 0.48 0.38 0.38 0.46 0.43 0.57 0.74 0.74 0.74 0.67<br />
39 0.48 0.48 0.64 0.42 0.42 0.38 0.46 0.43 0.52 0.43 0.60 0.64 0.58 0.58 0.58 0.42<br />
40 0.54 0.54 0.43 0.40 0.40 0.37 0.37 0.50 0.58 0.50 0.57 0.62 0.56 0.56 0.56 0.48<br />
41 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.48 0.48 0.54 0.62 0.69 0.70 0.64 0.59 0.59 0.59 0.44<br />
42 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50 0.47 0.47 0.44 0.52 0.59 0.50 0.62 0.50 0.50 0.50 0.36<br />
77
ตารางผนวกที่<br />
2 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48<br />
1 0.43 0.55 0.52 0.45 0.52 0.36 0.40 0.38 0.57 0.62 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57<br />
2 0.43 0.55 0.52 0.45 0.52 0.36 0.40 0.38 0.57 0.62 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57<br />
3 0.62 0.52 0.48 0.41 0.48 0.54 0.70 0.50 0.69 0.67 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54<br />
4 0.40 0.38 0.33 0.43 0.58 0.56 0.45 0.35 0.48 0.46 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40<br />
5 0.56 0.54 0.67 0.64 0.58 0.56 0.45 0.52 0.48 0.54 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56<br />
6 0.54 0.44 0.48 0.55 0.48 0.54 0.52 0.58 0.54 0.59 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62<br />
7 0.59 0.50 0.54 0.60 0.46 0.52 0.58 0.64 0.59 0.64 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
8 0.44 0.64 0.69 0.53 0.46 0.59 0.50 0.40 0.59 0.71 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
9 0.44 0.64 0.69 0.53 0.46 0.59 0.50 0.40 0.59 0.71 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
10 0.44 0.64 0.69 0.53 0.46 0.59 0.50 0.40 0.59 0.71 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
11 0.40 0.54 0.58 0.50 0.50 0.56 0.64 0.35 0.56 0.62 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56<br />
12 0.40 0.54 0.58 0.50 0.50 0.56 0.64 0.35 0.56 0.62 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56<br />
13 0.40 0.54 0.58 0.50 0.50 0.56 0.64 0.35 0.56 0.62 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56<br />
14 0.40 0.54 0.58 0.50 0.50 0.56 0.64 0.35 0.56 0.62 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56<br />
15 0.43 0.48 0.52 0.52 0.67 0.50 0.48 0.46 0.64 0.55 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57<br />
16 0.64 0.69 0.59 0.58 0.44 0.36 0.48 0.54 0.64 0.62 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64<br />
17 0.64 0.69 0.59 0.58 0.44 0.36 0.48 0.54 0.64 0.62 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64<br />
18 0.64 0.69 0.59 0.58 0.44 0.36 0.48 0.54 0.64 0.62 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64<br />
19 0.48 0.46 0.50 0.64 0.50 0.48 0.64 0.43 0.56 0.62 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56<br />
20 0.67 0.71 0.54 0.67 0.69 0.52 0.42 0.40 0.59 0.50 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
21 0.67 0.71 0.54 0.67 0.69 0.52 0.42 0.40 0.59 0.50 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
22 0.55 0.47 0.57 0.56 0.57 0.48 0.38 0.37 0.48 0.47 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55<br />
23 0.55 0.47 0.57 0.56 0.57 0.48 0.46 0.37 0.48 0.47 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55<br />
24 0.54 0.67 0.64 0.41 0.64 0.38 0.43 0.50 0.54 0.44 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54<br />
25 0.54 0.52 0.64 0.55 0.56 0.38 0.52 0.58 0.62 0.52 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54<br />
26 0.69 0.52 0.64 0.55 0.56 0.46 0.43 0.50 0.69 0.59 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62<br />
27 0.61 0.58 0.73 0.46 0.45 0.43 0.60 0.57 0.70 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
28 0.79 0.62 0.59 0.58 0.52 0.57 0.64 0.62 0.64 0.62 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50<br />
29 0.67 0.64 0.62 0.53 0.54 0.74 0.58 0.56 0.59 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
30 0.67 0.64 0.62 0.53 0.54 0.74 0.58 0.56 0.59 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
31 0.67 0.64 0.62 0.53 0.54 0.74 0.58 0.56 0.59 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
32 0.81 0.71 0.62 0.60 0.46 0.67 0.42 0.48 0.44 0.36 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44<br />
33 1.00 0.69 0.67 0.65 0.52 0.64 0.40 0.54 0.57 0.48 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50<br />
34 0.69 1.00 0.79 0.69 0.64 0.62 0.46 0.52 0.62 0.47 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55<br />
35 0.67 0.79 1.00 0.67 0.69 0.67 0.58 0.56 0.67 0.57 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
36 0.65 0.69 0.67 1.00 0.73 0.65 0.64 0.62 0.58 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
37 0.52 0.64 0.69 0.73 1.00 0.74 0.42 0.40 0.44 0.29 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44<br />
38 0.64 0.62 0.67 0.65 0.74 1.00 0.40 0.38 0.50 0.48 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57<br />
39 0.40 0.46 0.58 0.64 0.42 0.40 1.00 0.78 0.80 0.77 0.72 0.72 0.72 0.72 0.72 0.72<br />
40 0.54 0.52 0.56 0.62 0.40 0.38 0.78 1.00 0.69 0.59 0.69 0.69 0.69 0.69 0.69 0.69<br />
41 0.57 0.62 0.67 0.58 0.44 0.50 0.80 0.69 1.00 0.83 0.79 0.79 0.79 0.79 0.79 0.79<br />
42 0.48 0.47 0.57 0.50 0.29 0.48 0.77 0.59 0.83 1.00 0.83 0.83 0.83 0.83 0.83 0.83<br />
78
ตารางผนวกที่<br />
2 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64<br />
1 0.57 0.57 0.44 0.48 0.48 0.48 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.59 0.64 0.64 0.64 0.44<br />
2 0.57 0.57 0.44 0.48 0.48 0.48 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.59 0.64 0.64 0.64 0.44<br />
3 0.54 0.54 0.56 0.59 0.59 0.59 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.69 0.69 0.69 0.40<br />
4 0.40 0.40 0.33 0.46 0.46 0.46 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.50 0.48 0.48 0.48 0.42<br />
5 0.56 0.56 0.42 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.58 0.56 0.56 0.56 0.50<br />
6 0.62 0.62 0.48 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.64 0.69 0.69 0.69 0.48<br />
7 0.59 0.59 0.54 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.69 0.74 0.74 0.74 0.46<br />
8 0.52 0.52 0.54 0.50 0.50 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.31<br />
9 0.52 0.52 0.54 0.50 0.50 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.31<br />
10 0.52 0.52 0.54 0.50 0.50 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.31<br />
11 0.56 0.56 0.58 0.54 0.54 0.54 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.50 0.56 0.56 0.56 0.42<br />
12 0.56 0.56 0.58 0.54 0.54 0.54 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.50 0.56 0.56 0.56 0.42<br />
13 0.56 0.56 0.58 0.54 0.54 0.54 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.50 0.56 0.56 0.56 0.42<br />
14 0.56 0.56 0.58 0.54 0.54 0.54 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.50 0.56 0.56 0.56 0.42<br />
15 0.57 0.57 0.52 0.55 0.55 0.55 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.57 0.57 0.57 0.44<br />
16 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.50 0.50 0.50 0.37<br />
17 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.50 0.50 0.50 0.37<br />
18 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.50 0.50 0.50 0.37<br />
19 0.56 0.56 0.58 0.54 0.54 0.54 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.50 0.48 0.48 0.48 0.42<br />
20 0.59 0.59 0.54 0.57 0.57 0.57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.62 0.52 0.52 0.52 0.62<br />
21 0.59 0.59 0.54 0.57 0.57 0.57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.62 0.52 0.52 0.52 0.62<br />
22 0.55 0.55 0.43 0.47 0.47 0.47 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.41 0.41 0.41 0.43<br />
23 0.55 0.55 0.43 0.47 0.47 0.47 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.50 0.41 0.41 0.41 0.43<br />
24 0.54 0.54 0.56 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.62 0.62 0.62 0.64<br />
25 0.54 0.54 0.56 0.59 0.59 0.59 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.56 0.54 0.54 0.54 0.40<br />
26 0.62 0.62 0.56 0.59 0.59 0.59 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.40 0.54 0.54 0.54 0.40<br />
27 0.52 0.52 0.55 0.58 0.58 0.58 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.45 0.52 0.52 0.52 0.27<br />
28 0.50 0.50 0.59 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.67 0.50 0.50 0.50 0.52<br />
29 0.52 0.52 0.54 0.71 0.71 0.71 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.62<br />
30 0.52 0.52 0.54 0.71 0.71 0.71 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.62<br />
31 0.52 0.52 0.54 0.71 0.71 0.71 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.62<br />
32 0.44 0.44 0.38 0.50 0.50 0.50 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.54 0.67 0.67 0.67 0.46<br />
33 0.50 0.50 0.44 0.48 0.48 0.48 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.64 0.64 0.64 0.44<br />
34 0.55 0.55 0.50 0.60 0.60 0.60 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.55 0.55 0.55 0.57<br />
35 0.59 0.59 0.62 0.71 0.71 0.71 0.69 0.69 0.69 0.69 0.69 0.54 0.59 0.59 0.59 0.54<br />
36 0.52 0.52 0.53 0.62 0.62 0.62 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.53 0.52 0.52 0.52 0.60<br />
37 0.44 0.44 0.38 0.57 0.57 0.57 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.59 0.59 0.59 0.62<br />
38 0.57 0.57 0.52 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.64 0.64 0.64 0.67<br />
39 0.72 0.72 0.67 0.77 0.77 0.77 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.58 0.56 0.56 0.56 0.33<br />
40 0.69 0.69 0.56 0.67 0.67 0.67 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.56 0.62 0.62 0.62 0.40<br />
41 0.79 0.79 0.81 0.83 0.83 0.83 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.67 0.64 0.64 0.64 0.44<br />
42 0.83 0.83 0.79 0.87 0.87 0.87 0.86 0.86 0.86 0.86 0.86 0.71 0.62 0.62 0.62 0.43<br />
79
ตารางผนวกที่<br />
2 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80<br />
1 0.44 0.44 0.44 0.44 0.46 0.40 0.59 0.59 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.48 0.48<br />
2 0.44 0.44 0.44 0.44 0.46 0.40 0.59 0.59 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.48 0.48<br />
3 0.40 0.40 0.40 0.40 0.42 0.43 0.56 0.56 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.37 0.37<br />
4 0.42 0.42 0.42 0.42 0.35 0.18 0.25 0.25 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.38 0.38<br />
5 0.50 0.50 0.50 0.50 0.52 0.55 0.67 0.67 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.54 0.54<br />
6 0.48 0.48 0.48 0.48 0.58 0.61 0.72 0.72 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.59 0.59<br />
7 0.46 0.46 0.46 0.46 0.56 0.58 0.77 0.77 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.57 0.57<br />
8 0.31 0.31 0.31 0.31 0.40 0.42 0.62 0.62 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50<br />
9 0.31 0.31 0.31 0.31 0.40 0.42 0.62 0.62 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50<br />
10 0.31 0.31 0.31 0.31 0.40 0.42 0.62 0.62 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50<br />
11 0.42 0.42 0.42 0.42 0.43 0.36 0.42 0.42 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.46 0.46<br />
12 0.42 0.42 0.42 0.42 0.43 0.36 0.42 0.42 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.46 0.46<br />
13 0.42 0.42 0.42 0.42 0.43 0.36 0.42 0.42 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.46 0.46<br />
14 0.42 0.42 0.42 0.42 0.43 0.36 0.42 0.42 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.46 0.46<br />
15 0.44 0.44 0.44 0.44 0.54 0.48 0.52 0.52 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.48 0.48<br />
16 0.37 0.37 0.37 0.37 0.54 0.56 0.59 0.59 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.62 0.62<br />
17 0.37 0.37 0.37 0.37 0.54 0.56 0.59 0.59 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.62 0.62<br />
18 0.37 0.37 0.37 0.37 0.54 0.56 0.59 0.59 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.62 0.62<br />
19 0.42 0.42 0.42 0.42 0.43 0.55 0.50 0.50 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.23 0.23<br />
20 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.67 0.38 0.38 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.43 0.43<br />
21 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.67 0.38 0.38 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.43 0.43<br />
22 0.43 0.43 0.43 0.43 0.52 0.54 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.60 0.60<br />
23 0.43 0.43 0.43 0.43 0.52 0.54 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.67 0.67<br />
24 0.64 0.64 0.64 0.64 0.67 0.52 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.44 0.44<br />
25 0.40 0.40 0.40 0.40 0.58 0.61 0.64 0.64 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.44 0.44<br />
26 0.40 0.40 0.40 0.40 0.33 0.35 0.32 0.32 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.44 0.44<br />
27 0.27 0.27 0.27 0.27 0.29 0.40 0.45 0.45 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.42 0.42<br />
28 0.52 0.52 0.52 0.52 0.31 0.24 0.59 0.59 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.62 0.62<br />
29 0.62 0.62 0.62 0.62 0.40 0.25 0.46 0.46 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.43 0.43<br />
30 0.62 0.62 0.62 0.62 0.40 0.25 0.46 0.46 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.43 0.43<br />
31 0.62 0.62 0.62 0.62 0.40 0.25 0.46 0.46 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.43 0.43<br />
32 0.46 0.46 0.46 0.46 0.56 0.50 0.46 0.46 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.43 0.43<br />
33 0.44 0.44 0.44 0.44 0.54 0.48 0.52 0.52 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.41 0.41<br />
34 0.57 0.57 0.57 0.57 0.52 0.38 0.43 0.43 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.53 0.53<br />
35 0.54 0.54 0.54 0.54 0.48 0.42 0.46 0.46 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.50 0.50<br />
36 0.60 0.60 0.60 0.60 0.41 0.36 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53 0.50 0.50<br />
37 0.62 0.62 0.62 0.62 0.48 0.33 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.50 0.50<br />
38 0.67 0.67 0.67 0.67 0.54 0.40 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.55 0.55<br />
39 0.33 0.33 0.33 0.33 0.26 0.36 0.50 0.50 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.31 0.31<br />
40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.42 0.52 0.64 0.64 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.37 0.37<br />
41 0.44 0.44 0.44 0.44 0.38 0.40 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.34 0.34<br />
42 0.43 0.43 0.43 0.43 0.37 0.38 0.57 0.57 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.53 0.53<br />
80
ตารางผนวกที่<br />
2 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91<br />
1 0.31 0.48 0.67 0.56 0.50 0.50 0.48 0.48 0.48 0.48 0.24<br />
2 0.31 0.48 0.67 0.56 0.50 0.50 0.48 0.48 0.48 0.48 0.24<br />
3 0.33 0.52 0.48 0.52 0.45 0.45 0.59 0.59 0.59 0.59 0.17<br />
4 0.43 0.46 0.58 0.55 0.48 0.48 0.54 0.54 0.54 0.54 0.09<br />
5 0.43 0.54 0.58 0.55 0.57 0.57 0.46 0.46 0.46 0.46 0.45<br />
6 0.58 0.74 0.64 0.61 0.64 0.64 0.44 0.44 0.44 0.44 0.17<br />
7 0.56 0.71 0.62 0.58 0.61 0.61 0.50 0.50 0.50 0.50 0.17<br />
8 0.32 0.57 0.46 0.58 0.52 0.52 0.50 0.50 0.50 0.50 0.08<br />
9 0.32 0.57 0.46 0.58 0.52 0.52 0.50 0.50 0.50 0.50 0.08<br />
10 0.32 0.57 0.46 0.58 0.52 0.52 0.50 0.50 0.50 0.50 0.08<br />
11 0.52 0.62 0.50 0.55 0.48 0.48 0.54 0.54 0.54 0.54 0.27<br />
12 0.52 0.62 0.50 0.55 0.48 0.48 0.54 0.54 0.54 0.54 0.27<br />
13 0.52 0.62 0.50 0.55 0.48 0.48 0.54 0.54 0.54 0.54 0.27<br />
14 0.52 0.62 0.50 0.55 0.48 0.48 0.54 0.54 0.54 0.54 0.27<br />
15 0.54 0.55 0.37 0.48 0.50 0.50 0.41 0.41 0.41 0.41 0.16<br />
16 0.46 0.55 0.59 0.64 0.58 0.58 0.41 0.41 0.41 0.41 0.16<br />
17 0.46 0.55 0.59 0.64 0.58 0.58 0.41 0.41 0.41 0.41 0.16<br />
18 0.46 0.55 0.59 0.64 0.58 0.58 0.41 0.41 0.41 0.41 0.16<br />
19 0.35 0.62 0.58 0.55 0.48 0.48 0.46 0.46 0.46 0.46 0.27<br />
20 0.40 0.57 0.54 0.50 0.43 0.43 0.50 0.50 0.50 0.50 0.25<br />
21 0.40 0.57 0.54 0.50 0.43 0.43 0.50 0.50 0.50 0.50 0.25<br />
22 0.44 0.60 0.64 0.46 0.48 0.48 0.40 0.40 0.40 0.40 0.23<br />
23 0.44 0.60 0.64 0.46 0.48 0.48 0.40 0.40 0.40 0.40 0.23<br />
24 0.50 0.59 0.48 0.61 0.45 0.45 0.30 0.30 0.30 0.30 0.43<br />
25 0.58 0.59 0.64 0.61 0.55 0.55 0.30 0.30 0.30 0.30 0.35<br />
26 0.50 0.67 0.64 0.52 0.55 0.55 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
27 0.57 0.58 0.45 0.40 0.42 0.42 0.50 0.50 0.50 0.50 0.40<br />
28 0.38 0.55 0.67 0.56 0.50 0.50 0.41 0.41 0.41 0.41 0.24<br />
29 0.48 0.57 0.54 0.58 0.52 0.52 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
30 0.48 0.57 0.54 0.58 0.52 0.52 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
31 0.48 0.57 0.54 0.58 0.52 0.52 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
32 0.40 0.71 0.62 0.50 0.52 0.52 0.36 0.36 0.36 0.36 0.25<br />
33 0.46 0.69 0.67 0.48 0.50 0.50 0.34 0.34 0.34 0.34 0.24<br />
34 0.52 0.53 0.36 0.54 0.48 0.48 0.40 0.40 0.40 0.40 0.38<br />
35 0.56 0.50 0.54 0.42 0.35 0.35 0.50 0.50 0.50 0.50 0.42<br />
36 0.34 0.44 0.47 0.36 0.30 0.30 0.50 0.50 0.50 0.50 0.36<br />
37 0.40 0.50 0.46 0.42 0.26 0.26 0.50 0.50 0.50 0.50 0.17<br />
38 0.46 0.48 0.37 0.40 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.08<br />
39 0.43 0.38 0.33 0.55 0.38 0.38 0.69 0.69 0.69 0.69 0.27<br />
40 0.42 0.52 0.32 0.35 0.36 0.36 0.59 0.59 0.59 0.59 0.35<br />
41 0.54 0.62 0.52 0.48 0.50 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.32<br />
42 0.52 0.47 0.50 0.54 0.40 0.40 0.67 0.67 0.67 0.67 0.23<br />
81
ตารางผนวกที่<br />
2 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16<br />
42 0.62 0.62 0.67 0.46 0.54 0.59 0.64 0.71 0.71 0.71 0.62 0.62 0.62 0.62 0.55 0.62<br />
43 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
44 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
45 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
46 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
47 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
48 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
49 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
50 0.57 0.57 0.54 0.40 0.56 0.62 0.59 0.52 0.52 0.52 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.64<br />
51 0.44 0.44 0.56 0.33 0.42 0.48 0.54 0.54 0.54 0.54 0.58 0.58 0.58 0.58 0.52 0.59<br />
52 0.48 0.48 0.59 0.46 0.46 0.52 0.57 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.55 0.62<br />
53 0.48 0.48 0.59 0.46 0.46 0.52 0.57 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.55 0.62<br />
54 0.48 0.48 0.59 0.46 0.46 0.52 0.57 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.55 0.62<br />
55 0.52 0.52 0.64 0.42 0.50 0.56 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.67<br />
56 0.52 0.52 0.64 0.42 0.50 0.56 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.67<br />
57 0.52 0.52 0.64 0.42 0.50 0.56 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.67<br />
58 0.52 0.52 0.64 0.42 0.50 0.56 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.67<br />
59 0.52 0.52 0.64 0.42 0.50 0.56 0.62 0.62 0.62 0.62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.59 0.67<br />
60 0.59 0.59 0.64 0.50 0.58 0.64 0.69 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50 0.50 0.50 0.59 0.59<br />
61 0.64 0.64 0.69 0.48 0.56 0.69 0.74 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.50<br />
62 0.64 0.64 0.69 0.48 0.56 0.69 0.74 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.50<br />
63 0.64 0.64 0.69 0.48 0.56 0.69 0.74 0.59 0.59 0.59 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.50<br />
64 0.44 0.44 0.40 0.42 0.50 0.48 0.46 0.31 0.31 0.31 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.37<br />
65 0.44 0.44 0.40 0.42 0.50 0.48 0.46 0.31 0.31 0.31 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.37<br />
66 0.44 0.44 0.40 0.42 0.50 0.48 0.46 0.31 0.31 0.31 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.37<br />
67 0.44 0.44 0.40 0.42 0.50 0.48 0.46 0.31 0.31 0.31 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.37<br />
68 0.44 0.44 0.40 0.42 0.50 0.48 0.46 0.31 0.31 0.31 0.42 0.42 0.42 0.42 0.44 0.37<br />
69 0.46 0.46 0.42 0.35 0.52 0.58 0.56 0.40 0.40 0.40 0.43 0.43 0.43 0.43 0.54 0.54<br />
70 0.40 0.40 0.43 0.18 0.55 0.61 0.58 0.42 0.42 0.42 0.36 0.36 0.36 0.36 0.48 0.56<br />
71 0.59 0.59 0.56 0.25 0.67 0.72 0.77 0.62 0.62 0.62 0.42 0.42 0.42 0.42 0.52 0.59<br />
72 0.59 0.59 0.56 0.25 0.67 0.72 0.77 0.62 0.62 0.62 0.42 0.42 0.42 0.42 0.52 0.59<br />
73 0.52 0.52 0.40 0.17 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.33 0.33 0.33 0.33 0.44 0.52<br />
74 0.52 0.52 0.40 0.17 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.33 0.33 0.33 0.33 0.44 0.52<br />
75 0.52 0.52 0.40 0.17 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.33 0.33 0.33 0.33 0.44 0.52<br />
76 0.52 0.52 0.40 0.17 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.33 0.33 0.33 0.33 0.44 0.52<br />
77 0.52 0.52 0.40 0.17 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.33 0.33 0.33 0.33 0.44 0.52<br />
78 0.52 0.52 0.40 0.17 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.33 0.33 0.33 0.33 0.44 0.52<br />
79 0.48 0.48 0.37 0.38 0.54 0.59 0.57 0.50 0.50 0.50 0.46 0.46 0.46 0.46 0.48 0.62<br />
80 0.48 0.48 0.37 0.38 0.54 0.59 0.57 0.50 0.50 0.50 0.46 0.46 0.46 0.46 0.48 0.62<br />
81 0.31 0.31 0.33 0.43 0.43 0.58 0.56 0.32 0.32 0.32 0.52 0.52 0.52 0.52 0.54 0.46<br />
82 0.48 0.48 0.52 0.46 0.54 0.74 0.71 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.55 0.55<br />
83 0.67 0.67 0.48 0.58 0.58 0.64 0.62 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50 0.50 0.50 0.37 0.59<br />
82
ตารางผนวกที่<br />
2 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32<br />
43 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
44 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
45 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
46 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
47 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
48 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
49 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
50 0.64 0.64 0.56 0.59 0.59 0.55 0.55 0.54 0.54 0.62 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.44<br />
51 0.59 0.59 0.58 0.54 0.54 0.43 0.43 0.56 0.56 0.56 0.55 0.59 0.54 0.54 0.54 0.38<br />
52 0.62 0.62 0.54 0.57 0.57 0.47 0.47 0.59 0.59 0.59 0.58 0.62 0.71 0.71 0.71 0.50<br />
53 0.62 0.62 0.54 0.57 0.57 0.47 0.47 0.59 0.59 0.59 0.58 0.62 0.71 0.71 0.71 0.50<br />
54 0.62 0.62 0.54 0.57 0.57 0.47 0.47 0.59 0.59 0.59 0.58 0.62 0.71 0.71 0.71 0.50<br />
55 0.67 0.67 0.58 0.54 0.54 0.50 0.57 0.56 0.64 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
56 0.67 0.67 0.58 0.54 0.54 0.50 0.57 0.56 0.64 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
57 0.67 0.67 0.58 0.54 0.54 0.50 0.57 0.56 0.64 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
58 0.67 0.67 0.58 0.54 0.54 0.50 0.57 0.56 0.64 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
59 0.67 0.67 0.58 0.54 0.54 0.50 0.57 0.56 0.64 0.64 0.64 0.59 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
60 0.59 0.59 0.50 0.62 0.62 0.50 0.50 0.56 0.56 0.40 0.45 0.67 0.62 0.62 0.62 0.54<br />
61 0.50 0.50 0.48 0.52 0.52 0.41 0.41 0.62 0.54 0.54 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
62 0.50 0.50 0.48 0.52 0.52 0.41 0.41 0.62 0.54 0.54 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
63 0.50 0.50 0.48 0.52 0.52 0.41 0.41 0.62 0.54 0.54 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
64 0.37 0.37 0.42 0.62 0.62 0.43 0.43 0.64 0.40 0.40 0.27 0.52 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
65 0.37 0.37 0.42 0.62 0.62 0.43 0.43 0.64 0.40 0.40 0.27 0.52 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
66 0.37 0.37 0.42 0.62 0.62 0.43 0.43 0.64 0.40 0.40 0.27 0.52 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
67 0.37 0.37 0.42 0.62 0.62 0.43 0.43 0.64 0.40 0.40 0.27 0.52 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
68 0.37 0.37 0.42 0.62 0.62 0.43 0.43 0.64 0.40 0.40 0.27 0.52 0.62 0.62 0.62 0.46<br />
69 0.54 0.54 0.43 0.72 0.72 0.52 0.52 0.67 0.58 0.33 0.29 0.31 0.40 0.40 0.40 0.56<br />
70 0.56 0.56 0.55 0.67 0.67 0.54 0.54 0.52 0.61 0.35 0.40 0.24 0.25 0.25 0.25 0.50<br />
71 0.59 0.59 0.50 0.38 0.38 0.50 0.50 0.48 0.64 0.32 0.45 0.59 0.46 0.46 0.46 0.46<br />
72 0.59 0.59 0.50 0.38 0.38 0.50 0.50 0.48 0.64 0.32 0.45 0.59 0.46 0.46 0.46 0.46<br />
73 0.52 0.52 0.58 0.54 0.54 0.50 0.50 0.48 0.56 0.40 0.36 0.44 0.38 0.38 0.38 0.38<br />
74 0.52 0.52 0.58 0.54 0.54 0.50 0.50 0.48 0.56 0.40 0.36 0.44 0.38 0.38 0.38 0.38<br />
75 0.52 0.52 0.58 0.54 0.54 0.50 0.50 0.48 0.56 0.40 0.36 0.44 0.38 0.38 0.38 0.38<br />
76 0.52 0.52 0.58 0.54 0.54 0.50 0.50 0.48 0.56 0.40 0.36 0.44 0.38 0.38 0.38 0.38<br />
77 0.52 0.52 0.58 0.54 0.54 0.50 0.50 0.48 0.56 0.40 0.36 0.44 0.38 0.38 0.38 0.38<br />
78 0.52 0.52 0.58 0.54 0.54 0.50 0.50 0.48 0.56 0.40 0.36 0.44 0.38 0.38 0.38 0.38<br />
79 0.62 0.62 0.23 0.43 0.43 0.60 0.67 0.44 0.44 0.44 0.42 0.62 0.43 0.43 0.43 0.43<br />
80 0.62 0.62 0.23 0.43 0.43 0.60 0.67 0.44 0.44 0.44 0.42 0.62 0.43 0.43 0.43 0.43<br />
81 0.46 0.46 0.35 0.40 0.40 0.44 0.44 0.50 0.58 0.50 0.57 0.38 0.48 0.48 0.48 0.40<br />
82 0.55 0.55 0.62 0.57 0.57 0.60 0.60 0.59 0.59 0.67 0.58 0.55 0.57 0.57 0.57 0.71<br />
83 0.59 0.59 0.58 0.54 0.54 0.64 0.64 0.48 0.64 0.64 0.45 0.67 0.54 0.54 0.54 0.62<br />
84 0.64 0.64 0.55 0.50 0.50 0.46 0.46 0.61 0.61 0.52 0.40 0.56 0.58 0.58 0.58 0.50<br />
83
ตารางผนวกที่<br />
2 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48<br />
43 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
44 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
45 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
46 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
47 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
48 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
49 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
50 0.50 0.55 0.59 0.52 0.44 0.57 0.72 0.69 0.79 0.83 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00<br />
51 0.44 0.50 0.62 0.53 0.38 0.52 0.67 0.56 0.81 0.79 0.81 0.81 0.81 0.81 0.81 0.81<br />
52 0.48 0.60 0.71 0.63 0.57 0.62 0.77 0.67 0.83 0.87 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90<br />
53 0.48 0.60 0.71 0.63 0.57 0.62 0.77 0.67 0.83 0.87 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90<br />
54 0.48 0.60 0.71 0.63 0.57 0.62 0.77 0.67 0.83 0.87 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90<br />
55 0.52 0.57 0.69 0.60 0.46 0.59 0.75 0.64 0.89 0.86 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89<br />
56 0.52 0.57 0.69 0.60 0.46 0.59 0.75 0.64 0.89 0.86 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89<br />
57 0.52 0.57 0.69 0.60 0.46 0.59 0.75 0.64 0.89 0.86 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89<br />
58 0.52 0.57 0.69 0.60 0.46 0.59 0.75 0.64 0.89 0.86 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89<br />
59 0.52 0.57 0.69 0.60 0.46 0.59 0.75 0.64 0.89 0.86 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89<br />
60 0.52 0.57 0.54 0.53 0.46 0.59 0.58 0.56 0.67 0.71 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74<br />
61 0.64 0.55 0.59 0.52 0.59 0.64 0.56 0.62 0.64 0.62 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71<br />
62 0.64 0.55 0.59 0.52 0.59 0.64 0.56 0.62 0.64 0.62 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71<br />
63 0.64 0.55 0.59 0.52 0.59 0.64 0.56 0.62 0.64 0.62 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71<br />
64 0.44 0.57 0.54 0.60 0.62 0.67 0.33 0.40 0.44 0.43 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
65 0.44 0.57 0.54 0.60 0.62 0.67 0.33 0.40 0.44 0.43 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
66 0.44 0.57 0.54 0.60 0.62 0.67 0.33 0.40 0.44 0.43 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
67 0.44 0.57 0.54 0.60 0.62 0.67 0.33 0.40 0.44 0.43 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
68 0.44 0.57 0.54 0.60 0.62 0.67 0.33 0.40 0.44 0.43 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
69 0.54 0.52 0.48 0.41 0.48 0.54 0.26 0.42 0.38 0.37 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54<br />
70 0.48 0.38 0.42 0.36 0.33 0.40 0.36 0.52 0.40 0.38 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56<br />
71 0.52 0.43 0.46 0.53 0.31 0.44 0.50 0.64 0.52 0.57 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
72 0.52 0.43 0.46 0.53 0.31 0.44 0.50 0.64 0.52 0.57 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59<br />
73 0.44 0.36 0.38 0.53 0.31 0.44 0.42 0.56 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
74 0.44 0.36 0.38 0.53 0.31 0.44 0.42 0.56 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
75 0.44 0.36 0.38 0.53 0.31 0.44 0.42 0.56 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
76 0.44 0.36 0.38 0.53 0.31 0.44 0.42 0.56 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
77 0.44 0.36 0.38 0.53 0.31 0.44 0.42 0.56 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
78 0.44 0.36 0.38 0.53 0.31 0.44 0.42 0.56 0.52 0.50 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67<br />
79 0.41 0.53 0.50 0.50 0.50 0.55 0.31 0.37 0.34 0.53 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62<br />
80 0.41 0.53 0.50 0.50 0.50 0.55 0.31 0.37 0.34 0.53 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62<br />
81 0.46 0.52 0.56 0.34 0.40 0.46 0.43 0.42 0.54 0.52 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62<br />
82 0.69 0.53 0.50 0.44 0.50 0.48 0.38 0.52 0.62 0.47 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55<br />
83 0.67 0.36 0.54 0.47 0.46 0.37 0.33 0.32 0.52 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
84 0.48 0.54 0.42 0.36 0.42 0.40 0.55 0.35 0.48 0.54 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48<br />
84
ตารางผนวกที่<br />
2 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64<br />
43 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
44 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
45 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
46 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
47 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
48 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
49 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
50 1.00 1.00 0.81 0.90 0.90 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.89 0.74 0.71 0.71 0.71 0.59<br />
51 0.81 0.81 1.00 0.86 0.86 0.86 0.92 0.92 0.92 0.92 0.92 0.69 0.67 0.67 0.67 0.62<br />
52 0.90 0.90 0.86 1.00 1.00 1.00 0.93 0.93 0.93 0.93 0.93 0.79 0.69 0.69 0.69 0.57<br />
53 0.90 0.90 0.86 1.00 1.00 1.00 0.93 0.93 0.93 0.93 0.93 0.79 0.69 0.69 0.69 0.57<br />
54 0.90 0.90 0.86 1.00 1.00 1.00 0.93 0.93 0.93 0.93 0.93 0.79 0.69 0.69 0.69 0.57<br />
55 0.89 0.89 0.92 0.93 0.93 0.93 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.77 0.74 0.74 0.74 0.54<br />
56 0.89 0.89 0.92 0.93 0.93 0.93 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.77 0.74 0.74 0.74 0.54<br />
57 0.89 0.89 0.92 0.93 0.93 0.93 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.77 0.74 0.74 0.74 0.54<br />
58 0.89 0.89 0.92 0.93 0.93 0.93 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.77 0.74 0.74 0.74 0.54<br />
59 0.89 0.89 0.92 0.93 0.93 0.93 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.77 0.74 0.74 0.74 0.54<br />
60 0.74 0.74 0.69 0.79 0.79 0.79 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 1.00 0.81 0.81 0.81 0.69<br />
61 0.71 0.71 0.67 0.69 0.69 0.69 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74 0.81 1.00 1.00 1.00 0.67<br />
62 0.71 0.71 0.67 0.69 0.69 0.69 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74 0.81 1.00 1.00 1.00 0.67<br />
63 0.71 0.71 0.67 0.69 0.69 0.69 0.74 0.74 0.74 0.74 0.74 0.81 1.00 1.00 1.00 0.67<br />
64 0.59 0.59 0.62 0.57 0.57 0.57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.69 0.67 0.67 0.67 1.00<br />
65 0.59 0.59 0.62 0.57 0.57 0.57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.69 0.67 0.67 0.67 1.00<br />
66 0.59 0.59 0.62 0.57 0.57 0.57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.69 0.67 0.67 0.67 1.00<br />
67 0.59 0.59 0.62 0.57 0.57 0.57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.69 0.67 0.67 0.67 1.00<br />
68 0.59 0.59 0.62 0.57 0.57 0.57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.69 0.67 0.67 0.67 1.00<br />
69 0.54 0.54 0.48 0.52 0.52 0.52 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.64 0.69 0.69 0.69 0.72<br />
70 0.56 0.56 0.50 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.58 0.56 0.56 0.56 0.58<br />
71 0.59 0.59 0.54 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.77 0.67 0.67 0.67 0.54<br />
72 0.59 0.59 0.54 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.77 0.67 0.67 0.67 0.54<br />
73 0.67 0.67 0.62 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.62<br />
74 0.67 0.67 0.62 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.62<br />
75 0.67 0.67 0.62 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.62<br />
76 0.67 0.67 0.62 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.62<br />
77 0.67 0.67 0.62 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.62<br />
78 0.67 0.67 0.62 0.57 0.57 0.57 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.59 0.59 0.59 0.62<br />
79 0.62 0.62 0.50 0.47 0.47 0.47 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.57 0.55 0.55 0.55 0.57<br />
80 0.62 0.62 0.50 0.47 0.47 0.47 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.57 0.55 0.55 0.55 0.57<br />
81 0.62 0.62 0.64 0.59 0.59 0.59 0.64 0.64 0.64 0.64 0.64 0.40 0.62 0.62 0.62 0.32<br />
82 0.55 0.55 0.43 0.47 0.47 0.47 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.55 0.55 0.55 0.43<br />
83 0.52 0.52 0.46 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.62 0.59 0.59 0.59 0.38<br />
84 0.48 0.48 0.50 0.46 0.46 0.46 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.48 0.48 0.48 0.25<br />
85
ตารางผนวกที่<br />
2 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80<br />
43 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
44 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
45 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
46 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
47 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
48 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
49 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
50 0.59 0.59 0.59 0.59 0.54 0.56 0.59 0.59 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.62 0.62<br />
51 0.62 0.62 0.62 0.62 0.48 0.50 0.54 0.54 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50<br />
52 0.57 0.57 0.57 0.57 0.52 0.46 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.47 0.47<br />
53 0.57 0.57 0.57 0.57 0.52 0.46 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.47 0.47<br />
54 0.57 0.57 0.57 0.57 0.52 0.46 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.47 0.47<br />
55 0.54 0.54 0.54 0.54 0.48 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50<br />
56 0.54 0.54 0.54 0.54 0.48 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50<br />
57 0.54 0.54 0.54 0.54 0.48 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50<br />
58 0.54 0.54 0.54 0.54 0.48 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50<br />
59 0.54 0.54 0.54 0.54 0.48 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.50 0.50<br />
60 0.69 0.69 0.69 0.69 0.64 0.58 0.77 0.77 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.57 0.57<br />
61 0.67 0.67 0.67 0.67 0.69 0.56 0.67 0.67 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.55 0.55<br />
62 0.67 0.67 0.67 0.67 0.69 0.56 0.67 0.67 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.55 0.55<br />
63 0.67 0.67 0.67 0.67 0.69 0.56 0.67 0.67 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.59 0.55 0.55<br />
64 1.00 1.00 1.00 1.00 0.72 0.58 0.54 0.54 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.57 0.57<br />
65 1.00 1.00 1.00 1.00 0.72 0.58 0.54 0.54 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.57 0.57<br />
66 1.00 1.00 1.00 1.00 0.72 0.58 0.54 0.54 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.57 0.57<br />
67 1.00 1.00 1.00 1.00 0.72 0.58 0.54 0.54 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.57 0.57<br />
68 1.00 1.00 1.00 1.00 0.72 0.58 0.54 0.54 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.62 0.57 0.57<br />
69 0.72 0.72 0.72 0.72 1.00 0.87 0.64 0.64 0.72 0.72 0.72 0.72 0.72 0.72 0.37 0.37<br />
70 0.58 0.58 0.58 0.58 0.87 1.00 0.75 0.75 0.83 0.83 0.83 0.83 0.83 0.83 0.38 0.38<br />
71 0.54 0.54 0.54 0.54 0.64 0.75 1.00 1.00 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.43 0.43<br />
72 0.54 0.54 0.54 0.54 0.64 0.75 1.00 1.00 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85 0.43 0.43<br />
73 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.83 0.85 0.85 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.36 0.36<br />
74 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.83 0.85 0.85 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.36 0.36<br />
75 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.83 0.85 0.85 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.36 0.36<br />
76 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.83 0.85 0.85 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.36 0.36<br />
77 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.83 0.85 0.85 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.36 0.36<br />
78 0.62 0.62 0.62 0.62 0.72 0.83 0.85 0.85 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.36 0.36<br />
79 0.57 0.57 0.57 0.57 0.37 0.38 0.43 0.43 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 1.00 1.00<br />
80 0.57 0.57 0.57 0.57 0.37 0.38 0.43 0.43 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 1.00 1.00<br />
81 0.32 0.32 0.32 0.32 0.42 0.43 0.32 0.32 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.52 0.52<br />
82 0.43 0.43 0.43 0.43 0.44 0.46 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.53 0.53<br />
83 0.38 0.38 0.38 0.38 0.48 0.50 0.46 0.46 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.50 0.50<br />
84 0.25 0.25 0.25 0.25 0.35 0.36 0.42 0.42 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.54 0.54<br />
86
ตารางผนวกที่<br />
2 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91<br />
43 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
44 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
45 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
46 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
47 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
48 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
49 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
50 0.62 0.55 0.52 0.48 0.42 0.42 0.48 0.48 0.48 0.48 0.32<br />
51 0.64 0.43 0.46 0.50 0.35 0.35 0.43 0.43 0.43 0.43 0.25<br />
52 0.59 0.47 0.50 0.46 0.48 0.48 0.60 0.60 0.60 0.60 0.31<br />
53 0.59 0.47 0.50 0.46 0.48 0.48 0.60 0.60 0.60 0.60 0.31<br />
54 0.59 0.47 0.50 0.46 0.48 0.48 0.60 0.60 0.60 0.60 0.31<br />
55 0.64 0.50 0.54 0.50 0.43 0.43 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
56 0.64 0.50 0.54 0.50 0.43 0.43 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
57 0.64 0.50 0.54 0.50 0.43 0.43 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
58 0.64 0.50 0.54 0.50 0.43 0.43 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
59 0.64 0.50 0.54 0.50 0.43 0.43 0.57 0.57 0.57 0.57 0.25<br />
60 0.40 0.50 0.62 0.50 0.52 0.52 0.50 0.50 0.50 0.50 0.08<br />
61 0.62 0.55 0.59 0.48 0.50 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.24<br />
62 0.62 0.55 0.59 0.48 0.50 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.24<br />
63 0.62 0.55 0.59 0.48 0.50 0.50 0.62 0.62 0.62 0.62 0.24<br />
64 0.32 0.43 0.38 0.25 0.26 0.26 0.36 0.36 0.36 0.36 0.33<br />
65 0.32 0.43 0.38 0.25 0.26 0.26 0.36 0.36 0.36 0.36 0.33<br />
66 0.32 0.43 0.38 0.25 0.26 0.26 0.36 0.36 0.36 0.36 0.33<br />
67 0.32 0.43 0.38 0.25 0.26 0.26 0.36 0.36 0.36 0.36 0.33<br />
68 0.32 0.43 0.38 0.25 0.26 0.26 0.36 0.36 0.36 0.36 0.33<br />
69 0.42 0.44 0.48 0.35 0.36 0.36 0.07 0.07 0.07 0.07 0.17<br />
70 0.43 0.46 0.50 0.36 0.38 0.38 0.15 0.15 0.15 0.15 0.18<br />
71 0.32 0.50 0.46 0.42 0.43 0.43 0.36 0.36 0.36 0.36 0.25<br />
72 0.32 0.50 0.46 0.42 0.43 0.43 0.36 0.36 0.36 0.36 0.25<br />
73 0.40 0.50 0.38 0.33 0.35 0.35 0.21 0.21 0.21 0.21 0.42<br />
74 0.40 0.50 0.38 0.33 0.35 0.35 0.21 0.21 0.21 0.21 0.42<br />
75 0.40 0.50 0.38 0.33 0.35 0.35 0.21 0.21 0.21 0.21 0.42<br />
76 0.40 0.50 0.38 0.33 0.35 0.35 0.21 0.21 0.21 0.21 0.42<br />
77 0.40 0.50 0.38 0.33 0.35 0.35 0.21 0.21 0.21 0.21 0.42<br />
78 0.40 0.50 0.38 0.33 0.35 0.35 0.21 0.21 0.21 0.21 0.42<br />
79 0.52 0.53 0.50 0.54 0.56 0.56 0.47 0.47 0.47 0.47 0.15<br />
80 0.52 0.53 0.50 0.54 0.56 0.56 0.47 0.47 0.47 0.47 0.15<br />
81 1.00 0.74 0.48 0.61 0.64 0.64 0.30 0.30 0.30 0.30 0.43<br />
82 0.74 1.00 0.64 0.62 0.64 0.64 0.40 0.40 0.40 0.40 0.23<br />
83 0.48 0.64 1.00 0.75 0.70 0.70 0.50 0.50 0.50 0.50 0.17<br />
84 0.61 0.62 0.75 1.00 0.95 0.95 0.46 0.46 0.46 0.46 0.27<br />
87
ตารางผนวกที่<br />
2 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16<br />
84 0.56 0.56 0.52 0.55 0.55 0.61 0.58 0.58 0.58 0.58 0.55 0.55 0.55 0.55 0.48 0.64<br />
85 0.50 0.50 0.45 0.48 0.57 0.64 0.61 0.52 0.52 0.52 0.48 0.48 0.48 0.48 0.50 0.58<br />
86 0.50 0.50 0.45 0.48 0.57 0.64 0.61 0.52 0.52 0.52 0.48 0.48 0.48 0.48 0.50 0.58<br />
87 0.48 0.48 0.59 0.54 0.46 0.44 0.50 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.41 0.41<br />
88 0.48 0.48 0.59 0.54 0.46 0.44 0.50 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.41 0.41<br />
89 0.48 0.48 0.59 0.54 0.46 0.44 0.50 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.41 0.41<br />
90 0.48 0.48 0.59 0.54 0.46 0.44 0.50 0.50 0.50 0.50 0.54 0.54 0.54 0.54 0.41 0.41<br />
91 0.24 0.24 0.17 0.09 0.45 0.17 0.17 0.08 0.08 0.08 0.27 0.27 0.27 0.27 0.16 0.16<br />
Index (No) 1/ . 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32<br />
85 0.58 0.58 0.48 0.43 0.43 0.48 0.48 0.45 0.55 0.55 0.42 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
86 0.58 0.58 0.48 0.43 0.43 0.48 0.48 0.45 0.55 0.55 0.42 0.50 0.52 0.52 0.52 0.52<br />
87 0.41 0.41 0.46 0.50 0.50 0.40 0.40 0.30 0.30 0.52 0.50 0.41 0.57 0.57 0.57 0.36<br />
88 0.41 0.41 0.46 0.50 0.50 0.40 0.40 0.30 0.30 0.52 0.50 0.41 0.57 0.57 0.57 0.36<br />
89 0.41 0.41 0.46 0.50 0.50 0.40 0.40 0.30 0.30 0.52 0.50 0.41 0.57 0.57 0.57 0.36<br />
90 0.41 0.41 0.46 0.50 0.50 0.40 0.40 0.30 0.30 0.52 0.50 0.41 0.57 0.57 0.57 0.36<br />
91 0.16 0.16 0.27 0.25 0.25 0.23 0.23 0.43 0.35 0.52 0.40 0.24 0.25 0.25 0.25 0.25<br />
Index (No) 1/ . 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48<br />
85 0.50 0.48 0.35 0.30 0.26 0.42 0.38 0.36 0.50 0.40 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42<br />
86 0.50 0.48 0.35 0.30 0.26 0.42 0.38 0.36 0.50 0.40 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42<br />
87 0.34 0.40 0.50 0.50 0.50 0.48 0.69 0.59 0.62 0.67 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48<br />
88 0.34 0.40 0.50 0.50 0.50 0.48 0.69 0.59 0.62 0.67 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48<br />
89 0.34 0.40 0.50 0.50 0.50 0.48 0.69 0.59 0.62 0.67 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48<br />
90 0.34 0.40 0.50 0.50 0.50 0.48 0.69 0.59 0.62 0.67 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48<br />
91 0.24 0.38 0.42 0.36 0.17 0.08 0.27 0.35 0.32 0.23 0.32 0.32 0.32 0.32 0.32 0.32<br />
Index (No) 1/ . 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64<br />
85 0.42 0.42 0.35 0.48 0.48 0.48 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.52 0.50 0.50 0.50 0.26<br />
86 0.42 0.42 0.35 0.48 0.48 0.48 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.52 0.50 0.50 0.50 0.26<br />
87 0.48 0.48 0.43 0.60 0.60 0.60 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.50 0.62 0.62 0.62 0.36<br />
88 0.48 0.48 0.43 0.60 0.60 0.60 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.50 0.62 0.62 0.62 0.36<br />
89 0.48 0.48 0.43 0.60 0.60 0.60 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.50 0.62 0.62 0.62 0.36<br />
90 0.48 0.48 0.43 0.60 0.60 0.60 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.50 0.62 0.62 0.62 0.36<br />
91 0.32 0.32 0.25 0.31 0.31 0.31 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.08 0.24 0.24 0.24 0.33<br />
88
ตารางผนวกที่<br />
2 (ตอ)<br />
Index (No) 1/ . 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80<br />
85 0.26 0.26 0.26 0.26 0.36 0.38 0.43 0.43 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.56 0.56<br />
86 0.26 0.26 0.26 0.26 0.36 0.38 0.43 0.43 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.56 0.56<br />
87 0.36 0.36 0.36 0.36 0.07 0.15 0.36 0.36 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.47 0.47<br />
88 0.36 0.36 0.36 0.36 0.07 0.15 0.36 0.36 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.47 0.47<br />
89 0.36 0.36 0.36 0.36 0.07 0.15 0.36 0.36 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.47 0.47<br />
90 0.36 0.36 0.36 0.36 0.07 0.15 0.36 0.36 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.47 0.47<br />
91 0.33 0.33 0.33 0.33 0.17 0.18 0.25 0.25 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.42 0.15 0.15<br />
Index (No) 1/ . 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91<br />
85 0.64 0.64 0.70 0.95 1.00 1.00 0.40 0.40 0.40 0.40 0.29<br />
86 0.64 0.64 0.70 0.95 1.00 1.00 0.40 0.40 0.40 0.40 0.29<br />
87 0.30 0.40 0.50 0.46 0.40 0.40 1.00 1.00 1.00 1.00 0.31<br />
88 0.30 0.40 0.50 0.46 0.40 0.40 1.00 1.00 1.00 1.00 0.31<br />
89 0.30 0.40 0.50 0.46 0.40 0.40 1.00 1.00 1.00 1.00 0.31<br />
90 0.30 0.40 0.50 0.46 0.40 0.40 1.00 1.00 1.00 1.00 0.31<br />
91 0.43 0.23 0.17 0.27 0.29 0.29 0.31 0.31 0.31 0.31 1.00<br />
หมายเหตุ 1/ Index (No.) คือ หมายเลขการเรียงลําดับของสายพันธุเชื้อ<br />
Ralstonia solanacearum ดัง<br />
แสดงในภาพที่<br />
8<br />
89
Change language