Significato tossicologico degli indicatori biologici - Giornale Italiano ...

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, 267-428 © PI-ME, Pavia 2004
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67° CONGRESSO NAZIONALE SIMLII
75° ANNIVERSARIO DELLA FONDAZIONE DELLA SOCIETÀ ITALIANA DI MEDICINA DEL LAVORO
MONITORAGGIO BIOLOGICO E AMBIENTI CONFINATI NON INDUSTRIALI:
AGGIORNAMENTI E PROSPETTIVE
RELAZIONI
Sorrento, 3-6 novembre 2004
a cura di M. Manno, M. Imbriani, N. Sannolo

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NUOVI INDICATORI BIOLOGICI IN MEDICINA DEL LAVORO
Basi razionali e significato tossicologico degli indicatori biologici

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4, 270-277 © PI-ME, Pavia 2004
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M. Manno 1 , N. Sannolo 2
Significato tossicologico degli indicatori biologici
1 Sezione di Medicina del Lavoro, Dipartimento di Scienze Mediche Preventive, Università degli Studi di Napoli Federico II
2 Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di Medicina del Lavoro, Tossicologia ed Igiene Industriale, Seconda Università degli Studi di Napoli
RIASSUNTO. Il monitoraggio biologico (MB) è l’insieme delle
procedure (raccolta del campione, analisi in laboratorio,
interpretazione, valutazione e gestione del risultato) atte a
determinare quali-quantitativamente in fluidi, sistemi o
campioni biologici il grado di esposizione, effetto o suscettibilità
ad agenti tossici occupazionali. L’obiettivo più frequente del MB
è quello di individuare più precocemente possibile
un’alterazione, generalmente reversibile, dei parametri
bioumorali, funzionali o strutturali secondaria all’esposizione a
fattori di rischio occupazionali prima che diventi di rilevanza
clinica. Il MB integra le informazioni fornite dal monitoraggio
ambientale (MA) e permette di personalizzare ed ottimizzare la
valutazione del rischio soprattutto nel singolo lavoratore, in
quanto consente una valutazione più completa e accurata
dell’esposizione reale totale. Alle tre categorie di indicatori
biologici (IB) tradizionali, ovvero quelli di esposizione, di
risposta/effetto e di suscettibilità, si sono aggiunte recentemente
alcune sottocategorie: gli indicatori di dose interna, quelli di dose
biologicamente efficace e quelli precoci di malattia.
L’introduzione di queste nuove tipologie rende più completa e
articolata la valutazione del processo che parte dall’esposizione
al fattore di rischio e arriva alla patologia conclamata. Tuttavia,
non è sempre facile attribuire un dato IB all’una o all’altra
categoria, come dimostrano, ad esempio, le difficoltà
interpretative incontrate nell’uso del fenotipo metabolico del
citocromo P450 (CYP-2E1) per il MB di soggetti esposti a
solventi. Particolarmente complesse sono le implicazioni sociali,
etiche e deontologiche connesse con l’uso di tali strumenti e con
l’interpretazione dei dati così ottenuti, in particolare per quanto
riguarda la valutazione della suscettibilità individuale. Anche il
Codice Etico dell’International Commission of Occupational
Health (ICOH), che pure è stato recentemente aggiornato, non
fornisce una soluzione esaustiva dei problemi etici sollevati dai
nuovi IB. L’obiettivo della presente relazione è quello di
richiamare i diversi tipi di IB oggi disponibili o in via di
validazione, con un duplice approccio: valutandone da un lato le
basi razionali e il significato tossicologico e dall’altro le
differenze esistenti nel loro uso nella pratica o nella ricerca in
medicina del lavoro. Lo sviluppo di nuovi IB, sempre più validi
ed efficaci, dipende in larga misura dalla comprensione non solo
dei meccanismi tossicocinetici e tossicodinamici dei composti in
causa, ma anche dei fattori di suscettibilità individuale, genetici
o acquisiti. È auspicabile, comunque, che un uso integrato di più
indicatori di diverso significato (monitoraggio biologico
razionale) possa portare ad una migliore valutazione del rischio
nei lavoratori, sia come individui che come gruppo.
Parole chiave: monitoraggio biologico, significato tossicologico,
suscettibilità.
ABSTRACT. www.gimle.fsm.it
TOXICOLOGICAL SIGNIFICANCE OF BIOLOGICAL MARKERS. Biological
monitoring or, simply, biomonitoring (BM), refers to the periodic
measurement of biological markers, or biomarkers (BMKs), in
human fluids and tissues to assess the interaction (absorption,
early health effects, susceptibility) between physical, chemical or
biological agents and the human organism. The primary aim of
BM in the workplace is to integrate environmental monitoring
data and detect early, reversible biochemical or functional
changes in workers exposed to chemicals before they become
clinically relevant. BM also contributes to the assessment of
chemical risk to workers, as individuals or as a group.
Biomarkers are generally divided into three main types:
biomarkers of exposure (BME), response/effect (BMR), and
susceptibility (BMS). Other, more specific types of biomarkers
are those of internal dose (BID), those of biologically effective
dose (BED) and early biomarkers of disease (EBD). It is not
always easy, however, to allocate a given BMK - such as the
measurement of cytochrome P450 phenotype in subjects exposed
to organic solvents - to one or the other type. Biomonitoring
provides several advantages over environmental monitoring or
health surveillance. For example, it allows an estimate of interand
intra-individual variability in the absorption, distribution
and excretion of chemicals. It also allows the detection of
reversible changes before the appearance of a clinically relevant
occupational impairment or disease. For these reasons, BM has
become a routine procedure in occupational health practice
throughout the world. Even the widely acknowledged, recently
updated Code of Ethics for Occupational Health Professionals, a
milestone in occupational health practice, only provides the basic
ethical principles associated with biological monitoring. The aim
of the present paper is to survey the various types of BMK
available today with two main objectives: to discuss their
toxicological significance and highlight the substantial differences
that exist between their use in the practice of occupational health
and in medical research. The development of new, more valid and
reliable BMKs is strongly dependent on the understanding not
only of the toxicokinetic and toxicodinamic mechanisms of
chemicals, but also of the various susceptibility factors involved,
whether genetic or environmental. It is hoped that the concurrent
use of BMKs of different types may improve chemical risk
assessment in workers, both individually and as a group.
Key words: biological monitoring, toxicological significance,
susceptibility.
Introduzione
La determinazione di indicatori biologici (IB), o bioindicatori
o biomarkers, in liquidi, tessuti o più in generale
in campioni biologici di soggetti esposti a fattori di rischio
presenti negli ambienti di vita o di lavoro, è nota come monitoraggio
biologico (MB). Essa costituisce oggi, o almeno
dovrebbe costituire, una pratica routinaria in tutte le situazioni
di esposizione professionale in cui esistano IB
scientificamente validi, analiticamente affidabili ed eticamente
accettabili. L’obiettivo principale del monitoraggio
biologico in medicina del lavoro, in estrema sintesi, è quello
di integrare i dati forniti dal monitoraggio ambientale,

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ove essi siano fattibili e disponibili, e dalla sorveglianza
sanitaria (anamnesi, visita medica, accertamenti clinici) al
fine di ottenere una valutazione più completa dello stato di
salute del lavoratore e della sua “interazione” con l’ambiente
di lavoro per valutarne l’idoneità alla mansione specifica.
Il monitoraggio biologico mira quindi ad ottenere,
nel singolo soggetto esposto o in gruppi di soggetti esposti
ad uno specifico fattore di rischio, indicazioni precoci e
preferibilmente, ma non esclusivamente, reversibili sull’esposizione,
la suscettibilità e gli effetti biologici secondari
a quel fattore di rischio.
La rapida evoluzione delle scienze, sia di base che mediche,
fornisce oggi nuovi strumenti d’indagine estremamente
sensibili e specifici le cui possibili applicazioni in
Medicina del Lavoro sono ancora largamente inesplorate.
Questi includono, ad esempio, la determinazione su base
individuale, in vivo o ex vivo, dei polimorfismi genetici
degli enzimi metabolici (fenotipizzazione e genotipizzazione),
la misura nel singolo lavoratore della dose biologicamente
efficace nel sangue o, in alcuni casi, direttamente
all’organo bersaglio, mediante la determinazione degli addotti
macromolecolari all’Hb o al DNA, la determinazione
contemporanea dell’espressione multigenica mediante microchips
ed altre tecniche di biologia molecolare applicata,
l’uso di nuove matrici biologiche come il condensato
dell’aria espirata, ed altre ancora. L’applicazione routinaria,
tuttavia, di queste nuove tecniche nella pratica della
medicina del lavoro è ancora in molti casi di là da venire.
Gli IB possono venir utilizzati in contesti diversi, quali
sorveglianza sanitaria, programmi di screening di vario
genere e ricerca clinica su patologie comuni. Ci si limiterà
qui ad esaminare esclusivamente il primo contesto, ovvero
l’uso degli IB per la valutazione dell’esposizione e per la
tutela della salute dei lavoratori. Vedremo che la distinzione
ormai classica degli IB in indicatori di esposizione, risposta
o suscettibilità non è sempre agevole. Per quanto riguarda,
ad esempio, i fattori di rischio chimici, l’interpretazione
del significato tossicologico di un IB richiede la
conoscenza non solo dei meccanismi tossicocinetici e tossicodinamici
del/dei composto/i in questione, ma anche
un’attenta valutazione dei numerosi fattori metodologici o
individuali in giuoco: le circostanze in cui il campione è
stato raccolto, le modalità con cui l’IB è stato misurato, le
caratteristiche dei soggetti esaminati, ivi compresa
l’eventuale esposizione ad altri fattori di rischio
occupazionali o extra-occupazionali, quali abitudini
alimentari, fumo, stile di vita ed altri ancora.
L’obiettivo di questa relazione è quello di discutere
brevemente e in termini essenzialmente teorici
il significato tossicologico e le basi razionali dei
diversi tipi di indicatori biologici oggi già in uso o
in corso di validazione (scientifica, analitica, etica).
Inoltre, come esempio di approccio metodologico
razionale allo sviluppo di nuovi IB si userà il test di
fenotipizzazione dell’isoforma 2E1 del citocromo
P450 (CYP-2E1), un enzima inducibile e polimor-
fico (Plee-Gautier et al. 2001) coinvolto nell’attivazione
di numerosi xenobiotici epato-, nefro-, emo-,
pneumo- o neurotossici, quali benzene, n-esano, tetracloruro
di carbonio, cloroformio, tricloro- e per-
cloroetilene ed altri ancora. Il fenotipo CYP-2E1 può, a seconda
delle circostanze, essere appunto considerato come
un indicatore di esposizione, di risposta/effetto, di suscettibilità
e in determinate circostanze persino di dose biologicamente
efficace. Solo un attento esame delle condizioni di
campionamento e del ruolo del CYP-2E1 nei meccanismi
tossicocinetici e tossicodinamici del composto in esame, ci
può chiarire quale significato attribuire al test.
Infine, richiamando alcuni concetti fondamentali connessi
con la programmazione, esecuzione, interpretazione e gestione
dei programmi di monitoraggio biologico, si cercherà
di anticipare alcune delle (molte) domande tuttora aperte circa
i vantaggi e i limiti nell’uso degli IB in medicina del lavoro.
Sarà fatto, inoltre, un breve cenno alle differenze di
metodi e contenuti esistenti nell’uso degli IB in due contesti
concettualmente molto diversi tra loro ma che spesso vengono
tra loro confusi, consapevolmente o inconsapevolmente:
la pratica della medicina del lavoro e la ricerca in medicina
del lavoro. Le analisi costo/beneficio o rischio/beneficio, che
pure sono parte integrante della valutazione e gestione di
ogni programma di MB, non saranno qui discusse.
Cenni storici
Il monitoraggio biologico è oggi considerato una componente
fondamentale dell’attività del medico del lavoro.
Tuttavia, se rapportato alla scala temporale e all’evoluzione
della medicina del lavoro come disciplina medica, esso
rappresenta un’acquisizione ancora relativamente recente
in quanto sviluppatosi solo nel corso degli ultimi 40 anni.
Se confrontiamo, ad esempio, il numero di pubblicazioni
su riviste peer review citate da PubMed che abbiano come
parola-chiave “biological monitoring”, vedremo che dai
soli 9 lavori pubblicati nel quinquennio1960-64 si passa ai
579 del quinquennio 1980-84, e a ben 13.876 negli ultimi
cinque anni, includendo il solo primo semestre dell’anno
in corso (Figura 1). Ciò non è attribuibile, o quanto meno
non lo è solamente, come invece si potrebbe pensare, all’aumento
del numero delle pubblicazioni medico-scientifiche
in genere. Se confrontiamo, infatti, il numero delle
medesime pubblicazioni con quelle che, negli stessi anni,
hanno invece la parola chiave “protein”, vediamo che que-
Figura 1. Distribuzione del numero di pubblicazioni citate da PubMed
e contenenti le parole-chiave “biological monitoring” o “protein” dal
1980 ad oggi (i valori di “protein” e del rapporto “protein/biological
monitoring” sono stati corretti per farli rientrare nel grafico)

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ste ultime passano da 10.436 nel quinquennio 1960-64, a
266.987 nel 1980-84, a “solo” 713.279 negli ultimi cinque
anni. Conseguentemente negli stessi anni il valore del rapporto
numerico protein/biological monitoring è diminuito
di un ordine di grandezza, passando da 1159 nel 1060-64 a
solo 51 nel 2000-04. Quindi, l’enorme aumento delle pubblicazioni
sul monitoraggio biologico degli ultimi anni è
un dato reale e non dipende dall’aumento della letteratura
scientifica nel suo complesso.
Il monitoraggio biologico è stato già tema di precedenti
congressi della S.I.M.L.I.I. (Sorrento, 1982; Pavia, 1985; Palermo,
1989; Fiuggi-Fonte, 1994; Bologna, 1995; Genova,
1999) e costituisce oggi per il Medico Competente, ma non
solo per lui, uno strumento essenziale alla valutazione del rischio
ed un’integrazione ormai consolidata della sorveglianza
sanitaria, come peraltro recepito anche dalla recente, e per
certi versi discussa (Manno et al., 2002), normativa sul Rischio
Chimico (D.Lgs. 25/2002). Si è ritenuto pertanto utile
fare il punto sulle metodiche di MB oggi disponibili, riconsiderando
il significato degli indicatori biologici, vecchi e nuovi,
alla luce dello sviluppo tecnologico e delle più recenti acquisizioni
scientifiche in biologia e tossicologia molecolare e
della scienza medica nel suo complesso.
Definizioni e classificazione
In senso lato, il MB può essere definito come l’analisi,
singola o ripetuta nel tempo, di fluidi o tessuti biologici per
documentare e quantificare l’interazione di un agente fisico,
chimico o biologico con l’organismo. Un IB è dunque
un qualsiasi indicatore di un evento o modificazione in un
sistema o campione biologico che sia in rapporto con l’esposizione
ad uno di tali agenti. In senso stretto, il termine
è più spesso usato in riferimento all’esposizione, risposta o
suscettibilità ad agenti chimici. Gli IB possono essere classificati
in base a criteri diversi:
a) alla matrice biologica in cui vengono testati (urine,
sangue, tessuti, aria espirata, ecc.)
b) all’organo o tessuto in cui hanno origine o che li ha
prodotti (renali, epatici, del sistema nervoso, ecc.)
c) alle caratteristiche chimico-fisiche (volatili, idro/liposolubili,
ecc.)
d) al significato tossicologico e al valore predittivo che
viene loro attribuito rispetto al fattore di rischio di cui
sono appunto indicatori.
In base a quest’ultimo criterio, gli IB vengono divisi
tradizionalmente in tre categorie: gli indicatori di esposizione,
quelli di risposta (o effetto) e quelli di suscettibilità
(IPCS, 1993). All’interno di queste categorie sono stati individuati
dei sottogruppi che, per le loro caratteristiche o il
loro significato particolari, meritano di essere citati separatamente.
Esamineremo ora brevemente i diversi tipi di
IB oggi disponibili, dandone una breve definizione e riassumendone
le caratteristiche principali e il ruolo, potenziale
o reale, in medicina del lavoro. Per un’analisi approfondita
dei diversi tipi di biomarcatori, con particolare
riguardo a quelli di recente o possibile futura acquisizione,
si rimanda alle specifiche relazioni dei gruppi di esperti
pubblicate nel presente volume.
Indicatori biologici di esposizione (IBE)
Un indicatore biologico di esposizione secondo la definizione
classica del National Research Council (NRC,
1987) statunitense è una “sostanza esogena o un suo metabolita
o il prodotto dell’interazione tra uno xenobiotico
ed una molecola o cellula bersaglio, misurati in un
compartimento dell’organismo”. Gli IBE rappresentano
certamente la categoria di IB più numerosa e sono, peraltro,
in continua espansione grazie alle nuove tecniche
analitiche sempre più sofisticate oggi disponibili. In pratica
essi sono costituiti dalla misura di elementi o composti
chimici esogeni (xenobiotici) assorbiti nel corso
dell’esposizione professionale, ma non solo professionale,
o di loro metaboliti o di complessi con molecole endogene
(es. CO-Hb), presenti nei diversi fluidi o matrici
biologiche. Il loro uso, individuale o di gruppo, è in molti
casi ampiamente validato e routinario, costituendo
un’utile integrazione dei dati di monitoraggio ambientale,
soprattutto nei casi in cui esistano/coesistano modalità
di esposizione (cutanea, gastroenterica) non valutabili
con gli strumenti del monitoraggio ambientale.
Il principale vantaggio degli IBE, rispetto agli altri IB,
consiste nella specificità per il composto/elemento testato
(es. Pb, benzene, ecc.) o per la classe di composti testati (es.
PCB, diossine, ecc.). La principale applicazione pratica degli
IBE sta nella possibilità di confrontare i valori riscontrati
nei lavoratori coi valori limite di esposizione disponibili,
quali ad esempio i Biological Exposure Indices (BEI)
dell’American Conference of Government Industrial Hygienists
(ACGIH) o gli Occupational Exposure Limits
(OEL) dell’Unione Europea (EU). L’utilizzo degli IBE in
molti casi è condizionato, tuttavia, alla possibilità di confrontare
i valori misurati nei lavoratori con quelli presenti
in una adeguata popolazione di controllo non professionalmente
esposta, detta di riferimento. Tale esigenza ha motivato
la costituzione nel nostro Paese di una società scientifica
ad hoc, la Società Italiana Valori di Riferimento (SI-
VR), che ha come compito statutario appunto quello di promuovere
la misura e la pubblicazione dei valori di riferimento
presenti in diverse zone e gruppi della popolazione.
L’abbassamento dei livelli di esposizione occorso negli
ultimi anni/decenni in molti settori industriali e artigianali
ha motivato una rivalutazione critica di molti IBE, che un
tempo venivano usati comunemente, ma che oggi non sono
più validi in quanto non sono in grado di discriminare i soggetti
professionalmente esposti da quelli non-esposti, ovvero
i lavoratori in corso di esposizione da quelli lontani dall’esposizione.
Si pensi, ad esempio, alla determinazione del
fenolo urinario in soggetti esposti a benzene. Ciò ha stimolato
fortemente la ricerca di Nuovi Indicatori biologici di
Esposizione (NIE) più sensibili e specifici (come ad esempio
l’acido t,t-muconico o l’acido S-fenilmercapturico urinari
nel caso, già citato, del benzene). Per una trattazione
dettagliata e sistematica dei NIE si rimanda alla relazione di
Apostoli et al., 2004, pubblicata nel presente volume.
Indicatori biologici di risposta o effetto (IBR)
Un indicatore biologico di risposta/effetto, sempre secondo
il NRC, è “un’alterazione biochimica, fisiologica o
di altro tipo misurabile in un organismo che, a seguito del-

G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4 273
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l’esposizione ad un determinato fattore di rischio e a seconda
dell’entità, indica un danno effettivo o potenziale
alla salute o una vera e propria malattia”. Gli IBR rappresentano
la categoria più vicina alla clinica (ma non ancora
clinicamente rilevante) nella sequenza dall’esposizione
alla malattia e sono quindi particolarmente utili per la
valutazione del rischio nei lavoratori, sia a livello individuale
che di gruppo. Essi inoltre, se utilizzati in studi epidemiologici
ad hoc, permettono di individuare i cosiddetti
“livelli di non effetto avverso osservabile” o no observed
adverse effect level (NOAEL) utili alla definizione dei valori
limite di esposizione occupazionali ed ambientali. Per
una trattazione del ruolo del MB nella valutazione del rischio
si veda la relazione di Lotti et al. in questo volume.
Mentre per l’uso del MB nella sorveglianza sanitaria ed
epidemiologica si rimanda a quelle di Consonni e Bertazzi
e di Assennato e Bisceglia, sempre in questo volume.
Indicatori biologici di suscettibilità (IBS)
Gli IBS per il NRC indicano una “intrinseca o acquisita
diminuzione della capacità di un organismo di rispondere
ai possibili effetti conseguenti l’esposizione ad un determinato
xenobiotico”. L’utilità pratica di un test di suscettibilità,
come peraltro di qualsiasi tipo di test, dipende essenzialmente
da due fattori: a) il suo valore predittivo, ovvero
la sua validità (sensibilità e specificità) nel predire una determinata
suscettibilità ad una data patologia, e b) l’effettiva
prevalenza di quella patologia nella popolazione studiata.
L’esclusione dall’esposizione di soggetti ritenuti suscettibili
in base ad un test predittivo di suscettibilità porterebbe
all’allontanamento dal lavoro anche di un certo numero,
talora elevato e quindi non accettabile, di soggetti non suscettibili.
Ammettiamo, ad esempio, che una patologia abbia
una prevalenza del 10% nella popolazione esaminata e
che un test genetico (o di altro tipo) abbia una sensibilità ed
una specificità, diciamo, del 90%. Il test è cioè in grado di
individuare correttamente come positivi il 90% dei soggetti
“suscettibili” (sensibilità) e correttamente come negativi
il 90% dei soggetti “non suscettibili”. In questo caso l’uso
del test con l’obiettivo di escludere tutti i soggetti positivi,
in quanto ritenuti appunto suscettibili, porterebbe anche all’esclusione
di un numero elevato di soggetti risultati falsamente
positivi al test. In questo specifico caso, su 100 soggetti
testati, ne risulterebbero positivi al test ben 18 ma i veri
positivi sarebbero solo 9, così che 9 lavoratori, ovvero il
50% dei soggetti risultati positivi, sarebbero esclusi dall’esposizione
senza motivo. Tale percentuale di soggetti inutilmente
allontanati dal lavoro, nel caso di un test di pari
sensibilità e specificità ma applicato ad una patologia che
avesse una prevalenza nella popolazione pari all’1% (valore,
questo, non infrequente nel caso, ad esempio, di polimorfismi
genetici degli enzimi metabolici, come discusso
nella relazione di Pavanello e Clonfero, 2004), salirebbe ad
oltre il 90% dei soggetti positivi al test! Una percentuale
ovviamente non accettabile.
Indicatori biologici di dose interna (IDI)
Rappresentano una particolare categoria di IBE in
quanto sono in grado di misurare direttamente, o indirettamente
attraverso la misura dei metaboliti, la quantità/con-
centrazione di xenobiotico presente o accumulata in un determinato
compartimento od organo, come ad es. il piombo
urinario dopo chelazione (PbU). Gli IDI sono spesso
più informativi dei corrispondenti IBE in quanto forniscono
un’informazione più mirata e che si presta ad una valutazione
del rischio più precisa, soprattutto nei casi in cui la
dose venga misurata a livello dell’organo bersaglio.
Indicatori di dose biologicamente efficace (IDBE)
Anche gli IDBE appartengono alla categoria degli indicatori
di esposizione e rispetto agli indicatori tradizionali
rappresentano una misura dell’esposizione più vicina al
bersaglio, in quanto sono in grado di fornire indicazioni altamente
sensibili e specifiche della piccola o minima frazione
di xenobiotico che, generalmente dopo attivazione
metabolica, ha legato un determinato bersaglio. Il bersaglio
può essere critico, ovvero strettamente connesso con l’eziopatogenesi
della patologia (es. addotti al DNA nell’organo
bersaglio per i cancerogeni genotossici), o non-critico,
ovvero indipendente dall’organo bersaglio (es. addotti
all’emoglobina per composti epato- o nefrotossici). È forse
inutile ricordare che l’effetto tossico dipende dalla piccola
o piccolissima frazione di composto, o di suoi metaboliti,
che interagisce col bersaglio critico, e non già dalla quota
preponderante di essi che viene eliminata dagli organi
emuntori e che costituisce gli IBE tradizionali. Per una più
ampia trattazione deli IDBE vedi Miraglia et al., 2004.
Indicatori precoci di malattia (IPM)
Ai tipi di biomarcatori già citati se ne è aggiunto un altro
che, nella sequenza di eventi che vanno dall’esposizione
alla patologia conclamata, si colloca in una fase subito
precedente quella dei test clinico-diagnostici di malattia
usati nella sorveglianza sanitaria. Il termine indicatori precoci
di malattia indica appunto quelle alterazioni dei parametri
biochimici, funzionali o biomolecolari di base di un
individuo che, pur non essendo il risultato di un quadro di
malattia clinicamente conclamata, dimostrano tuttavia che
tale processo è in corso. Vi è quindi un’elevata probabilità
che, qualora si verifichino o persistano determinate condizioni,
ad esempio l’esposizione al fattore di rischio (professionale
o non-professionale che sia), la malattia si svilupperà
effettivamente. La rivista Biomarkers ha recentemente
aggiunto agli indicatori tradizionali anche questo tipo
di indicatore con il nome di biomarker of disease. Appare
evidente che la classificazione di un test come appartenente
alla categoria degli indicatori biologici piuttosto
che a quella dei test propriamente clinici, come pure la distinzione
tra i diversi tipi di IB, non è facile né ovvia e richiede
un’attenta valutazione sia del significato fisiopatologico
del test medesimo che del ruolo eziopatogenetico
(causale o concausale) del fattore di rischio nello sviluppo
e nell’evoluzione della patologia. Per una discussione più
approfondita del significato diagnostico dei test di monitoraggio
biologico ed in particolare dei criteri da adottare per
distinguere gli IBR dagli IPM, si veda anche la relazione
di De Palma et al. in questo volume.
Riassumendo, la corretta individuazione di un IB come
IBE, IBR o IBS e a quale sottocategoria esso appartenga
all’interno di ciascuna categoria, come già detto, non è

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sempre facile ma è necessaria al medico del lavoro per poter
attribuire al test il suo vero significato, sia in termini di
valutazione del rischio (interpretazione del test, diagnosi,
ecc.) che di gestione del rischio (giudizio d’idoneità, provvedimenti
sul lavoratore, eventuale terapia, ecc.). Sarà utile
quindi considerare ora con alcuni esempi quali sono i
problemi interpretativi relativi ad un nuovo IB, ovvero la
caratterizzazione fenotipica in vivo nell’uomo di alcune
isoforme del citocromo P450 (CYP), in particolare il
CYP-2E1. Tale test, tuttora in corso di validazione, è potenzialmente
assai specifico e sensibile, come dimostra il
crescente interesse negli ultimi anni di molti gruppi di ricerca
in questo settore.
Citocromo P450 e monitoraggio biologico
È noto che gli effetti sulla salute, sia deterministici che
stocastici, di molti inquinanti ambientali e occupazionali
sono il risultato della loro biotrasformazione (attivazione e
detossificazione) nel fegato e in altri organi (Manno &
Saia, 1994). Il principale sistema enzimatico responsabile
dell’attivazione degli xenobiotici è il citocromo P-450, una
superfamiglia di circa 1000 proteine presenti in quasi tutti
gli organismi viventi e situate nel reticolo endoplasmatico
degli epatociti e di altre cellule/organi. Solo nell’uomo sono
state isolate e caratterizzate alcune decine di isoforme
costitutive di cui però solo alcune sono quantitativamente
e cataliticamente importanti. Individui diversi hanno diverse
quantità di ciascuna isoforma. Inoltre, alcuni CYP
sono geneticamente polimorfici ed altri sono inducibili,
ovvero la loro sintesi (e quindi la loro attività metabolica)
è stimolata da vari fattori, quali la dieta, l’alcol, il digiuno,
i farmaci ed altri ancora. Ne consegue che individui diversi
presentano capacità di metabolizzare gli xenobiotici anche
molto diverse tra loro (Puga et al., 1997). Tali differenze
individuali nel contenuto e attività del CYP si ritiene
possano spiegare, almeno in parte, la variabilità umana
nella risposta tossicologica agli agenti chimici (Perera F.P.,
1996, 1997; Meyer & Zanger, 1997; Caporaso & Landi
1995). Vari studi di epidemiologia molecolare che cercavano
di stabilire una correlazione tra genotipo di questi enzimi
e risposta tossica o cancerogena in soggetti esposti ad
un dato composto non hanno potuto, eccetto che per alcune
eccezioni (D’Errico et al, 1996), confermare l’ipotesi di
partenza. E ciò solo in parte a causa delle piccole dimensioni
dello studio o di altre limitazioni metodologiche
(Boffetta, 1995). Il motivo principale di queste scarse correlazioni
sta invece nel fatto che l’individuazione di un
singolo, anche se importante, passaggio metabolico di attivazione
o di detossificazione non costituisce un indicatore
sufficientemente sensibile e specifico in grado di predire
se l’esposizione a (determinate concentrazioni di) quel
composto determinerà tossicità o cancerogenesi (Hong &
Yang, 1997). È necessario pertanto riflettere sulla necessità
di un approccio più complesso, che permetta una valutazione
integrata dei vari fattori in gioco, inclusi quelli di suscettibilità,
sia genetica che acquisita.
La possibilità di determinare in vivo, con metodiche
relativamente semplici e poco o per nulla invasive, l’atti-
vità metabolica individuale di specifiche isoforme del citocromo
P450 ha ovvie implicazioni in tossicologia industriale.
Questo è stato uno degli obiettivi di due progetti di
ricerca interdisciplinari condotti in collaborazione tra
gruppi europei e latinoamericani, che miravano a studiare
il citocromo P450 come bioindicatore di suscettibilità nell’esposizione
umana e sperimentale a diversi agenti, quali
composti organici volatili (VOC), idrocarburi aromatici
policiclici (IPA), e idrocarburi da benzine e diesel (Manno
M. e Albores A., 2003). Lo studio prevedeva la determinazione
nei lavoratori e in un gruppo di controllo del
test di fenotipizzazione del CYP-2E1 mediante la metodica
del clorzoxazone (CHZ), un farmaco miorilassante di
largo uso in molti paesi. Questa consiste nella misurazione,
mediante un semplice metodo isocratico HPLC, del
rapporto metabolico tra il metabolita 6-idrossiclorzoxazone
(6-OH-CHZ) e il CHZ stesso rilevato nel sangue del
soggetto due ore dopo l’assunzione di una compressa di
CHZ (500 mg). Poiché il CHZ è un substrato altamente
specifico per il CYP-2E1, il rapporto metabolico 6-OH-
CHZ/CHZ in vivo indica con buona precisione e accuratezza,
purché effettuato a distanza dall’assunzione di alcol,
la capacità metabolica, ovvero, il fenotipo CYP-2E1
in quel soggetto. Per una descrizione più dettagliata della
metodica si veda altrove (Lucas et al., 2001).
È stata pertanto utilizzata questa metodica per cercare di
valutare la suscettibilità metabolica di soggetti esposti a
solventi clorurati in un’industria calzaturiera, dopo l’approvazione
dello studio da parte dei Comitati Etici dei laboratori
partecipanti, sia europei (Italia, Francia) che messicano.
Un’osservazione interessante fatta nel corso dello studio
è stato il riscontro di una riduzione altamente significativa
(di circa 40-50%) del fenotipo CYP-2E1, rispetto ai
controlli, in soggetti messicani (lavoratori calzaturieri)
esposti a vari VOC, tra cui toluene, xilene ed altri, presenti
nell’aria a concentrazioni pari o addirittura inferiori al TLV-
TWA e quindi prive di effetto tossico (Martinez-Hernandez
et al. 2000, Lucas et al., 1999). Il dato, confermato dalla ripetizione
delle analisi in tre laboratori diversi, in Messico,
Francia e Italia, suggerisce che la determinazione del fenotipo
CYP-2E1 usata per valutare la potenziale suscettibilità
metabolica dei soggetti esaminati, può rappresentare invece
un nuovo indicatore biologico di esposizione o di risposta/effetto.
Tale nuovo IB mostra di essere estremamente
più sensibile e specifico di molti IBE o IBR per il MB dei
solventi oggi in uso (i soggetti non presentavano alterazioni
dei principali test di citolisi e colestasi, né individualmente
né come gruppo rispetto ai controlli non esposti).
Il meccanismo di inibizione del CYP-2E1 osservato
nei lavoratori messicani non è ancora chiaro e sarebbe pertanto
difficile inserire il test tra gli IBE, gli IBR o gli ID-
BE. Possiamo tuttavia fare delle ipotesi:
1. Le basse concentrazioni di solventi cui erano esposti i
lavoratori non erano di per sé tossiche ma potrebbero
essere state in grado di inibire funzionalmente e reversibilmente
l’attività catalitica del CYP-2E1, diminuendo
la disponibilità dell’enzima per il substrato CHZ
(inibizione competitiva).
2. Il CYP-2E1 e/o il reticolo endoplasmatico (RE) dell’epatocita,
in cui il CYP-2E1 si trova, potrebbero essere

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particolarmente sensibili alle specie reattive dell’ossigeno
(ROS) o di altra natura prodotte dai solventi o da
loro metaboliti (inibizione non competitiva).
3. Il sito cataliticamente attivo dell’enzima, cioè l’eme
e/o l’apoproteina, è stato attaccato selettivamente e irreversibilmente
proprio dagli intermedi reattivi dei solventi
dallo stesso enzima prodotti (inibizione suicida)
Ciascuna delle tre ipotesi è ragionevole e supportata
da dati della letteratura. L’inibizione competitiva di diversi
substrati per lo stesso enzima è un capitolo importante
della farmacologia e della tossicologia generale e
costituirebbe la spiegazione più semplice tra le tre qui
ipotizzate. Sarebbe inoltre quella più tranquillizzante in
termini di valutazione del rischio, per la sicura reversibilità
e lo scarso o nullo significato tossicologico dell’effetto
osservato. In questo caso l’osservazione si configurerebbe
come un IBE.
La sensibilità e specificità dell’epatocita in generale, e
del RE più in particolare, per alcuni solventi quali tetracloruro
di carbonio, cloroformio e, in misura minore, tricloro-
e percloroetilene sono anch’esse note. Questa possibilità,
più allarmante da un punto di vista tossicologico,
porterebbe, se confermata, a ribadire l’inadeguatezza del
rispetto dei singoli TLV-TWA per la tutela della salute dei
lavoratori nel caso di esposizione a miscele. In questo caso
si tratterebbe di un IBR.
Infine, l’inattivazione del CYP-2E1 durante il metabolismo
di vari composti, detti appunto “substrati suicidi”,
tra cui l’alotano, alcuni idroclorofluorocarburi (HCFC), il
CCl 4 ed altri alometani, è stata ampiamente documentata
(Ferrara et al. 1997, Manno et al. 1988, 1991, 1995). Inoltre,
da studi in vitro si è visto che l’inattivazione dell’enzima
è dovuta al legame covalente di metabolici reattivi di
natura radicalica o elettrofilica all’eme o all’apoproteina
del CYP, in un rapporto stechiometrico di 1:1 a quindi altamente
selettivo. In questo caso la perdita di attività CYP-
2E1 si configurerebbe pertanto come IDBE.
L’esempio sopra esposto dimostra, due cose. La prima
è che il ruolo e l’utilità degli IB in medicina del lavoro e,
in pratica, la loro classificazione come IBE, IBR o IBS,
non sono sempre ovvi né sempre gli stessi, in quanto di-
pendono dalla comprensione del loro significato tossicologico
e del contesto in cui di volta in volta vengono usati. Il
secondo messaggio è in realtà la conferma di quanto già
sapevamo e cioè che un avanzamento delle conoscenze
molto spesso si basa dall’osservazione di risultati non previsti
o addirittura opposti a quelli attesi.
Approccio razionale per lo sviluppo di nuovi IB
La procedura qui proposta auspica un approccio integrato
multidisciplinare (sperimentale, clinico, epidemiologico)
allo sviluppo di nuovi IB di esposizione, effetto o suscettibilità
atti a migliorare la valutazione del rischio da
agenti chimici. Essa si basa sulla necessità di considerare
tutte le diverse fasi che vanno dall’esposizione ad un fattore
di rischio fino al manifestarsi della relativa patologia,
come riportato qui di seguito (Tabella I).
Brevemente, una valutazione razionale ed efficace dei
rischi per la salute derivanti dall’esposizione occupazionale
ad un dato composto deve considerare, idealmente, varie
fasi in sequenza logica. La prima fase è la descrizione
qualitativa e quantitativa dell’esposizione all’agente in
questione. Sono necessarie cioè l’identificazione e la
quantificazione dei livelli di composto presenti nell’ambiente
(monitoraggio ambientale). Inoltre, è necessaria la
determinazione della concentrazione del tossico, o quella
dei suoi metaboliti o addotti, nei liquidi o tessuti biologici
dei soggetti esposti, in modo da valutarne la biodisponibilità
(biomonitoraggio dell’esposizione). La seconda fase
consiste nel chiarimento delle vie metaboliche del composto,
sia di attivazione che di detossificazione, ad esempio
di quelle CYP-dipendenti come nel caso descritto sopra.
La terza fase è costituita dai fattori genetici e ambientali
che modulano la suscettibilità individuale, compresa la determinazione
del fenotipo e del genotipo degli enzimi polimorfici
coinvolti, soprattutto quelli responsabili della
biotrasformazione. La quarta fase consiste nel chiarimento
dei meccanismi con cui il composto esercita l’effetto
tossico e nello sviluppo di biomarcatori di effetto. Ciò è ottenibile
soprattutto dagli studi in vitro e in modelli speri-
Tabella I. Sequenza di eventi tossicologicamente rilevanti nel continuum che va dall’esposizione al manifestarsi
della patologia e relativi indicatori biologici
Evento tossicologicamente rilevante Indicatore biologico (IB)
1. Assorbimento dello xenobiotico nell’organismo (via inalatoria, di esposizione (IBE)
digestiva, cutanea, parenterale) • corrente (IBEC),
• recente (IBER)
• pregressa/remota (IBEP)
2. Distribuzione e accumulo (ossa, lipidi, SNC, ecc.) di dose interna (IDI)
3. Escrezione (urinaria, epatica, polmonare) di esposizione (IBE) o di dose interna (IDI)
4. Legame con bersaglio critico o non-critico (DNA, Hb, enzimi, ecc.) di dose biologicamente efficace (IDBE)
5. Alterazioni biochimiche, funzionali o strutturali precoci di risposta/effetto (IBR)
• deterministico (d’organo, sistemici)
• stocastico (tumore, effetti immunoallergici)
6. Suscettibilità genetica o acquisita di suscettibilità (IBS)
7. Lesione d’organo o sistema precoce di malattia (IPM)

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mentali animali, ma si basa anche sull’osservazione nell’uomo
di alterazioni biologiche, preferibilmente precoci e
reversibili, indotte dal composto stesso. Una nuova area di
ricerca che sta nascendo, quella della tossicogenomica/proteomica,
è ad esempio in grado di studiare,
mediante tecniche potenti (“DNA array”), gli effetti del
composto sull’espressione di un gran numero di geni e
proteine contemporaneamente. Questo nuovo approccio,
peraltro in fase ancora molto prematura, potrebbe portare
a nuove e inattese scoperte, sia nell’uomo che nei modelli
animali, circa i meccanismi di tossicità degli agenti chimici.
Infine, nell’ultima fase, gli IB sviluppati nelle fasi precedenti
vanno convalidati da studi epidemiologici su gruppi
di soggetti esposti al composto in questione.
Aspetti etici
La discussione degli aspetti etici del MB è oggetto di
una relazione specifica (Van Damme et al., 2004) e non si
entrerà qui in dettaglio se non per sottolineare la crescente
attenzione e importanza che il medico del lavoro oggi più
che mai è chiamato a dare, nello svolgimento della sua attività
professionale, alla valutazione degli aspetti socio-etici
del MB. Il Codice Etico dell’International Commission
on Occupational Health (ICOH), recentemente aggiornato,
non può dare, pur trattando specificamente il MB in
uno dei suoi capitoli, raccomandazioni dettagliate sulla
prassi da adottare in tutte le possibili situazioni in cui il
medico del lavoro o, per citare testualmente il Codice, l’operatore
di medicina del lavoro (OML) si possa venire a
trovare nell’esecuzione di un programma di MB (ICOH,
1993). La valutazione di questi aspetti riguarda, com’è ovvio,
tutti gli IB ma per alcuni di essi, in particolare gli IBS,
riveste un’importanza molto particolare, ponendo quesiti
etico-deontologici di non facile soluzione. Un problema è
rappresentato, ad esempio, dalla non sempre chiara distinzione
tra test di monitoraggio biologico da applicare ai lavoratori
già occupati (e quindi potenzialmente esposti) per
proteggerli e test di screening genetico da applicare a soggetti
non ancora occupati (e quindi non ancora esposti) per
valutarne l’eventuale suscettibilità a fattori di rischio presenti
nell’ambiente di lavoro (Van Damme e Castleyn,
1998). L’uso di test di screening genetico, o di altro genere,
per prevenire l’esposizione dei soggetti suscettibili o ritenuti
tali, non solo è scientificamente discutibile ed eticamente
inaccettabile, come discusso sopra, ma, nel nostro
paese, non è nemmeno previsto dalla legge. Solo i lavoratori
già assunti possono, infatti, essere sottoposti ad accertamenti
sanitari e di MB.
Un altro punto che si vuole qui sottolineare è che il
MB, prima di essere applicato ai lavoratori, deve essere
sottoposto ad una valutazione di qualità in tutti i suoi
aspetti, soprattutto scientifici, metodologici ed etici. L’affermazione
che i primi requisiti etici di uno studio di monitoraggio
biologico devono essere un’impostazione adeguata
ed una corretta metodologia (Bertazzi et al., 2001)
non può che trovarci pienamente d’accordo. La qualità del
dato di MB è un tema trattato dettagliatamente da una specifica
relazione (Manini et al., 2004).
Il monitoraggio biologico nella pratica e nella ricerca in medicina
del lavoro
L’ultimo tema cui si vuole qui accennare è quello relativo
alla differenza, non sempre chiara, tra MB all’interno
della pratica professionale della medicina del lavoro e
quello effettuato in un contesto di ricerca scientifica in medicina
del lavoro o, più in generale, di ricerca medica. Le
differenze sono talora sostanziali e riguardano tutte le fasi,
dalla programmazione dello studio alla sua esecuzione, dall’analisi
in laboratorio alla raccolta, elaborazione ed interpretazione
dei dati, fino alla comunicazione, pubblicazione
ed utilizzazione dei risultati. La ricerca scientifica, sia quella
epidemiologica che quella sperimentale, segue, com’è
noto, una metodologia ben definita. Essa parte dall’osservazione
della realtà per poi formulare un’ipotesi, testarla
sperimentalmente e dedurne una regola generale che varrà
fino a quando un’ulteriore osservazione non permetterà di
formulare, testare ed eventualmente confermare una nuova
regola o sottoregola. Per evitare di raggiungere risultati e
conclusioni errati, infatti, tutte le fasi innovative del processo
devono essere programmate e controllate direttamente,
in quanto sono, per definizione, “sperimentali”. I risultati,
generalmente di gruppo, hanno valore solo se statisticamente
significativi rispetto ad un appropriato gruppo di
controllo in base a un test parametrico o non parametrico
che sia adeguato al tipo di misura e alla variabilità del dato.
Nella pratica della medicina del lavoro, invece, la metodica
di raccolta del campione e di analisi deve essere già
validata e i valori riscontrati nel/nei lavoratore/i hanno valore
in sé, anche senza gruppo di controllo. È comunque necessario
un loro confronto con i più appropriati valori di riferimento
disponibili (per una definizione dei “valori di riferimento”
e il loro uso nell’interpretazione degli IBE vedasi
la relazione di Apostoli et al. 2004). Non è sempre metodologicamente
corretto, quindi, considerare come “scientifica”
l’interpretazione, pur rigorosa, dei risultati di uno
studio di MB eseguito e mirato ad esigenze di sorveglianza
sanitaria, solo per il fatto che include anche la valutazione
di nuovi test non precedentemente validati.
Le differenze tra i problemi etici del MB incontrati nei
due contesti qui esaminati, quello della ricerca e quello
della pratica in medicina del lavoro, sono discussi specificamente
in altra relazione (Van Damme et al. 2004) e non
saranno qui ulteriormente trattati.
Conclusioni
In sintesi, nuovi biomarcatori di esposizione, effetto e
suscettibilità che siano sensibili e specifici potranno essere
sviluppati a patto che si tengano in considerazione non solo
le caratteristiche strutturali e le vie di biotrasformazione
dei composti in questione, ma anche il loro meccanismo
d’azione, i bersagli molecolari ed i fattori di suscettibilità
che modulano la risposta individuale. Nel caso dell’esposizione
a basse dosi poi, gli effetti tossici, sia deterministici
che stocastici, sono quasi sempre di natura multifattoriale e
dipendono largamente da fattori di suscettibilità individua-

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le, sia genetici che ambientali. Un importante elemento di
variabilità individuale è, ad esempio, il rapporto in un dato
soggetto tra capacità di attivazione (es. citocromo P450) e
quella di detossificazione (es. enzimi metabolici di II fase).
Tuttavia, questo non è l’unico fattore critico nel determinare
la suscettibilità ad agenti chimici. Fattori di suscettibilità
tossicodinamica, anch’essi genetici o ambientali, sono pure
importanti, soprattutto per quanto riguarda gli effetti stocastici
come le reazioni immunoallergiche e il cancro.
Questo della suscettibilità è l’aspetto del monitoraggio
biologico, e più in generale della valutazione del rischio
chimico, in cui le nostre conoscenze sono più carenti e in
cui l’approccio tradizionale, basato sui test di tossicità e
sui soli concetti di dose-risposta e dose-soglia, risulta del
tutto insoddisfacente (Manno, 1995). È importante pertanto
studiare nell’uomo, se possibile, o in modelli sperimentali
nell’animale non solo il profilo metabolico dei composti
indagati, ma anche il loro meccanismo di tossicità e i
principali fattori genetici e ambientali che si ritiene siano
alla base della suscettibilità (o della resistenza) individuale
alla risposta tossica.
Infine, è importante tener presente che le conoscenze
generate da questo approccio di tipo meccanicistico sono
assai utili anche nell’affrontare e tentare di risolvere i problemi
etici e sociali legati all’uso dei nuovi possibili biomarcatori
in medicina del lavoro ed ambientale, soprattutto
quelli di suscettibilità.
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