determinazione di aflatossine in matrici alimentari mediante hplc ...

DETERMINAZIONE DI AFLATOSSINE IN MATRICI ALIMENTARI MEDIANTE
HPLC CON DERIVATIZZATORE FOTOCHIMICO POST-COLONNA ON-LINE E
RIVELAZIONE FLUORIMETRICA.
G. Spadaccino 1 , M. Dentico 1 , M. Muscarella 2 , M.Quinto 1 , D. Centonze 1 , T. Rotunno 1
1 DiSACD – Dipartimento di Scienze Agro-ambientali, Chimica e Difesa Vegetale, Università
degli Studi di Foggia – Facoltà di Agraria – Via Napoli, 25 – 71100 Foggia
2 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata – Via Manfredonia, 20 –
71100 Foggia
Le aflatossine sono metaboliti secondari di muffe tossigene del genere Aspergillus, ed in
particolare A. flavus, A. parasiticus ed A. nomius. Esse sono riconducibili a 5 molecole
principali, ritrovate ed identificate negli alimenti: B 1 , B 2 , G 1 , G 2 ed M 1 .
Il grande interesse della comunità scientifica per questo tipo di composti, testimoniato dai
numerosi studi e dalle pubblicazioni sull’argomento, è dovuto al fatto che sono da tempo stati
accertati i loro effetti carcinogenici, mutageni ed immunosoppressivi su molte specie
animali. 1 L’aflatossina B 1 , in particolare, è stata classificata dall’Agenzia Internazionale per la
Ricerca sul Cancro (IARC) come appartenente alla prima classe di cancerogenicità. 2 La
Commissione Europea ha fissato il limite massimo di concentrazione per l’aflatossina B 1 a 2
µg/kg e per le aflatossine totali a 4 µg/kg nei cereali destinati al consumo umano, ed a 0,1
µg/kg di aflatossina B 1 negli alimenti per l’infanzia. 3 E’ evidente, quindi, come sia molto
sentita l’esigenza di migliorare i metodi di analisi per le aflatossine, soprattutto in termini di
limiti di rivelabilità (LOD) e di quantificazione (LOQ). A questo proposito il metodo analitico
più utilizzato è quello cromatografico (in particolare la RP-HPLC) con rivelazione a
fluorescenza e derivatizzazione chimica pre- o post-colonna. 4 Questi metodi presentano
tuttavia numerosi svantaggi sia dal punto di vista della manipolazione di sostanze tossiche da
parte dell’operatore, che della riproducibilità nel tempo. 5 La derivatizzazione fotochimica
post-colonna, utilizzata nel presente lavoro, è un metodo relativamente recente 5 le cui
potenzialità non sono state a nostro avviso completamente esplorate. Essa offre i vantaggi
della derivatizzazione chimica, evitando l’utilizzo di reagenti e riducendo notevolmente le
operazioni manuali.
Nel presente lavoro viene presentato un metodo per l’analisi delle aflatossine in matrici
alimentari mediante RP-HPLC con derivatizzazione fotochimica post-colonna on-line e
rivelazione fluorimetrica. L’ottimizzazione di alcuni parametri operativi ha permesso di
ottenere limiti di rivelazione (LOD) e quantificazione (LOQ) paragonabili o più bassi rispetto
a quelli riportati in letteratura. 6,7 In particolare, l’utilizzo di una fase mobile a pH acido ha
comportato un aumento del segnale dell’aflatossina G1, mentre una fase mobile a pH basico
ha prodotto un aumento del segnale delle aflatossine B 1 , B 2 e G 2 . Le potenzialità del metodo
sono state valutate mediante l’analisi di campioni reali ed i bassi LOD mostrati dal metodo
(0.1 µg/kg per l’aflatossina M 1 , 10 ng/kg per la B 1 , 5 ng/kg per la G 1 e la G 2 , e 1.7 ng/kg per
la B 2 ) hanno permesso di monitorare le aflatossine a livelli che sono molto al di sotto dei
limiti massimi ammessi negli alimenti.

Bibliografia
1 Peta, J.E. and Groopman, J.D. Aflatoxin and liver cancer. Best Pr ctice & Research in Clinical
Gastroenterology. 1999. n.13, p. 545
2 International Agency for Research on Cancer. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic Risks to
humans. Lyon 1993. n. 56, p. 489.
3 Regolamento CE n. 2174/2003 del 12/12/2003.
4 Kussak, A. Andersson, B. and Andersson, K. Determination of aflatoxins in airborne dust from feed factories
by automated immunoaffinity column clean-up and liquid chromatography. Journal of Chromatography A. 1995.
n. 708, p. 55.
5 Waltking, A.E. and Wilson, D. Liquid chromatographic analysis of aflatoxin using post-column photochemical
derivatization: collaborative study. 2006. Journal of AOAC International. Vol. 89, n. 3, p. 678.
6 Tavčar-Kalcher, G. Vrtač, K., Pestevšek, U. and Vengušt, A. Validation of the procedure for the determination
of aflatoxin B 1 in animal liver using immunoaffinity columns and liquid chromatography with post-column
derivatization and fluorescence detection. Food Control.- 2007. Vol. 18, p. 333.
7 Joshua, H. Determination of aflatoxins by reversed-phase high-performance liquid chromatography with postcolumn
in-line derivatization and fluorescence detection. Journal of Chromatography A. 1993. Vol. 654, p. 247.