Sanità animale - IZS della Lombardia e dell'Emilia Romagna

Anno 11 - n. 4 - Agosto 2008
RIVISTA BIMESTRALE D’INFORMAZIONE SCIENTIFICA
a cura dell’Osservatorio Epidemiologico Veterinario della Regione Lombardia
Regione Lombardia
Direzione Generale Sanità - Servizio Veterinario
Istituto Zooprofilattico Sperimentale
della Lombardia e dell’Emilia Romagna
Osservatorio Epidemiologico Veterinario Regionale - Via Bianchi, 9 - 25124 Brescia

S ommario
Anno 11 - n. 3 - Giugno 2008
RIVISTA BIMESTRALE D’INFORMAZIONE SCIENTIFICA
a cura dell’Osservatorio Epidemiologico Veterinario della Regione Lombardia
MONOGRAFIA
Regione Lombardia
Direzione Generale Sanità - Servizio Veterinario
Istituto Zooprofilattico Sperimentale
della Lombardia e dell’Emilia Romagna
Osservatorio Epidemiologico Veterinario Regionale - Via Bianchi, 9 - 25124 Brescia
4 Rassegna sulla diagnosi ante-mortem
di tubercolosi nel bovino
Recensione a cura di G. Zanardi tratta dall’articolo
di R. De la Rua-Domenech et al. (2006).
Ante mortem diagnosis of tuberculosis in cattle:
a review of the tuberculin tests, y-interferon assay and other
ancillary diagnostic techniques.
Research in Veterinary Science, vol. 81, issue 2, 190-210
Direttore responsabile
Stefano Cinotti
Direttore scientifico
Giorgio Zanardi
Redattore
Giorgio Zanardi
Responsabile comitato redazione
Giorgio Zanardi
Comitato di redazione
M. Astuti, P. Cordioli,
M. Domenichini, P. Antoniolli,
L. Gemma, C. Genchi,
G. Gridavilla, A. Lavazza,
A. Palma, V.M. Tranquillo
Hanno collaborato a questo
numero
G. Zanardi
Segreteria di redazione
M. Guerini
L. Marella
Fotocomposizione
Editrice Vannini - Gussago (BS)
Editore
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale della Lombardia
ed Emilia Romagna
“Bruno Ubertini”
Tutti coloro che vogliono scriverci, devono indirizzare le lettere al
seguente indirizzo:
“L’OSSERVATORIO” rubrica “La posta dei lettori”,
via Bianchi, 9 - 25124 Brescia - tel. 030 2290259-235;
oppure utilizzare la posta elettronica: oevr@oevr.org
L’Osservatorio e i numeri del precedente Bollettino Epidemiologico
possono essere consultati anche sul sito web http:\\www.oevr.org

Editoriale
Ho ritenuto interessante ed utile tradurre l’articolo che potete visionare su questo numero, poiché
il Centro di referenza Nazionale della Tubercolosi bovina da M. bovis, che ha sede a Brescia presso
l’IZSLER, è soventemente interpellato nell’esprimere pareri sulla sensibilità e specifi cità delle prove
in vita che possono essere utilizzare per diagnosticare la tubercolosi.
Dal 2007 le regioni Calabria, Campania, Puglia e Sicilia sono impegnate ad applicare il piano
straordinario d’eradicazione previsto dall’Ordinanza del Ministero della Salute del 14 novembre
2006; nel frattempo si sono manifestate tre gravi recrudescenze di tubercolosi bovina nella provincia
autonoma di Trento e nelle regioni autonome di Sardegna e Valle d’Aosta, tutte uffi cialmente indenni
da TB da diversi anni. Le attività mirate al rilievo e all’estinzione dei focolai sono ancora in corso e
la risoluzione del problema sanitario non appare a breve termine.
Pur nelle peculiarità delle singole autonomie, il fattore che accomuna gli episodi è il diradamento
dell’esecuzione delle prove intradermiche con la tubercolina (IDT) a due e anche quattro anni, associato
alla fallacia del sistema di sorveglianza al macello e all’insuffi ciente controllo degli animali
movimentati. La promiscuità al pascolo, tipico in tutte tre le realtà colpite, ha contribuito alla diffusione
della malattia. Il problema in queste situazioni apparentemente tranquille da anni è che la
tubercolosi bovina viene rilevata, quando ormai è presente e circola sul territorio da molto tempo;
per le caratteristiche subdole della malattia, defi nire la sua reale diffusione per cercare d’eradicarla
tempestivamente è un’operazione onerosa e che richiede tempo. Inoltre, la gestione dei focolai in
realtà montane e di pascolo con allevamenti di dimensioni medio-piccole è più complessa e richiede
un deciso intervento dell’autorità regionale, anche in termini di sostegno agli allevatori nelle fasi
d’abbattimento dei capi.
In ogni caso, il tempestivo ricorso all’esecuzione dell’IDT su tutti i bovini, eventualmente associata
all’uso del γ interferon nei focolai è imprescindibile sulla strada dell’eradicazione. L’ispezione al
macello (al di fuori dei territori colpiti), ancora una volta, ha evidenziato, seppure in ritardo, la
malattia sul territorio e rappresenta il punto di controllo cardine in un territorio uffi cialmente indenne.
Da ultimo, si sottolinea che la diagnosi tubercolosi bovina non è mirata al singolo capo ma all’allevamento
e come tale, deve essere integrata dalla sua storia anamnestica, che emerge dall’indagine
epidemiologica.
Giorgio Zanardi
’OSSERVATORIO
L
3 Sanità animale

Rassegna sulla diagnosi ante-mortem
di tubercolosi nel bovino
recensione a cura di G. Zanardi, tratta dall’articolo di R. de la Rua-Domenech et al. (2006).
Ante mortem diagnosis of tuberculosis in cattle: a review of the tuberculin tests,
γ-interferon assay and other ancillary diagnostic techniques.
Research in Veterinary Science, vol. 81, issue 2, 190-210
Introduzione
Il controllo della tubercolosi (TB) bovina da Mycobacterium
bovis è basato sull’accurata rilevazione e
rimozione degli animali infetti. Questi ultimi possono
essere infettanti per lungo tempo prima di manifestare
segni clinici o lesioni tipiche tubercolari. I
segni clinici non sono patognomonici ed è per questa
ragione che si ricorre a test immunodiagnostici per
rilevare gli animali infetti ad uno stadio precoce.
La risposta immunitaria cellulo-mediata all’infezione
intra-cellulare dei macrofagi e di altre cellule
monocitiche rappresenta un meccanismo di difesa
e la causa dell’infiammazione cronica (granuloma),
caratteristica dell’infezione da M. bovis. Alti livelli
di anticorpi circolanti contro M. bovis si riscontrano
solo negli stadi avanzati d’infezione o in caso di elevate
dosi infettanti.
Perciò, i test ante-mortem basati sull’immunità cellulare
individuano animali infetti con M. bovis più
precocemente e con maggior sensibilità rispetto ai
test basati sul rilievo degli anticorpi.
La diagnosi di tubercolosi è fatta con due test approvati
dall’Unione Europea: il test tubercolinico intradermico
in vivo e quello in vitro (γ-interferon o γ-
IFN su sangue). Il primo rileva la reazione d’ipersensibilità
di tipo ritardato all’iniezione intradermica di
tubercolina, mentre il secondo evidenzia il rilascio di
γ-IFN in colture di sangue totale stimolate dalla tubercolina
usando la tecnica ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay).
Il test intradermico o skin test)o intradermotubercolinizzazione
(IDT) e sue varianti è quello usato
di routine nei paesi che implementano programmi
d’eradicazione della TB. L’IDT è, inoltre, prescritta
dall’OIE come test ante-mortem per il commercio internazionale
di bovini.
Generalmente, il test intradermico lavora bene nell’identificare
i bovini infetti, anche se non è perfetto;
d’altra parte, esso rimane il miglior strumento diagnostico
di screening da quando Koch scoprì la tubercolina.
I programmi basati sul principio del sistematico e
regolare controllo con il test intradermico, accompagnato
dalla macellazione dei reattori, dalla restrizione
alle movimentazioni degli allevamenti infetti e dalla
sorveglianza al macello per le infezioni non rilevate,
hanno eradicato la TB in molti paesi sviluppati, come
l’Australia e la maggior parte dei paesi europei, Svizzera,
Canada e quasi tutti gli stati degli USA. In altri
paesi il completo controllo della malattia con il tradizionale
approccio del “test e macellazione” è stato
vanificato dall’esistenza di reservoirs selvatici di M.
bovis, dallo stato di free-range di alcuni allevamenti,
da inadeguate infrastrutture veterinarie, fondi insufficienti
per il funzionamento del programma.
A causa delle dinamiche di trasmissione di M. bovis,
delle dimensioni microscopiche delle lesioni iniziali
e del tempo necessario per un animale nel manifestare
una risposta immune rilevabile, non ci si può
attendere che qualunque test singolo ante (o post)
mortem per TB, di per sé, rilevi ogni allevamento infetto
e ogni animale infetto in tali allevamenti.
Nel corso degli anni diversi fattori hanno compromesso
la capacità del test tubercolinico di identificare
gli animali infetti (sensibilità) o di aumentare la probabilità
di risultati falsi positivi (i.e. ridotta specificità).
Di conseguenza, sono stati sviluppati una serie
di test ancillari, come il γ interferon, a complemento
dello skin test con due principali obiettivi strategici:
• migliorare la probabilità totale di rilevare bovini
tubercolotici (sensibilità) in regioni o allevamenti
con elevata incidenza di TB, rimuovendo i bovini
positivi ad entrambi i test (test in parallelo);
• aumentare la specificità totale del test negli ultimi
stadi della campagna d’eradicazione, in aree a bassa
incidenza di TB, o in regioni con alta incidenza
di bovini con reazioni aspecifiche al test tubercolinico,
rimuovendo solo i bovini che risultano positivi
ad entrambi i test (test in serie).
Altri test ancillari in vitro, come il test ELISA per
anticorpi, il test di proliferazione linfocitaria, la polarizzazione
fluorescente e il “naso elettronico”, sono
stati sviluppati per i bovini, ma la loro applicazione
rimane confinata a livello sperimentale o in situazioni
molto specifiche.
Lo skin test rimane la pietra miliare nella diagnosi di
routine di TB nei bovini, in altri animali domestici e
nell’uomo.
Sanità animale 4 ’OSSERVATORIO
L

Il test intradermico tubercolinico (skin test)
Sviluppo e principi immunologici dello skin test
Il test intradermico è uno standard internazionale per la
diagnosi ante mortem della tubercolosi bovina a livello
di allevamento e di animale. Esso è basato sull’evocazione
di una risposta immunitaria d’ipersensibilità
ritardata ad un’inoculazione intradermica di tubercolina,
un estratto grezzo proteico dal sur-natante di colture
di micobatteri. Dai tempi dell’estratto al glicerolo
di colture liquide pure di bacilli tubercolari di Robert
Koch nel 1890, si è giunti all’uso mondiale della tubercolina
derivata da proteina purificata (PPD).
Quando la tubercolina bovina è inoculato nel derma
di un animale non sensibilizzato agli antigeni tubercolari,
non vi è alcuna significativa risposta infiammatoria
a livello locale. Al contrario, se l’animale
è sensibilizzato Da una pregressa infezione con M.
bovis o dall’esposizione ad antigeni cross-reagenti,
si sviluppa una risposta infiammatoria ed un edema
nel sito d’inoculazione, che raggiunge la più grande
intensità dopo 48-72 ore dopo l’iniezione e in seguito
regredisce rapidamente. Questa ipersensibilità ritardata
è mediata dalle cellule T sensibilizzate, che si
attivano alcune settimane dopo l’infezione.
Vi sono due tipi di test intradermico, singolo (SIT =
single intradermal test) e comparativo (SICCT = single
intradermal comparative cervical tuberculin), con
iniezione simultanea di tubercoline aviare e bovina.
Quest’ultimo test consente una miglior discriminazione
del SIT tra animali infetti con M. bovis e quelli
sensibilizzati perché esposti a M. avium complex o a
micobatteri ambientali non patogeni.
La scelta del tipo di test intradermico dipende dalla
prevalenza di TB e dalla prevalenza d’esposizione ad
altri micobatteri ambientali.
Il SIT caudale è il test di routine per lo screening di TB
negli USA, nel Canada, in Nuova Zelanda ed è stato
usato con successo per eradicare la malattia in Australia,
mentre in Europa è utilizzato quello cervicale. In
tutti i paesi il SICCT è usato come test seriale ancillare
per i reattori o per i reattori in conclusivi al SIT, anche
se gradualmente il γ interferon lo sta sostituendo.
Al contrario, nel Regno Unito e in Irlanda viene adottato
il SICCT come test di screening, utilizzando la
tubercolina bovina di Weybridge.
Accuratezza diagnostica della prova intradermica
L’accuratezza diagnostica di un test è definita in termini
di sensibilità e specificità, rispettivamente calcolate
come proporzione di animali infetti e non infetti,
correttamente diagnosticati.
Questi due parametri possono essere influenzati dallo
stadio e dalla gravità della malattia, dalla prevalenza
degli organismi che cross-reagiscono e da altri fattori
legati all’ospite.
L
’OSSERVATORIO
La percentuale di risultati positivi o negativi al test
che è corretta (valori predittivi) è fortemente influenzata
dalla prevalenza d’infezione da M. bovis.
Sensibilità
La sensibilità (Se) è la proporzione di animali ammalati
(infetti) rilevati come positivi dal test diagnostico.
Il contrario della sensibilità è la proporzione di
falsi negativi (1 – Se).
Nella tabella 1 sono elencati i motivi per i quali possono
verificarsi reazioni false negative alla prova intradermica.
I bovini infettatisi recentemente di solito
non reagiscono all’inoculazione intradermica della
tubercolina. L’ipersensibilità nel bovino si sviluppa
tra 1 e 9 settimane dopo l’infezione con M. bovis, ma
per la maggior parte degli animali la risposta piena si
sviluppa più probabilmente tra le 3 e le 6 settimane
post-infezione.
La durata della fase pre-allergica è stata determinata recentemente
con un’infezione sperimentale di 10 4 UFC
di M. bovis per via endonasale in 20 vitelli, che hanno
dimostrato reattività al SICCT tre settimane dopo il
challenge, confermata dopo 4, 6, 7, 8, 9 settimane.
In altri esperimenti condotti nel Regno Unito non è
stata trovata alcuna correlazione tra dose infettante
di M. bovis e il periodo impiegato a sviluppare una
reazione all’inoculazione intradermica di tubercolina.
Comunque, c’è un’associazione positiva tra le
dimensioni della risposta alla prova intradermica e la
probabilità e l’estensione della patologia tubercolare
al macello.
Uno stato di energia si può sviluppare con tubercolosi
avanzata o generalizzata e temporaneamente in
soggetti stressati. Bovine tubercolotiche che hanno
figliato nelle 4-6 settimane precedenti talvolta non
reagiscono al test tubercolinico.
Somministrazione topica o sistemica di glicocorticoidi
può portare a una significativa riduzione delle
dimensioni della reazione in animali infetti. Co-infezioni
con virus immuno-depressivi come il BVD
possono avere un effetto d’eclisse transitoria sul test.
Altre cause di false negatività possono essere imputate
a malnutrizione, che deprime il sistema innunitario,
e ala desensibilizzazione con una seconda iniezione
ravvicinata (al di sotto di 42 giorni) di tubercolina.
Come per tutti i test, gli errori degli operatori (e.g.
inoculazione non intradermica, lettura troppo precoce
o ritardata della reazione) o il malfunzionamento
dell’attrezzatura (e.g. dose inoculata insufficiente)
possono condurre a false negatività. Infine, una precedente
esposizione al M. avium intracellulare complex
può mascherare temporaneamente la reazione
intradermica e il γ IFN test. Possibili soluzioni alle
implicazioni sul campo nella sorveglianza della TB
in regioni dove l’infezione da M. avium è comune
5 Sanità animale

sono quella di ignorare reazioni alla tubercolina aviare
o usare il SIT con una diminuzione, però, della
specificità del test. L’uso nel γ IFN d’antigeni espressi
solo da membri del MTB complex aumenterebbe
la probabilità di identificare gli infetti con M. bovis,
precedentemente esposti a M. avium.
Per ottenere un’accurata stima della sensibilità tutti gli
animali testati, sia positivi che negativi al test, dovrebbero
essere macellati e sottoposti ad ulteriori test.
Stime di sensibilità per il SIT caudale e cervicale e il
SICCT riportate in diversi paesi sono riassunte nelle
tabelle 1 e 2.
Queste stime variano da 63,2% a 100% per il SIT
caudale e cervicale con un valore mediano di sensibilità
di 83,9%. Il SIT cervicale appare più sensibile e
meno specifico di quello caudale (tabella 1).
Gli studi eseguiti per valutare la sensibilità del SICCT
hanno impiegato numeri contenuti di animali selezionati
da popolazioni con alta prevalenza di reattori. I
risultati (tab. 3) suggeriscono che la Se di SICCT si
ponga tra 52,0% e 100% con valori mediani di 80,0%
(interpretazione standard) e 93,5% (interpretazione
restrittiva).
Specifi cità
La specificità (Sp) è la proporzione di animali sani
(non ammalati, non infetti), che sono correttamente
identificati come negativi dal test diagnostico. Come
per tutti i test, anche per la prova intradermica non
esiste una Se e Sp del 100% e tra loro vi è un rapporto
inversamente proporzionale. La SIT ha una Sp
che varia dal 75,5% al 99,0% (mediana del 96,8%)
(tabella 2).
Tabella 1. Riassunto dei risultati di trial di campo condotti per stimare la sensibilità me specificità del SIT nei bovini,
in ordine cronologico di pubblicazione.
Tipo di
test
tubercolinico
Quantità di
PPD bovina
Proporzione
apparente di
malati
N° animali
testati (o sottoposti
a necroscopia)
Sensibilità
%
Specificità
%
Referenze (paese)
SIT
caudale
0,2-0,4 mg 3.955 (2.967) 3,4 72,0 98,8
0,3 mg 6.264 (6.264) 1,39 63,2 99,0
0,2-0,3 mg 1.362 (1.362) 1,6 68,2 96,8
Francis et al. (1978)
(Australia)
Wood et al. (1991)
(Australia)
Wood et al. (1992)
(Australia)
0,1 mg 656 (656) 31,1
80,4-
84,4
Non
valutato
Whipple et al. (1995)
(USA)
0,1 mg
494 (494) da
7 allevamenti
1,1-5,5 (all. a
bassa P)
23,1-32,6 (all.
a moderata P)
83,3
96,8
Non
valutato
Norby et al. (2004)
(USA)
SIT
cervicale
0,1 mg 10.305 0,56 100 88,6
Lesslie et al. (1975)
(GB)
Legenda:
* per stimare la sensibilità
** per stimare la specificità
anche PPD
umana
Dettaglio
non
disponibile
Dettaglio
non
disponibile
0,1 mg
Dettaglio
non
disponibile
2.949 (2.949) 51,8 91,2 75,5
1.036 (140) 10,7 91,0
232 (218) 57,8 80,2
22 (22)*
10 (10)**
800 (35) da
20 all. U.I.
Non
valutato
Non
valutato
100
0,0 86,4 90,0
0,0
Non
valutato
Media da 5 fonti da
vari paesi (citati in
Francis et al., 1978)
Domingo et al.
(1995) Spagna
Gonzales Llamazareset
al. (1999)
(Spagna)
Pollock et al. (1999)
(2003) (Nord Irlanda)
Sanità animale 6 ’OSSERVATORIO
96,8
Cagiola et al. (2004)
(Italia)
L

Tabella 2. Riassunto dei risultati di trial di campo condotti per stimare la sensibilità e specificità del SICCT nei bovini,
in ordine cronologico di pubblicazione.
PPD
bovina
PPD
aviare
N° animali
testati (o
sottoposti a
necroscopia)
Proporzione
apparente di
malati
Interpretazione
del test
Sensibilità
%
Specificità
%
Referenze
(paese)
L
0,2 mg 0,05 mg
’OSSERVATORIO
1.110 (0) in
25 all. UI
0,0
0,1 mg 0,05 mg 1.035 (88) 0,56
0,1 mg 0,05 mg
Vari,
inclusa
PPD
umana
vari
671 (316)*
500 (107)**
1.425
(1.425)
0,1 mg 0,05 mg 270 (68) 25,2
0,1 mg 0,05 mg
2.799 (192)*
1.396 (0)**
Usati in serie
per ri-testare i
sospetti entro 7
giorni dal SIT
Standard
Severa
Dettagli non
disponibili
Standard
Severa
74,4
88,5
non
valutata
91,4
100
100
99,9
15,0 Standard 95,5 97,8
36,9 Severa 68,6 88,8
6,4
0,1 mg 0,05 mg 18 (18) 83,3
Standard
Severa
Standard
Severa
Standard
Severa
75,0
94,1
55,1 100
93,3
100
0,1 mg 0,05 mg 258 (258) 14,0 Standard 90,9
non
valutata
non
valutata
2.000 UI 2.500 UI 30 zebu (30) 73,3 Standard 90,9 100
5.000 UI 2.500 UI
2.000 UI 2.500 UI
0,1 mg 0,1 mg
Legenda:
* per stimare la sensibilità
** per stimare la specificità
84 (84)
bovini
negativi al
clturale,
reattori al
SIT caudale
100 (100)
zebu
(gruppo a
moderata P)
22 (22)
(gruppo ad
alta P)
494 (494) in
7 all.
0,0 Standard
21,0
43,5
1,1-1,5 (all.
a bassa P)
23,1-32,6
(all. a
moderata P)
Giudizio
soggettivo
(palpazione del
punto di inoculo
e osservazione
segni clinici)
Usato come
test in serie
per ri-testare
i sospetti al
SIT caudale
entro 7 giorni
(interpretazione
Non
valutata
52,0
80,0
75,0
93,5
94,0
99,0
100
Non
valutata
Non
valutata
Roswurm and
Konya (1973)
citato da
Norby et al.
(2004)
Lesslie et al.
(1975)
Lesslie et al.
(1975)
O’Reilly and
MacClancy
(1975)
Citato da
Francis et al.
(1978)
O’Reilly (1986)
Neill et al.
(1994) (Nord
Irlanda)
Doherty et al.
(1995) (Irlanda)
Costello et al.
(1997) (Irlanda)
Ameni et al.
(2000) (Etiopia)
Buddle et al.
(2001) (Nuova
Zelanda)
Quirin et
al. (2001)
(Madagascar)
Norby et al.
(2004) (USA)
7 Sanità animale

Studi eseguiti su popolazioni bovine libere da TB la
Sp del SICCT variava dal 78,8% al 100% (mediana
del 99,5%) (tabella 3). La Sp del SICCT raggiungeva
il 99,9% in zone dove la prevalenza di TB tendeva
allo zero (sulla base dell’esame post-mortem).
L’imperfetta Sp conduce a falsi positivi, conosciuti
anche come “reattori non specifici” (RNS). Le cause
sono complesse e molti batteri sono implicati, che
condividono antigeni proteici con la tubercolina PPD
(tabella 4).
Nel test intradermico comparativo gli animali infetti
con micobatteri diversi da quelli appartenenti al MTB
complex in genere sviluppano reazioni alla tubercolina
aviare molto più evidenti di quelle causate dalla
tubercolina bovina. Su questo fenomeno si basa la soluzione
di molti problemi di aspecifcità legate al SIT.
Ad ogni modo, è possibile che la tubercolina aviare
sia uguale o ecceda quella bovina in una piccola proporzione
di bovini naturalmente infetti con M. bovis,
i quali presentano lesioni al macello. La soluzione a
lungo termine per discriminare la sensibilizzazione
non specifica sarebbe l’utilizzo nel test d’antigeni purificati
specifici per M. bovis.
Signifi cato epidemiologico dei reattori con lesioni
non visibili (NVL = non-visible lesions reactors).
Nel Regno Unito e in Irlanda circa il 50-80% dei bovini
reattori allo skin test non mostra segni di malattia
al macello (NVL e mancato isolamento di M. bovis
in coltura). Sembrerebbe, perciò, che la Sp del test
sia molto più bassa delle valutazioni fatte sul campo.
Questo, naturalmente, indebolisce la fiducia dei
veterinari di campo e degli allevatori nella prova intradermica
e in altri metodi diagnostici ante-mortem
(γ IFN). Questa percezione, tuttavia, origina da due
fraintendimenti. Il primo è l’assunzione erronea che
l’esame post-mortem e la coltura batteriologica sono
“gold standards” contro i quali si dovrebbe stabilire
l’accuratezza dei test immunodiagnostici per TB.
Diversi autori hanno già sottolineato che l’esame
post-mortem (particolarmente quello condotto in
grandi macelli) e i test batteriologici standard per
Tabella 3. Potenziali cause di risultati falsi negativi ai test tubercolinici nel bovino (adattato da Snider, 1982)
Fattori legati all’animale
• De-sensibilizzazione alla tubercolina bovina (test eseguito a distanza troppo ravvicinata dalla precedente
prova intradermica)
• Periodo non reattivo (pre-allergico) (esecuzione del test troppo precoce dal momento dell’infezione)*
• Infezione con M. bovis iperacuta o generalizzata (anergia)*
• Co-infezione con (o pre-esposizione a micobatteri ambientali (e.g. M. avium-intracellulare complex) che
causano ipersensibilità alla tubercolina aviare nei test SICCT e IFN*
• Vaccinazione contro Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (malattia di Johne)* e **
• Infezione concorrente con virus che deprimono il sistema immunitario (e.g. BVD)* e **
• Farmaci (e.g. corticosteroidi e agenti immunosoppressivi)*
• Immunosopressione nel primo periodo post-partum*
• Stress nutrizionali o da trasporto*
• Ceppo di M. bovis*
Fattori legati alla tubercolina usata
• Prodotto scaduto*
• Conservazione inappropriata del prodotto (esposto alla luce e calore per lunghi periodi di tempo)*
• Errori di produzione (uso di ceppi inadeguati, non corretta calibrazione della potenza, etc.)*
Fattori legati al metodo di somministrazione, lettura e registrazione del test (errori degli operatori dovuti
ad inesperienza, mancanza di attenzione, scarsa manutenzione dell’attrezzatura, etc.)
• Inoculazione di una dose insufficiente di tubercolina
• Iniezione sottocutanea di tubercolina
• Sito di inoculazione non corretto
• Inoculazione di tubercolina bovina nel sito della tubercolina aviare e viceversa (SICCT test)
• Lettura dei risultati troppo precoce o troppo tardiva (non entro le 72 h ± 4-6 h dopo l’inoculazione della
tubercolina)
• Errori nella registrazione delle letture
• Errori nell’identificazione degli animali che reagiscono
• Distorsioni consce o inconsce dell’operatore
Legenda:
* applicabile anche al IFN e ad altri test in vitro che rilevano risposte cellulo-mediate alla tubercolina bovina
** potenziale causa anche di risultati falsi positivi
Sanità animale 8 ’OSSERVATORIO
L

M. bovis (che rilevano la malattia tubercolare) sono
meno sensibili dei test immunologici (che rilevano
spesso un’infezione sub-clinica, i.e. la risposta immunitaria
cellulo-mediata contro il batterio).
Il secondo equivoco è l’insufficiente apprezzamento
della differenza tra il tasso di falsi positivi (“dato che
un animale non è infetto, qual è la probabilità che il
test sarà positivo”) e il valore predittivo di un risultato
positivo al test (“dato che l’animale che ho controllato
è positivo, qual è la probabilità che l’animale
sia veramente infetto”). Il primo è l’inverso della
specificità del test, mentre l’ultimo è una funzione
della Se, Sp e della prevalenza vera dell’infezione
nella popolazione (che raramente è conosciuta). Qualunque
test di screening per TB con meno del 100%
di Sp classificherà, per definizione, degli animali
come falsi positivi, che, naturalmente, non avranno
lesioni visibili (NVL) e risulteranno negativi all’esame
colturale.
Nondimeno, è importante non confondere tutti i reattori
NVL con i veri reattori non specifici (falsi positivi)
(NSR = non-specific reactors). Mentre i NSR
saranno NVL per definizione, non tutti gli NVL, reattori
negativi all’esame colturale sarebbero necessariamente
considerati come NSR.
I reattori NVL originano per molteplici ragioni e il
loro significato dipende dalla specificità intrinseca
del test, dallo stadio della campagna d’eradicazione
della TB, dall’accuratezza dell’esame dei reattori al
macello, dal tempo d’inizio dell’infezione, dalla dose
infettante, dalla prevalenza di TB e dal numero di
reattori trovati nell’allevamento controllato.
Gli animali NVL possono, perciò, essere indicativi di:
• animali ad uno stadio precoce d’infezione con M.
bovis, quando i granulomi sono troppo piccoli o infrequenti
per essere notati durante l’esame ispettivo
post-mortem;
• animali infetti con M. bovis, ma senza malattia,
i.e. temporaneamente capaci di contenere i bacilli
in una condizione di latenza (sebbene la natura e
l’estensione della TB latente nei bovini richieda ulteriori
ricerche);
• animali non-infetti esposti ad antigeni di micobatteri
ambientali che cross-reagiscono con la tubercolina
bovina o altri antigeni di M. bovis usati nei test
diagnostici ante-mortem (i.e. veri “falsi positivi o
NSR”).
In regioni dove la TB bovina è endemica o in allevamenti
in cui la presenza della malattia è già stata
confermata da esami post-mortem o di laboratorio, i
reattori alla tubercolina sono molto predittivi d’infezione
da M. bovis e, a quel punto, è insignificante se
sono o no NVL.
Al contrario, analogamente alla diminuzione della
prevalenza di TB, anche il valore predittivo di una
L
’OSSERVATORIO
prova intradermica positiva ( o γ IFN) declina e grandi
proporzioni di risultati positivi al test deriveranno
da sensibilizzazioni non specifiche dei bovini ad antigeni
di M. bovis (NSR).
In tali casi, può essere raccomandata l’applicazione
di test ancillari da usare in serie, al fine di chiarire lo
stato dei reattori alla tubercolina.
In sintesi, il “problema” dei reattori NVL non è legato
ad una scarsa specificità della prova tubercolinica,
ma ad un inadeguato gold standard e ad un basso valore
predittivo del risultato positivo al test, quando
si controlla una popolazione libera da TB o con una
bassa prevalenza d’infezione.
“Un buon test d’allevamento, ma non per l’animale”
Una delle teorie avanzate per spiegare la mancanza
di progressi nell’eradicazione della TB dal Regno
Unito e dall’Irlanda e in altri paesi è l’imperfetta Se
del test SICCT. Con altre prove intradermiche, esso è
descritto come un buon test d’allevamento, ma scarso
nell’individuare singoli animali infetti. Il fatto è
che ogni test diagnostico, non solo quello intradermico)
che viene applicato al singolo animale, avrà
una chance maggiore di individuare gruppi infetti di
animali rispetto ad animali infetti controllati singolarmente.
Ciononostante, è stato ipotizzato che l’uso
routinario di un test di screening con una Se imperfetta
può portare ad un gruppo sostanziale d’infezioni
non rilevate negli allevamenti britannici.
A questo punto, è importante non trascurare alcune
importanti caratteristiche dei programmi di controllo
della TB nei paesi sviluppati.
La sensibilità a livello d’allevamento (Herd-level
sensitivity o HSe) o la probabilità che un allevamento
infetto sia identificato come tale dal test di screening
è una funzione della prevalenza all’interno dell’allevamento
(within-herd prevalence), il numero di animali
controllati in allevamento, la Se del test a livello
di singolo animale e il numero minimo di singoli animali
positivi al test richiesto per classificare un allevamento
come infetto (uno, nel caso della TB).
HSe aumenterà rapidamente al massimo livello
(100%) nel momento in cui il numero di animali testati
nell’allevamento aumenta. Questa correlazione
è vera, anche se la prevalenza di malattia all’interno
dell’allevamento è bassa o moderata e la Se individuale
del test è lontana dall’essere perfetta. In Gran
Bretagna, per esempio, l’80% e il 75% di tutti i nuovi
focolai confermati scoperti nel 2002 e nel 2003
contenevano un totale di due o più reattori. Inoltre, il
test annuale in aree endemiche per TB era eseguito su
tutti gli animali oltre le sei settimane di vita. Perciò,
l’HSe della prova intradermica è molto più elevata rispetto
alla Se calcolata a livello del singolo animale.
In accordo con i protocolli UE sui test, la prova in-
9 Sanità animale

Tabella 4. Riassunto dei risultati di studi pubblicati sulla sensibilità e specificità del IFN (Bovigam ® ) nel bovino, in
ordine cronologico di pubblicazione
Tubercolina
bovina (mg/
ml)
Tubercolina
aviare (mg/
ml)
Criterio
d’interpretazione
del test
N° testati
(o sottoposti a
necroscopia)
Proporzione
apparenste
di
malati (%)
Sensibilità
(%)
Specificità
(%)
0,3 0,3 C4 6.264 (6.264) 1,4 81,6 99,4
0,3 0,3
C1
C2
C3
C4
C5
5.733 (0) bovini da all.
UI da 5 anni
0,0
Non
valutata
0,2 0,2 C4 1.362 (1.362) 1,6 81,8 99,1
0,5 1,0 C6
1.396 (389) bovini
presunti non infetti
0,0
Non
valutata
0,5 1,0 Non stabilito 2.799 (192) 6,4 84,3
Non fornito Non fornito C4
0,02 0,02
Non fornito
Non fornito
C4
C11
C1
C7
656 (656) da un all.
infetto
1.036 (140) 10,7
203 (203) bovini da
un n° non specificato
di all. infetti (stima
della Se)
923 (0) bovini da
13 all. UI da 5 anni
(stima Sp)
31,1 73,0
100
0,0
93,7
87,4
87,7
Non
valutata
96,2
97,4
98,0
98,1
97,8
99,6
Non
valutata
Non
valutata
Non
valutata
Non
valutata
Non fornito Non fornito C4 220 (8) - 100 94,0
0,3 0,3 C4 232 (218) 57,8 84,9
Non fornito Non fornito C12
1.557 (0) bovini da
all. UI con notevoli
reazioni alla PPD
aviare
0,0
Non
valutata
96,6
Non
valutata
0,2 0,2 Non stabilito 30 zebu (30) 73,3 95,5 87,7
Non fornito
Non fornito
C6, C13
C13
163 (163) bovini positivi
a SIT e colturale
da 21 all. (stima Se)
213 (57) bovini da 82
all. senza infezione
evidente, ma con
anamnesi remota di
test + e necrospia +
(stima Sp)
100
0
85,0
Non
valutata
88,9
Non
valutata
93,0
Referenze
(paese di
studio)
Wood et al.
(1991) (Australia)
Wood et al.
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Gonzalez
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(1999) (Spagna)
Lauzi et al.
(2000) (Italia)
Ameni et al.
(2000) (Etiopia)
Ryan et al.
(2000) (Nuova
Zelanda)
Legenda: il criterio d’interpretazione per un test positivo non era lo stesso per tutti gli studi. Criteri d’interpretazione usati per il test del γ IFN nei differenti studi:
C1: BOD-COD > 0 e BOD-AOD > 0
C2: BOD/COD > 1,25 e BOD-AOD > 0
C3: BOD/COD > 1,5 e BOD-AOD > 0
C4: BOD/COD ≥ 0,0,5 e BOD-AOD > 0
C5: se BOD = 0,1, allora BOD/COD > 1,5 e BOD-AOD > 0. Se BOD > 0,1, allora BOD/COD > 1,5 e BOD-AOD > 0,5 e BOD-AOD > 0
C6: BOD-AOD ≥ 0,1
C7: BOD/COD ≥ 0,1 e BOD-AOD ≥ 1,8
C8: BOD/COD ≥ 0,1 e BOD-AOD ≥ 1,25
C9: BOD-AOD ≥ 1,8
C10: BOD/COD ≥ 0,05 e BOD-AOD ≥ 1,8 (= C4 se BOD-AOD ≥ 1,0)
C11: BOD/COD ≥ 0,1 e BOD-AOD > 0
C12: BOD/COD ≥ 2 (COD) e BOD-AOD ≥ 0,05
C13: BOD/COD ≥ 0,1 e BOD-AOD ≥ 0,1
C14: BOD-AOD ≥ 0,4
BOD = valore medio di Densità Ottica del plasma stimolato dalla PPD bovina
AOD: valore medio di Densità Ottica del plasma stimolato dalla PPD aviare
COD: valore medio di Densità Ottica del plasma incubato con buffer di soluzione salina fosfato (nessun antigene di controllo)
Sanità animale 10 ’OSSERVATORIO
L

tradermica è automaticamente ripetuta ad intervalli
di 60 giorni in allevamenti con reattori alla TB, fini a
quando uno o due test risultino negativi (in relazione
alla conferma o meno di malattia nei precedenti
reattori). I test di controllo sono eseguiti 6 mesi dopo
la rimozione delle misure restrittive e 12 mesi dopo,
prima che l’allevamento in questione ripristini il suo
normale intervallo di controllo.
L’interpretazione severa è applicata automaticamente
per la conferma di TB in un allevamento.
Nuovamente, questo aumenta la Se a livello individuale
del test SICCT.
La sorveglianza della TB a livello d’allevamento con
la prova intradermica è affiancata dall’ispezione dei
bovini al macello e dal rintraccio di qualunque carcassa
con granulomi sospetti. In Gran Bretagna il numero
di casi di TB riportati annualmente dai veterinari
ispettori e confermati in seguito dagli esami colturali
varia da 100 a 300. Questa è una proporzione molto
piccola su oltre 2,5 milioni di bovini macellati ogni
anno e ha inciso per il 14% di tutti gli allevamenti
nuovi infetti nel 2004.
Il parziale o totale de-popolamento dei bovini è applicato
quando necessario, al fine di risolvere focolai
cronici o esplosivi.
Indubbiamente, ogni animale infetto non rimosso al
test tubercolinico può essere, o diventare, infetto e
potenzialmente agire come fonte di M. bovis per gli
altri animali in allevamento, vanificando la risoluzione
del focolaio.
L’imperfezione della Se del test aumenta il rischio che
bovini infetti non rilevati rimangano nell’allevamento
dopo la rimozione delle restrizioni. Questi scenari
sono stati investigati e modellati in Gran Bretagna. Le
regole della probabilità indicano che in allevamenti
con reattori multipli (infetti), l’uso di un test più sensibile
o una combinazione di due test differenti che
identificano lievemente sub-popolazioni differenti di
animali infetti (test parallelo) aumenterebbe la velocità
di risoluzione del focolaio. Analogamente, in assenza
di una fonte esterna di re-infezione la probabilità di
recidiva del focolaio sarebbe ridotta dall’uso di due
o più test in parallelo (i.e. interpretazione “qualunque
positivo”). La questione cruciale per chi governa la
politica sanitaria è di determinare le specifiche circostanze
nelle quali l’applicazione di un test ancillare in
parallelo a fianco della prova intradermica è consigliata
e rappresenta un uso efficiente delle risorse.
Il test del γ interferon (γ IFN)
Il γ IFN fu sviluppato negli anni 80 in Australia come
test diagnostico da usarsi in combinazione con il SIT
caudale. L’Australia diventò ufficialmente indenne
da TB nel1997 attraverso la sistematica applicazione
del test intradermico, lo stringente controllo dei movimenti
e la rimozione dei reservoirs d’infezione nei
bufali d’acqua e nei bovini selvatici.
Con il tempo, il test è stato ottimizzato e valicato per
l’uso sul campo, ma i foci d’infezione rimasti in Australia
erano pochi e troppo distanti dai laboratori per
poterlo utilizzare nell’eradicazione. Nondimeno esso
fu autorizzato come metodo diagnostico ufficiale nel
1991 ed adottato come test ufficiale in Nuova Zelanda
alla fine degli anni 90.
Il γ IFN è una citochina che viene prevalentemente rilasciata
dai linfociti T dopo stimolazione antigenica e
gioca un ruolo importante nella risposta immunitaria
verso i micobatteri tubercolari come maggior fattore
d’attivazione macrofagica. Analogamente alla prova
intradermica esso rileva la risposta immunitaria cel-
Box 1 - Vantaggi del test γ IFN sulla prova intradermica
• La sua sensibilità è considerata simile a quella del SIT e maggiore rispetto al SICCT;
• il tempo necessario per sviluppare la risposta al test γ IFN dopo l’infezione (tra 1 e 5
settimane) è lievemente più breve rispetto al test intradermico (3-6 settimane);
• consente una più rapida ripetizione del test (non vi è interferenza con il sistema immunitario
dell’ospite). Comunque, test intradermici recenti possono influenzare le
risposte al test γ IFN;
• non vi è necessità di una seconda visita in allevamento per la lettura del test;
• vi è un’interpretazione dei risultati più obiettiva, standardizzata, poiché tutte le misure
sono basate sul laboratorio;
• riduce molti dei problemi pratici legati al test intradermico (scarse attrezzature, errori
degli operatori, possibilità di frode), che possono contribuire a sottostimare gli animali
infetti o dubbi;
• è soggetto all’inclusione di antigeni definiti e ciò aumenta la differenziazione delle
risposte al γ IFN dovute ad infezione con micobatteri patogeni da quelle derivate dall’esposizione
a micobatteri ambientali o da ceppo vaccinale.
’OSSERVATORIO
L
11 Sanità animale

Box 2 - Svantaggi del test γ IFN nei confronti della prova intradermica
• Specificità apparentemente più bassa. Ciò può essere parzialmente compensato utilizzando
al posto della tubercolina bovina determinati antigeni del micobatterio come la
proteina ESAT 6 (early secretory antigenic target) e la proteina filtrata da coltura 10
(CFP). Entrambe le proteine sono codificate da geni presenti nei genomi di M. bovis e
M. tuberculosis e assenti da M. bovis BCG e quasi tutti i micobatteri ambientali;
• una piccola proporzione di bovini infetti che reagiscono al test intradermico non sono
individuati dal test γ IFN;
• è più probabile che vitelli non infetti diano reazioni non specifiche al test. Questo è dovuto
probabilmente alla produzione innata di γ IFN da parte delle cellule natural killer
nel sangue periferico, quando stimolate in vitro con certi antigeni del MTB complex;
• alcune difficoltà logistiche associate alla necessità di trasportare i campioni di sangue
in un ambiente stabile (circa 10-26°C) e di incubarli con l’antigene entro poche ore
dalla raccolta. Ritardi nel processo dei campioni può ridurre significativamente la sensibilità
del test;
• alto costo della componente del laboratorio, sebbene si eviti il ritorno in allevamento
e via sia l’automazione e l’economia di scala;
• necessità di un’accurata identificazione degli animali al campionamento, poiché i positivi
non sono marcati nella reazione al test.
lulo-mediata dell’ospite nei confronti dell’infezione
con M. bovis.
Dopo 1-4 settimane dall’infezione, le cellule T nel
sangue periferico del bovino rilasciano quantità misurabili
di γ IFN, quando stimolate dalla tubercolina
bovina o antigeni simili. Nel caso in cui l’infezione
sia causata da M. avium o micobatteri ambientali, la
produzione di γ IFN sarà più copiosa da parte delle
cellule T incubate con la tubercolina aviare. L’infezione
con M. bovis è determinata, quando la tubercolina
bovina stimola una produzione di γ IFN maggiore
della tubercolina aviare o dell’antigene di controllo
negativo. La quantità di γ IFN prodotto è misurato
con lo sviluppo di colore all’ELISA test ed è espresso
in unità di densità ottica (DO).
Accuratezza diagnostica, vantaggi e svantaggi del γ
IFN
La performance diagnostica del γ IFN convenzionale
è stata valutata in diversi studi svolti in Australia,
Brasile, Etiopia, Gran Bretagna, Repubblica d’Irlanda,
Italia, Nuova Zelanda, Irlanda del Nord, Spagna
e USA. In questi trias la Se del γ IFN variava tra il
73% e il 100%, con un valore mediano di 87,6%. Il
valore mediano della Sp era del 96,6%, con un range
di 85,0-99,6% (tabella 5). Come atteso, i risultati
furono influenzati anche dalle caratteristiche della
popolazione bovina sottoposta al test, dai differenti
valori di cut-off adottati per classificare gli animali
come positivi, dal lotto e dalla fonte di tubercolina
PPD usata come antigene e dal gold standard usato
per determinare il vero stato d’infezione degli animali
in studio.
Generalmente, si considera che il γ IFN abbia una
sensibilità sovrapponibile alla prova intradermica
(tabella 4). Alcuni autori sostengono che il test del
γ IFN sveli un numero sostanziale di bovini infetti
che sfuggono al test tubercolinico, poiché riesce ad
identificare gli animali ad uno stadio precoce d’infezione.
Perciò, i due test rilevano due sottopopolazioni
di animali tubercolotici leggermente differenti.
I bovini positivi al γ IFN e negativi all’IDT che non
sono immediatamente macellati hanno una maggior
probabilità di reagire a test intradermici susseguenti
rispetto ad animali negativi ad entrambi i test. Recenti
studi in Gran Bretagna hanno dimostrato che
l’intervallo tra l’infezione e il tempo necessario per
giungere ad una risposta positiva al γ IFN (periodo
d’insensibilità) è del tutto indipendente dalla dose infettiva
di M. bovis.
Il γ IFN e l’IDT hanno una bassa probabilità di individuare
bovini infetti anergici (risposta immune cellullo-mediata
depressa).
I vantaggi pratici del test γ IFN paragonati all’IDT
sono riassunti nel box 1.
Nella tabella 3 sono elencati alcuni fattori che deprimono
la risposta cellulo-mediata e che diminuiscono
la sensibilità dell’IDT e del test γ IFN.
Nel box 2 sono evidenziati gli svantaggi del test γ
IFN rispetto all’IDT.
Infl uenza del test intradermico sulla risposta del γ
IFN
Dati preliminari di un lavoro del 1992 hanno suggerito
che risposte al γ IFN in bovini infetti erano
Sanità animale 12 ’OSSERVATORIO
L

influenzate dalla precedente applicazione del test intradermico;
in particolare, si osservava un graduale
incremento nei valori OD per il test γ IFN tra 7 e 59
giorni dopo il SIT caudale.
Ad ogni modo, successivi studi differenti hanno portato
a conclusioni contrastanti circa la temporanea diminuzione
nella risposta al γ IFN dopo applicazioni
recenti del test intradermico.
Queste discrepanze sono probabilmente dovute a
condizioni variabili con cui sono stati condotti i diversi
studi, incluso il tipo di skin test applicato. Alcuni
autori hanno valutato il test Bovigam ® in bovini
naturalmente infetti tra 8 e 28 giorni dopo la lettura
del SIT caudale. Le conclusioni sono state favorevoli
all’utilizzo del test anche dopo 8 giorni dalla lettura
del SIT. Questi risultati sono alla base dell’attuale
protocollo del test con γ IFN in Nuova Zelanda, dove
il campionamento di sangue viene eseguito tra 13 e
33 giorni dopo l’inoculazione della tubercolina.
Negli USA altri studi confermano che il SIT caudale
incrementa le risposte del γ IFN a partire da tre giorni
dopo lo skin test e fino a 63 giorni. Applicando il
SICCT test a 63 giorni dopo il SIT non si evidenziava
un ulteriore incremento nella risposta al γ IFN.
Inoltre, è stato dimostrato che si raggiungono valori
di OD elevati nel sangue prelevato dopo 3 giorni dal
SIT e conservati per una notte rispetto a campioni
prelevati contestualmente, ma testati immediatamente,
entro 2 ore.
Questi risultati hanno supportato l’autorizzazione da
parte del Dipartimento dell’Agricoltura USA di applicare
il test Bovigam ® tra 3 e 30 giorni dopo il SIT
caudale.
Diversi studi condotti in Irlanda e in Gran Bretagna
non hanno mostrato significative differenze nella
risposta al γ IFN in animali naturalmente infetti e
reattori allo skin test fino a 7 e 65 giorni dopo il test
SICCT. In un altro lavoro si afferma che il test del
γ IFN può essere eseguito su campioni prelevati tre
giorni dopo l’applicazione del SICCT test senza influenzarne
la sensibilità.
Di converso, un altro studio eseguito su vitelli infettati
sperimentalmente con alte dosi di M. bovis, ha dimostrato
una diminuzione pronunciata della risposta
al γ IFN in sangue prelevato dopo 3 giorni dall’applicazione
del SICCT test, anche se l’interpretazione
del test non veniva influenzata quando si usavano le
tubercoline bovina e aviare. Anche in Gran Bretagna
è stato segnalato che le risposte del γ IFN alla tubercolina
aviare in vitelli sperimentalmente infettati
aumentano transitoriamente, quando il sangue è raccolto
una settimana dopo il SICCT test.
Questo incremento selettivo della risposta alla tubercolina
aviare potrebbe mascherare la diagnosi d’infezione
con il test Bovigam ® .
Nel box 3 sono rappresentate le conclusioni generali
di tutti gli studi presi in considerazione circa gli effetti
dello skin test sulle risposte del γ IFN in animali
infetti.
Applicazioni in campo del γ IFN
Come già affermato, la specificità mediana del γ IFN
convenzionale usando la PPD bovina è 96,6%; può
sembrare alta e solo marginalmente bassa se paragonata
al 99,5% del SICCT test. Ad ogni modo, in un
paese o regione dove la prevalenza di TB a livello
individuale è bassa, questo valore porterebbe a macellare
un numero inaccettabile di bovini non infetti.
Questo è il principale argomento portato contro l’utilizzo
del test Bovigam ® come test di screening di
massa. Inoltre, il test è relativamente costoso e il suo
uso comporta alcuni svantaggi logistici e non identifica
ogni animale infetto che reagisce allo skin test.
Perciò, l’applicazione più idonea del γ IFN ad oggi
è il suo uso come test ancillare in parallelo in focolai
di TB o in allevamenti persistentemente infetti a più
skin test, in cui la rimozione di pochi animali o falsi
positivi è di trascurabile importanza. L’impiego sia
dello skin test che del γ IFN in rapida successione
può innalzare la sensibilità diagnostica totale fino al
20% in più rispetto al solo SIT test, con la rimozione
di più bovini infetti, ma non necessariamente tutti, da
allevamenti infetti con più rapidità.
In più, in paesi dove il SIT è il test di screening primario
(compresa l’Italia), il test γ IFN è il test seriale
di scelta per ri-testare i reattori allo skin test in allevamenti
bovini indenni da TB situati in aree a bassa
prevalenza di TB.
Box 3 - Riassunto degli effetti osservati dello skin test su susseguenti risposte di γ IFN
in animali infetti.
• Il SIT caudale può incrementare le risposte del γ IFN in bovini infetti con M. bovis;
• il SICCT test non incrementa significativamente le risposte del γ IFN;
• il sangue per il test Bovigam® può essere prelevato dopo tre giorni dal SIT test, senza
influenzare il risultato;
• vi sono risultati contradditori in relazione al SICCT test. Alcuni risultati supportano
l’affermazione precedente, altri dati sperimentali suggeriscono che è più sicuro evitare
di usare il test Bovigam® nei 7 giorni seguenti il SICCT test.
’OSSERVATORIO
L
13 Sanità animale

Tabella 5. Esempi d’applicazioni in campo del test IFN (Bovigam ® ), a complemento dei test diagnostici primari
per TB nel bovino
Paese
Nuova
Zelanda
USA
Sud
Africa
Italia
Repubblica
d’Irlanda
Nord
Irlanda
Gran
Bretagna
(UK)
Test
primario
di
screening
per TB
SIT
caudale
SIT
caudale
SIT
caudale
SIT
cervicale
SICCT
SICCT
SICCT
Test in parallelo in bovini skin test negativi
(interpretazione “qualsiasi positivo) per > Se
Allevamenti infetti in modo acuto o cronico,
per ridurre il tempo d’eradicazione
Pre-movement test in bovini > 6 settimane
da allevamenti infetti
Come alternativa alla macellazione
dell’intero allevamento infetto
Allevamenti bovini e bufalini infetti in modo
acuto o cronico
Allevamenti bovini e bufalini infetti in modo
acuto o cronico
Allevamenti infetti in modo acuto o cronico,
per ridurre il tempo di eradicazione
Possibile screening d’allevamenti contigui
a focolai confermati
Parte di un pilota per supportare la
rilevazione di bovini infetti in allevamenti
“problema” con infezione cronica Gli
allevamenti reclutati (e gli animali positivi
rimossi) sono su base volontaria
In focolai TB persistenti in cui ci sono
reattori con lesioni visibili nei successivi 60
giorni d’intervallo tra gli skin test
In gravi focolai come alternativa alla
macellazione totale o parziale
In nuovi focolai confermati fuori da aree
endemiche
La tabella 5 riassume le diverse applicazioni in campo
del test γ IFN in una selezione di paesi non ufficialmente
indenni da TB con attivi programmi di
controllo.
Negli USA il γ IFN è un test supplementare approvato
nel bovino dal 2001; ora è usato di routine in alternativa
al SICCT per chiarire lo stato dei reattori al
SIT caudale in allevamenti presumibilmente indenni
dall’infezione (test seriale) ed è approvato anche
come test in parallelo con il SIT caudale in allevamenti
infetti, in alternativa al de-popolamento.
Anche in Nuova Zelanda il γ IFN è approvato nel bovino
come test ancillare a complemento del SIT caudale,
sia come test in serie per i reattori allo skin test e
come test in parallelo per gli animali skin test negativi
in allevamenti infetti. Inoltre, il γ IFN è usato in parallelo
con il SIT nel controllo dei bovini al pre-movement
da allevamenti infetti (al contrario degli allevamenti
indenni, in cui i bovini sono testati al pre-movement
solo con il SIT). Nel luglio 2002 il test γ IFN è
Usi operativi del test γ IFN
Test in serie (di conferma) di reattori
allo skin test (interpretazione “entrambi
positivi”) per > Sp
Su tutti i reattori al test primario in
allevamenti indenni. Tre differenti formati di
test sono disponibili, mirati a diversi livelli
di specifcità
Applicati anche in circostanze eccezionali in
allevamenti infetti o sospesi
In allevamenti presumibilmente TB free, per
ri-testare i reattori sospetti di aspecificità al
test primario
stato formalmente riconosciuto dall’Unione Europea
come test parallelo supplementare per aumentare la
rilevazione del numero di bovini infetti in allevamento.
Il test ora è uno strumento standard nel controllo
di bovini nei paesi europei con tubercolosi endemica.
Dal punto di vista del costo-beneficio della combinazione
dei due test in situazioni differenti non è stato
pubblicato alcuno studio completo. Un modello decisionale
ad albero dell’uso del γ IFN in allevamenti con
reattori multipli alla tubercolina in Gran Bretagna ha
comunque stimato che ci vorrebbero significativi benefici
nella riduzione della diffusione intra e inter-allevamenti
per rendere efficiente il test. Sarebbero necessari
costosi trial rnadomizzati per controllare queste
ipotesi sul campo, ad esempio se l’uso congiunto del
γ IFN e dello skin test potesse significativamente accorciare
il tempo di restrizione cui sono sottoposti gli
allevamenti infetti rispetto all’uso del solo skin test.
Nondimeno, l’impiego del γ IFN in Gran Bretagna si
è diffuso dal 2002 per l’uso ancillare ad hoc a complemento
del SICCT test in situazioni specifiche.
Sanità animale 14 ’OSSERVATORIO
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Nel caso di sospetto di reazioni non
specifiche a SICCT, usando un punto di
cut-off più alto e antigeni specifici di M.
bovis
Parte di un trial volontario in un numero
d’allevamenti indenni selezionati random
per stabilire la specificità
In allevamenti reattori non confermati
(NVL, colture negative) senza precedenti
infezioni confermate e in aree a bassa
prevalenza, dove si sospetta una reazione
non specifica alla tubercolina
Rapido ri-controllo di bovini con reazioni
anomale allo skin test, in cui si sospetta
interferenza fraudolenta
L

Diagnosi basata sugli anticorpi
La reazione dell’ospite alla tubercolosi è prevalentemente
rappresentata dall’immunità cellulo-mediata,
affiancata, con il progredire della malattia, dalla risposta
anticorpale.
Figura 1. Rappresentazione schematica dello spettro
di risposte del sistema immunitario bovino ai vari test
per TB (adattata da Vordermeier et al., 2004)
La figura 1 rappresenta schematicamente l’evoluzione.
Sulla destra del grafico vi sono gli animali con infezione
avanzata e generalizzata, ma che non rispondono
alla tubercolina a causa di una debole risposta
dell’immunità cellulo-mediata. E’ stato speculato che
questi animali “anergici” sono probabilmente malati
e altamente infettanti e che potrebbero essere la causa
di gravi e persistenti focolai. Un a certa proporzione
di bovini “anergici” può essere rilevata con metodi
sierologici (tipo ELISA). Questi test sono stati sviluppati
nelle ultime due decadi per rilevare la tubercolosi
bovina ed umana, ma generalmente soffrono di
una bassa Se, quando paragonati allo skin test e al γ
IFN, soprattutto quando applicati ad animali ai primi
stadi d’infezione. L’inclusione d’antigeni di M. bovis
più specifici (e.g. MPB70 e MPB83) ha aumentato la
Sp, ma non la Se. Studi recenti hanno mostrato che
la risposta anticorpale contro M. bovis è incrementata
dallo skin test (risposta anamnestica). Questo incremento
è direttamente proporzionale alla gravità della
malattia e alla sua generalizzazione.
In sintesi, i test sierologici che rilevano gli anticorpi
sono relativamente economici e semplici da fare, ma
non offrono, al momento un’alternativa ai test basati
sull’immunità cellulo-mediata.
Essi possono essere considerati come test ancillari per
lo skin e il γ IFN test in bovini negativi appartenenti
ad allevamenti con infezione cronica confermata o in
caso di focolaio.
Altri test diagnostici complementari
La coltura convenzionale rimane il gold standard per
la rilevazione di M. bovis in campioni clinici come i
tessuti, il muco nasale, il sangue. I metodi basati su
L
’OSSERVATORIO
PCR offrono potenziali vantaggi di sensibilità, flessibilità
e rapidità. Le metodiche PCR non hanno però
fino ad ora mostrato d’essere superiori alla coltura di
routine in termini di sensibilità e specificità. Le limitazioni
probabilmente sono legate al basso numero di
bacilli in campioni clinici, all’eliminazione intermittente,
all’estrazione inefficiente del DNA dei micobatteri
o alla presenza d’inibitori di PCR nei campioni.
PCR rimane d’uso limitato nell’identificazione d’infezione
con M. bovis nei campioni clinici, poiché
richiede elevate quantità di bacilli. In breve, anche
se le metodiche PCR beneficiano di una più precoce
identificazione delle specie di micobatteri rispetto
alla coltura, non è realistico considerale ancora una
valida scelta agli strumenti impiegati per la diagnosi
di routine di TB negli animali in vita.
Infine, sono state investigate le potenzialità di sensori
chimici nel diagnosticare l’infezione con M. bovis,
che si basano sulla rilevazione ed analisi di composti
organici volatili in campioni di siero da vitelli infetti,
un approccio conosciuto come “naso elettronico”
(“e-nose”). Nonostante risultati iniziali promettenti
(8 vitelli infettati sperimentalmente discriminati correttamente
da controlli non infetti tre settimane dopo
l’infezione), sono necessari altri studi allargati per
valicare scientificamente questa tecnologia.
Sviluppi futuri
L’uso d’antigeni o peptici sintetici specifici per M.
bovis, in alternativa alla PPD bovina, sono ancora in
corso di valutazione per lo sviluppo di un test intradermico
più specifico.
Le recenti acquisizioni sulle sequenze genomiche di
M. tuberculosis, M. bovis e M. bovis BCG hanno permesso
di eseguire analisi genomiche comparative per
screening immunologici di potenziali antigeni. Diversi
antigeni possono incrementare la sensibilità e
la specificità del γ IFN quando usati in combinazione
con ESAT-6 e CFP-10, anche se più antigeni vanno
valutati per giungere alla sensibilità della tubercolina.
L’uso d’antigeni ESAT-6 e CFP-10 nel test del γ
IFN sono in grado di discriminare gli animali vaccinati
da quelli infetti, ma vi è bisogno di estendere i la
sperimentazione ad un più grande numero di bovini.
In Gran Bretagna si sta acquisendo esperienza circa
l’evidenza di differenze esistenti tra ceppi di M. bovis
(spoligotipi) nella loro capacità di indurre una risposta
cellulo-mediata dell’ospite. Questo fenomeno è già
stato descritto per differenti genotipi di M. tuberculosis.
Il riconoscimento di differenti cloni di M. bovis
consentirà di paragonarli e di identificare differenze
nella virulenza, trasmissibilità e immunogenicità.
Se esiste tale variabilità, la sorveglianza costante dei
tipi molecolari può essere necessaria al fine di mirare
la diagnosi di TB e le misure di controllo concernenti
i ceppi di M. bovis prevalenti a livello locale.
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