Sanità animale - IZS della Lombardia e dell'Emilia Romagna

izsler.it

Sanità animale - IZS della Lombardia e dell'Emilia Romagna

Anno 11 - n. 4 - Agosto 2008

RIVISTA BIMESTRALE D’INFORMAZIONE SCIENTIFICA

a cura dell’Osservatorio Epidemiologico Veterinario della Regione Lombardia

Regione Lombardia

Direzione Generale Sanità - Servizio Veterinario

Istituto Zooprofilattico Sperimentale

della Lombardia e dell’Emilia Romagna

Osservatorio Epidemiologico Veterinario Regionale - Via Bianchi, 9 - 25124 Brescia


S ommario

Anno 11 - n. 3 - Giugno 2008

RIVISTA BIMESTRALE D’INFORMAZIONE SCIENTIFICA

a cura dell’Osservatorio Epidemiologico Veterinario della Regione Lombardia

MONOGRAFIA

Regione Lombardia

Direzione Generale Sanità - Servizio Veterinario

Istituto Zooprofilattico Sperimentale

della Lombardia e dell’Emilia Romagna

Osservatorio Epidemiologico Veterinario Regionale - Via Bianchi, 9 - 25124 Brescia

4 Rassegna sulla diagnosi ante-mortem

di tubercolosi nel bovino

Recensione a cura di G. Zanardi tratta dall’articolo

di R. De la Rua-Domenech et al. (2006).

Ante mortem diagnosis of tuberculosis in cattle:

a review of the tuberculin tests, y-interferon assay and other

ancillary diagnostic techniques.

Research in Veterinary Science, vol. 81, issue 2, 190-210

Direttore responsabile

Stefano Cinotti

Direttore scientifico

Giorgio Zanardi

Redattore

Giorgio Zanardi

Responsabile comitato redazione

Giorgio Zanardi

Comitato di redazione

M. Astuti, P. Cordioli,

M. Domenichini, P. Antoniolli,

L. Gemma, C. Genchi,

G. Gridavilla, A. Lavazza,

A. Palma, V.M. Tranquillo

Hanno collaborato a questo

numero

G. Zanardi

Segreteria di redazione

M. Guerini

L. Marella

Fotocomposizione

Editrice Vannini - Gussago (BS)

Editore

Istituto Zooprofilattico

Sperimentale della Lombardia

ed Emilia Romagna

“Bruno Ubertini”

Tutti coloro che vogliono scriverci, devono indirizzare le lettere al

seguente indirizzo:

“L’OSSERVATORIO” rubrica “La posta dei lettori”,

via Bianchi, 9 - 25124 Brescia - tel. 030 2290259-235;

oppure utilizzare la posta elettronica: oevr@oevr.org

L’Osservatorio e i numeri del precedente Bollettino Epidemiologico

possono essere consultati anche sul sito web http:\\www.oevr.org


Editoriale

Ho ritenuto interessante ed utile tradurre l’articolo che potete visionare su questo numero, poiché

il Centro di referenza Nazionale della Tubercolosi bovina da M. bovis, che ha sede a Brescia presso

l’IZSLER, è soventemente interpellato nell’esprimere pareri sulla sensibilità e specifi cità delle prove

in vita che possono essere utilizzare per diagnosticare la tubercolosi.

Dal 2007 le regioni Calabria, Campania, Puglia e Sicilia sono impegnate ad applicare il piano

straordinario d’eradicazione previsto dall’Ordinanza del Ministero della Salute del 14 novembre

2006; nel frattempo si sono manifestate tre gravi recrudescenze di tubercolosi bovina nella provincia

autonoma di Trento e nelle regioni autonome di Sardegna e Valle d’Aosta, tutte uffi cialmente indenni

da TB da diversi anni. Le attività mirate al rilievo e all’estinzione dei focolai sono ancora in corso e

la risoluzione del problema sanitario non appare a breve termine.

Pur nelle peculiarità delle singole autonomie, il fattore che accomuna gli episodi è il diradamento

dell’esecuzione delle prove intradermiche con la tubercolina (IDT) a due e anche quattro anni, associato

alla fallacia del sistema di sorveglianza al macello e all’insuffi ciente controllo degli animali

movimentati. La promiscuità al pascolo, tipico in tutte tre le realtà colpite, ha contribuito alla diffusione

della malattia. Il problema in queste situazioni apparentemente tranquille da anni è che la

tubercolosi bovina viene rilevata, quando ormai è presente e circola sul territorio da molto tempo;

per le caratteristiche subdole della malattia, defi nire la sua reale diffusione per cercare d’eradicarla

tempestivamente è un’operazione onerosa e che richiede tempo. Inoltre, la gestione dei focolai in

realtà montane e di pascolo con allevamenti di dimensioni medio-piccole è più complessa e richiede

un deciso intervento dell’autorità regionale, anche in termini di sostegno agli allevatori nelle fasi

d’abbattimento dei capi.

In ogni caso, il tempestivo ricorso all’esecuzione dell’IDT su tutti i bovini, eventualmente associata

all’uso del γ interferon nei focolai è imprescindibile sulla strada dell’eradicazione. L’ispezione al

macello (al di fuori dei territori colpiti), ancora una volta, ha evidenziato, seppure in ritardo, la

malattia sul territorio e rappresenta il punto di controllo cardine in un territorio uffi cialmente indenne.

Da ultimo, si sottolinea che la diagnosi tubercolosi bovina non è mirata al singolo capo ma all’allevamento

e come tale, deve essere integrata dalla sua storia anamnestica, che emerge dall’indagine

epidemiologica.

Giorgio Zanardi

’OSSERVATORIO

L

3 Sanità animale


Rassegna sulla diagnosi ante-mortem

di tubercolosi nel bovino

recensione a cura di G. Zanardi, tratta dall’articolo di R. de la Rua-Domenech et al. (2006).

Ante mortem diagnosis of tuberculosis in cattle: a review of the tuberculin tests,

γ-interferon assay and other ancillary diagnostic techniques.

Research in Veterinary Science, vol. 81, issue 2, 190-210

Introduzione

Il controllo della tubercolosi (TB) bovina da Mycobacterium

bovis è basato sull’accurata rilevazione e

rimozione degli animali infetti. Questi ultimi possono

essere infettanti per lungo tempo prima di manifestare

segni clinici o lesioni tipiche tubercolari. I

segni clinici non sono patognomonici ed è per questa

ragione che si ricorre a test immunodiagnostici per

rilevare gli animali infetti ad uno stadio precoce.

La risposta immunitaria cellulo-mediata all’infezione

intra-cellulare dei macrofagi e di altre cellule

monocitiche rappresenta un meccanismo di difesa

e la causa dell’infiammazione cronica (granuloma),

caratteristica dell’infezione da M. bovis. Alti livelli

di anticorpi circolanti contro M. bovis si riscontrano

solo negli stadi avanzati d’infezione o in caso di elevate

dosi infettanti.

Perciò, i test ante-mortem basati sull’immunità cellulare

individuano animali infetti con M. bovis più

precocemente e con maggior sensibilità rispetto ai

test basati sul rilievo degli anticorpi.

La diagnosi di tubercolosi è fatta con due test approvati

dall’Unione Europea: il test tubercolinico intradermico

in vivo e quello in vitro (γ-interferon o γ-

IFN su sangue). Il primo rileva la reazione d’ipersensibilità

di tipo ritardato all’iniezione intradermica di

tubercolina, mentre il secondo evidenzia il rilascio di

γ-IFN in colture di sangue totale stimolate dalla tubercolina

usando la tecnica ELISA (Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay).

Il test intradermico o skin test)o intradermotubercolinizzazione

(IDT) e sue varianti è quello usato

di routine nei paesi che implementano programmi

d’eradicazione della TB. L’IDT è, inoltre, prescritta

dall’OIE come test ante-mortem per il commercio internazionale

di bovini.

Generalmente, il test intradermico lavora bene nell’identificare

i bovini infetti, anche se non è perfetto;

d’altra parte, esso rimane il miglior strumento diagnostico

di screening da quando Koch scoprì la tubercolina.

I programmi basati sul principio del sistematico e

regolare controllo con il test intradermico, accompagnato

dalla macellazione dei reattori, dalla restrizione

alle movimentazioni degli allevamenti infetti e dalla

sorveglianza al macello per le infezioni non rilevate,

hanno eradicato la TB in molti paesi sviluppati, come

l’Australia e la maggior parte dei paesi europei, Svizzera,

Canada e quasi tutti gli stati degli USA. In altri

paesi il completo controllo della malattia con il tradizionale

approccio del “test e macellazione” è stato

vanificato dall’esistenza di reservoirs selvatici di M.

bovis, dallo stato di free-range di alcuni allevamenti,

da inadeguate infrastrutture veterinarie, fondi insufficienti

per il funzionamento del programma.

A causa delle dinamiche di trasmissione di M. bovis,

delle dimensioni microscopiche delle lesioni iniziali

e del tempo necessario per un animale nel manifestare

una risposta immune rilevabile, non ci si può

attendere che qualunque test singolo ante (o post)

mortem per TB, di per sé, rilevi ogni allevamento infetto

e ogni animale infetto in tali allevamenti.

Nel corso degli anni diversi fattori hanno compromesso

la capacità del test tubercolinico di identificare

gli animali infetti (sensibilità) o di aumentare la probabilità

di risultati falsi positivi (i.e. ridotta specificità).

Di conseguenza, sono stati sviluppati una serie

di test ancillari, come il γ interferon, a complemento

dello skin test con due principali obiettivi strategici:

• migliorare la probabilità totale di rilevare bovini

tubercolotici (sensibilità) in regioni o allevamenti

con elevata incidenza di TB, rimuovendo i bovini

positivi ad entrambi i test (test in parallelo);

• aumentare la specificità totale del test negli ultimi

stadi della campagna d’eradicazione, in aree a bassa

incidenza di TB, o in regioni con alta incidenza

di bovini con reazioni aspecifiche al test tubercolinico,

rimuovendo solo i bovini che risultano positivi

ad entrambi i test (test in serie).

Altri test ancillari in vitro, come il test ELISA per

anticorpi, il test di proliferazione linfocitaria, la polarizzazione

fluorescente e il “naso elettronico”, sono

stati sviluppati per i bovini, ma la loro applicazione

rimane confinata a livello sperimentale o in situazioni

molto specifiche.

Lo skin test rimane la pietra miliare nella diagnosi di

routine di TB nei bovini, in altri animali domestici e

nell’uomo.

Sanità animale 4 ’OSSERVATORIO

L


Il test intradermico tubercolinico (skin test)

Sviluppo e principi immunologici dello skin test

Il test intradermico è uno standard internazionale per la

diagnosi ante mortem della tubercolosi bovina a livello

di allevamento e di animale. Esso è basato sull’evocazione

di una risposta immunitaria d’ipersensibilità

ritardata ad un’inoculazione intradermica di tubercolina,

un estratto grezzo proteico dal sur-natante di colture

di micobatteri. Dai tempi dell’estratto al glicerolo

di colture liquide pure di bacilli tubercolari di Robert

Koch nel 1890, si è giunti all’uso mondiale della tubercolina

derivata da proteina purificata (PPD).

Quando la tubercolina bovina è inoculato nel derma

di un animale non sensibilizzato agli antigeni tubercolari,

non vi è alcuna significativa risposta infiammatoria

a livello locale. Al contrario, se l’animale

è sensibilizzato Da una pregressa infezione con M.

bovis o dall’esposizione ad antigeni cross-reagenti,

si sviluppa una risposta infiammatoria ed un edema

nel sito d’inoculazione, che raggiunge la più grande

intensità dopo 48-72 ore dopo l’iniezione e in seguito

regredisce rapidamente. Questa ipersensibilità ritardata

è mediata dalle cellule T sensibilizzate, che si

attivano alcune settimane dopo l’infezione.

Vi sono due tipi di test intradermico, singolo (SIT =

single intradermal test) e comparativo (SICCT = single

intradermal comparative cervical tuberculin), con

iniezione simultanea di tubercoline aviare e bovina.

Quest’ultimo test consente una miglior discriminazione

del SIT tra animali infetti con M. bovis e quelli

sensibilizzati perché esposti a M. avium complex o a

micobatteri ambientali non patogeni.

La scelta del tipo di test intradermico dipende dalla

prevalenza di TB e dalla prevalenza d’esposizione ad

altri micobatteri ambientali.

Il SIT caudale è il test di routine per lo screening di TB

negli USA, nel Canada, in Nuova Zelanda ed è stato

usato con successo per eradicare la malattia in Australia,

mentre in Europa è utilizzato quello cervicale. In

tutti i paesi il SICCT è usato come test seriale ancillare

per i reattori o per i reattori in conclusivi al SIT, anche

se gradualmente il γ interferon lo sta sostituendo.

Al contrario, nel Regno Unito e in Irlanda viene adottato

il SICCT come test di screening, utilizzando la

tubercolina bovina di Weybridge.

Accuratezza diagnostica della prova intradermica

L’accuratezza diagnostica di un test è definita in termini

di sensibilità e specificità, rispettivamente calcolate

come proporzione di animali infetti e non infetti,

correttamente diagnosticati.

Questi due parametri possono essere influenzati dallo

stadio e dalla gravità della malattia, dalla prevalenza

degli organismi che cross-reagiscono e da altri fattori

legati all’ospite.

L

’OSSERVATORIO

La percentuale di risultati positivi o negativi al test

che è corretta (valori predittivi) è fortemente influenzata

dalla prevalenza d’infezione da M. bovis.

Sensibilità

La sensibilità (Se) è la proporzione di animali ammalati

(infetti) rilevati come positivi dal test diagnostico.

Il contrario della sensibilità è la proporzione di

falsi negativi (1 – Se).

Nella tabella 1 sono elencati i motivi per i quali possono

verificarsi reazioni false negative alla prova intradermica.

I bovini infettatisi recentemente di solito

non reagiscono all’inoculazione intradermica della

tubercolina. L’ipersensibilità nel bovino si sviluppa

tra 1 e 9 settimane dopo l’infezione con M. bovis, ma

per la maggior parte degli animali la risposta piena si

sviluppa più probabilmente tra le 3 e le 6 settimane

post-infezione.

La durata della fase pre-allergica è stata determinata recentemente

con un’infezione sperimentale di 10 4 UFC

di M. bovis per via endonasale in 20 vitelli, che hanno

dimostrato reattività al SICCT tre settimane dopo il

challenge, confermata dopo 4, 6, 7, 8, 9 settimane.

In altri esperimenti condotti nel Regno Unito non è

stata trovata alcuna correlazione tra dose infettante

di M. bovis e il periodo impiegato a sviluppare una

reazione all’inoculazione intradermica di tubercolina.

Comunque, c’è un’associazione positiva tra le

dimensioni della risposta alla prova intradermica e la

probabilità e l’estensione della patologia tubercolare

al macello.

Uno stato di energia si può sviluppare con tubercolosi

avanzata o generalizzata e temporaneamente in

soggetti stressati. Bovine tubercolotiche che hanno

figliato nelle 4-6 settimane precedenti talvolta non

reagiscono al test tubercolinico.

Somministrazione topica o sistemica di glicocorticoidi

può portare a una significativa riduzione delle

dimensioni della reazione in animali infetti. Co-infezioni

con virus immuno-depressivi come il BVD

possono avere un effetto d’eclisse transitoria sul test.

Altre cause di false negatività possono essere imputate

a malnutrizione, che deprime il sistema innunitario,

e ala desensibilizzazione con una seconda iniezione

ravvicinata (al di sotto di 42 giorni) di tubercolina.

Come per tutti i test, gli errori degli operatori (e.g.

inoculazione non intradermica, lettura troppo precoce

o ritardata della reazione) o il malfunzionamento

dell’attrezzatura (e.g. dose inoculata insufficiente)

possono condurre a false negatività. Infine, una precedente

esposizione al M. avium intracellulare complex

può mascherare temporaneamente la reazione

intradermica e il γ IFN test. Possibili soluzioni alle

implicazioni sul campo nella sorveglianza della TB

in regioni dove l’infezione da M. avium è comune

5 Sanità animale


sono quella di ignorare reazioni alla tubercolina aviare

o usare il SIT con una diminuzione, però, della

specificità del test. L’uso nel γ IFN d’antigeni espressi

solo da membri del MTB complex aumenterebbe

la probabilità di identificare gli infetti con M. bovis,

precedentemente esposti a M. avium.

Per ottenere un’accurata stima della sensibilità tutti gli

animali testati, sia positivi che negativi al test, dovrebbero

essere macellati e sottoposti ad ulteriori test.

Stime di sensibilità per il SIT caudale e cervicale e il

SICCT riportate in diversi paesi sono riassunte nelle

tabelle 1 e 2.

Queste stime variano da 63,2% a 100% per il SIT

caudale e cervicale con un valore mediano di sensibilità

di 83,9%. Il SIT cervicale appare più sensibile e

meno specifico di quello caudale (tabella 1).

Gli studi eseguiti per valutare la sensibilità del SICCT

hanno impiegato numeri contenuti di animali selezionati

da popolazioni con alta prevalenza di reattori. I

risultati (tab. 3) suggeriscono che la Se di SICCT si

ponga tra 52,0% e 100% con valori mediani di 80,0%

(interpretazione standard) e 93,5% (interpretazione

restrittiva).

Specifi cità

La specificità (Sp) è la proporzione di animali sani

(non ammalati, non infetti), che sono correttamente

identificati come negativi dal test diagnostico. Come

per tutti i test, anche per la prova intradermica non

esiste una Se e Sp del 100% e tra loro vi è un rapporto

inversamente proporzionale. La SIT ha una Sp

che varia dal 75,5% al 99,0% (mediana del 96,8%)

(tabella 2).

Tabella 1. Riassunto dei risultati di trial di campo condotti per stimare la sensibilità me specificità del SIT nei bovini,

in ordine cronologico di pubblicazione.

Tipo di

test

tubercolinico

Quantità di

PPD bovina

Proporzione

apparente di

malati

N° animali

testati (o sottoposti

a necroscopia)

Sensibilità

%

Specificità

%

Referenze (paese)

SIT

caudale

0,2-0,4 mg 3.955 (2.967) 3,4 72,0 98,8

0,3 mg 6.264 (6.264) 1,39 63,2 99,0

0,2-0,3 mg 1.362 (1.362) 1,6 68,2 96,8

Francis et al. (1978)

(Australia)

Wood et al. (1991)

(Australia)

Wood et al. (1992)

(Australia)

0,1 mg 656 (656) 31,1

80,4-

84,4

Non

valutato

Whipple et al. (1995)

(USA)

0,1 mg

494 (494) da

7 allevamenti

1,1-5,5 (all. a

bassa P)

23,1-32,6 (all.

a moderata P)

83,3

96,8

Non

valutato

Norby et al. (2004)

(USA)

SIT

cervicale

0,1 mg 10.305 0,56 100 88,6

Lesslie et al. (1975)

(GB)

Legenda:

* per stimare la sensibilità

** per stimare la specificità

anche PPD

umana

Dettaglio

non

disponibile

Dettaglio

non

disponibile

0,1 mg

Dettaglio

non

disponibile

2.949 (2.949) 51,8 91,2 75,5

1.036 (140) 10,7 91,0

232 (218) 57,8 80,2

22 (22)*

10 (10)**

800 (35) da

20 all. U.I.

Non

valutato

Non

valutato

100

0,0 86,4 90,0

0,0

Non

valutato

Media da 5 fonti da

vari paesi (citati in

Francis et al., 1978)

Domingo et al.

(1995) Spagna

Gonzales Llamazareset

al. (1999)

(Spagna)

Pollock et al. (1999)

(2003) (Nord Irlanda)

Sanità animale 6 ’OSSERVATORIO

96,8

Cagiola et al. (2004)

(Italia)

L


Tabella 2. Riassunto dei risultati di trial di campo condotti per stimare la sensibilità e specificità del SICCT nei bovini,

in ordine cronologico di pubblicazione.

PPD

bovina

PPD

aviare

N° animali

testati (o

sottoposti a

necroscopia)

Proporzione

apparente di

malati

Interpretazione

del test

Sensibilità

%

Specificità

%

Referenze

(paese)

L

0,2 mg 0,05 mg

’OSSERVATORIO

1.110 (0) in

25 all. UI

0,0

0,1 mg 0,05 mg 1.035 (88) 0,56

0,1 mg 0,05 mg

Vari,

inclusa

PPD

umana

vari

671 (316)*

500 (107)**

1.425

(1.425)

0,1 mg 0,05 mg 270 (68) 25,2

0,1 mg 0,05 mg

2.799 (192)*

1.396 (0)**

Usati in serie

per ri-testare i

sospetti entro 7

giorni dal SIT

Standard

Severa

Dettagli non

disponibili

Standard

Severa

74,4

88,5

non

valutata

91,4

100

100

99,9

15,0 Standard 95,5 97,8

36,9 Severa 68,6 88,8

6,4

0,1 mg 0,05 mg 18 (18) 83,3

Standard

Severa

Standard

Severa

Standard

Severa

75,0

94,1

55,1 100

93,3

100

0,1 mg 0,05 mg 258 (258) 14,0 Standard 90,9

non

valutata

non

valutata

2.000 UI 2.500 UI 30 zebu (30) 73,3 Standard 90,9 100

5.000 UI 2.500 UI

2.000 UI 2.500 UI

0,1 mg 0,1 mg

Legenda:

* per stimare la sensibilità

** per stimare la specificità

84 (84)

bovini

negativi al

clturale,

reattori al

SIT caudale

100 (100)

zebu

(gruppo a

moderata P)

22 (22)

(gruppo ad

alta P)

494 (494) in

7 all.

0,0 Standard

21,0

43,5

1,1-1,5 (all.

a bassa P)

23,1-32,6

(all. a

moderata P)

Giudizio

soggettivo

(palpazione del

punto di inoculo

e osservazione

segni clinici)

Usato come

test in serie

per ri-testare

i sospetti al

SIT caudale

entro 7 giorni

(interpretazione

Non

valutata

52,0

80,0

75,0

93,5

94,0

99,0

100

Non

valutata

Non

valutata

Roswurm and

Konya (1973)

citato da

Norby et al.

(2004)

Lesslie et al.

(1975)

Lesslie et al.

(1975)

O’Reilly and

MacClancy

(1975)

Citato da

Francis et al.

(1978)

O’Reilly (1986)

Neill et al.

(1994) (Nord

Irlanda)

Doherty et al.

(1995) (Irlanda)

Costello et al.

(1997) (Irlanda)

Ameni et al.

(2000) (Etiopia)

Buddle et al.

(2001) (Nuova

Zelanda)

Quirin et

al. (2001)

(Madagascar)

Norby et al.

(2004) (USA)

7 Sanità animale


Studi eseguiti su popolazioni bovine libere da TB la

Sp del SICCT variava dal 78,8% al 100% (mediana

del 99,5%) (tabella 3). La Sp del SICCT raggiungeva

il 99,9% in zone dove la prevalenza di TB tendeva

allo zero (sulla base dell’esame post-mortem).

L’imperfetta Sp conduce a falsi positivi, conosciuti

anche come “reattori non specifici” (RNS). Le cause

sono complesse e molti batteri sono implicati, che

condividono antigeni proteici con la tubercolina PPD

(tabella 4).

Nel test intradermico comparativo gli animali infetti

con micobatteri diversi da quelli appartenenti al MTB

complex in genere sviluppano reazioni alla tubercolina

aviare molto più evidenti di quelle causate dalla

tubercolina bovina. Su questo fenomeno si basa la soluzione

di molti problemi di aspecifcità legate al SIT.

Ad ogni modo, è possibile che la tubercolina aviare

sia uguale o ecceda quella bovina in una piccola proporzione

di bovini naturalmente infetti con M. bovis,

i quali presentano lesioni al macello. La soluzione a

lungo termine per discriminare la sensibilizzazione

non specifica sarebbe l’utilizzo nel test d’antigeni purificati

specifici per M. bovis.

Signifi cato epidemiologico dei reattori con lesioni

non visibili (NVL = non-visible lesions reactors).

Nel Regno Unito e in Irlanda circa il 50-80% dei bovini

reattori allo skin test non mostra segni di malattia

al macello (NVL e mancato isolamento di M. bovis

in coltura). Sembrerebbe, perciò, che la Sp del test

sia molto più bassa delle valutazioni fatte sul campo.

Questo, naturalmente, indebolisce la fiducia dei

veterinari di campo e degli allevatori nella prova intradermica

e in altri metodi diagnostici ante-mortem

(γ IFN). Questa percezione, tuttavia, origina da due

fraintendimenti. Il primo è l’assunzione erronea che

l’esame post-mortem e la coltura batteriologica sono

“gold standards” contro i quali si dovrebbe stabilire

l’accuratezza dei test immunodiagnostici per TB.

Diversi autori hanno già sottolineato che l’esame

post-mortem (particolarmente quello condotto in

grandi macelli) e i test batteriologici standard per

Tabella 3. Potenziali cause di risultati falsi negativi ai test tubercolinici nel bovino (adattato da Snider, 1982)

Fattori legati all’animale

• De-sensibilizzazione alla tubercolina bovina (test eseguito a distanza troppo ravvicinata dalla precedente

prova intradermica)

• Periodo non reattivo (pre-allergico) (esecuzione del test troppo precoce dal momento dell’infezione)*

• Infezione con M. bovis iperacuta o generalizzata (anergia)*

• Co-infezione con (o pre-esposizione a micobatteri ambientali (e.g. M. avium-intracellulare complex) che

causano ipersensibilità alla tubercolina aviare nei test SICCT e IFN*

• Vaccinazione contro Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (malattia di Johne)* e **

• Infezione concorrente con virus che deprimono il sistema immunitario (e.g. BVD)* e **

• Farmaci (e.g. corticosteroidi e agenti immunosoppressivi)*

• Immunosopressione nel primo periodo post-partum*

• Stress nutrizionali o da trasporto*

• Ceppo di M. bovis*

Fattori legati alla tubercolina usata

• Prodotto scaduto*

• Conservazione inappropriata del prodotto (esposto alla luce e calore per lunghi periodi di tempo)*

• Errori di produzione (uso di ceppi inadeguati, non corretta calibrazione della potenza, etc.)*

Fattori legati al metodo di somministrazione, lettura e registrazione del test (errori degli operatori dovuti

ad inesperienza, mancanza di attenzione, scarsa manutenzione dell’attrezzatura, etc.)

• Inoculazione di una dose insufficiente di tubercolina

• Iniezione sottocutanea di tubercolina

• Sito di inoculazione non corretto

• Inoculazione di tubercolina bovina nel sito della tubercolina aviare e viceversa (SICCT test)

• Lettura dei risultati troppo precoce o troppo tardiva (non entro le 72 h ± 4-6 h dopo l’inoculazione della

tubercolina)

• Errori nella registrazione delle letture

• Errori nell’identificazione degli animali che reagiscono

• Distorsioni consce o inconsce dell’operatore

Legenda:

* applicabile anche al IFN e ad altri test in vitro che rilevano risposte cellulo-mediate alla tubercolina bovina

** potenziale causa anche di risultati falsi positivi

Sanità animale 8 ’OSSERVATORIO

L


M. bovis (che rilevano la malattia tubercolare) sono

meno sensibili dei test immunologici (che rilevano

spesso un’infezione sub-clinica, i.e. la risposta immunitaria

cellulo-mediata contro il batterio).

Il secondo equivoco è l’insufficiente apprezzamento

della differenza tra il tasso di falsi positivi (“dato che

un animale non è infetto, qual è la probabilità che il

test sarà positivo”) e il valore predittivo di un risultato

positivo al test (“dato che l’animale che ho controllato

è positivo, qual è la probabilità che l’animale

sia veramente infetto”). Il primo è l’inverso della

specificità del test, mentre l’ultimo è una funzione

della Se, Sp e della prevalenza vera dell’infezione

nella popolazione (che raramente è conosciuta). Qualunque

test di screening per TB con meno del 100%

di Sp classificherà, per definizione, degli animali

come falsi positivi, che, naturalmente, non avranno

lesioni visibili (NVL) e risulteranno negativi all’esame

colturale.

Nondimeno, è importante non confondere tutti i reattori

NVL con i veri reattori non specifici (falsi positivi)

(NSR = non-specific reactors). Mentre i NSR

saranno NVL per definizione, non tutti gli NVL, reattori

negativi all’esame colturale sarebbero necessariamente

considerati come NSR.

I reattori NVL originano per molteplici ragioni e il

loro significato dipende dalla specificità intrinseca

del test, dallo stadio della campagna d’eradicazione

della TB, dall’accuratezza dell’esame dei reattori al

macello, dal tempo d’inizio dell’infezione, dalla dose

infettante, dalla prevalenza di TB e dal numero di

reattori trovati nell’allevamento controllato.

Gli animali NVL possono, perciò, essere indicativi di:

• animali ad uno stadio precoce d’infezione con M.

bovis, quando i granulomi sono troppo piccoli o infrequenti

per essere notati durante l’esame ispettivo

post-mortem;

• animali infetti con M. bovis, ma senza malattia,

i.e. temporaneamente capaci di contenere i bacilli

in una condizione di latenza (sebbene la natura e

l’estensione della TB latente nei bovini richieda ulteriori

ricerche);

• animali non-infetti esposti ad antigeni di micobatteri

ambientali che cross-reagiscono con la tubercolina

bovina o altri antigeni di M. bovis usati nei test

diagnostici ante-mortem (i.e. veri “falsi positivi o

NSR”).

In regioni dove la TB bovina è endemica o in allevamenti

in cui la presenza della malattia è già stata

confermata da esami post-mortem o di laboratorio, i

reattori alla tubercolina sono molto predittivi d’infezione

da M. bovis e, a quel punto, è insignificante se

sono o no NVL.

Al contrario, analogamente alla diminuzione della

prevalenza di TB, anche il valore predittivo di una

L

’OSSERVATORIO

prova intradermica positiva ( o γ IFN) declina e grandi

proporzioni di risultati positivi al test deriveranno

da sensibilizzazioni non specifiche dei bovini ad antigeni

di M. bovis (NSR).

In tali casi, può essere raccomandata l’applicazione

di test ancillari da usare in serie, al fine di chiarire lo

stato dei reattori alla tubercolina.

In sintesi, il “problema” dei reattori NVL non è legato

ad una scarsa specificità della prova tubercolinica,

ma ad un inadeguato gold standard e ad un basso valore

predittivo del risultato positivo al test, quando

si controlla una popolazione libera da TB o con una

bassa prevalenza d’infezione.

“Un buon test d’allevamento, ma non per l’animale

Una delle teorie avanzate per spiegare la mancanza

di progressi nell’eradicazione della TB dal Regno

Unito e dall’Irlanda e in altri paesi è l’imperfetta Se

del test SICCT. Con altre prove intradermiche, esso è

descritto come un buon test d’allevamento, ma scarso

nell’individuare singoli animali infetti. Il fatto è

che ogni test diagnostico, non solo quello intradermico)

che viene applicato al singolo animale, avrà

una chance maggiore di individuare gruppi infetti di

animali rispetto ad animali infetti controllati singolarmente.

Ciononostante, è stato ipotizzato che l’uso

routinario di un test di screening con una Se imperfetta

può portare ad un gruppo sostanziale d’infezioni

non rilevate negli allevamenti britannici.

A questo punto, è importante non trascurare alcune

importanti caratteristiche dei programmi di controllo

della TB nei paesi sviluppati.

La sensibilità a livello d’allevamento (Herd-level

sensitivity o HSe) o la probabilità che un allevamento

infetto sia identificato come tale dal test di screening

è una funzione della prevalenza all’interno dell’allevamento

(within-herd prevalence), il numero di animali

controllati in allevamento, la Se del test a livello

di singolo animale e il numero minimo di singoli animali

positivi al test richiesto per classificare un allevamento

come infetto (uno, nel caso della TB).

HSe aumenterà rapidamente al massimo livello

(100%) nel momento in cui il numero di animali testati

nell’allevamento aumenta. Questa correlazione

è vera, anche se la prevalenza di malattia all’interno

dell’allevamento è bassa o moderata e la Se individuale

del test è lontana dall’essere perfetta. In Gran

Bretagna, per esempio, l’80% e il 75% di tutti i nuovi

focolai confermati scoperti nel 2002 e nel 2003

contenevano un totale di due o più reattori. Inoltre, il

test annuale in aree endemiche per TB era eseguito su

tutti gli animali oltre le sei settimane di vita. Perciò,

l’HSe della prova intradermica è molto più elevata rispetto

alla Se calcolata a livello del singolo animale.

In accordo con i protocolli UE sui test, la prova in-

9 Sanità animale


Tabella 4. Riassunto dei risultati di studi pubblicati sulla sensibilità e specificità del IFN (Bovigam ® ) nel bovino, in

ordine cronologico di pubblicazione

Tubercolina

bovina (mg/

ml)

Tubercolina

aviare (mg/

ml)

Criterio

d’interpretazione

del test

N° testati

(o sottoposti a

necroscopia)

Proporzione

apparenste

di

malati (%)

Sensibilità

(%)

Specificità

(%)

0,3 0,3 C4 6.264 (6.264) 1,4 81,6 99,4

0,3 0,3

C1

C2

C3

C4

C5

5.733 (0) bovini da all.

UI da 5 anni

0,0

Non

valutata

0,2 0,2 C4 1.362 (1.362) 1,6 81,8 99,1

0,5 1,0 C6

1.396 (389) bovini

presunti non infetti

0,0

Non

valutata

0,5 1,0 Non stabilito 2.799 (192) 6,4 84,3

Non fornito Non fornito C4

0,02 0,02

Non fornito

Non fornito

C4

C11

C1

C7

656 (656) da un all.

infetto

1.036 (140) 10,7

203 (203) bovini da

un n° non specificato

di all. infetti (stima

della Se)

923 (0) bovini da

13 all. UI da 5 anni

(stima Sp)

31,1 73,0

100

0,0

93,7

87,4

87,7

Non

valutata

96,2

97,4

98,0

98,1

97,8

99,6

Non

valutata

Non

valutata

Non

valutata

Non

valutata

Non fornito Non fornito C4 220 (8) - 100 94,0

0,3 0,3 C4 232 (218) 57,8 84,9

Non fornito Non fornito C12

1.557 (0) bovini da

all. UI con notevoli

reazioni alla PPD

aviare

0,0

Non

valutata

96,6

Non

valutata

0,2 0,2 Non stabilito 30 zebu (30) 73,3 95,5 87,7

Non fornito

Non fornito

C6, C13

C13

163 (163) bovini positivi

a SIT e colturale

da 21 all. (stima Se)

213 (57) bovini da 82

all. senza infezione

evidente, ma con

anamnesi remota di

test + e necrospia +

(stima Sp)

100

0

85,0

Non

valutata

88,9

Non

valutata

93,0

Referenze

(paese di

studio)

Wood et al.

(1991) (Australia)

Wood et al.

(1991) (Australia)

Wood et al.

(1992) (Australia

e NZ)

Neill et al. (1994)

(Nord Irlanda)

Neill et al. (1994)

(Nord Irlanda)

Whipple et al.

(1995) (USA)

Domingo et al.

(1995) (Spagna)

Monaghan et al.

(1997)

(Repubblica

d’Irlanda)

Lilenbaum et al.

(1999) (Brasile)

Gonzalez

Llamazares et al.

(1999) (Spagna)

Lauzi et al.

(2000) (Italia)

Ameni et al.

(2000) (Etiopia)

Ryan et al.

(2000) (Nuova

Zelanda)

Legenda: il criterio d’interpretazione per un test positivo non era lo stesso per tutti gli studi. Criteri d’interpretazione usati per il test del γ IFN nei differenti studi:

C1: BOD-COD > 0 e BOD-AOD > 0

C2: BOD/COD > 1,25 e BOD-AOD > 0

C3: BOD/COD > 1,5 e BOD-AOD > 0

C4: BOD/COD ≥ 0,0,5 e BOD-AOD > 0

C5: se BOD = 0,1, allora BOD/COD > 1,5 e BOD-AOD > 0. Se BOD > 0,1, allora BOD/COD > 1,5 e BOD-AOD > 0,5 e BOD-AOD > 0

C6: BOD-AOD ≥ 0,1

C7: BOD/COD ≥ 0,1 e BOD-AOD ≥ 1,8

C8: BOD/COD ≥ 0,1 e BOD-AOD ≥ 1,25

C9: BOD-AOD ≥ 1,8

C10: BOD/COD ≥ 0,05 e BOD-AOD ≥ 1,8 (= C4 se BOD-AOD ≥ 1,0)

C11: BOD/COD ≥ 0,1 e BOD-AOD > 0

C12: BOD/COD ≥ 2 (COD) e BOD-AOD ≥ 0,05

C13: BOD/COD ≥ 0,1 e BOD-AOD ≥ 0,1

C14: BOD-AOD ≥ 0,4

BOD = valore medio di Densità Ottica del plasma stimolato dalla PPD bovina

AOD: valore medio di Densità Ottica del plasma stimolato dalla PPD aviare

COD: valore medio di Densità Ottica del plasma incubato con buffer di soluzione salina fosfato (nessun antigene di controllo)

Sanità animale 10 ’OSSERVATORIO

L


tradermica è automaticamente ripetuta ad intervalli

di 60 giorni in allevamenti con reattori alla TB, fini a

quando uno o due test risultino negativi (in relazione

alla conferma o meno di malattia nei precedenti

reattori). I test di controllo sono eseguiti 6 mesi dopo

la rimozione delle misure restrittive e 12 mesi dopo,

prima che l’allevamento in questione ripristini il suo

normale intervallo di controllo.

L’interpretazione severa è applicata automaticamente

per la conferma di TB in un allevamento.

Nuovamente, questo aumenta la Se a livello individuale

del test SICCT.

La sorveglianza della TB a livello d’allevamento con

la prova intradermica è affiancata dall’ispezione dei

bovini al macello e dal rintraccio di qualunque carcassa

con granulomi sospetti. In Gran Bretagna il numero

di casi di TB riportati annualmente dai veterinari

ispettori e confermati in seguito dagli esami colturali

varia da 100 a 300. Questa è una proporzione molto

piccola su oltre 2,5 milioni di bovini macellati ogni

anno e ha inciso per il 14% di tutti gli allevamenti

nuovi infetti nel 2004.

Il parziale o totale de-popolamento dei bovini è applicato

quando necessario, al fine di risolvere focolai

cronici o esplosivi.

Indubbiamente, ogni animale infetto non rimosso al

test tubercolinico può essere, o diventare, infetto e

potenzialmente agire come fonte di M. bovis per gli

altri animali in allevamento, vanificando la risoluzione

del focolaio.

L’imperfezione della Se del test aumenta il rischio che

bovini infetti non rilevati rimangano nell’allevamento

dopo la rimozione delle restrizioni. Questi scenari

sono stati investigati e modellati in Gran Bretagna. Le

regole della probabilità indicano che in allevamenti

con reattori multipli (infetti), l’uso di un test più sensibile

o una combinazione di due test differenti che

identificano lievemente sub-popolazioni differenti di

animali infetti (test parallelo) aumenterebbe la velocità

di risoluzione del focolaio. Analogamente, in assenza

di una fonte esterna di re-infezione la probabilità di

recidiva del focolaio sarebbe ridotta dall’uso di due

o più test in parallelo (i.e. interpretazione “qualunque

positivo”). La questione cruciale per chi governa la

politica sanitaria è di determinare le specifiche circostanze

nelle quali l’applicazione di un test ancillare in

parallelo a fianco della prova intradermica è consigliata

e rappresenta un uso efficiente delle risorse.

Il test del γ interferon (γ IFN)

Il γ IFN fu sviluppato negli anni 80 in Australia come

test diagnostico da usarsi in combinazione con il SIT

caudale. L’Australia diventò ufficialmente indenne

da TB nel1997 attraverso la sistematica applicazione

del test intradermico, lo stringente controllo dei movimenti

e la rimozione dei reservoirs d’infezione nei

bufali d’acqua e nei bovini selvatici.

Con il tempo, il test è stato ottimizzato e valicato per

l’uso sul campo, ma i foci d’infezione rimasti in Australia

erano pochi e troppo distanti dai laboratori per

poterlo utilizzare nell’eradicazione. Nondimeno esso

fu autorizzato come metodo diagnostico ufficiale nel

1991 ed adottato come test ufficiale in Nuova Zelanda

alla fine degli anni 90.

Il γ IFN è una citochina che viene prevalentemente rilasciata

dai linfociti T dopo stimolazione antigenica e

gioca un ruolo importante nella risposta immunitaria

verso i micobatteri tubercolari come maggior fattore

d’attivazione macrofagica. Analogamente alla prova

intradermica esso rileva la risposta immunitaria cel-

Box 1 - Vantaggi del test γ IFN sulla prova intradermica

• La sua sensibilità è considerata simile a quella del SIT e maggiore rispetto al SICCT;

• il tempo necessario per sviluppare la risposta al test γ IFN dopo l’infezione (tra 1 e 5

settimane) è lievemente più breve rispetto al test intradermico (3-6 settimane);

• consente una più rapida ripetizione del test (non vi è interferenza con il sistema immunitario

dell’ospite). Comunque, test intradermici recenti possono influenzare le

risposte al test γ IFN;

• non vi è necessità di una seconda visita in allevamento per la lettura del test;

• vi è un’interpretazione dei risultati più obiettiva, standardizzata, poiché tutte le misure

sono basate sul laboratorio;

• riduce molti dei problemi pratici legati al test intradermico (scarse attrezzature, errori

degli operatori, possibilità di frode), che possono contribuire a sottostimare gli animali

infetti o dubbi;

• è soggetto all’inclusione di antigeni definiti e ciò aumenta la differenziazione delle

risposte al γ IFN dovute ad infezione con micobatteri patogeni da quelle derivate dall’esposizione

a micobatteri ambientali o da ceppo vaccinale.

’OSSERVATORIO

L

11 Sanità animale


Box 2 - Svantaggi del test γ IFN nei confronti della prova intradermica

• Specificità apparentemente più bassa. Ciò può essere parzialmente compensato utilizzando

al posto della tubercolina bovina determinati antigeni del micobatterio come la

proteina ESAT 6 (early secretory antigenic target) e la proteina filtrata da coltura 10

(CFP). Entrambe le proteine sono codificate da geni presenti nei genomi di M. bovis e

M. tuberculosis e assenti da M. bovis BCG e quasi tutti i micobatteri ambientali;

• una piccola proporzione di bovini infetti che reagiscono al test intradermico non sono

individuati dal test γ IFN;

• è più probabile che vitelli non infetti diano reazioni non specifiche al test. Questo è dovuto

probabilmente alla produzione innata di γ IFN da parte delle cellule natural killer

nel sangue periferico, quando stimolate in vitro con certi antigeni del MTB complex;

• alcune difficoltà logistiche associate alla necessità di trasportare i campioni di sangue

in un ambiente stabile (circa 10-26°C) e di incubarli con l’antigene entro poche ore

dalla raccolta. Ritardi nel processo dei campioni può ridurre significativamente la sensibilità

del test;

• alto costo della componente del laboratorio, sebbene si eviti il ritorno in allevamento

e via sia l’automazione e l’economia di scala;

• necessità di un’accurata identificazione degli animali al campionamento, poiché i positivi

non sono marcati nella reazione al test.

lulo-mediata dell’ospite nei confronti dell’infezione

con M. bovis.

Dopo 1-4 settimane dall’infezione, le cellule T nel

sangue periferico del bovino rilasciano quantità misurabili

di γ IFN, quando stimolate dalla tubercolina

bovina o antigeni simili. Nel caso in cui l’infezione

sia causata da M. avium o micobatteri ambientali, la

produzione di γ IFN sarà più copiosa da parte delle

cellule T incubate con la tubercolina aviare. L’infezione

con M. bovis è determinata, quando la tubercolina

bovina stimola una produzione di γ IFN maggiore

della tubercolina aviare o dell’antigene di controllo

negativo. La quantità di γ IFN prodotto è misurato

con lo sviluppo di colore all’ELISA test ed è espresso

in unità di densità ottica (DO).

Accuratezza diagnostica, vantaggi e svantaggi del γ

IFN

La performance diagnostica del γ IFN convenzionale

è stata valutata in diversi studi svolti in Australia,

Brasile, Etiopia, Gran Bretagna, Repubblica d’Irlanda,

Italia, Nuova Zelanda, Irlanda del Nord, Spagna

e USA. In questi trias la Se del γ IFN variava tra il

73% e il 100%, con un valore mediano di 87,6%. Il

valore mediano della Sp era del 96,6%, con un range

di 85,0-99,6% (tabella 5). Come atteso, i risultati

furono influenzati anche dalle caratteristiche della

popolazione bovina sottoposta al test, dai differenti

valori di cut-off adottati per classificare gli animali

come positivi, dal lotto e dalla fonte di tubercolina

PPD usata come antigene e dal gold standard usato

per determinare il vero stato d’infezione degli animali

in studio.

Generalmente, si considera che il γ IFN abbia una

sensibilità sovrapponibile alla prova intradermica

(tabella 4). Alcuni autori sostengono che il test del

γ IFN sveli un numero sostanziale di bovini infetti

che sfuggono al test tubercolinico, poiché riesce ad

identificare gli animali ad uno stadio precoce d’infezione.

Perciò, i due test rilevano due sottopopolazioni

di animali tubercolotici leggermente differenti.

I bovini positivi al γ IFN e negativi all’IDT che non

sono immediatamente macellati hanno una maggior

probabilità di reagire a test intradermici susseguenti

rispetto ad animali negativi ad entrambi i test. Recenti

studi in Gran Bretagna hanno dimostrato che

l’intervallo tra l’infezione e il tempo necessario per

giungere ad una risposta positiva al γ IFN (periodo

d’insensibilità) è del tutto indipendente dalla dose infettiva

di M. bovis.

Il γ IFN e l’IDT hanno una bassa probabilità di individuare

bovini infetti anergici (risposta immune cellullo-mediata

depressa).

I vantaggi pratici del test γ IFN paragonati all’IDT

sono riassunti nel box 1.

Nella tabella 3 sono elencati alcuni fattori che deprimono

la risposta cellulo-mediata e che diminuiscono

la sensibilità dell’IDT e del test γ IFN.

Nel box 2 sono evidenziati gli svantaggi del test γ

IFN rispetto all’IDT.

Infl uenza del test intradermico sulla risposta del γ

IFN

Dati preliminari di un lavoro del 1992 hanno suggerito

che risposte al γ IFN in bovini infetti erano

Sanità animale 12 ’OSSERVATORIO

L


influenzate dalla precedente applicazione del test intradermico;

in particolare, si osservava un graduale

incremento nei valori OD per il test γ IFN tra 7 e 59

giorni dopo il SIT caudale.

Ad ogni modo, successivi studi differenti hanno portato

a conclusioni contrastanti circa la temporanea diminuzione

nella risposta al γ IFN dopo applicazioni

recenti del test intradermico.

Queste discrepanze sono probabilmente dovute a

condizioni variabili con cui sono stati condotti i diversi

studi, incluso il tipo di skin test applicato. Alcuni

autori hanno valutato il test Bovigam ® in bovini

naturalmente infetti tra 8 e 28 giorni dopo la lettura

del SIT caudale. Le conclusioni sono state favorevoli

all’utilizzo del test anche dopo 8 giorni dalla lettura

del SIT. Questi risultati sono alla base dell’attuale

protocollo del test con γ IFN in Nuova Zelanda, dove

il campionamento di sangue viene eseguito tra 13 e

33 giorni dopo l’inoculazione della tubercolina.

Negli USA altri studi confermano che il SIT caudale

incrementa le risposte del γ IFN a partire da tre giorni

dopo lo skin test e fino a 63 giorni. Applicando il

SICCT test a 63 giorni dopo il SIT non si evidenziava

un ulteriore incremento nella risposta al γ IFN.

Inoltre, è stato dimostrato che si raggiungono valori

di OD elevati nel sangue prelevato dopo 3 giorni dal

SIT e conservati per una notte rispetto a campioni

prelevati contestualmente, ma testati immediatamente,

entro 2 ore.

Questi risultati hanno supportato l’autorizzazione da

parte del Dipartimento dell’Agricoltura USA di applicare

il test Bovigam ® tra 3 e 30 giorni dopo il SIT

caudale.

Diversi studi condotti in Irlanda e in Gran Bretagna

non hanno mostrato significative differenze nella

risposta al γ IFN in animali naturalmente infetti e

reattori allo skin test fino a 7 e 65 giorni dopo il test

SICCT. In un altro lavoro si afferma che il test del

γ IFN può essere eseguito su campioni prelevati tre

giorni dopo l’applicazione del SICCT test senza influenzarne

la sensibilità.

Di converso, un altro studio eseguito su vitelli infettati

sperimentalmente con alte dosi di M. bovis, ha dimostrato

una diminuzione pronunciata della risposta

al γ IFN in sangue prelevato dopo 3 giorni dall’applicazione

del SICCT test, anche se l’interpretazione

del test non veniva influenzata quando si usavano le

tubercoline bovina e aviare. Anche in Gran Bretagna

è stato segnalato che le risposte del γ IFN alla tubercolina

aviare in vitelli sperimentalmente infettati

aumentano transitoriamente, quando il sangue è raccolto

una settimana dopo il SICCT test.

Questo incremento selettivo della risposta alla tubercolina

aviare potrebbe mascherare la diagnosi d’infezione

con il test Bovigam ® .

Nel box 3 sono rappresentate le conclusioni generali

di tutti gli studi presi in considerazione circa gli effetti

dello skin test sulle risposte del γ IFN in animali

infetti.

Applicazioni in campo del γ IFN

Come già affermato, la specificità mediana del γ IFN

convenzionale usando la PPD bovina è 96,6%; può

sembrare alta e solo marginalmente bassa se paragonata

al 99,5% del SICCT test. Ad ogni modo, in un

paese o regione dove la prevalenza di TB a livello

individuale è bassa, questo valore porterebbe a macellare

un numero inaccettabile di bovini non infetti.

Questo è il principale argomento portato contro l’utilizzo

del test Bovigam ® come test di screening di

massa. Inoltre, il test è relativamente costoso e il suo

uso comporta alcuni svantaggi logistici e non identifica

ogni animale infetto che reagisce allo skin test.

Perciò, l’applicazione più idonea del γ IFN ad oggi

è il suo uso come test ancillare in parallelo in focolai

di TB o in allevamenti persistentemente infetti a più

skin test, in cui la rimozione di pochi animali o falsi

positivi è di trascurabile importanza. L’impiego sia

dello skin test che del γ IFN in rapida successione

può innalzare la sensibilità diagnostica totale fino al

20% in più rispetto al solo SIT test, con la rimozione

di più bovini infetti, ma non necessariamente tutti, da

allevamenti infetti con più rapidità.

In più, in paesi dove il SIT è il test di screening primario

(compresa l’Italia), il test γ IFN è il test seriale

di scelta per ri-testare i reattori allo skin test in allevamenti

bovini indenni da TB situati in aree a bassa

prevalenza di TB.

Box 3 - Riassunto degli effetti osservati dello skin test su susseguenti risposte di γ IFN

in animali infetti.

• Il SIT caudale può incrementare le risposte del γ IFN in bovini infetti con M. bovis;

• il SICCT test non incrementa significativamente le risposte del γ IFN;

• il sangue per il test Bovigam® può essere prelevato dopo tre giorni dal SIT test, senza

influenzare il risultato;

• vi sono risultati contradditori in relazione al SICCT test. Alcuni risultati supportano

l’affermazione precedente, altri dati sperimentali suggeriscono che è più sicuro evitare

di usare il test Bovigam® nei 7 giorni seguenti il SICCT test.

’OSSERVATORIO

L

13 Sanità animale


Tabella 5. Esempi d’applicazioni in campo del test IFN (Bovigam ® ), a complemento dei test diagnostici primari

per TB nel bovino

Paese

Nuova

Zelanda

USA

Sud

Africa

Italia

Repubblica

d’Irlanda

Nord

Irlanda

Gran

Bretagna

(UK)

Test

primario

di

screening

per TB

SIT

caudale

SIT

caudale

SIT

caudale

SIT

cervicale

SICCT

SICCT

SICCT

Test in parallelo in bovini skin test negativi

(interpretazione “qualsiasi positivo) per > Se

Allevamenti infetti in modo acuto o cronico,

per ridurre il tempo d’eradicazione

Pre-movement test in bovini > 6 settimane

da allevamenti infetti

Come alternativa alla macellazione

dell’intero allevamento infetto

Allevamenti bovini e bufalini infetti in modo

acuto o cronico

Allevamenti bovini e bufalini infetti in modo

acuto o cronico

Allevamenti infetti in modo acuto o cronico,

per ridurre il tempo di eradicazione

Possibile screening d’allevamenti contigui

a focolai confermati

Parte di un pilota per supportare la

rilevazione di bovini infetti in allevamenti

“problema” con infezione cronica Gli

allevamenti reclutati (e gli animali positivi

rimossi) sono su base volontaria

In focolai TB persistenti in cui ci sono

reattori con lesioni visibili nei successivi 60

giorni d’intervallo tra gli skin test

In gravi focolai come alternativa alla

macellazione totale o parziale

In nuovi focolai confermati fuori da aree

endemiche

La tabella 5 riassume le diverse applicazioni in campo

del test γ IFN in una selezione di paesi non ufficialmente

indenni da TB con attivi programmi di

controllo.

Negli USA il γ IFN è un test supplementare approvato

nel bovino dal 2001; ora è usato di routine in alternativa

al SICCT per chiarire lo stato dei reattori al

SIT caudale in allevamenti presumibilmente indenni

dall’infezione (test seriale) ed è approvato anche

come test in parallelo con il SIT caudale in allevamenti

infetti, in alternativa al de-popolamento.

Anche in Nuova Zelanda il γ IFN è approvato nel bovino

come test ancillare a complemento del SIT caudale,

sia come test in serie per i reattori allo skin test e

come test in parallelo per gli animali skin test negativi

in allevamenti infetti. Inoltre, il γ IFN è usato in parallelo

con il SIT nel controllo dei bovini al pre-movement

da allevamenti infetti (al contrario degli allevamenti

indenni, in cui i bovini sono testati al pre-movement

solo con il SIT). Nel luglio 2002 il test γ IFN è

Usi operativi del test γ IFN

Test in serie (di conferma) di reattori

allo skin test (interpretazione “entrambi

positivi”) per > Sp

Su tutti i reattori al test primario in

allevamenti indenni. Tre differenti formati di

test sono disponibili, mirati a diversi livelli

di specifcità

Applicati anche in circostanze eccezionali in

allevamenti infetti o sospesi

In allevamenti presumibilmente TB free, per

ri-testare i reattori sospetti di aspecificità al

test primario

stato formalmente riconosciuto dall’Unione Europea

come test parallelo supplementare per aumentare la

rilevazione del numero di bovini infetti in allevamento.

Il test ora è uno strumento standard nel controllo

di bovini nei paesi europei con tubercolosi endemica.

Dal punto di vista del costo-beneficio della combinazione

dei due test in situazioni differenti non è stato

pubblicato alcuno studio completo. Un modello decisionale

ad albero dell’uso del γ IFN in allevamenti con

reattori multipli alla tubercolina in Gran Bretagna ha

comunque stimato che ci vorrebbero significativi benefici

nella riduzione della diffusione intra e inter-allevamenti

per rendere efficiente il test. Sarebbero necessari

costosi trial rnadomizzati per controllare queste

ipotesi sul campo, ad esempio se l’uso congiunto del

γ IFN e dello skin test potesse significativamente accorciare

il tempo di restrizione cui sono sottoposti gli

allevamenti infetti rispetto all’uso del solo skin test.

Nondimeno, l’impiego del γ IFN in Gran Bretagna si

è diffuso dal 2002 per l’uso ancillare ad hoc a complemento

del SICCT test in situazioni specifiche.

Sanità animale 14 ’OSSERVATORIO

-

-

Nel caso di sospetto di reazioni non

specifiche a SICCT, usando un punto di

cut-off più alto e antigeni specifici di M.

bovis

Parte di un trial volontario in un numero

d’allevamenti indenni selezionati random

per stabilire la specificità

In allevamenti reattori non confermati

(NVL, colture negative) senza precedenti

infezioni confermate e in aree a bassa

prevalenza, dove si sospetta una reazione

non specifica alla tubercolina

Rapido ri-controllo di bovini con reazioni

anomale allo skin test, in cui si sospetta

interferenza fraudolenta

L


Diagnosi basata sugli anticorpi

La reazione dell’ospite alla tubercolosi è prevalentemente

rappresentata dall’immunità cellulo-mediata,

affiancata, con il progredire della malattia, dalla risposta

anticorpale.

Figura 1. Rappresentazione schematica dello spettro

di risposte del sistema immunitario bovino ai vari test

per TB (adattata da Vordermeier et al., 2004)

La figura 1 rappresenta schematicamente l’evoluzione.

Sulla destra del grafico vi sono gli animali con infezione

avanzata e generalizzata, ma che non rispondono

alla tubercolina a causa di una debole risposta

dell’immunità cellulo-mediata. E’ stato speculato che

questi animali “anergici” sono probabilmente malati

e altamente infettanti e che potrebbero essere la causa

di gravi e persistenti focolai. Un a certa proporzione

di bovini “anergici” può essere rilevata con metodi

sierologici (tipo ELISA). Questi test sono stati sviluppati

nelle ultime due decadi per rilevare la tubercolosi

bovina ed umana, ma generalmente soffrono di

una bassa Se, quando paragonati allo skin test e al γ

IFN, soprattutto quando applicati ad animali ai primi

stadi d’infezione. L’inclusione d’antigeni di M. bovis

più specifici (e.g. MPB70 e MPB83) ha aumentato la

Sp, ma non la Se. Studi recenti hanno mostrato che

la risposta anticorpale contro M. bovis è incrementata

dallo skin test (risposta anamnestica). Questo incremento

è direttamente proporzionale alla gravità della

malattia e alla sua generalizzazione.

In sintesi, i test sierologici che rilevano gli anticorpi

sono relativamente economici e semplici da fare, ma

non offrono, al momento un’alternativa ai test basati

sull’immunità cellulo-mediata.

Essi possono essere considerati come test ancillari per

lo skin e il γ IFN test in bovini negativi appartenenti

ad allevamenti con infezione cronica confermata o in

caso di focolaio.

Altri test diagnostici complementari

La coltura convenzionale rimane il gold standard per

la rilevazione di M. bovis in campioni clinici come i

tessuti, il muco nasale, il sangue. I metodi basati su

L

’OSSERVATORIO

PCR offrono potenziali vantaggi di sensibilità, flessibilità

e rapidità. Le metodiche PCR non hanno però

fino ad ora mostrato d’essere superiori alla coltura di

routine in termini di sensibilità e specificità. Le limitazioni

probabilmente sono legate al basso numero di

bacilli in campioni clinici, all’eliminazione intermittente,

all’estrazione inefficiente del DNA dei micobatteri

o alla presenza d’inibitori di PCR nei campioni.

PCR rimane d’uso limitato nell’identificazione d’infezione

con M. bovis nei campioni clinici, poiché

richiede elevate quantità di bacilli. In breve, anche

se le metodiche PCR beneficiano di una più precoce

identificazione delle specie di micobatteri rispetto

alla coltura, non è realistico considerale ancora una

valida scelta agli strumenti impiegati per la diagnosi

di routine di TB negli animali in vita.

Infine, sono state investigate le potenzialità di sensori

chimici nel diagnosticare l’infezione con M. bovis,

che si basano sulla rilevazione ed analisi di composti

organici volatili in campioni di siero da vitelli infetti,

un approccio conosciuto come “naso elettronico”

(“e-nose”). Nonostante risultati iniziali promettenti

(8 vitelli infettati sperimentalmente discriminati correttamente

da controlli non infetti tre settimane dopo

l’infezione), sono necessari altri studi allargati per

valicare scientificamente questa tecnologia.

Sviluppi futuri

L’uso d’antigeni o peptici sintetici specifici per M.

bovis, in alternativa alla PPD bovina, sono ancora in

corso di valutazione per lo sviluppo di un test intradermico

più specifico.

Le recenti acquisizioni sulle sequenze genomiche di

M. tuberculosis, M. bovis e M. bovis BCG hanno permesso

di eseguire analisi genomiche comparative per

screening immunologici di potenziali antigeni. Diversi

antigeni possono incrementare la sensibilità e

la specificità del γ IFN quando usati in combinazione

con ESAT-6 e CFP-10, anche se più antigeni vanno

valutati per giungere alla sensibilità della tubercolina.

L’uso d’antigeni ESAT-6 e CFP-10 nel test del γ

IFN sono in grado di discriminare gli animali vaccinati

da quelli infetti, ma vi è bisogno di estendere i la

sperimentazione ad un più grande numero di bovini.

In Gran Bretagna si sta acquisendo esperienza circa

l’evidenza di differenze esistenti tra ceppi di M. bovis

(spoligotipi) nella loro capacità di indurre una risposta

cellulo-mediata dell’ospite. Questo fenomeno è già

stato descritto per differenti genotipi di M. tuberculosis.

Il riconoscimento di differenti cloni di M. bovis

consentirà di paragonarli e di identificare differenze

nella virulenza, trasmissibilità e immunogenicità.

Se esiste tale variabilità, la sorveglianza costante dei

tipi molecolari può essere necessaria al fine di mirare

la diagnosi di TB e le misure di controllo concernenti

i ceppi di M. bovis prevalenti a livello locale.

15 Sanità animale

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