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Box 2 - Svantaggi del test γ IFN nei confronti della prova intradermica • Specificità apparentemente più bassa. Ciò può essere parzialmente compensato utilizzando al posto della tubercolina bovina determinati antigeni del micobatterio come la proteina ESAT 6 (early secretory antigenic target) e la proteina filtrata da coltura 10 (CFP). Entrambe le proteine sono codificate da geni presenti nei genomi di M. bovis e M. tuberculosis e assenti da M. bovis BCG e quasi tutti i micobatteri ambientali; • una piccola proporzione di bovini infetti che reagiscono al test intradermico non sono individuati dal test γ IFN; • è più probabile che vitelli non infetti diano reazioni non specifiche al test. Questo è dovuto probabilmente alla produzione innata di γ IFN da parte delle cellule natural killer nel sangue periferico, quando stimolate in vitro con certi antigeni del MTB complex; • alcune difficoltà logistiche associate alla necessità di trasportare i campioni di sangue in un ambiente stabile (circa 10-26°C) e di incubarli con l’antigene entro poche ore dalla raccolta. Ritardi nel processo dei campioni può ridurre significativamente la sensibilità del test; • alto costo della componente del laboratorio, sebbene si eviti il ritorno in allevamento e via sia l’automazione e l’economia di scala; • necessità di un’accurata identificazione degli animali al campionamento, poiché i positivi non sono marcati nella reazione al test. lulo-mediata dell’ospite nei confronti dell’infezione con M. bovis. Dopo 1-4 settimane dall’infezione, le cellule T nel sangue periferico del bovino rilasciano quantità misurabili di γ IFN, quando stimolate dalla tubercolina bovina o antigeni simili. Nel caso in cui l’infezione sia causata da M. avium o micobatteri ambientali, la produzione di γ IFN sarà più copiosa da parte delle cellule T incubate con la tubercolina aviare. L’infezione con M. bovis è determinata, quando la tubercolina bovina stimola una produzione di γ IFN maggiore della tubercolina aviare o dell’antigene di controllo negativo. La quantità di γ IFN prodotto è misurato con lo sviluppo di colore all’ELISA test ed è espresso in unità di densità ottica (DO). Accuratezza diagnostica, vantaggi e svantaggi del γ IFN La performance diagnostica del γ IFN convenzionale è stata valutata in diversi studi svolti in Australia, Brasile, Etiopia, Gran Bretagna, Repubblica d’Irlanda, Italia, Nuova Zelanda, Irlanda del Nord, Spagna e USA. In questi trias la Se del γ IFN variava tra il 73% e il 100%, con un valore mediano di 87,6%. Il valore mediano della Sp era del 96,6%, con un range di 85,0-99,6% (tabella 5). Come atteso, i risultati furono influenzati anche dalle caratteristiche della popolazione bovina sottoposta al test, dai differenti valori di cut-off adottati per classificare gli animali come positivi, dal lotto e dalla fonte di tubercolina PPD usata come antigene e dal gold standard usato per determinare il vero stato d’infezione degli animali in studio. Generalmente, si considera che il γ IFN abbia una sensibilità sovrapponibile alla prova intradermica (tabella 4). Alcuni autori sostengono che il test del γ IFN sveli un numero sostanziale di bovini infetti che sfuggono al test tubercolinico, poiché riesce ad identificare gli animali ad uno stadio precoce d’infezione. Perciò, i due test rilevano due sottopopolazioni di animali tubercolotici leggermente differenti. I bovini positivi al γ IFN e negativi all’IDT che non sono immediatamente macellati hanno una maggior probabilità di reagire a test intradermici susseguenti rispetto ad animali negativi ad entrambi i test. Recenti studi in Gran Bretagna hanno dimostrato che l’intervallo tra l’infezione e il tempo necessario per giungere ad una risposta positiva al γ IFN (periodo d’insensibilità) è del tutto indipendente dalla dose infettiva di M. bovis. Il γ IFN e l’IDT hanno una bassa probabilità di individuare bovini infetti anergici (risposta immune cellullo-mediata depressa). I vantaggi pratici del test γ IFN paragonati all’IDT sono riassunti nel box 1. Nella tabella 3 sono elencati alcuni fattori che deprimono la risposta cellulo-mediata e che diminuiscono la sensibilità dell’IDT e del test γ IFN. Nel box 2 sono evidenziati gli svantaggi del test γ IFN rispetto all’IDT. Infl uenza del test intradermico sulla risposta del γ IFN Dati preliminari di un lavoro del 1992 hanno suggerito che risposte al γ IFN in bovini infetti erano Sanità animale 12 ’OSSERVATORIO L
influenzate dalla precedente applicazione del test intradermico; in particolare, si osservava un graduale incremento nei valori OD per il test γ IFN tra 7 e 59 giorni dopo il SIT caudale. Ad ogni modo, successivi studi differenti hanno portato a conclusioni contrastanti circa la temporanea diminuzione nella risposta al γ IFN dopo applicazioni recenti del test intradermico. Queste discrepanze sono probabilmente dovute a condizioni variabili con cui sono stati condotti i diversi studi, incluso il tipo di skin test applicato. Alcuni autori hanno valutato il test Bovigam ® in bovini naturalmente infetti tra 8 e 28 giorni dopo la lettura del SIT caudale. Le conclusioni sono state favorevoli all’utilizzo del test anche dopo 8 giorni dalla lettura del SIT. Questi risultati sono alla base dell’attuale protocollo del test con γ IFN in Nuova Zelanda, dove il campionamento di sangue viene eseguito tra 13 e 33 giorni dopo l’inoculazione della tubercolina. Negli USA altri studi confermano che il SIT caudale incrementa le risposte del γ IFN a partire da tre giorni dopo lo skin test e fino a 63 giorni. Applicando il SICCT test a 63 giorni dopo il SIT non si evidenziava un ulteriore incremento nella risposta al γ IFN. Inoltre, è stato dimostrato che si raggiungono valori di OD elevati nel sangue prelevato dopo 3 giorni dal SIT e conservati per una notte rispetto a campioni prelevati contestualmente, ma testati immediatamente, entro 2 ore. Questi risultati hanno supportato l’autorizzazione da parte del Dipartimento dell’Agricoltura USA di applicare il test Bovigam ® tra 3 e 30 giorni dopo il SIT caudale. Diversi studi condotti in Irlanda e in Gran Bretagna non hanno mostrato significative differenze nella risposta al γ IFN in animali naturalmente infetti e reattori allo skin test fino a 7 e 65 giorni dopo il test SICCT. In un altro lavoro si afferma che il test del γ IFN può essere eseguito su campioni prelevati tre giorni dopo l’applicazione del SICCT test senza influenzarne la sensibilità. Di converso, un altro studio eseguito su vitelli infettati sperimentalmente con alte dosi di M. bovis, ha dimostrato una diminuzione pronunciata della risposta al γ IFN in sangue prelevato dopo 3 giorni dall’applicazione del SICCT test, anche se l’interpretazione del test non veniva influenzata quando si usavano le tubercoline bovina e aviare. Anche in Gran Bretagna è stato segnalato che le risposte del γ IFN alla tubercolina aviare in vitelli sperimentalmente infettati aumentano transitoriamente, quando il sangue è raccolto una settimana dopo il SICCT test. Questo incremento selettivo della risposta alla tubercolina aviare potrebbe mascherare la diagnosi d’infezione con il test Bovigam ® . Nel box 3 sono rappresentate le conclusioni generali di tutti gli studi presi in considerazione circa gli effetti dello skin test sulle risposte del γ IFN in animali infetti. Applicazioni in campo del γ IFN Come già affermato, la specificità mediana del γ IFN convenzionale usando la PPD bovina è 96,6%; può sembrare alta e solo marginalmente bassa se paragonata al 99,5% del SICCT test. Ad ogni modo, in un paese o regione dove la prevalenza di TB a livello individuale è bassa, questo valore porterebbe a macellare un numero inaccettabile di bovini non infetti. Questo è il principale argomento portato contro l’utilizzo del test Bovigam ® come test di screening di massa. Inoltre, il test è relativamente costoso e il suo uso comporta alcuni svantaggi logistici e non identifica ogni animale infetto che reagisce allo skin test. Perciò, l’applicazione più idonea del γ IFN ad oggi è il suo uso come test ancillare in parallelo in focolai di TB o in allevamenti persistentemente infetti a più skin test, in cui la rimozione di pochi animali o falsi positivi è di trascurabile importanza. L’impiego sia dello skin test che del γ IFN in rapida successione può innalzare la sensibilità diagnostica totale fino al 20% in più rispetto al solo SIT test, con la rimozione di più bovini infetti, ma non necessariamente tutti, da allevamenti infetti con più rapidità. In più, in paesi dove il SIT è il test di screening primario (compresa l’Italia), il test γ IFN è il test seriale di scelta per ri-testare i reattori allo skin test in allevamenti bovini indenni da TB situati in aree a bassa prevalenza di TB. Box 3 - Riassunto degli effetti osservati dello skin test su susseguenti risposte di γ IFN in animali infetti. • Il SIT caudale può incrementare le risposte del γ IFN in bovini infetti con M. bovis; • il SICCT test non incrementa significativamente le risposte del γ IFN; • il sangue per il test Bovigam® può essere prelevato dopo tre giorni dal SIT test, senza influenzare il risultato; • vi sono risultati contradditori in relazione al SICCT test. Alcuni risultati supportano l’affermazione precedente, altri dati sperimentali suggeriscono che è più sicuro evitare di usare il test Bovigam® nei 7 giorni seguenti il SICCT test. ’OSSERVATORIO L 13 Sanità animale
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