Ecologia dei principali cianobatteri tossici (Manganelli) - Istituto ...

Ecologia dei principalicianobatteri tossiciManganelli M.Istituto Superiore di Sanità, AMPP, Roma

Principali caratteristichefisiologiche• Meccanismi di raccolta luce molto efficienti (ficobilisomi)• Capacità di fotosintesi a basse concentrazioni di CO 2 e pH elevato• Resistenza agli UV (carotenoidi)• Euritermi• Meccanismi di fissazione dell’azoto (eterocisti)• Meccanismi di galleggiamento (vescicole gassose)• Meccanismi di incorporazione di nutrienti efficienti• Cellule specializzate per la riproduzione (ormogoni) o lasopravvivenza (acineti)• Difese chimiche (tossine) e fisiche (colonie) dalla predazione• Associazioni simbiotiche spcialistiche con batteri

Fattori che influenzano le fiorituredi cianobatteriIntensità della luce: molti cianobatteri sono sensibili all’esposizioneprolungata ad elevate intensità di luce – I cianobatteri avrannoun vantaggio competitivo nei laghi torbidi a causa di intensefioriture di altri organismi fitoplanctoniciLento tasso di crescita: I cianobatteri non danno luogo a fioriturein ambienti acquatici con un tempo di ricambio breve (ambientilentici o stagnanti)Hanno un rapporto N:P minore delle algheMolte specie producono tossine

Specie tossicheMattei D, Stefanelli M, Rappori ISTISAN, 08/6

Ruolo ecologico delle tossineLa produzione di tossine dipende da molti fattoriambientali (temperatura Preussel et al. 2009; luce,Wiedner et al. 2003; nutrienti, Oh et al. 2000) e dallacomposizione genetica della popolazione (presenza omeno del gene per la produzione di tossine, Briand etal. 2008; Okello et al. 2010; Orr et al. 2010);regolazione della produzione di tossine (Kurmayer et al.2004; Wood et al. 2010; Fewer et al. 2010)Difesa dalla predazione? (Rohrlack et al. 1999 – Daphnia)Allelopatia? (Leão et al. 09)

Eventi di fioriture e/o presenza di cianobatteri in Italia – fino 2005Regione Presenza/fioriture tossinaFenomeni dimorieriferimentoSardegnaMicrosystisAphanizomenonAnabaenaPlanktothrixnegativoOsservate nel lagoLiscioCattini, 2005. RapportiISTISAN 5/29Valli ComacchioCylindrospermopsisManfredini Ghion, 2005.Rapporti ISTISAN5/29Laghi subalpiniAnabaenaPlanktothrix MicrosystisAphanizomenonSalmaso, 2005. RapportiISTISAN 5/29Laghi Macerata Planktothrix

Eventi di fioriture e/o presenza dicianobatteri in Italia – dopo 2005Piemonte - Anabaena lemmermannii, A. planctonicaVeneto – P. rubescens, A. lemmermanniiProvincia autonoma di Trento – Anabaena, Aphanizomenon,Microcystis, Coelosphaerium, Planktothrix (presenza tossine)Marche – P. rubescens (presenza poche tossine)Umbria – Cilindrospermopsis raciborskii, Aphanizomenon,Leptolyngbya, Geitlerinema (no tossine)Lazio – P. rubescens, Anabaena (no tossine). Lago di Albano2006-2007 P. rubescens (Elwood et al 2009)

Fioriture superficiali diPlanktothrix rubescensFilamenti singoli, basse temperature, bassaintensità di luce, preferibilmenteipolimnio.Tossica(Microcistine)Chorus I. and Bartram J. Eds. 1999. Toxic Cyanobacteria in Water. WHO

Effetto dell’intervento di recupero in unlago alpino franceseRiduzione del carico dinutrienti e della clorofilla dal1984 al 2001; variazioni nelrapporto N:P, aumentoprofondità di uno stratoeufotico con concentrazioneinsignificante di PO4 eparallelo aumento ditrasparenza nello stessomomentoS. Jacquet et al. Harmful Algae 4 (2005) 651–672

Effetto dell’intervento di recupero in unlago alpino franceseFioritura di P. rubescens appena sotto il termoclino in estate, eelevate concentrazioni algali in autunno su tutta la colonnad’acqua. Variazioni nella composizione algale

Dinamica temporale di P. rubescens nelLago di Gerosa (AP) - Lago oligotroficoP. rubescens batteriManganelli et al. 2010 – Water research 44 (2010) 1297-1306

processed N (nmol L-1 h-1)Dinamica temporale di P. rubescens nelLago di Gerosa (AP)N tot600500y = -64.525Ln(x) + 349.81R 2 = 0.6038400300200100N inorg00 50 100 150 200 250NO3-N (mg L-1)Il bloom avviene in assenza di Ninorganico, grazie all’attività diriciclo dei batteri

Tossicità del bloom nel Lago diGerosaLa concentrazione di tossine noncoincide con il massimo cellulare;in parte, è dovuta allapercentuale di cellule tossichepresenti nella popolazioneP. rubescensLa percentuale di cellule tossichea 25 metri è sempre moltoelevataManganelli et al., 2010

Indicazioni su P. rubescens•Poco importante per la balneazione (bloomsuperficiali in autunno/inverno con eccezioni);•La densità algale non è un buon indicatore di unasituazione a rischio;•È una specie che può proliferare anche incondizioni di oligotrofia;•In caso di utilizzo per acqua potabile, è necessariomonitorare anche in estate in prossimità dei puntidi captazione dell’acqua, generalmente inprofondità.

Cylindrospermopsis raciborskiiM. StefanelliFilamenti singoli, larghi 1-5 mEterocisti sulle estremitàappuntite – formazione diacineti (solo nelle zonetemperate)Difficilmente distinguibilile celluleNo bloom visibili• Inizialmente tropicale, ora diffusa in ambienti temperati inestate; la temperatura di crescita coincide con il max neiluoghi temperati (nei laghi tropicali è > che nei laghitemperati)• Basse concentrazioni di nutrienti inorganici

Cylindrospermopsis raciborskiiLuce ottimale:prove di laboratorio indicano basse intensità (p.e.Briand et al . 2004);l’analisi di dati storici (13 anni) di due laghi inGermania nord-orientale indica un’elevata intensità. Unclima più caldo favorisce la germinazione degli acineti diCylindrospermopsis prima del solito, in concomitanza conla massima intensità luminosa, favorendo così la suaproliferazione e la sua diffusione in Europa (Wiedner etal. 2007)

Tossicità Cylindrospermopsis raciborskii•ceppi australiani e asiatici - cilindrospermopsina (CYN)(Saker et al. 1999; Li et al. 2001),•ceppo brasiliano saxitossina (STX) (Lagos et al. 1999),•ceppi europei epatotossici ??? (Fastner et al. 2003; Sakeret al. 2003).•La cilindrospermopsina, al contrario delle microcistine, sitrova spesso extracellularmente, anche durante la fase dicrescita esponenziale. E’ probabile che ci sia un processoattivo di escrezione. I tempi di decadimento della tossinasono molto lunghi.

Tossicità Cylindrospermopsis raciborskiiin Italia• Lago Trasimeno 1 e 10 milioni di cell L-1 ma no tossine(Manti et al 2005; Mugnai et al 2008)• Estate 2010 da 6-20 milioni di cell L-1, no tossine (ISS-Arpa Umbria)• Raggiunta un densità molto elevata in un mese.• Mancano studi conclusivi sulla tossicità del ceppoitaliano; necessario approfondimento sulla genetica esull’eventuale produzione di tossine diverse dacilindrospermopsina.• Analisi di tossicità sul campione tal quale,considerato che la cilindrospermopsina spesso haconcentrazioni extracellulari superiori a quelleintracellulari

Aphanizomenon flos-aquaehttp://www.ifm-geomar.de/index.php?id=5053http://www.butbn.cas.cz/ccala/index.phpFilamenti lineari non ramificati, uniti in fasci facilmentevisibili;Presenza di eterocisti ed acineti in mezzo al filamento;Bloom superficiali visibili; meccanismo di galleggiamentosimile a Microcystis;

Aphanizomenon flos-aquaeSopravvive bene in inverno grazie alla formazione di acineti;Fiorisce a temperature fra i 15 e i 28°C, ma in presenza dialtre specie (p.e. Anchistrodesmus), la temperatura deveessere un po’ più alta del suo optimum. Basse concentrazionidi nutrienti la favoriscono (Yamamoto e Nakahara, 2006)Fioriture primaverili e/o tarda estatehttp://www.umich.edu/~hrstudy/photoset.htm

Aphanizomenon flos-aquae•Produce anatossina a, saxitossina e cilindrospermopsina(Preussel et al 2006).•Un’elevata percentuale della tossina prodotta èextracellulare;•Questa specie sembra più controllata da fattori ambientaliche genetici sia per la produzione di tossine che per ilrilascio attivo all’esterno della cellula (Preussel et al. 2009)•L’intensità di luce diversa ha effetti diversi a secondadella temperatura. Combinazioni di luce/temperatura chesimulano condizioni di stress aumentano la produzione ditossine e soprattutto il suo rilascio all’esterno della cellula(Preussel et al. 2009)

Microcystis aeruginosaColonie di cellule sferiche,generalmente tossicaMeccanismi di galleggiamento,intensità della luce ottimaleIntense fioriture superficialihttp://www.biol.tsukuba.ac.jp/~makoto/pics/fig1_L.jpgChorus I. and Bartram J. Eds. 1999. Toxic Cyanobacteria in Water. WHO

Microcystis aeruginosaSoprattutto regioni temperate, specialmente in acque dolci incondizioni di bassa salinità. Livelli adeguati di nutrienti etemperature non al di sotto dei 15°C (ottimo di temperatura25°C).Fioriture nella tarda estate ed all’inizio dell’autunno e sonocomuni in corpi d’acqua eutrofici o ipertrofici.Mycrocistis aeruginosa regola il proprio galleggiamento inrisposta alla luce, alle condizioni di turbolenza dell’acqua ed ainutrienti disponibili. Le piogge possono favorire la formazionedelle fioriture in quanto aumentano i livelli di nutrienti (anchea seguito del dilavamento del suolo). Le fioriture sono rapideed imponenti.

Fioriture superficiali di MicrocystisGalleggiamento rispetto alle dimensioni della coloniaChorus I. and Bartram J. Eds. 1999. Toxic Cyanobacteria in Water. WHO

Tossicità di Microcystis aeruginosa•Produce microcistine (più di 80 varianti conosciute)•E’ una specie con un’elevata variabilità genetica ancheall’interno dello stesso habitat;•La produzione di tossine dipende da fattori ambientali(indirettamente, agiscono sul tasso di crescita) e genetici(rapporto fra genotipo tossico/non tossico, Davis et al.,2009)•Ha una certa resistenza alla salinità e aumenta la produzionedi tossine (Tonk et al., 2007; Mazur-Marzec et al., 2005)

Cenni sulle strategie di campionamentoPossibili distribuzioni dei cianobatteri lungola colonna d’acquaAccumulo di cianobatteriDistribuzione uniforme di cianobatteriA. Accumulo e/o schiume, più probabili a riva ma possono verificarsi anche in acque aperteB. Distribuzione uniforme nella zona foticaC. Distribuzione a profondità specifiche nella zona foticaD. Bloom metalimnetico (caso speciale di C)E. Bloom sotto il ghiaccio

Campionamento di superficie• Prelevare il campione sistematico di tipo istantaneo a circa 10 cmdi profondità. Non prelevare il campione rasentando la superficie.• Non sciacquare l’interno del contenitore con l’acqua del corpoidrico in esame prima del campionamento.• Prelevare il campione direttamente nel contenitore:• Immergere lentamente il contenitore, dalla parte con l’apertura.Se sono presenti schiume che non si intende campionare, evitarequanto possibile di attraversarle con il contenitore.• Capovolgere la bottiglia alla profondità desiderata possibilmentenella direzione della corrente, far entrare l’acqua fino a riempirela bottiglia.• Versare una piccola quantità di campione in modo da consentirel’omogeneizzazione una volta in laboratorio.• Chiudere velocemente il contenitore serrando bene

Campionamento lungo la colonnaCampioni compositiCampioni più rappresentatividelle condizioni generalidell’invasoTuttavia a causa delladistribuzione irregolare dellefioriture si potrebbe avereun effetto diluizione troppomarcatoCampioni discreti puntualiSe si ha la necessità di studiarela distribuzione lungo la colonna1 2 3nylon cordinsert corkNiskinVan Dornlead collar

Campionamento di schiume 1Campionamento effettuato per valutare ilrischio associato alle attività di balneazioneSimulare le condizioni create da bagnanti ebambini che giocano (mescolare la schiuma con lostrato sottostante prima del prelievo daeffettuare come un prelievo di superficie)

Campionamento di schiume 2Campionamento di carattere ecologico• Densità massimaCampionare nella zona dove laschiuma appare più spessaDensità mediaCampionamento composito,effettuando più campionamentinell’area interessata.2134

• Se lo studio prevede il confronto di più parametri(cianotossine, parametri chimico-fisici, contecellulari) è assolutamente necessario che i campionivengano prelevati CONTEMPORANEAMENTE edallo STESSO PUNTO• Riportare sulla scheda di campionamento qualunquecambiamento rispetto al protocollo stabilito

Fissare il campione• Fissare sul campo con Lugol e trasportare il campione albuio in laboratorio.• Se il campione arriva in laboratorio entro due ore, si puòfissare il campione in laboratorio, sotto cappa, conformaldeide (anche non tamponata, maprecedentemente filtrata su 0.2 m, concentrazionefinale 4%)• Conservare i campioni in frigo se non si effettua subitola conta

ContaUnità da contare: cellule; filamenti singoli e colonie di unicellulari in cui si possonocontare le singole cellule.Nel caso di filamenti singoli o colonie di unicellulari, si contano i filamenti e le coloniedel campione, come per le cellule. Sullo stesso campione, si contano le cellule dei primitrenta filamenti/colonie, per avere un numero medio di cellule per filamento/colonia chesi moltiplica per il numero di unità precedentemente contate.Nel caso di filamentosi coloniali o colonie di unicellulari con molte cellule, è megliorompere le colonie e contare le singole cellule (diluizione; sonicazione; sonicazione conTriton-X 1%; idrolisi alcalina 80°-90°C 15min).Conta in camere di sedimentazione (3-4 ore sedimentazione per cm di acqua, il doppio incaso di fissazione con formalina; Chorus e Bartram, 1999):Campi randomTransetti (vedi fig. slide successiva)Per la conta dei cianobatteri unicellulari, è meglio filtrare il campione su un filtro amembrana, con porosità fra 0.2 m, nel caso di picocianobatteri, e 1 m, nel caso diunicellulari più grandi. Il filtro, una volta asciugato a temperatura ambiente, su una cartaassorbente, viene appoggiato su un vetrino per microscopia, coperto con una goccia diolio per immersione e il coprioggetto, e analizzato con un microscopio dritto.

Toxic Cyanobacteria in Water: A guide to their public health consequences, monitoring and management Edited byIngrid Chorus and Jamie Bartram © 1999 WHO Chp. 12 DETERMINATION OF CYANOBACTERIA IN THE LABORATORYEsempi di conta su transetto e per campi random

coefficiente di variazioneNumero minimo di unità da contare, nel caso di una o due specie: 400Nel caso di una comunità più complessa, con più specie dominanti: 400-800 unità, chesignifica un errore del 7-10% sul totale di individui, 10-20% sulle due specie dominanti,20-60 su quelle subdominanti, il resto è trascurabile3002502001501005000 100 200 300 400 500 600 700 800 900N. unità contate

Indicazioni bibliografiche (libri e siti) utili per il riconoscimento e la conta•Manual on aquatic cyanobacteria. A photo guide and synopsis of their toxicology. ByGertrud Cronberg and Heléne Annadotter. 2006. ISSHA and IOC of UNESCO, Copenhagen.106 pp.Per acquistarlo: http://www.issha.org/Welcome-to-ISSHA/Web-shop/Manual-on-aquaticcyanobacteria2•Toxic cyanobacteria in water: A guide to their public health consequences, monitoring andmanagementEdited by Ingrid Chorus and Jamie Bartram 1999 WHOParticolarmente il capitolo 12. Scaricabile dal sito, anche come capitoli singolihttp://www.who.int/water_sanitation_health/resources/toxicyanbact/en/

Komárek J. & Hauer T. (2010): CyanoDB.cz - On-line database of cyanobacterial genera. -Word-wide electronic publication, Univ. of South Bohemia & Inst. of Botany AS CR,http://www.cyanodb.czFondamentale per la tassonomia. Informazioni sulla nomenclatura aggiornatahttp://galerie.sinicearasy.cz/galerie/Cyanobacteria/Ricca galleria fotograficahttp://www-cyanosite.bio.purdue.edu/index.htmlUn sito con molte foto e diversi link interessanti. Non è utile quello sui cianobatteritossicihttp://cyanobacteries.pagesperso-orange.fr/pages/Methodes/Description-m.htm(il resto del sito è in francese). Utile per la descrizione degli aspetti utili allaclassificazione; interessante una breve descrizione delle tecniche di isolamentoGreat Lakes Water Life Photo Gallery Blue-Green Algae Cyanophyta (NOAA)http://www.glerl.noaa.gov/seagrant/GLWL/Algae/Cyanophyta/Cyanophyta.htmlUn po’ di foto e qualche link utilehttp://protist.i.hosei.ac.jp/pdb/images/Prokaryotes/index.htmlBelle foto

http://www.keweenawalgae.mtu.edu/index.htmMolte foto e qualche filminohttp://www.greenwaterlab.com/photo_algal.htmUn po’ di fotohttp://www.phycology.cz/DCCA phycology group at the University of South Bohemia, České BudějoviceLink alla descrizione di un corso estivo per il riconoscimento dei cianobatteri -Komarekhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiPer ricerche biomolecolarihttp://genome.kazusa.or.jp/Alternativo o complementare al Blast