Biossegurança na manipulação de microrganismos patogênicos ao ...

Biossegurança na manipulação
de microrganismos patogênicos
ao homem e animais
Erna Geessien Kroon
Laboratório de Vírus
ICB – UFMG

Como evitar a
cadeia ?
Perigo
Acidente
Dano pessoal e material
Plantas, animais, homem,
meio ambiente

Biossegurança
A construção do conceito de
biossegurança, teve seu inicio na
década de 70, quando a comunidade
científica iniciou a discussão sobre os
impactos da engenharia genética na
sociedade.

Riscos – Agentes Infecciosos
Probabilidade de dano ou doença
Patogenicidade
Via de transmissão
Estabilidade do agente
Dose infectante
Concentração
Origem
Profilaxia
Determinação dos níveis de Biossegurança
para impedir o escape ao meio ambiente

Níveis de Biossegurança
NB-1
normas de biossegurança nível 1 =
normas para a manipulação de agentes
biológicos que representam baixo risco
individual e para a comunidade
(microrganismos que normalmente não
causam doença em seres humanos ou
animais de laboratório sadios).

NB-1
Equipamento de Segurança ( Barreira Primária)
Roupa protetora - avental e luvas
Podem ser necessários: proteção facial
proteção de ouvidos
Instalações (Barreiras Secundárias)
•Pia para lavar as mãos
•Superficies de fácil limpeza
•Bancadas
•Mobiliário robusto
•Janelas teladas

NB-1
Práticas microbiológicas
•Uso de pipetadores mecânicos (automáticos)
•Lavar as mãos
•Acesso restrito ou limitado quando estiver
trabalhando
•Proibição de comer, beber e fumar
•Minimizar gotas e aerossóis
•Descontaminar áreas de serviço diariamente
•Descontaminar resíduos
•Manutenção de programa de controle de
insetos & roedores

Níveis de Biossegurança
NB-2 = normas de biossegurança
nível 2 = normas para a manipulação
de agentes biológicos que
representam risco individual
moderado e risco limitado para a
comunidade (microrganismos
capazes de causar doenças em seres
humanos ou animais de laboratório
sem apresentar risco grave ao
trabalhador, comunidade ou
ambiente. Tratamento efetivo e
medidas preventivas disponíveis,
risco de disseminação pequeno).

Como em NB-1 +
Práticas Microbiológicas
•Luvas
•Pipetas automáticas
NB-2
•Cuidados com objetos cortantes
Equipamento ( Barreira Primária)
•Uso de capela classe II para agentes infecciosos
que formam aerossóis ou gotas
•grandes volumes
•altas concentrações
Instalação (Barreiras Secundárias)
•Autoclave
•Estação Lava Olho

NB-2 Práticas Especiais
•Descontaminar área de serviço
•Relatar liberações e acidentes
•Não ter animais no laboratório
•Programas de imunização
•Amostras de soro base
•Precauções com agulhas e objetos
cortantes
•Usar plásticos quando possível
•Não tocar em vidro cortado com as
mãos

Equipamento de Segurança
( Barreiras Primárias)
• Capelas biológicas [NB-2/3]
•Roupa protetora pessoal
•Luvas
•Gorros
•Pipetadores automáticos
•Proteção para olhos e face
•Proteção respiratória [NB-3]

Cabine Segurança Biológica
Classe II
Proteção para indíviduo e ambiente
Suprimento e exaustão de ar por filtro
HEPA
IIA entrada de 75 lfpm e recircula
70% do ar
IIB entrada de 100 lfpm e exaustão de
70% (B1) ou 100% ( B2)

HEPA - High Efficiency Particulate Air

Fluxo laminar

Níveis de Biossegurança
NB-3 = normas de biossegurança nível 3
= normas para a manipulação de
agentes biológicos que representam
elevado risco individual e risco limitado
para a comunidade (normas para o
trabalho com microrganismos que
geralmente causam doenças em seres
humanos e/ou animais, ou ainda
resultam em sérias consequências
econômicas, com risco pequeno de
disseminação por contatos individuais,
existindo tratamento antimicrobiano ou
antiparasitário).

NB-3

NB-3

Níveis de Biossegurança
NB-4 = normas de biossegurança nível 4
= normas para a manipulação de
agentes biológicos que representam
elevado risco individual e elevado risco
para a comunidade (normas para o
trabalho com microrganismos que
causam doenças graves ou são letais
para seres humanos e animais, de
transmissão fácil por contatos
individuais casuais).

Desinfecção e esterilização
Antisséptico- inativa microrganismos
ou inibe sua multiplicação. Aplicado
em superfície de organismos.
Desinfetante - inativa microrganismos
ou inibe sua multiplicação. Não
inativa os esporos. Aplicado em
superfícies inertes
Esterilização – destrói todos os
microrganismos

Germicidas químicos
Hipoclorito de sódio 1a 5 g/l cloro – 1:50 a
1:10
Formaldeído -5% carcinogênico
Glutaraldeído -20 g/l -2% (alcalino)
Compostos fenólicos
Amônio quaternário – cloreto benzalcônio
Alcool – etanol ou 2 -propanol
Iodo
Peróxido de hidrogenio – 3%

Esterilização
Calor Seco 160 0 C de 2 a 4 h
Calor úmido – 15 minutos a 121 0 C
25 minutos a 115 0 C
Deslocamento por gravidade
Pré-vacuo
Incineração

AUTOCLAVE

Principais falhas humanas
limpeza incorreta ou deficiente dos materiais;
utilização de invólucros inadequados para os artigos a
serem esterilizados;
confecção de pacotes muito grandes, pesados ou
apertados;
disposição inadequada dos pacotes na câmara;
abertura muito rápida da porta ao término da esterilização;
tempo de esterilização insuficiente;
utilização de pacotes que saíram úmidos da autoclave;
mistura de pacotes esterilizados e não esterilizados;
não identificação da data de esterilização e data-limite de
validade nos pacotes;
desconhecimento ou despreparo da equipe para usar o
equipamento.

Substituir o bico de Bunsen
Calor infra-vermelho 5-7 segundos
a 815.6 o C

Ou Bico de Bunsen protegido ou
alças descartáveis

Transporte
Embalagem primária e secundária a
prova de derramamento
Absorvente entre primário e
secundário
Cada embalagem primária é
embalada individualmente
Identificação depois da embalagem
secundária
Identificação de gelo seco

Transporte

Transporte de agente infeccioso

Recipientes para
recolher lixo

Depósito de vidro e
plástico

Recipientes para objetos
cortantes e vidro

Circulação de agentes infecciosos no
meio ambiente

Doenças Emergentes e re-
emergentes em humanos
75% de origem animal
Fatores predisponentes
Alterações demográficas
Produção animal intensiva
Turismo
Comércio
Guerras
Degradação Ambiental

Tecnologia do DNA recombinante
Métodos usados para construção e
caracterização de moléculas de DNA
recombinante.
DNA Recombinante : DNA quimera de 2
espécies diferentes, usualmente a
bacteriana, plasmidial ou viral contendo
um gene de outra espécie.
Engenharia Genética : Aplicação de
técnicas de DNA recombinante

Plasmídeos

Produção de ovelha transgênica
Produção de proteínas de uso
farmacêutico
Imunização de animais por meio da
expressão transgênica de antígenos
virais

Transferência de genes para seres humanos
In vivo
Transferência in vivo (seta em laraja)
Nesta estratégia os vetores contendo o gene
"terapêutico" são colocados diretamente no
tecido alvo.
Transferência ex vivo (seta em azul)
As células do paciente são removidas pelo
médico. No laboratório, o gene "terapêutico"
é adicionado às células que, em seguida,
retornam para o paciente geneticamente
corrigidas.
Ex-vivo
vetor
Gene
terapêutico
vetores Células humanas
Células alteradas

No Brasil - Lei de
Biossegurança
11.105, 24 de março de 2005 Art. 1°
Esta Lei estabelece normas de segurança e
mecanismos de fiscalização sobre a
construção, o cultivo, a produção, a
manipulação, o transporte, a transferência, a
importação, a exportação, o armazenamento, a
pesquisa, a comercialização, o consumo, a
liberação no meio ambiente e o descarte de
organismos geneticamente modificados – OGM
e seus derivados ...

Da classificação de risco do
OGM
Para a classificação de risco, deve-se também
considerar:
a) a possibilidade de recombinação de seqüências
inseridas no OGM, levando à reconstituição
completa e funcional de genomas de agentes
infecciosos;
b) outros processos que gerem um genoma
infecciosos;
c) genes que codifiquem substâncias tóxicas aos
homens, aos animais, aos vegetais ou que
causem efeitos adversos ao meio ambiente;
d) genes de resistência a antibióticos de amplo
uso clínico.

Resolução Normativa Nº 02
Os OGM serão classificados em quatro classes de
risco, adotando-se como critérios o potencial
patogênico dos organismos doador e receptor, a(s)
seqüência(s) nucleotídica(s) transferida(s), a
expressão desta(s) no organismo receptor, o OGM
resultante e seus efeitos adversos à saúde humana
e animal, aos vegetais e ao meio ambiente.
Para genes que codificam produtos nocivos para a
saúde humana e animal, aos vegetais e ao meio
ambiente, o vetor utilizado deverá ter capacidade
limitada para sobreviver fora do ambiente de
contenção.
Todo organismo geneticamente modificado deverá
possuir um marcador capaz de identificá-lo dentre
uma população da mesma espécie.

Resolução Normativa Nº 5, de 12 de
março de 2008
Dispõe sobre normas para liberação
comercial de Organismos
Geneticamente Modificados e seus
derivados.

SISTEMA DE BIOSSEGURANÇA DE OGM
Sócio-econômica e
interesse nacional
CNBS
CTNBio
OERF
Registro e Fiscalização
Normas de
Biossegurança e
avaliação de risco
CIBio
Manutenção da
Biossegurança

Resolução Normativa Nº 01, De 20 De Junho
De 2006
Art. 3º. A instituição que se dedique ao ensino, à
pesquisa científica, ao desenvolvimento tecnológico e à
produção industrial que utilize técnicas e métodos de
engenharia genética ou realize pesquisas com
Organismos Geneticamente Modificados (OGM) e seus
derivados deverá criar uma Comissão Interna de
Biossegurança (CIBio).
§ 1º. A instituição de que trata o caput deste artigo
indicará um técnico principal responsável para cada
projeto específico.
§ 2º. A instituição que pretender importar OGM e seus
derivados para uso em atividades de pesquisa deverá
instalar sua CIBio.
§ 3º. As instituições devem reconhecer o papel legal das
CIBios e sua autoridade e assegurar o suporte
necessário para o cumprimento de suas obrigações,
promover sua capacitação em biossegurança e
implementar suas recomendações, garantindo que elas
possam supervisionar as atividades com OGM e seus
derivados.

Resolução Normativa Nº 01, De 20 De Junho
De 2006
Art. 12. A instituição de direito público ou
privado que pretender realizar pesquisa em
laboratório, regime de contenção ou campo,
como parte do processo de obtenção de OGM
ou de avaliação da biossegurança de OGM, o
que engloba, no âmbito experimental, a
construção, o cultivo, a manipulação, o
transporte, a transferência, a importação, a
exportação, o armazenamento, a liberação no
meio ambiente e o descarte de OGM, deverá
requerer, junto à CTNBio, a emissão do
CQB.

Resolução Normativa Nº 01, De 20 De Junho
De 2006
Art. 13. As organizações públicas e privadas,
nacionais e estrangeiras, financiadoras ou
patrocinadoras de atividades ou ao ensino
com manipulação de organismos vivos, à
pesquisa científica e ao desenvolvimento
tecnológico e à produção industrial, devem
exigir a apresentação de CQB, sob pena de se
tornarem co-responsáveis pelos eventuais
efeitos decorrentes do descumprimento do
Decreto nº 5.591, de 22 de novembro de 2005.
Parágrafo único. A instituição que pretender
importar OGM e seus derivados para uso em
atividades de pesquisa deverá requerer CQB.

Resolução Normativa Nº 01,
de 20 de Junho de 2006
Art. 14. O CQB será emitido pela
CTNBio mediante requerimento da
CIBio da instituição interessada, o
qual deverá estar acompanhado da
documentação que consta do Anexo
desta Resolução Normativa.

Resolução Normativa Nº 01,
de 20 de Junho de 2006
V. para a emissão do CQB, a CTNBio
considerará a competência e
adequação do quadro funcional e a
infra-estrutura disponível para os
trabalhos com OGM e seus
derivados.

Resolução Normativa Nº 01,
de 20 de Junho de 2006
Art. 15. O CQB será emitido para uma
unidade operativa dentro de uma
instituição, podendo ser esta unidade
constituída por um ou mais laboratórios
ou outro tipo de infra-estrutura de
funcionamento.
Parágrafo único. A instituição, de
acordo com suas necessidades, poderá
requerer um ou mais CQBs.

Resolução Normativa Nº 01,
de 20 de Junho de 2006
Art. 16. Sempre que uma instituição
detentora de CQB pretender alterar
qualquer componente que possa
modificar as condições aprovadas na
emissão do CQB, sua CIBio deverá
requerer revisão ou extensão de seu
CQB junto à CTNBio.

Resolução Normativa Nº 01,
de 20 de Junho de 2006
Art. 19. A CTNBio poderá, conjuntamente com um ou
mais órgãos e entidades de registro e fiscalização,
realizar vistorias às instituições detentoras de CQB,
devendo, com base nos seus resultados, manter,
suspender ou cancelar o CQB da instituição vistoriada.
Parágrafo único. A critério da CTNBio e considerando as
classes de risco do OGM e seus derivados, a emissão,
revisão extensão, suspensão e cancelamento de CQB
poderá depender de vistoria às instalações.

Liberações comerciais – Vacinas
animais
Vacina Inativada Contra Circovirose Suína –
Ingelvac Circoflex
- Processo 01200.002191/2007-35
Vacina Inativada Contra Circovirose Suína –
Suvaxyn PCV2 One
Dose - Processo 01200.001967/2007-08
Vacina RECOMBITEK - vacina contra
cinomose, hepatite, adenovirose, parvovirose,
parainfluenza, coronavirose
e leptospirose caninas - Processo 01200.000292/98-92.
Vacina VAXXITEK MD/IBD - uma vacina viva
recombinante contra a doença de Marek
e doença de Gumboro
- Processo 01200.005090/2003-92.

Fluxo para OGM
Indicação CIBio
CQB
Aprovação CQB
Submissão Projeto
NB-1 – pode ser CIBio
NB-2 – CTNBio
Aprovação
Identificação das áreas no Laboratório
Trabalho seguindo as normas

Impacto da tecnologia DNA recombinante
Genética Humana
Mapeamento e clonagem de genes de doenças humanas
Diagnóstico de doenças genéticas
Determinação de paternidade
Terapia genética
Estudo dos genomas inteiros
Biotecnologia
Medicina
Indústria
Agricultura e Pecuária
Produção de plantas e animais transgênicos

CRONOLOGIA DAS INOVAÇÕES NO
DESENVOLVIMENTO
DE NOVAS DROGAS
*
Fonte: Lehman Brothers Pharmaceutical Research

Produção da insulina
humana em E.coli
Promotor bacteriano
Amp R
β gal
Peptídeos
da β gal
Primeira proteína recombinante
licenciada para uso terapêutico
Cadeia A
β gal
Cadeia A da
insulina
Transformação em E.coli
Cultura de células
Purificação da proteína
de fusão β gal-insulina
Cadeia A Cadeia B
Tratamento com BrCN
Purificação das cadeias A e B
β gal
Cadeia B
da insulina
Região aminoterminal
da cadeia B
madura
Cadeia B
Re-enovelamento
e oxidação das cisteínas
Ponte dissulfeto
Insulina ativa

Biotecnologia Verde
Plantas produzindo antígenos para vacinas:
Raiva
E. coli enterotoxigênica
Vibrio cholerae
Hepatite B
HIV
Malaria

Biotecnologia Branca - Industrial
desenvolvimento sustentado
2010 – 20% da indústria química
aplicará biotecnologia
300 bilhões de dólares
Hoje apenas 2%
Exemplo de integração interdisciplinar –
biocatálise, nanobiotecnologia,
bioprocessamento e bioinformática

Biotecnologia branca -exemplo
Remoção de óleos e graxas das
fibras de algodão – solução alcalina
quente
Uso de enzimas reduz em 60% de
emissão de resíduos na água, 20%
de redução de energia e 20% de
redução de custos .

Biotecnologia branca
Requer desenvolvimento de novas
enzimas, processos, produtos e
aplicações.
Metagenomica promete fornecer novas
moléculas
Mas ........
Sistemas de expressão são necessários
para que cada nova enzima e molécula
bioativa seja um sucesso econômico

O cupim é capaz de gerar 2 litros de
hidrogenio da fermentação de uma folha de
papel, sendo um dos reatores mais eficientes
do mundo.Tem mais de 200 espécies de
bactérias em seu intestino ajudando a explorar
os potenciais metabolitos da lignocelulose.

Metagenômica
Metagenômica é a estratégia para
isolar, sequenciar e caracterizar DNA
extraidos de amostras do meio
ambiente. Esses dados com as
assinaturas de RNA 16S ribosomal é
utilizado para determinar o perfil da
comunidade microbiana

Biotecnologia Azul
Tecnologias que envolvam aplicação
de métodos de biologia molecular a
organaismos marinhos e de água
doce

Antibióticos gerados de
diatomáceas marinhas

Oceanos
Oceanos ocupam 70 % da superfície
da terra
Produz metade do oxigênio da terra
Microrganismos constituem 90 % da
biomassa viva dos oceanos
Vírus matam 20% dessa biomassa
por dia
Reservatórios inexplorados de
diversidade genética da Terra

Oceanos
1 ml de água contem milhões de
partículas virais
A abundancia é 15 vezes maior que
de bactérias e archaebactérias
55% da biomassa procariota

Biotecnologia Vermelha
Envolve uso de biotecnologia para
processos biomédicos

Produção de ovelha transgênica
Produção de proteínas de uso
farmacêutico
Imunização de animais por meio da
expressão transgênica de antígenos
virais

Biotecnologia Vermelha
Finalidades
Médicas

Fonte: 2008 Survey, Biotechnology, New Medicines in Development, PhRMA

Fonte: 2008 Survey, Biotechnology, New Medicines in Development, PhRMA

Obrigada!