CCL3 - Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFMG

3.7.2. Avaliação da Resposta Humoral
Os níveis de IgE total no soro dos camundongos de diferentes grupos experimentais foi
estimado pela técnica de ELISA, utilizando um kit comercialmente disponível e metodologia
recomendada pelo fabricante (Mouse IgE ELISA Quantitation Kit, Bethyl Laboratories Inc.,
EUA). Placas de 96 poços (MaxiSorp ® , NUNC, EUA) foram sensibilizadas com 100µl/poço
de anticorpo de captura diluído em “coating buffer” durante 1h em temperatura ambiente. Em
seguida, as placas foram lavadas três vezes com solução de lavagem (Tris 50mM, NaCl
0,14M, Tween 20 0,05%, pH 8.0) o e o bloqueio foi realizado colocando-se 200µl de solução
de bloqueio (Tris 50mM, NaCl 0,14M, Albumina de soro bovino (BSA) 1%, pH 8.0) por 30
min também em temperatura ambiente. Após esse tempo, as placas foram novamente lavadas
três vezes com solução de lavagem e foi adicionado 100µl de cada amostra diluída em tampão
Tris-NaCl (Tris 50mM, NaCl 0,14M, pH 8.0) por poço na diluição de 1:100. Após 60 min em
temperatura ambiente, as placas foram lavadas três vezes com solução de lavagem e foi
acrescentado 100µl anticorpo anti-IgE com peroxidase (HRP) em cada poço da placa. Após
uma hora, as placas foram lavadas cinco vezes com solução de lavagem e foi aplicado 100µl
do cromógeno ortofenilenodiamina (OPD) e substrato 100µl H2O2 em cada poço. Após 30
min em temperatura ambiente, a reação foi interrompida pela adição de 100µl de H2SO4 2M
em cada poço. A leitura foi realizada em espectrofotômetro no comprimento de onda de
450nm.
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