Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 1

Entrevista 

Nova tecnologia 

no combate ao 

“mal da vaca louca” 

mal da vaca louca, conhecido cientificamente como 

BSE (sigla em inglês para encefalopatia 

espongiforme bovina), afeta o cérebro do animal, 

provocando descontrole motor. As células morrem 

e o cérebro fica com a aparência de uma esponja. 

A vaca passa a agir como se estivesse enlouquecida, o que explica 

o fato de ser conhecida popularmente como mal da vaca louca. 

Não há tratamento conhecido para essa doença, que já foi 

detectada em cerca de 20 países da Europa, atingindo mais de 180 

mil cabeças de gado. Ao contrário da maior parte das enfermidades, 

o mal da vaca louca não é transmitido por fungos, vírus ou 

bactérias, e sim por proteínas específicas denominadas prions. 

Essa doença nunca foi detectada no Brasil e a sua entrada, certamente, 

resultaria em um desastre para o país, que tem na pecuária um de seus 

principais alicerces econômicos, representando ganhos de mais de R$ 55 

bilhões por ano. Sem falar que o rebanho brasileiro é hoje maior do que a 

soma dos rebanhos da Argentina, Paraguai e Uruguai. Diante da necessidade 

urgente de conter a sua disseminação, a Empresa Brasileira de Pesquisa 

Agropecuária (Embrapa), por meio de uma de suas 40 unidades de pesquisa, 

a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, localizada em Brasília, DF, 

desenvolveu um método para detecção de proteínas de origem animal em 

rações destinadas a mamíferos, especialmente ruminantes, que tem como 

objetivo monitorar a qualidade do alimento e evitar a transmissão de doenças 

causadas por substâncias infecciosas, tais como prions transmissores de 

encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSE), principalmente o mal da 

vaca louca. 

O método, desenvolvido pela equipe do pesquisador Carlos Bloch Jr há 

cerca de três anos, cuja patente foi depositada pela Embrapa em 2002, utiliza 

aparelhos de última geração denominados espectrômetros de massa, para a 

detecção das proteínas. Para se ter uma idéia do grau de modernidade e de 

eficiência desses aparelhos, eles possuem tecnologia comparável à que está 

sendo usada pelos robôs Spirit e Opportunity nas pesquisas que estão sendo 

feitas pela NASA no Planeta Marte, para a detecção de outros tipos de 

moléculas. De acordo com o pesquisador, esses aparelhos são hipersensíveis, 

com um limite de detecção altíssimo, de uma parte por milhão, ou seja, se 

fizermos uma comparação com uma balança na qual fossem colocadas um 

milhão de pessoas, o espectrômetro de massa seria capaz de detectar a ausência 

de apenas uma delas. 

2 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 

Metodologia detecta proteínas na ração e evita a contaminação de animais 

Entrevista concedida a 

Maria Fernanda Diniz

Para falar sobre essa metodologia 

e a sua importância para a pesquisa 

agropecuária brasileira, a revista 

Biotecnologia, Ciência & Desenvolvimento 

entrevistou o pesquisador 

da Embrapa Recursos Genéticos 

e Biotecnologia, Carlos Bloch Jr. Durante 

a entrevista, ele falou sobre o 

método desenvolvido por sua equipe 

e das vantagens que representa 

sobre os outros métodos utilizados 

até o momento, além dos rumos 

dessas pesquisas para o futuro. 

BC&D – Em que consiste o 

método utilizado pela Embrapa 

Recursos Genéticos e Biotecnologia 

e há quanto tempo foi desenvolvido? 

Bloch – O método começou a 

ser desenvolvido pela nossa equipe 

há cerca de três anos, foi aperfeiçoado 

ao longo de 2001 e em 2002 foi 

depositada a patente. O objetivo 

desse método é avaliar a qualidade 

das rações destinadas a ruminantes 

e, assim, evitar a transmissão de 

TSE’s (encefalopatias espongiformes 

transmissíveis), especialmente a 

encefalopatia espongiforme bovina 

(BSE), pela detecção de proteínas de 

origem animal, em particular daquelas 

provenientes de restos de carcaças 

de animais abatidos que pudessem 

ser misturados à ração. O 

desenvolvimento dessa metodologia 

compreende três etapas: a primeira e 

mais trabalhosa é a extração do material 

protéico para separá-lo, principalmente 

de lipídeos e dos carboidratos. 

Em seguida, cada amostra 

pode ser analisada em dois tipos de 

espectrômetros de massa simultaneamente, 

o primeiro analisa em poucos 

minutos a presença de moléculas 

de proteína animal, como a mioglobina, 

cadeias alfa e beta da hemoglobina 

e proteínas plasmáticas, para 

dizer se existe ou não algum indício 

de contaminação. O segundo analisa 

e quantifica os seus fragmentos 

(peptídeos) derivados de moléculas 

inteiras de contaminantes, que podem 

se formar a partir do ataque de 

microrganismos e/ou da ação mecâ- 

nica durante o processo de fabricação. 

A terceira etapa é a interpretação 

dos dados para determinar os 

níveis de contaminação e a sua origem, 

ou seja, se as moléculas contaminantes 

encontradas eram provenientes 

de bovinos, suínos, eqüinos, 

ovinos, aves, peixes, etc. 

“O O grande grande avanço avanço propiciado 

propiciado 

por por essa essa metodologia metodologia é é o o fato 

fato 

de de poder poder detectar detectar as as proteínas 

proteínas 

inteiras inteiras ou ou fragmentos fragmentos delas 

delas 

com com uma uma precisão precisão de de uma 

uma 

parte parte por por milhão milhão (PPM).” 

(PPM).” 

BC&D – Qual é a vantagem da 

espectrometria de massa sobre 

os outros métodos utilizados para 

o controle dessas doenças? 

Bloch – A espectrometria de 

massa é um método muito mais sensível, 

rápido e seguro para se diagnosticar 

a presença desse tipo de 

molécula. Não é à toa que você 

encontra espectrômetros de massa 

espalhados por locais e em atividades 

que até bem pouco tempo atrás 

não se poderia imaginar. Só para 

citar alguns exemplos, encontram-se 

hoje espectrômetros de massa nos 

aeroportos, nos correios, nos esportes, 

nos tanques e aviões de guerra, 

sem falar nas missões espaciais. São 

esses equipamentos que produzem, 

com mais rapidez e eficiência, respostas 

sobre a presença ou não de 

explosivos, material de guerra química 

ou biológica. Atualmente, são 

utilizados três métodos para monitorar 

a qualidade dos alimentos dos ruminantes: 

o primeiro é o de microscopia 

ótica, que se baseia na procura de 

fragmentos de pele, ossos etc. na 

ração; o segundo é o método ELISA, 

que utiliza anticorpos para detectar 

as proteínas alvo; e o terceiro e mais 

novo é o método PCR, que detecta o 

DNA das proteínas por meio de um 

primer (um tipo de gene marcador). 

Todos esses métodos apresentam li- 

mitações da mesma natureza, ou seja, 

não detectam diretamente a presença 

de proteína. O primeiro, e mais 

utilizado ainda hoje na União Européia 

é também o mais falho de todos, 

já que a microscopia ótica não permite 

a detecção de proteínas. O método 

ELISA tem como fator limitante o 

fato de utilizar anticorpos específicos 

para determinadas classes de proteínas, 

o que impede a identificação de 

outros grupos; e o terceiro, o de PCR, 

esbarra no problema do DNA ser 

fragmentado depois do processo de 

industrialização, tornando difícil a 

sua amplificação para a análise. Logo, 

a espectrometria de massa aparece 

como o método mais preciso para a 

detecção direta e não indireta de 

proteínas. O grande avanço propiciado 

por essa metodologia é o fato de 

poder detectar as proteínas inteiras 

ou fragmentos delas com uma precisão 

de uma parte por milhão (PPM). 

O que isso significa? Se fizermos uma 

analogia com uma balança na qual 

são colocadas um milhão de pessoas, 

o espectrômetro é capaz de detectar 

a ausência de apenas uma delas. E os 

níveis de detecção estão sendo melhorados 

cada vez mais. Os últimos 

espectrômetros lançados já têm poder 

de menos de uma parte por 

milhão, ou seja, menos de uma pessoa, 

se continuarmos a seguir aquela 

analogia, e tudo isso com muita rapidez 

e eficiência automatizáveis. A 

parte mais demorada desse processo 

é a primeira etapa, na qual é feita a 

extração do material a ser analisado. 

Essa etapa pode demorar de 36 a 72 

horas, mas é comum a todos os 

outros métodos. Em suma, ao que 

tudo indica, essa metodologia é o 

que existe hoje de mais moderno e 

seguro para monitorar a qualidade 

dos alimentos oferecidos aos ruminantes 

e, logo, controlar a disseminação 

das encefalopatias espongiformes 

transmissíveis, ou TSE’s, como 

são conhecidas. 

BC&D – As TSE’ s , entre as 

quais a mais nociva é a BSE 

(encefalopatia espongiforme bovina), 

ou mal da vaca louca, re- 


presentam uma ameaça não apenas 

para os animais como também 

para os seres humanos. 

Como se dá a contaminação e 

qual o tratamento existente hoje 

para essas doenças? 

Bloch – As encefalopatias espongiformes 

transmissíveis, ou TSE’s, 

são doenças progressivas e letais que 

afetam o sistema nervoso central e se 

caracterizam por alterações anatômicas 

localizadas no cérebro. Essas alterações 

são um tipo de lesão histológica, 

constituídas de vacúolos e depósitos 

protéicos. As TSE’s podem resultar de 

infecções espontâneas, transmissão 

hereditária ou exposição a materiais 

contaminados. As TSE’s incluem: a 

BSE, conhecida popularmente como 

“mal da vaca louca”; a scrapie, ou 

paraplexia enzoótica dos ovinos, que 

afeta ovinos e caprinos em muitos 

países há mais de 200 anos; e a 

doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) 

que afeta seres humanos, principalmente 

com mais de 50 anos de idade. 

Essa doença tem distribuição mundial, 

com incidência anual de aproximadamente 

um caso por milhão e ocorre 

de três formas: esporádica (responsável 

por 85 a 90% dos casos). familiar 

(associada a mutações genéticas, representa 

5 a 10% dos casos) e 

iatrogênica, ou seja, por contaminação, 

(responsável por menos de 5% 

dos casos). Logo, em humanos, a 

chance de desenvolver a doença por 

contaminação é de menos de 5%. Nos 

outros 95% dos casos, a doença se 

desenvolve naturalmente. Em ovinos 

e bovinos, os principais sintomas são 

agressividade e falta de coordenação 

motora. Em humanos, os principais 

sintomas são: mioclonia – contração 

muscular brusca e breve – e demência. 

Não existe tratamento conhecido 

para a BSE, portanto, a única forma de 

combatê-la é evitando a contaminação. 

Cerca de 125 casos foram 

registrados no mundo em humanos, 

segundo os Centros de Controle e 

Prevenção de Doenças dos Estados 

Unidos, e na Europa, aproximadamente 

100 pessoas morreram em função 

dessa doença. Mas, para os ani- 

mais, a situação é bem mais séria, 

visto que já foi detectada em mais de 

20 países da Europa, atingindo mais 

de 180 mil cabeças de gado. 

BC&D – Então a BSE tem se 

disseminado de forma rápida, especialmente 

na Europa. Como se 

dá a contaminação? 

Bloch – A natureza do agente 

infeccioso da BSE, assim como das 

outras TSE’s, é ainda motivo de 

controvérsia. Acredita-se que as 

partículas infecciosas responsáveis 

pela BSE são predominantemente 

proteínas específicas denominadas 

prions, que são compostas, em quase 

a sua totalidade, de uma 

glicoproteína de conformação anormal, 

que se prende à superfície 

externa das células. Em outras 

palavras, a teoria mais aceita hoje 

afirma que o agente infeccioso, 

prion, é derivado de uma proteína 

da membrana celular, que sofre 

uma mutação e forma um tipo insolúvel 

e patogênico de prion. Ainda 

hoje não está totalmente esclarecido 

o mecanismo pelo qual essa 

proteína anormal produz as alterações 

patológicas no cérebro dos 

animais ou indivíduos afetados. 

BC&D – Desde que foi diagnosticada 

pela primeira vez no 

mundo, como se deu a evolução 

da BSE ao longo dos anos? 

Bloch – Os primeiros casos de 

BSE foram diagnosticados no Reino 

Unido, em 1986. No final de 1987, 

o Departamento de Epidemiologia 

do Laboratório Veterinário Central 

daquele país concluiu que a disseminação 

da doença entre os bovinos 

ocorria mediante o consumo de 

farinha de carne e ossos, obtida a 

partir de carcaças de animais contaminados 

e incorporada à ração oferecida 

aos bovinos. Essa teoria foi 

plenamente confirmada, já que a 

proibição do uso daquele produto 

na alimentação de ruminantes teve 

efeito claro, resultando em redução 

significativa no aparecimento de 


novos casos de BSE. Foram levantadas 

outras possibilidades de contaminação, 

como por exemplo, a 

transmissão vertical da vaca para o 

bezerro. Mas, o que se sabe de fato 

é que a epidemia do “mal da vaca 

louca” não teria acontecido se não 

houvesse disseminação por meio 

da farinha de carne e ossos. Diante 

disso, pode-se dizer que se um 

bovino contaminado for introduzido 

num país ou região onde não 

existe BSE, como é o caso do Brasil, 

só poderá ocorrer uma epidemia se 

a carcaça desse animal for utilizada 

para produzir farinha destinada à 

alimentação de ruminantes porque 

isso gera um sistema de disseminação 

e amplificação do agente infeccioso 

na população animal. Após 

o início da epidemia no Reino Unido, 

surgiu a teoria de que os primeiros 

casos de BSE teriam resultado 

da utilização de carcaças de ovinos 

contaminados com scrapie na alimentação 

de bovinos e que uma 

mudança no processo industrial de 

produção de farinha de carne e 

ossos teria diminuído a probabilidade 

de inativação do agente infeccioso. 

Entretanto, foram surgindo 

evidências de que a BSE e a scrapie 

são doenças diferentes, embora pertencentes 

ao mesmo grupo. Uma 

das evidências foi obtida a partir da 

inoculação experimental de scrapie 

em bovinos, que resultou em uma 

doença diferente da BSE. Além 

disso, a BSE mantém as suas características 

durante toda a epidemia, 

mesmo quando é transmitida a outra 

espécie animal, ao contrário da 

scrapie. Sem falar que essa doença 

não pode contaminar seres humanos, 

como é o caso da BSE. Na 

verdade, o ponto em comum entre 

as TSE’s é a elevada resistência a 

tratamentos físico-químicos de esterilização. 

BC&D – Mas há indícios de 

que a doença possa ter surgido 

antes de 1986, não é verdade? 

Bloch – Alguns relatórios técnicos 

mais recentes indicam que os

casos de BSE diagnosticados a partir 

de 1986 não teriam sido os primeiros 

casos da doença que, provavelmente, 

já existia no Reino Unido 

anteriormente. Alguns veterinários 

britânicos alegam ter visto casos 

semelhantes antes de 1986 que, na 

época, foram diagnosticados como 

doenças metabólicas comuns em 

vacas de alta produção. Mas não há 

comprovação científica sobre essas 

evidências. 

BC&D – Então a causa mais 

provável para a transmissão da 

BSE em bovinos está mesmo na 

mudança no processo de fabricação 

de farinha de carne e ossos, 

que tornou possível a reciclagem 

do agente infeccioso? 

Bloch – Essa, sem dúvida, é a 

causa mais provável para a transmissão 

dessa doença, o que tem representado 

um prejuízo para os produtores 

em escala mundial, já que as 

rações à base de farinha de osso, 

sangue e carne vinham sendo largamente 

recomendadas e usadas na 

alimentação de animais, como uma 

fonte de proteína, devido à presença 

de aminoácidos essenciais, minerais 

e vitamina B12. Além disso, essa 

forma de aproveitamento é uma maneira 

eficaz de reciclar os subprodutos 

proveniente do abate, evitando custos 

econômicos e ambientais adicionais. 

No entanto, como os materiais 

à base de osso e carnes de animais 

mamíferos presentes em dietas para 

ruminantes foram considerados a provável 

causa da BSE em bovinos, o seu 

uso foi proibido na Comunidade Européia, 

nos EUA e também no Brasil. 

Diante das vantagens desse tipo de 

alimentação para os bovinos, várias 

têm sido as tentativas de cessar a 

transmissão das TSE’s, em particular 

da BSE. Alguns trabalhos têm sido 

direcionados para a inativação das 

partículas infecciosas, favorecendo, 

assim, o aproveitamento dos resíduos 

do abate. Outros têm visado eliminar 

a possibilidade da transmissão 

pela detecção de proteínas animais 

nas rações e a sua rejeição no caso de 

teste positivo. Ambas as formas fazem 

uso de procedimentos analíticos 

para garantir a ausência de agentes 

causadores das TSE’s na alimentação 

animal. Dentre esses procedimentos, 

estão os que eu já descrevi na questão 

anterior, ou seja, a microscopia 

ótica, o método ELISA e as análises 

de DNA por PCR. A complexidade e 

especificidade das biomoléculas têm 

dificultado em muito a aplicação das 

técnicas freqüentemente utilizadas 

para a identificação e caracterização 

de compostos inorgânicos e orgânicos 

nas rações. Esse fato vem motivando 

o desenvolvimento de técnicas 

analíticas cada vez mais sofisticadas 

e eficientes, com ênfase na precisão 

requerida pela moderna biotecnologia. 

Dessa forma, chegamos hoje 

aos espectrômetros de massa que, 

como eu também já mencionei antes, 

são o que há de mais moderno e 

preciso para a detecção de proteínas 

nas rações de ruminantes. 

BC&D – E quais são os passos 

daqui pra frente, já existe alguma 

parceria para repasse dessa 

tecnologia à iniciativa privada? 

Existe alguma demanda do governo 

brasileiro para que essa 

tecnologia se torne obrigatória, 

de modo a evitar a entrada do 

“mal da vaca louca” no Brasil? 

Bloch – Creio firmemente que 

antes de nos preocuparmos com 

qualquer tipo de avanço tecnológico 

e sua comercialização, como é o 

caso desse método, devemos vê-lo 

como uma ferramenta de trabalho. 

Ela só poderá servir ao seu propósito 

e alcançar sua plenitude de uso 

se houver a visão clara do objetivo 

final que queremos atingir. Ou seja, 

se o nosso objetivo final for o lucro 

imediato, puro e simples para satisfazer 

acionistas, balanças de pagamentos 

e manutenção dos mesmos 

paradigmas de produção vigentes 

há décadas, essa tecnologia terá um 

impacto modesto e servirá somente 

nos momentos de crise, como o que 

estamos vivendo hoje, caso contrário 

cairá no esquecimento, como de 

fato ela se encontrava, até o 

surgimento da BSE nos Estados Unidos. 

Contudo, se tomarmos a decisão 

de priorizar a vida, a qualidade 

e a sanidade dos alimentos que 

chegam às mesas dessa geração e 

das próximas, essa tecnologia com 

certeza será de grande utilidade, 

não somente no processo de identificação 

de contaminantes intencionais 

ou acidentais, mas poderá 

didaticamente demonstrar internamente 

e para o exterior que esse 

país possui tecnologia de alto nível 

para responder a problemas mundiais 

imediatos, bem como para 

oferecer alternativas mais inteligentes 

e com visão de perspectiva para 

um setor tão importante como o do 

agronegócio. No que diz respeito 

aos aspectos legais dessa tecnologia, 

ela já está patenteada e pronta para 

ser licenciada à iniciativa privada. 

Estamos aguardando propostas de 

empresas interessadas em utilizála. 

Quanto ao governo brasileiro, a 

Embrapa e o Ministério da Agricultura, 

Pecuária e Abastecimento 

(MAPA) estão em entendimento 

para discutir a melhor forma de 

implementá-la e, assim, dar um grande 

passo para reduzir ainda mais a 

possibilidade da presença de proteínas 

animais nas rações. Provavelmente, 

será por meio de uma portaria 

que obrigue as empresas a testarem 

seus produtos. A nossa equipe 

da Embrapa Recursos Genéticos e 

Biotecnologia tem plenas condições 

de atender a essas demandas. Serão 

necessárias apenas algumas 

adaptações nos laboratórios de espectrometria 

de massa, de forma a 

torná-los mais aptos a prestar serviços 

– visto que hoje são laboratórios 

de pesquisa – além da contratação 

de pessoal especializado. Nós já 

atendemos a uma demanda do 

MAPA para análise de 800 amostras 

e, dessas, grande parte continha 

proteínas animais. No final do mês 

de fevereiro, teremos uma nova 

reunião com a equipe do Ministério 

para fechar essa questão. 

___________________________________ 

O e-mail do Professor Carlos Bloch Júnior é: 

cbloch@cenargen.embrapa.br 


BIOTECNOLOGIA Ciência & Desenvolvimento 

KL3 Publicações 

Fundador 

Dr. Henrique da Silva Castro 

Direção Geral e Edição 

Ana Lúcia de Almeida 

E-mail 

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Fax: (061) 468-3214 

Os artigos assinados são de 

inteira responsabilidade 

de seus autores. 

ISSN 1414-4522 

Carta ao Leitor 

Prezados Leitores, 

Já está bem divulgado o problema do “mal da vaca 

louca” no mundo todo, principalmente sobre os surtos 

que aconteceram na Europa e dizimaram milhares de 

cabeças de gado, causando imenso prejuízo. 

Aqui no Brasil, felizmente até agora, fomos poupados, 

mas sabemos também que pode ser apenas uma 

questão de tempo. Por isso mesmo o apoio à pesquisa 

dessa importante doença é primordial para a pecuária 

no país. 

Para falar sobre o assunto convidamos o Dr. Carlos 

Bloch Jr., que desenvolve, na Embrapa-Cenargen, um 

método de combate à doença. Confira a entrevista. 

Dr. Henrique da Silva Castro 

Nota: Todas as edições da Revista Biotecnologia Ciência & 

Desenvolvimento estão sendo indexadas para o AGRIS 

(International Information System for the Agricultural Sciences 

and Technology) da FAO e para a AGROBASE (Base de Dados 

da Agricultura Brasileira).

Conselho Científico 

Dr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento Vegetal 

Dr. Henrique da Silva Castro - Saúde; 

Dr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia; 

Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal; 

Dr. Naftale Katz - Saúde; 

Dr. Pedro Jurberg - Ciências; 

Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas; 

Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos; 

Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental. 

Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi 

Dr. Luís Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia 

Fundação Dalmo Catauli Giacometti 

Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética; 

Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico; 

Dra. Marisa de Goes - Recursos Genéticos 

Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN 

Dr. José Roberto Rogero 

Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotec 

Dr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPA 

Dr. Diógenes Santiago Santos - UFRGS 

Dr. José Luiz Lima Filho - UFPE 

Dra. Elba P. S. Bon - UFRJ 

Entrevista 

Entrevista 

Colaboraram nesta edição: 

Adriano Luiz Tonetti, Alessandra Pereira Fávero, Alexandre 

Patto Kanegae, Ana Paula Pacheco Clemente, Anderson 

Kurunczi Domingos, Antonio Costa de Oliveira, Bruno 

Coraucci Filho, Carla M. Y. Lemos, Celso Omoto, David 

John Bertioli, Eleni Gomes, Eliane Cristina Gruszka 

Vendruscolo, Elza Fernandes de Araújo, Enio Luiz Pedrotti, 

Erica Fuchs, Everaldo Gonçalves de Barros, Fábio Rueda 

Faucz, Fernando Irajá Félix de Carvalho, Francismar Corrêa 

Marcelino, Gabrielle Mouco, Gaspar Malone, Gláucia Maria 

Pastore, Helena Maria Wilhelm, Jorge Fernando Pereira, 

José Fernandes Barbosa Neto, Juliana Oliveira Lima, Karina 

Proite, Karla Thomas Kucek, Luiz Pereira Ramos, Maira 

Jardim Bernardino, Marcio Antônio Silva Pimenta, Márcio 

de Carvalho Moretzsohn, Márcio Nitschke, Marcos Barros 

de Medeiros, Maria Fernanda Diniz, Maria José Araújo 

Wanderley, Marisa Vieira de Queiroz, Marta Fonseca 

Martins, Maurílio Alves Moreira, Melânia Lopes Cornélio, 

Monita Fiori de Abreu, Patrícia Messenberg Guimarães, 

Paulo Alves Wanderley, Paulo Dejalma Zimmer, Paulo 

Henrique Machniewicz, Pilar Ximena Lizarazo Medina, 

Ricardo Antonio Polanczyk, Roberto da Silva, Rodrigo 

Barros Rocha, Ronaldo Stefanutti, Rubens Onofre Nodari, 

Samuel Martinelli, Sérgio Batista Alves, Soraya Cristina 

Leal-Bertioli, Valdir Marcos Stefenon. 

Nova tecnologia no combate ao “mal da vaca louca” 2 

Pesquisa esquisa 

Silenciamento Gênico e Transgênicos 8 

Detecção de resíduos de transgênicos em grãos e produtos derivados 14 

Bacillus thuringiensis no Manejo Integrado de Pragas 18 

Biodiesel 28 

Biofertilizantes Líquidos 38 

Iniciativas Genômicas 45 

Associação de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 53 

Biosurfatantes a partir de resíduos agroindustriais 63 

Controle de qualidade de ervas medicinais 68 

Nitrato Redutase em Fungos Filamentosos 74 

Glucoamilase:Estrutura e termoestabilização 86 

Marcadores Moleculares no Melhoramento Genético de Araucária 95 

Micropropagação de Macieira 100 

Método Alternativo de Tratamento de Esgotos 109 

Amendoim Selvagem 116 

Bioética 120

Pesquisa 

Eliane Cristina Gruszka Vendruscolo 

MSc, Melhoramento Genético Vegetal. 

Professora de Genética/UFPR - Campus Palotina 

vendruscolo.1@osu.edu; 

egvendru@vn.com.br 

Silenciamento Gênico 

e Transgênicos 

Introdução 

A estrutura genômica de plantas 

pode ser alterada por transformação 

genética durante o processo 

de transferência gênica utilizandose 

Agrobacterium tumefaciens, biobalística 

e outras técnicas que integram 

parte de um genoma (gene 

exógeno) em um outro genoma (no 

caso, vegetal). A transgenia tem sido 

usada com o propósito de integrar 

seqüências gênicas de interesse com 

conseqüente alteração da expressão 

gênica. A expressão desse transgene 

nem sempre pode ser predita. Desse 

modo, o estudo das conseqüências 

dessas transformações tem-se tornado 

relevante nos últimos anos 

(VOINNET & BAULCOMBE, 1997; 

WATERHOUSE et al., 1998; 

VAUCHERET et al., 2001). 

Vários termos podem ser encontrados 

na literatura para descrever 

o silenciamento gênico. Esses 

incluem cossupressão, RNAi (RNA 

de interferência) e quelling (interrupção 

da seqüência gênica) em 

leveduras. A cossupressão seria o 

termo aplicado ao silenciamento 

gênico do gene endógeno pela ação 

do RNA do transgene. Aqui ambos 

os genes, exógeno e endógeno, são 

coordenadamente suprimidos. 

Quelling é um termo de cossupressão 

usado em Neurospora crassa, e 

o RNAi é aplicado ao silenciamento 

gênico em animais, quando esse 

acontece pela ação de uma fita dupla 

de RNA, causando a não transcrição 

nem a tradução de determinado 

gene(BAULCOMBE, 2002). 


Importância, mecanismos e modelos do silenciamento gênico 

Em vários experimentos, foram 

obtidas evidências do silenciamento 

gênico em plantas, que levaram 

à conclusão que, ao aumentar 

o número de cópias de um gene de 

interesse em particular, poderia reduzir 

a sua expressão (MAZTKE & 

MAZTKE, 1995; DEPICKER & VAN 

MONTAGU, 1997). WEI et al. (2001) 

comentam sobre uma correlação 

positiva entre o número de insertos 

com pobre expressão gênica. Vários 

transgenes inseridos podem ser 

silenciados após uma (relativamente) 

longa fase de expressão e podem, 

às vezes, silenciar a expressão 

(parcialmente) de genes homólogos 

localizados em posições 

ectópicas no genoma (FAGARD & 

VAUCHERET, 2000). Em alguns casos, 

o silenciamento gênico de 

transgenes pode desencadear a resistência 

a vírus e, em outros casos, 

a infecção viral pode silenciar a 

expressão de genes endógenos nas 

plantas (BAULCOMBE, 1996). 

Mecanismos de 

silenciamento gênico 

O silenciamento gênico, como 

processo, corresponde a uma interação 

entre seqüências homólogas de 

DNA ou RNA. Até hoje, sabe-se que 

o RNA está envolvido em 2 tipos de 

silenciamento gênico dependente de 

homologia (SGDH): 1) SGPTS (silenciamento 

gênico pós-transcricional), 

onde a degradação de RNAs 

homólogos no citoplasma levaria a 

não tradução e 2) SGT (silenciamento 

gênico transcricional), que está

elacionado com o bloqueio na transcrição 

induzido por um RNA antisenso 

derivado do próprio DNA, 

que promoveria uma metilação na 

região promotora, a nível nuclear, e 

a homologia para a metilação dirigida 

ocorreria nas regiões transcritas 

(WASSENEGGER, 2000; FAGARD & 

VAUCHERET, 2000; VAUCHERET et 

al., 2001). 

Embora os genes que interagem 

podem estar muito próximos no 

mesmo cromossomo e iniciar a 

inativação em cis, muitos sistemas 

estudados envolvem a interação de 

seqüências localizadas em diferentes 

cromossomos ou a transinativação. 

Ambos os tipos de SGDH 

estão freqüentemente associados 

com metilações de novo em seqüências-específicas 

do DNA nuclear 

(KOOTER et al., 1999; 

WASSENEGGER, 2000). 

O mecanismo de silenciamento 

gênico transcricional (SGT) estaria associado 

a metilações de novo na região 

do promotor do transgene, que poderiam 

ser meioticamente herdáveis 

(KOOTER et al., 1999). Essa metilação 

seria induzida por pareamento de regiões 

homólogas de DNA ou ainda DNA- 

RNA. Esse pareamento constitui o passo 

inicial para a iniciação do SGPT 

(WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998). 

O pareamento induziria a uma 

metilação dentro da região codificante 

do transgene, que levaria a uma prematura 

interrupção de sua transcrição. 

Como resultado dessa síntese irregular 

de mRNA, um RNA aberrante (abRNA) 

seria formado (WASSENEGGER & 

PÉLISSIER, 1998; HAMILTON & 

BAULCOMBE, 1999; MATZKE et al., 

2001). 

Estudos recentes têm encontrado 

presença de um RNA de, aproximadamente, 

25 nt em sense e 

antisense, com homologia ao RNA 

alvo, em plantas que apresentam 

cossupressão e resistência a vírus, 

mas que não são encontradas em 

plantas usadas como controle. Tal 

fato contribui para evidenciar que 

existem diferentes formas de silenciamento, 

porém todas agindo num 

mesmo mecanismo (HAMILTON & 

BAULCOMBE, 1999). 

A resistência a vírus seria 

explicada pelo fato de estes abRNA 

serem o molde para que as RNA 

polimerases dependentes de RNA 

(RPdR) do hospedeiro (vegetal) possam 

sintetizar pequenas moléculas 

de RNA anti-sense (METTE et al., 

1999; MATZKE et al., 2001; 

MLOTSHWA et al., 2002). Esses pequenos 

RNA antisense agiriam em 

trans, em seqüências de RNA complementares 

(RNA viral), levando à 

formação de RNA fita dupla (dfRNA). 

Um complexo de RNAses específicas 

para esses dfRNAs (conhecidas 

como Complexo DICER ou RNAses 

tipo III, específicas para as dfRNAs), 

levariam a degradação dessas moléculas 

híbridas e, em conseqüência, 

tornariam a planta resistente ao vírus 

(METZLAFF et al., 1997; 

CERUTTI, 2003). 

No caso das integrações múltiplas, 

como as cópias do transgene, o 

silenciamento se iniciaria por um 

pareamento não recíproco entre o 

transgene e o gene endógeno, ou 

entre os transgenes e, como conseqüência 

desse pareamento, o locus 

receptor seria metilado, levando a 

uma terminação prematura da transcrição 

(ENGLISH & BAULCOMBE, 

1996; WASSENEGGER, 2000). 

A posição de integração do 

transgene também parece ser importante 

para o silenciamento pelo fato 

de o loci silenciador usualmente consistir 

de múltiplas cópias do transgene 

ligadas. Outro modelo que explica o 

silenciamento de transgenes em cópias 

múltiplas e invertidas é a formação 

de um RNA em alça (alRNA), 

que, posteriormente, se transformaria 

em dfRNA pela ação de RNA 

nucleases causando o efeito do silenciamento 

conforme foi descrito acima 

(WATERHOUSE et al., 2001). De 

modo similar, o dfRNA poderia também 

ser usado como molde para 

algumas RNA polimerases que transcreveriam 

moléculas de RNA antisenso, 

homólogos aos mRNAs, formando 

os dfRNAs e continuando o 

ciclo de silenciamento por indução 

do SGT e SGPT (KOOTER et al., 

1999; FAGARD & VAUCHERET, 

2000). 

Modelos para explicar o 


Vários autores têm sugerido 

modelos para os mecanismos moleculares 

envolvidos no silenciamento 

gênico, que não são eventos mutuamente 

exclusivos, mas que podem 

ser usados individualmente ou 

em conjunto para explicar o silenciamento 

gênico. 

1. Silenciamento mediado 

pelo pareamento DNA-DNA 

Esse modelo tem sido proposto 

para explicar certos tipos de cossupresssão 

(JORGENSEN, 1990; MEYER 

& SAEDLER, 1996); a trans-inativação 

(MATZKE & MATZKE; 1990; 

CHANDLER & VAUCHERET, 2001) e 

a paramutação (MEYER et al., 1993; 

CHANDLER & VAUCHERET, 2001). 

O pareamento de regiões homólogas 

do DNA, devido à interação 

entre duas seqüências homólogas 

numa interfase da meiose, levaria à 

formação de estruturas em alças, que 

seria o precursor da difusão de 

metilações no DNA, induzindo o SGT 

(ENGLISH & BAULCOMBE, 1996). 

Os transgenes diferem muito em 

sua capacidade de trans-inativar cópias 

homólogas, o que parece estar associado 

à capacidade de procurar outras 

posições cromossomais com homologia. 

A presença de genes silenciadores 

muito próximos ao telômero sugere 

que regiões teloméricas são sítios favoráveis 

para a interação com seqüências 

homólogas (MEYER & SAEDLER, 2001). 

2. Degradação de RNA em 

excesso 

Em transgênicos, é comum o 

uso de promotores fortes para se 

conseguir a alta expressão do 

transgene. Como conseqüência, para 

a detecção de planta com o inserto, 

são esperados níveis altos do mRNA 

do transgene. Nesse modelo, os 

abRNA seriam produzidos devido a 

uma alta taxa de transcrição do DNA, 

com isso, os altos níveis de mRNA. Se 

essa taxa de mRNA exceder a taxa de 

tradução, pode ocorrer, além da de- 


gradação parcial desses mRNA, a 

terminação abrupta da transcrição, o 

processamento irregular, originando 

abRNAs e induzindo ao SGPT 


Outrossim, o excesso de produção 

de uma determinada proteína pode 

transmitir um sinal para a maquinaria 

de tradução a fim de induzir a terminação 

de sua própria transcrição. As 

proteínas em excesso seriam marcadas 

por ubiquitinas, por fosforilação ou 

por outras modificações pós-transcricionais 

(HOCHSTRASSER, 1996; 

WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998). 

3. Híbridos DNA-RNA 

A observação de que o pareamento 

DNA-RNA pode induzir padrões 

de metilação sugere mudanças 

no estado epigenético caracterizado 

por um estado específico de metilação 

do DNA ou da estrutura da cromatina, 

durante o período pré-meiótico ou 

de hibridização somática (MEYER & 

SAEDLER, 2001). Estudos indicaram 

que fragmentos de RNA poderiam 

induzir uma hipermetilação em seqüências 

homólogas (pareamento 

DNA -RNA), causando as mudanças 

epigenéticas. Tal fenômeno foi comprovado 

em estudos com plantas 

transgênicas que continham o cDNA 

dos virióides do PSTV da batata. A 

metilação no genoma do viróide foi 

observada mesmo sem que a 

replicação do seu RNA tivesse ocorrido 

(WASSENEGGER et al., 1994; 

WASSENEGGER, 2000). 

Os transcritos poderiam induzir 

a metilação em regiões homólogas 

de DNA, que seria comum em transformantes, 

os quais acumulariam 

grandes concentrações dos transcritos 

no núcleo, devido às altas taxas 

de tradução e do processamento irregular 

desses RNAs. Como conseqüência 

dessa marcação, a proteína e 

seus produtos, após degradação, poderiam 

reconhecer seqüências homólogas 

surgindo nos ribossomos, e 

levando ao término prematuro da 

transcrição, além de uma deadenilação 

na posição 3’ e, com isso, ao 

surgimento dos abRNAs e a indução 

do SGPT (JONES et al., 1999). 

4. Modelo mediado por 

RNA antisenso 

O RNA antisenso parece ser 

fundamental nos mecanismos de 

cossupressão. As fitas duplas de RNA 

seriam alvos gerados pelos promotores 

presentes no DNA do transgene 

e pela ação de RNA polimerases 

dependente de RNA ( RPdR) 

(LINDBO et al., 1993). 

WASSENEGGER & PÉLISSIER 

(1998) ainda propõem que esse RNA 

poderia surgir devido à posição da 

seqüência de DNA produtora do 

RNA antisenso, próximo a um promotor 

localizado adjacente a uma 

cópia de T-DNA integrado e em 

anti-senso . 

A produção de RNA antisenso 

pelas RPdR dependeria de níveis 

específicos do RNA senso e do 

acúmulo de intermediários de RNA 

(durante o processamento ou transporte). 

Essa hipótese se baseia no 

fato de que as RPdR reconheceriam 

os transcritos aberrantes, que seriam 

derivados de transcrição, transporte 

ou tradução incorreta do 

transgene. A produção de abRNA 

poderia induzir as mudanças 

epigenéticas do gene que influenciaria 

o seu processamento (MEYER & 

SAEDLER, 1996; WASSENEGGER, 

2000). 

Certos transgenes somente podem 

silenciar ou cossuprimir seqüências 

caso contenham um final 3’ 

homólogo, enquanto certos transgenes 

com regiões 5’ homólogas não são 

afetadas (ENGLISH et al., 1996). Essas 

observações sugerem que os transcritos 

antisenso são feitos preferencialmente 

nas regiões 3’ do transgene 


O papel da metilação e da 

estrutura da cromatina no 


Em recentes estudos sobre silenciamento 

em plantas, a ocorrência 

de pareamento entre seqüências 

homólogas parece ser condição importante 

para o silenciamento 

(BAULCOMBE & ENGLISH, 1996; 

VOINNET et al., 1998). O silencia- 


mento em trans seria quando uma 

região metilada teria homologia com 

a região promotora de um determinado 

gene, dirigindo uma metilação 

de novo nessa região, para induzir o 

SGT. Tal fenômeno é conhecido 

como metilação do DNA dirigida 

por DNA (MDdD)(JONES et al., 1999; 

METTE et al., 1999; WASSENEGGER, 

2000). 

Muitos genes eucarióticos e elementos 

transponíveis exibem uma 

forte correlação inversa entre densidade 

de metilação do DNA e atividade 

transcricional ou transposicional. 

Ao certo, não se sabe se a 

ação da metilação da citosina alteraria 

a estrutura da cromatina, mas 

estudos em plantas demonstram 

uma correlação positiva entre o 

número de cópias do transgene, o 

aumento da metilação e a diminuição 

da atividade transcricional 

(KUMPATLA et al.,1997). 

Em eucariontes, os resíduos de 

citosina do DNA genômico podem 

ser metilados na posição 5’da citidina. 

As enzimas das DNA metiltransferases 

que realizam essa reação têm preferências 

por grupos CpG ou CpNpG. 

Em ambos os casos, o DNA recentemente 

replicado, que contém grupos 

CpG ou CpNpG hemimetilados, são 

fortes substratos para a ação das 

DNA metiltransferases. Tal padrão 

asseguraria as metilações de manutenção 

e de padrões de metilação 

pré-existentes nos cromossomos filhos 

(ATHERLY et al.,1999). 

Em transgenes, esse padrão de 

metilação não é igual. As metilações 

localizadas em resíduos de citosina 

não estão localizadas em seqüências 

CpG ou CpNpGp. Os fatores que 

especificam esse padrão de metilação 

não simétrico são ainda uma incógnita, 

mas parece que a metilação do 

DNA é dirigida por um RNA. Não se 

sabe se esse RNA seria o sinal em 

todos os casos da metilação não 

simétrica das citosinas em plantas 

(FINNEGAN et al., 1998). Alguns 

autores denominam esse fenômeno 

de metilação do DNA dirigida por 

RNA (MDdR)(WASSENEGGER, 2000; 

BAULCOMBE, 2002). Esse padrão 

também não parece ser conservado

durante a meiose, em contraste com 

o padrão de metilação simétrica 

(PARK et al., 1996; LUFF et al., 

1999). 

Estudos têm demonstrado que 

a metilação do DNA e a estrutura da 

cromatina têm um importante papel 

no SGT e SGPT. Nessa forma de 

silenciamento, a região promotora 

e, às vezes, a região codificante dos 

transgenes silenciados apresentamse 

densamente metilados (KOOTER 

et al., 1999). Plantas mutantes para 

o gene da proteína DDM1, que remodela 

a cromatina, não apresentaram 

o silenciamento gênico. Isso 

indica um possível papel da 

metilação do DNA e da estrutura da 

cromatina no estabelecimento e na 

manutenção de SGPT. Supõe-se que 

o aumento da metilação leve à 

heterocromatização do DNA e, com 

isso, ao difícil acesso às RNA 

polimerases, diminuindo a ação 

transcricional (YE et al., 1996; 

WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998; 

WASSENEGGER et al., 2000). 

Embora os modelos atuais proponham 

que a produção de um 

RNA aberrante, fruto de uma 

metilação, seja o causador de uma 

finalização prematura da transcrição 

do mRNA, existem estudos com 

linhagens defeituosas de N. crassa 

para o gene da metilase da citosina 

(dim2) que exibiram a mesma capacidade 

de silenciamento que a linhagem 

controle (dim +) (COGONI 

& MACINO, 1999). Fato semelhante 

foi observado em estudos realizados 

com plantas transgênicas de 

fumo, onde o gene nptII (neomicina 

fosfotransferase) metilado teve a 

transcrição e o SGPT normais quando 

comparado com uma cópia do 

gene nptII não metilado e não silenciado 

(VAN HOUDT et al., 1997). 

Tais fatos indicam que a metilação 

não parece ser condição sine qua 

non para a indução e a manutenção 

do SGPT (PARK et al., 1996). 

Razões para a ocorrência do 


Diversos autores têm levantado 

o papel do silenciamento gênico . O 

silenciamento gênico parece estar 

envolvido com a defesa a ácidos 

nucléicos estranhos (COVEY, 2000; 

JORGENSEN, 1995; MOURAIN et al., 

2000), com a proteção do genoma 

contra a inserção de elementos 

transponíveis (KETTING et al., 1999; 

BAULCOMBE, 2002) e com a 

regulação da expressão gênica de 

famílias de multigenes ou ainda 

genes duplicados em plantas 

(TANZER et al., 1997; CHANDLER & 

VAUCHERET, 2001). 

Uma outra questão poderia ser 

levantada, se seqüências homólogas 

de DNA podem parear e se tornar 

silenciadas, como então explicar que 

membros de famílias de genes poderiam 

escapar da inativação? MATZKE 

& MATZKE (1995) propõem a existência 

de duas maneiras de prevenir 

esse pareamento: ou pela divergência 

de seqüências encontradas em 

alelos (heterozigosidade) ou devido 

à redução do comprimento de seqüências 

homólogas, o que sugere 

um papel muito importante para os 

íntrons, que dividiriam a região 

codificante da proteína em segmentos 

pequenos demais para realizar 

um pareamento efetivo. 

Parece bastante unânime entre 

vários autores que o silenciamento 

gênico tem como função 

principal prevenir a superexpressão 

gênica, controlando o número 

de cópias de determinado gene ou 

ainda ser um mecanismo de defesa 

contra a superexpressão de 

transgenes (WASSENEGGER & 

PÉLISSIER, 1998; KOOTER et al., 

1999; WASSENEGGER, 2000). 

Difusão e amplificação do 


Um dos mais importantes aspectos 

do silenciamento gênico é que 

este é um mecanismo autômato, isto 

é, pode ser induzido localmente e 

pode se espalhar para distantes locais 

no organismo (VOINNET et al., 1998; 

COVEY, 2000). Esse transporte 

sistêmico do sinal de silenciamento 

parece relacionar-se com um sinal 

móvel, não metabólico, ainda não 

completamente identificado. Esse si- 

nal, sendo parte integral do processo 

de silenciamento, parece interagir com 

proteínas de membranas, movendose 

de célula em célula através do 

floema (plasmodesmata), assemelhando-se 

com o padrão de infecção de 

vírus nas plantas (PALAUQUI et al., 

1997; VOINNET & BAULCOMBE, 1997; 

VOINNET et al., 1998; MLOTSHWA 

et al., 2002). 

O SGPT teria três fases: início, 

manutenção e difusão propriamente 

dita. Os transgenes, os vírus e até 

mesmo o DNA exógeno (proveniente 

da transformação) poderiam 

iniciar o SGPT. Alguns autores sugerem 

que esse sinal seja na forma 

de RNA, mas não é conhecido ainda 

qual o tipo de RNA que estaria 

envolvido: se abRNA, dfRNA ou 

ainda o asRNA (METTE et al., 1999; 

KOOTER et al., 1999; MATZKE et 

al., 2001; MLOSTHWA et al., 2001). 

Esse conceito de difusão célulacélula 

e de transporte a longas distâncias 

não pode ser descartado, 

visto que o vírus tem seu genoma 

composto por RNA e esse RNA difunde-se 

para dentro da planta, podendo 

se mover de célula-célula 

através de proteínas codificadas pelo 

seu próprio genoma (WATERHOUSE 

et al., 2001). 

Ainda não está completamente 

elucidado como o sinal para o silenciamento 

pode se espalhar sistemicamente 

pela planta e ainda ter seus 

efeitos amplificados. O silenciamento 

parece ser um mecanismo de prevenção, 

como a vacina é para os 

humanos. Parece sensato estabelecer 

que o silenciamento nada mais é 

que uma mensagem enviada pelas 

células já infectadas pelo vírus para 

aquelas que ainda não o foram, mas 

que estejam na iminência de o ser, 

para que essas preparem suas defesas 

contra o agente invasor. Se esse 

sinal contiver fragmentos da seqüência 

viral, as células receptoras poderiam 

estar preparadas para degradar 

qualquer RNA que contivesse essas 

seqüências, mesmo antes de o vírus 

chegar (RATCLIFF et al., 1997; 

WATERHOUSE et al., 2001). 

Esse modelo poderia explicar algumas 

observações:1) de que plantas 


transgênicas com transgenes derivados 

de vírus podem apresentar uma 

recuperação, isto é, apresentar os sintomas 

da infecção inicial do vírus, 

seguida de crescimento sem os sintomas 

e de resistência ao vírus. 2) plantas 

transgênicas apresentando cossupressão 

tendem, inicialmente, a apresentar 

atividade do transgene, mas 

um silenciamento progressivo em tecidos 

em crescimento (WATERHOUSE 

et al., 2001). 

Considerações finais 

Na última década, o estudo do 

silenciamento gênico cresceu consideravelmente. 

Já existem evidências 

de que características específicas 

do DNA, como a metilação e a estrutura 

da cromatina, são importantes 

para o fenômeno do silenciamento. 

Todavia, o seu mecanismo molecular 

ainda não foi totalmente 

elucidado, mas, em razão de observações 

funcionais dos RNA anti-senso, 

abRNA, dfRNA, RNA polimerases 

e RNA nucleases, os estudiosos desse 

assunto puderam elaborar modelos 

para os mecanismos de SGDH , 

o SGT e SGPT. 

É notória a existência de algumas 

dificuldades para o estudo do 

silenciamento gênico em plantas 

transgênicas. Variações entre as linhas 

de plantas transgênicas constituem 

uma grande barreira para o 

completo estudo desses mecanismos. 

Duas linhas transgênicas não são 

similares pelo fato de o transgene em 

cada planta se situar em diferente 

domínio no cromossomo, em diferente 

arranjo e também devido à 

associação com diferentes quantidades 

de DNA do vetor de transformação 

(IGLESIAS et al., 1997; STAM et 

al., 1997). 

Apesar das dificuldades, vislumbram-se 

para essa área da ciência 

grandes e importantes descobertas: o 

completo entendimento da regulação 

gênica, a identificação dos fatores 

que podem afetar a expressão gênica 

e dos transgenes (talvez se discuta no 

futuro algumas propriedades dessa 

tecnologia) e, ainda mais, a compreensão 

dos mecanismos evolutivos. 

Agradecimentos 

Aos pesquisadores Ivan 

Schuster (Coodetec) e Maria Júlia 

Corazza Nunes (UEM/PR) pelas 

correções e sugestões dadas. Agradeço 

a Deus por tudo. 

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Pesquisa 

Francismar Corrêa Marcelino 

Mestre em Genética Molecular, Laboratório 

de Análises Genéticas - AgroGenética 

eg34680@vicosa.ufv.br 

Marta Fonseca Martins 

Doutora em Genética Molecular, Laboratório 

de Análises Genéticas - AgroGenética 

mmartins@tdnet.com.br 

Marcio Antonio Silva Pimenta 

Doutor em Genética Molecular, 

Universidade Federal de Viçosa 

marciopimenta@vicosa.ufv.br 

Maurilio Alves Moreira 

PhD, Bioquímica & Genética de Plantas, 


moreira@ufv.br 

Everaldo Gonçalves de Barros 

PhD, Biologia Molecular de Plantas, 


ebarros@ufv.br 

Ilustrações cedidas pelos autores 

Detecção de resíduos de 

transgênicos em grãos e 

produtos derivados 

Mais de 58 milhões de hectares são 

cultivados atualmente no mundo com 

espécies transgênicas, sendo a soja, o 

milho, o algodão e a canola, as principais 

delas. Os países com as maiores áreas 

cultivadas com transgênicos são, nesta 

ordem, os Estados Unidos, a Argentina, o 

Canadá e a China. Estes países respondem 

por cerca de 99% da área total plantada 

com cultivos transgênicos. O cultivo de 

plantas geneticamente modificadas vem 

crescendo rapidamente em vários países, 

inclusive no Brasil, onde no mês de 

setembro foi aprovado, embora com restrições, 

o plantio de soja transgênica para 

o ano agrícola 2003/2004 (Medida Provisória 

131, de 25 de setembro de 2003). 

A demanda por análises da presença 

de resíduos de transgênicos em matérias-primas 

e em alimentos tem aumentado 

significativamente no Brasil, nos últimos 

dois anos, principalmente após a 

comprovação do cultivo ilegal da soja 

transgênica, resistente ao herbicida 

glifosato, destacadamente no estado do 

Rio Grande do Sul, com sementes provenientes 

da Argentina. A maior parte das 


A experiência da Universidade Federal de Viçosa 

análises tem sido demandada por empresas 

exportadoras de grãos de soja e de 

produtos derivados. Esses produtos são 

exportados, na maioria, para a Europa, 

Japão e Coréia. Já antevendo esse cenário, 

a Universidade Federal de Viçosa 

(UFV), por intermédio do Instituto de 

Biotecnologia (BIOAGRO), desenvolveu 

e otimizou metodologias baseadas na 

técnica de PCR (Polymerase Chain 

Reaction) para determinar a presença e 

quantificar resíduos de transgênicos em 

amostras de DNA extraídas de grãos, 

bem como de seus produtos derivados. 

Recentemente, a AgroGenética, laboratório 

incubado na Incubadora de Empresas 

de Base Tecnológica da UFV, foi 

credenciado junto ao Ministério da Agricultura, 

Pecuária e Abastecimento (MAPA) 

- Portaria Nº 27, de 15 de maio de 2003, 

para a “detecção de modificação genética 

em produtos de origem vegetal”. 

As modificações genéticas introduzidas 

que derivam os organismos 

geneticamente modificados (OGMs) 

podem ser produzidas por pelo menos 

três metodologias: 

Figura 1 - Representação da construção presente na soja RR® (Roundup Ready). 

Região promotora 35S do vírus do mosaico da couve flor, peptídeo de trânsito de 

Petúnia, gene que codifica a proteína EPSPS, que confere a resistência ao herbicida, 

e o terminador do gene da nopalina sintase (NOS).

Figura 2 - Análise qualitativa de OGM em amostras de grãos de soja. O DNA das amostras foi 

extraído pelo método Wizard e amplificado com primers específicos que anelam ou no gene 

da lectina (controle A e B), ou na região do promotor 35S do CaMV (C e D), ou na região 

terminadora NOS (E e F), ou na região codificadora do gene EPSPS (G e H). Após a reação de 

PCR, os produtos amplificados foram separados em géis de agarose. À esquerda (A, C, E e G) 

está exemplificado um resultado negativo e à direita (B, D, F e H), um resultado positivo. Os 

símbolos nas canaletas representam: (–), reação de PCR sem DNA (controle); N, soja normal 

(controle); T, soja transgênica (controle); 1, 2 e 3, referem-se a amostras de grãos de soja. As 

setas indicam as bandas de DNA de interesse. 

Figura 3 - Curva de amplificação de uma análise quantitativa em PCR de tempo real. A 

determinação da porcentagem de resíduos de OGM é baseada na comparação da curva de 

amplificação da amostra analisada com as curvas de amplificação de padrões certificados 

contendo quantidades conhecidas de OGMs. 

- técnicas do DNA recombinante, 

utilizando vetores para transformação 

de plantas; 

- técnicas envolvendo a introdução 

direta do material genético no 

organismo; 

- fusão celular por métodos não 

naturais. 

A construção genética utilizada para 

produzir OGMs consiste de três elementos 

básicos: o promotor, que controla a 

expressão do transgene no organismo; 

a região codificadora, que codifica a 

proteína de interesse; e a região 

terminadora, que determina o final do 

processo de transcrição do gene. Além 

disso, pode ser usado um gene marcador 

que serve para selecionar as células que, 

de fato, foram transformadas. A soja 

resistente ao herbicida glifosato, por 

exemplo, tem como região reguladora o 

promotor 35S do vírus do mosaico da 

couve flor (CaMV); como região 

codificadora, o gene para a proteína 

EPSPS de Agrobacterium tumefasciens, 

que confere a resistência ao herbicida, e 

como região terminadora, o terminador 

do gene da nopalina sintase (NOS), 

também de Agrobacterium (Figura 1). 

A identificação de alimentos geneticamente 

modificados pode ser feita facilmente 

com o auxílio de técnicas de 

biologia molecular. OGMs podem ser 

identificados pela detecção direta do DNA 

exógeno nele contido, do mRNA correspondente 

produzido, da proteína resultante 

ou, ainda, pela característica introduzida. 

Os principais métodos analíticos 

de detecção utilizam a técnica da reação 

em Cadeia da DNA Polimerase (PCR) para 

detectar o DNA exógeno, ou métodos 

imunológicos, como o ELISA, para detectar 

a proteína. O método analítico escolhido 

deve ser sensível, confiável, 

reprodutível, minimizando, assim, falsos 

positivos e falsos negativos. 

Em nosso laboratório a detecção e 

quantificação de resíduos de OGMs em 

grãos, ingredientes e produtos derivados 

é feita pela técnica de PCR. Para tal, é 

necessária a extração de DNA das amostras 

e amplificação do fragmento de interesse. 

Para ser amplificado, o DNA purificado 

deve apresentar boa qualidade. Além 

disso, como controle, um gene normalmente 

presente no organismo, é amplificado 

em uma reação paralela. Para produtos 

que contenham soja na sua composição 

é utilizado o gene da lectina. Para 

produtos à base de milho, é utilizado o 


Figura 4 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a detecção de OGMs em 2000. 


Figura 6 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a detecção de OGMs em 2002 



gene da delta zeína. Quando se quer 

detectar a presença de OGM em uma 

amostra de salsicha, por exemplo, amplifica-se 

como controle o gene da lectina, 

uma vez que a salsicha geralmente contém 

pelo menos 2% de proteína de soja na 

sua composição. 

O nosso laboratório procura utilizar 

métodos validados internacionalmente 

nas suas análises. Para a extração 

de DNA das amostras é utilizada a 

metodologia Wizard, método já validado 

pela Comunidade Econômica Européia. 

O transgene, ou seja, o segmento 

de DNA que foi introduzido na planta, 

é amplificado com primers específicos. 

Para a detecção do gene RR (Roundup 

Ready) são utilizados primers que se 

ligam ou à região do promotor 35S do 

CaMV, ou à região codificadora, ou ao 

terminador NOS. Após a reação de PCR 

os produtos amplificados são separados 

em géis de agarose. Para as análises 

quantitativas, o DNA das amostras é 

extraído pela metodologia PrepMan- 

Ultra e a análise é baseada no método 

TaqMan ® , que utiliza a técnica de PCR 

em Tempo Real, para amplificar a seqüência 

de DNA do promotor 35S, o 

qual está presente na maioria dos OGMs 

comercializados até o momento. O procedimento 

é extremamente preciso devido 

à perfeita complementaridade entre 

os primers usados na reação de PCR, 

a sonda TaqMan ® e as seqüências alvo 

de DNA que estão sendo amplificadas. 

A fluorescência liberada durante a reação 

é lida pelo sistema de detecção ABI 

PRISM ® 7000 e os dados gerados são 

analisados eletronicamente. Como a 

metodologia é bastante sensível, podese 

detectar, numa dada amostra, uma 

contaminação da ordem de 0,01%. No 

entanto, devido ao limite de recuperação 

do DNA durante o processo de 

extração e também aos erros inerentes 

ao processo de amostragem, temos trabalhado 

com um nível de detecção e 

quantificação da ordem de 0,1%. Isto é, 

uma amostra contendo 0,1% de transgênicos 

é classificada como positiva na 

nossa análise, tendo como referência 

um padrão certificado. Amostras com 

uma contaminação menor que 0,1% são 

classificadas como negativas. A Figura 2 

mostra os possíveis resultados obtidos 

em uma análise qualitativa, enquanto 

que na Figura 3 pode ser visualizada 

uma curva de amplificação numa análise 

quantitativa em tempo real. A 

quantificação de uma determinada amos-

tra é feita com base na comparação da 

sua curva de amplificação com as de 

padrões certificados contendo quantidades 

conhecidas de OGMs. 

Desde o ano de 2000, o laboratório 

vem realizando a detecção de OGMs em 

grãos e em produtos derivados. Inicialmente 

a demanda era concentrada em 

amostras de grãos de soja e milho e em 

diferentes tipos de preparações de proteínas 

de soja. Com o passar dos anos, 

observamos um aumento na demanda 

pelas análises bem como uma diversificação 

das amostras enviadas. Atual- 

mente, temos recebido amostras de condimentos 

e temperos, óleos, amido de 

milho, sopas, fubá, entre outras. A partir 

de 2001 foram feitas as primeiras análises 

de produtos cárneos. A partir de 

2002 houve um aumento expressivo no 

número de análises para esse tipo de 

produto. Naquele ano, 12,3% do total de 

amostras analisadas foram de produtos 

cárneos. Até setembro de 2003 a porcentagem 

foi de 7,3%. 

As Figuras 4, 5, 6 e 7 mostram a 

porcentagem de cada classe de produto 

analisado em relação ao total de amos- 

Figura 8 - Percentual de amostras positivas para a presença de resíduos de OGMs com 

relação ao número total de amostras analisadas, entre os anos de 2000 e 2003. 

Quadro 

1 - Porcentagem 

de 

amostras 

positivas 

dentro 

de 

cada 

classe 

de 

amostras 

e com 

relação 

ao 

total 

de 

amostras 

analisadas 

% de 

% de 

% de 

% de 

% de 

% de 

% de 

% de 

amostras 

amostras 

amostras 

amostras 

amostras 

amostras 

amostras 

amostras 

Tipo 

de 

Amostra 

positivas 

pelo 

total 

de 

positivas 

dentro 

da 

classe 

positivas 

pelo 

total 

de 

positivas 

dentro 

da 

classe 

positivas 

pelo 

total 

de 

positivas 

dentro 

da 

classe 

positivas 

pelo 

total 

de 

positivas 

dentro 

da 

classe 

amostras 

analisada 

amostras 

analisada 

amostras 

analisada 

amostras 

analisada 

em 

2000 

em 

2000 

em 

2001 

em 

2001 

em 

2002 

em 

2002 

em 

2003 

em 

2003 

Soja grão 

Diferentes 

3, 89 

12, 96 

7, 74 

35, 42 

6, 16 

31, 69 

9, 22 

64, 

20 

tipos 

de 

proteínas 

de 

soja 

0, 00 

0, 0020 

0, 00 

0, 00 

0, 96 

3, 91 

2, 13 

7, 

41 

Farelo 

de 

soja 

1, 11 

11, 76 

1, 37 

14, 64 

7, 93 

54, 72 

8, 33 

54, 

49 

Produ 

tos 

cárneos 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

7, 93 

63, 04 

5, 32 

73, 

17 

Milho grão 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

1, 06 

13, 

04 

Ração 0, 00 

0, 00 

1, 82 

21, 62 

3, 56 

49, 06 

2, 30 

35, 

14 

Hidrolisad 

o 

de 

soja 

0, 00 

0, 00 

0, 23 

4, 76 

0, 00 

0, 00 

0, 18 

25, 

00 

Sopas 0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 

00 

Fubá 

de 

milho 

Condimen- 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 18 

14, 

29 

tos 

e 

temperos 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 55 

36, 36 

1, 42 

61, 

54 

Lecitina 

de 

soja 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 82 

75, 00 

0, 00 

0, 

00 

Óleos 

e 

gorduras 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 00 

0, 27 

40, 00 

0, 00 

0, 

00 

Outros 0, 00 

0, 00 

0, 23 

2, 22 

0, 27 

5, 88 

2, 30 

37, 

14 

tras desde o ano de 2000. Ao longo dos 

anos que temos realizado análises de 

OGM em grãos e diferentes tipos de 

alimentos, pudemos observar um aumento 

gradual no número de amostras 

positivas, demonstrando que embora 

seja proibido o plantio e a comercialização 

de OGM no país, estes de alguma 

forma estão presentes no mercado, pelo 

menos, desde o ano de 2000. Naquele 

ano apenas 5% das amostras analisadas 

foram positivas para a presença de 

resíduos de OGM. Em 2001, esse 

percentual subiu para 11,5%. Em 2002, 

para 28,5%, e até setembro de 2003, 

32,3% das amostras apresentaram resultado 

positivo. A Figura 8 representa de 

forma gráfica estes resultados. 

A porcentagem de amostras positivas 

dentro de cada classe de produtos 

também sofreu elevação, principalmente 

no caso de grãos de soja, farelo de soja e 

ração. A porcentagem de amostras de 

grãos de soja positivas para a presença de 

OGM em 2000 foi de 3,89 % com relação 

ao total de amostras analisadas. Com 

relação apenas às amostras de grãos 

analisadas, esse percentual foi de 12,96%, 

atingindo 35,42%, 31,69% e 64,20%, respectivamente, 

em 2001, 2002 e 2003. As 

amostras de farelo OGM subiram de 

1,11% do total de amostras analisadas, 

em 2000, para 8,33% em 2003, enquanto 

as de ração eram 1,82% em 2001 e 2,3% 

em 2003. A porcentagem de amostras de 

produtos cárneos contendo resíduos de 

OGM foi de 7,93% do total de amostras 

analisadas e 63,04% com relação ao total 

de amostras dessa classe de produtos em 

2002. Em 2003, esses valores foram de 

5,32% e 73,17%, respectivamente. Com 

relação às amostras de milho e derivados 

apenas em 2003 começamos a detectar 

algumas amostras positivas, o que reflete 

a presença de outros cultivos transgênicos, 

que não a soja RR®, no mercado 

mundial. O Quadro 1 mostra a porcentagem 

de amostras positivas em relação ao 

número total de amostras analisadas e 

dentro de cada classe de amostras. 

Os nossos dados permitem concluir 

que no período de 2000 a 2003 houve um 

aumento gradual da presença de resíduos 

de transgênicos em grãos, ingredientes e 

alimentos derivados no país, especialmente 

com relação à soja. Os dados apontam 

também para a necessidade de definição 

de normas claras de rotulagem de alimentos. 

Para esse fim, é importante que se 

disponham de laboratórios qualificados 

para realizar esse tipo de análise. 


Pesquisa 

Ricardo Antonio. Polanczyk 

Engenheiro Agrônomo, Doutorando – Programa de 

Pós Graduação em Entomologia (Escola Superior de 

Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ -USP). 

rapolanc@esalq.usp.br 

Samuel Martinelli 

Engenheiro Agrônomo, Doutorando – Programa de 

Pós Graduação em Entomologia (Escola Superior de 

Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ -USP). 

smartine@esalq.usp.br 

Celso Omoto 

Engenheiro Agrônomo, Prof. Dr. Depto 

Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola 

(ESALQ-USP). 

celomoto@esalq.usp.br 

Sérgio Batista Alves 

Engenheiro Agrônomo, Prof. Dr. Depto 

Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola 

(ESALQ-USP). 

sebalves@esalq.usp.br 


Bacillus thuringiensis 

no Manejo Integrado de Pragas 

1. Introdução 

A exploração agrícola intensiva, 

necessária para atender à crescente 

demanda interna por alimentos, 

aumento do volume de exportações 

agrícolas e necessidade por 

produtos como fibras, tem como 

fator limitante o impacto negativo 

nos ecossistemas. De acordo com 

Tilman et al. (2001), diante da continuidade 

dos impactos ambientais 

globais provocados pela agricultura, 

10 9 hectares de ecossistemas naturais 

serão convertidos em sistemas 

agrícolas até o ano de 2050. Do 

mesmo modo, os agroquímicos, utilizados 

para o controle de pragas 

agrícolas são muitas vezes responsáveis 

por contaminações do meio 

ambiente e intoxicações de produtores 

rurais. Portanto, é importante 

o desenvolvimento e implementação 

de táticas de controle de pragas 

menos agressivas, que estejam de 

acordo com as premissas do Manejo 

Integrado de Pragas, e que, ao 

mesmo tempo, proporcionem o retorno 

econômico ao agricultor. 

Neste sentido, o controle biológico 

é uma importante estratégia 

que, através da liberação, incremento 

e conservação de insetos parasitóides, 

predadores e microrganismos, 

impede que os insetos-praga 

atinjam níveis populacionais capazes 

de causar dano econômico. Indiretamente, 

diminui o impacto dos 

agroquímicos sobre o meio ambiente, 

pois minimiza ou torna desnecessário 

o seu uso. Entre os microrganismos 

com potencial para serem 

empregados no controle biológico 


Do uso convencional em Pulverização à Biotecnologia 

destaca-se o entomopatógeno 

Bacillus thuringiensis (Bt). Esta bactéria 

é capaz de produzir inclusões 

cristalinas durante a esporulação, 

que são responsáveis pela sua atividade 

tóxica. As suas toxinas, após a 

ingestão, solubilização e ativação 

no intestino do inseto, unem-se às 

células do epitélio, formando poros 

e desestabilizando os gradientes 

osmótico e iônico, fazendo com que 

este cesse a alimentação, morrendo 

por inanição ou septicemia (Priest, 

2000; Glare & OĆallagham, 2000). 

Para que a patologia de Bt ocorra é 

necessário que o intestino do inseto 

permita a eficiente solubilização do 

cristal e que proteases ativem as 

protoxinas resultantes desta solubilização. 

Estas etapas são essenciais 

para que a toxina passe pela membrana 

peritrófica e se ligue aos receptores 

presentes na parede do 

intestino médio do inseto. Em função 

da variabilidade genética, entre 

os insetos há diferenças específicas 

e não específicas com relação à 

especificidade dos receptores das 

toxinas de Bt. A especificidade do 

receptor assume papel vital na defesa 

do organismo contra esta ação 

inseticida, juntamente com a solubilização 

do cristal e ativação da toxina. 

A ausência de necessidade de 

solubilizar o cristal e ativar as toxinas 

produzidas pelas plantas transgênicas 

pode influenciar a suscetibilidade 

dos organismos-alvos e nãoalvos 

de controle. A morte do inseto, 

no caso de produtos à base de Bt é 

uma interação da ação da toxina e 

dos esporos; o primeiro fator leva à 

formação de poros no tecido epitelial,

causando desiquilíbrio osmótico e 

iônico e a segundo causa septicemia 

devido à germinação dos esporos, 

proporcionada pela redução do pH 

intestinal devido à ação das toxinas. 

No caso de plantas-Bt, a causa da 

morte é somente a toxina. 

As primeiras tentativas de utilização 

de Bt no controle de pragas 

foram feitas na Europa durante a 

década de 30. Devido aos êxitos 

iniciais, a produção deste patógeno 

começou na França em 1938. Nos 

EUA, o interesse por este patógeno 

aumentou após 1950, principalmente 

para o controle de lepidópteros 

(Lambert & Peferoen, 1992; Beegle & 

Yamamoto, 1992). 

Deve-se salientar que a pressão 

da opinião pública quanto à saúde 

humana e preservação do meio ambiente 

incentivou a utilização de produtos 

microbianos, principalmente em 

hortaliças e frutíferas com alto valor 

comercial. Em 1970 foi lançado no 

mercado o Dipel (Bt kurstaki) que 

provou ser 20 a 200 vezes mais potente 

que outros isolados desta bactéria 

(Beegle & Yamamoto, 1992). Este 

produto, atualmente, é utilizado para 

o controle de mais de 167 lepidópterospraga 

(Glare & O’Callagham, 2000). 

Além disso, em 1976 foi caracterizado 

um isolado eficaz para o controle de 

insetos da ordem Diptera, denominado 

Bt israelensis e em 1983 outro letal 

para coleópteros denominado de Bt 

tenebrionis. O sucesso do uso de Bt 

no mundo só não é maior até agora, 

em função da existência de inseticidas 

químicos baratos que podem substituí-lo 

no controle de lepidópteros. 

Além de ser utilizado como 

bioinseticida, a partir da metade da 

década de 1980, foram obtidas as 

primeiras plantas transgênicas com 

a incorporação dos genes codificadores 

das proteínas tóxicas de Bt 

em plantas de fumo e tomate (Dias, 

1992). Segundo Ely (1993), mais de 

50 espécies de plantas sofreram 

transformações deste tipo com resultados 

satisfatórios. Formas 

truncadas dos genes que codificam 

proteínas inseticidas de Bt na sua 

forma ativa foram introduzidas e 

expressas com sucesso em plantas 

de fumo (Vaeck et al., 1987) e 

algodão (Perlak et al., 1990). Koziel 

et al. (1993), através da inserção de 

uma versão modificada do gene 

truncado cry1Ab, conseguiram a expressão 

da proteína Cry1Ab em altos 

níveis em plantas de milho e, 

em testes de campo, foi verificada a 

proteção contra o consumo foliar e 

perfuração de colmos por Ostrinia 

nubillalis, uma importante praga 

da cultura do milho nos EUA. 

De acordo com Clive (2002), 

estima-se que foram ocupados cerca 

de 58,7 milhões de hectares com 

culturas transgênicas no ano de 2002, 

com um aumento de 11,6% em relação 

ao ano anterior (Figura 1). A 

Índia, o maior produtor mundial de 

algodão, comercializou algodão-Bt 

pela primeira vez em 2002. Também, 

foi verificado um aumento da área 

pré-comercial de algodão-Bt na Colômbia 

e em Honduras. O EUA foi o 

país com maior área plantada, cerca 

de 39 milhões de hectares (66%), 

seguido pela Argentina (23%), Canadá 

(6%) e China (4%). A China apresentou 

o maior incremento anual 

(40%) entre 2001 e 2002 na área 

plantada com algodão-Bt, ocupando 

51% da área cultivada com esta espécie. 

Em termos mundiais, o milho 

geneticamente modificado ocupou 

12,4 milhões de hectares (com aumento 

de 9% em relação à área de 

2001), seguido pelo algodão e canola 

com 6,8 e 3 milhões de hectares, 

respectivamente (Figura 2). 

2. Vantagens e Limitações 

O emprego de biopesticidas à 

base de Bt é altamente desejável em 

programas de controle de insetos devi- 

do à sua alta especificidade e rápida 

degradação do ambiente. No entanto, 

de acordo com Vaeck et al. (1987), 

independentemente das vantagens do 

uso de inseticidas à base de toxinas 

produzidas pela bactéria Bt, o emprego 

destes produtos em escala comercial 

é limitado em função da instabilidade 

do cristal protéico em campo, devido 

à ação da luz ultravioleta e do seu 

alto custo de produção. Em relação ao 

efeito destas toxinas sobre insetos benéficos, 

Glare & OĆallagham (2000) 

relatam estudos realizados sobre o 

efeito de várias subespécies e produtos 

à base de Bt sobre 9 ordens de 

predadores, distribuídos em 25 famílias. 

Em relação aos parasitóides, os 

mesmos autores enumeram uma série 

de trabalhos realizados com Diptera 

(Tachinidae) e Hymenoptera 

(Aphelinidae, Braconidae, Chalcididae, 

Encyrtidae, Eulophidae, Eupelmidae, 

Ichneumonidae, Pteromalidae, Scelionidae 

e Trichogrammatidae). Em ambos 

os casos, embora os estudos tenham 

mostrado alguma variação nos 

resultados, os produtos formulados com 

Bt e suas subespécies apresentam pouco 

ou nenhum efeito sobre estes inimigos 

naturais. 

Os benefícios potenciais do uso 

de plantas geneticamente modificadas 

como, por exemplo, milho-Bt, 

não se limitam apenas à redução na 

aplicação de inseticidas de largo 

espectro. Estudos mostram a diminuição 

dos níveis de micotoxinas 

nos grãos destas plantas (Munkvold 

et al., 1999). 

De acordo com Obrycki et al. 

(2001), os riscos ou limitações no 

uso das plantas geneticamente mo- 

Figura 1. Adoção mundial de plantas geneticamente modificadas (GM) 


dificadas podem ser agrupados em 

três categorias: troca de material 

genético entre as plantas geneticamente 

modificadas e espécies selvagens 

aparentadas por meio da dispersão 

de grãos de pólen; a seleção 

de indivíduos resistentes na população 

do inseto-alvo de controle e o 

impacto da tecnologia sobre outros 

insetos e organismos não-alvos do 

controle. Com relação à troca de 

material genético, segundo Ellstrand 

et al. (1999), as plantas domesticadas 

e utilizadas em sistemas agrícolas 

não podem ser consideradas 

como indivíduos evolutivamente separados 

de seus parentes selvagens. 

Dentre as 13 mais importantes espécies 

utilizadas para a produção de 

alimentos, 90% destas formam híbridos 

com seus parentes selvagens 

em algum local dentro de sua área 

de distribuição agrícola. Deste modo, 

os centros de origem das espécies 

seriam os locais mais suscetíveis a 

tal fenômeno. A taxa de fluxo gênico 

neste caso tende a ser extremamente 

variável e as suas conseqüências 

evolutivas dependem de sua magnitude. 

A conseqüência evolutiva mais 

clara do fluxo gênico é a sua tendência 

em homogeneizar a composição 

genética das populações. A taxa de 

fluxo gênico pode ser efetivamente 

zero entre plantas com incompatibilidade 

de cruzamento que estejam 

isoladas espacialmente ou que não 

apresentem sobreposição de suas 

épocas de florescimento. Porém, os 

autores chamam a atenção em particular 

para os agroecossistemas. Em 

tais casos, o plantio concentrado de 

uma espécie de interesse econômico 

pode permitir que outras espécies 

(ex: plantas daninhas) sofram 

hibridização e introgressão de genes 

vindos do campo de produção agrícola. 

Assim, o fluxo gênico entre as 

plantas domesticadas e seus parentes 

selvagens apresenta potencialmente 

duas conseqüências danosas: 

o aumento da capacidade de invasão 

de ambientes por algumas espécies 

e o aumento do risco de extinção 

destes parentes selvagens. De acordo 

com Wolfenbarger & Phifer 

(2000), modificações genéticas através 

do melhoramento genético, convencional 

ou através de engenharia 

genética, de uma espécie cultivada, 

ou não, podem produzir mudanças 

e promover a habilidade de um organismo 

se tornar invasor de diferentes 

ecossistemas. Deste modo, a 

transferência de pólen de plantas de 

milho-Bt para plantas selvagens aparentadas 

é uma preocupação decorrente 

da adoção desta tecnologia 

(Bergelson et al., 1998). No entanto, 

esta transferência é limitada a regiões 

do México e América Central 

onde ocorrem plantas do grupo dos 

teosíntos (Ellstrand et al., 1999). 

O impacto das plantas geneticamente 

modificadas sobre a entomofauna 

benéfica começou a receber 

grande atenção após a publicação de 

Losey et al. (1999) na revista Nature. 

Este estudo mostrou que o pólen do 

milho transgênico expressando toxinas 

de Bt causou mortalidade de 

cerca de 50% das lagartas da borboleta 

monarca (Dannaus plexippus) 

(Lepidoptera: Nymphalidae), quatro 

dias após a ingestão. Porém, este 

trabalho foi bastante criticado, principalmente, 

por não relatar precisamente 

a quantidade de toxina utilizada 

nos bioensaios. Outros estudos, 

como os realizados por Leong et al. 

(1992) e Hansen & Obrycki (1999) 

indicam que este inseto pode ser 

afetado pelo milho-Bt, porém os níveis 

de mortalidade são bastante inferiores 

aos verificados por Losey et 

al., (1999). Glare & OĆallagham 

(2000) ressaltam que o comportamento 

do inseto, migração a partir de 

áreas com esta toxina, poderia reduzir 

o efeito da toxina sobre esta 

espécie. 


Figura 2. Taxa de adoção mundial das principais culturas GM em 2002 

Deve-se ressaltar que o impacto 

das plantas geneticamente 

modificadas sobre os organismos 

não-alvos do controle pode ser 

avaliado através de estudos 

toxicológicos e/ou ecológicos 

(Obrycki et al., 2001). Nos estudos 

toxicológicos, o parâmetro avaliado 

é a mortalidade dos herbívoros 

e dos consumidores de pólen quando 

expostos às toxinas de Bt como 

realizado por Losey et al. (1999). 

Por sua vez, nos estudos ecológicos 

são observados os efeitos da 

utilização destas plantas sobre os 

demais níveis tróficos constituintes 

de uma cadeia alimentar (herbívoros 

predadores e parasitóides). 

Ainda existem questionamentos 

quanto ao impacto das toxinas presentes 

em plantas de milho-Bt sobre 

insetos polinizadores de outras 

plantas. Vandenberg (1990) 

detectou valores significativos de 

mortalidade de abelhas domesticadas 

quando expostas à solução de 

Bt tenebrionis, o qual é considerado 

específico para coleópteros. Ainda, 

segundo Obrycki et al. (2001), 

os efeitos das plantas de milho-Bt 

também deveriam ser avaliados 

sobre decompositores presentes no 

solo (ex: Collembola) e outros predadores 

vertebrados. Estes últimos 

estudos se justificam já que algumas 

espécies de pássaros e morcegos 

são predadoras de lepidópteros 

que freqüentemente ocorrem em 

campos de milho. 

Em relação ao efeito de plantas 

transgênicas sobre inimigos naturais, 

de acordo com Orr & Landis

(1997), o número de predadores e 

o parasitismo de massas de ovos 

de O. nubilalis não foram adversamente 

afetados por plantas de milho-Bt 

expressando Cry1A(b). Entre 

os predadores foram avaliados 

adultos e ninfas do percevejo predador 

Orius insidiosus, bem como 

adultos e larvas de coccinelídeos e 

crisopídeos. 

Pilcher et al. (1997) conduziram 

estudos em laboratório e campo para 

determinar os efeitos de milho-Bt 

expressando Cry1A(b) sobre insetos 

predadores. No laboratório, não foi 

verificado qualquer efeito detrimental 

agudo sobre o desenvolvimento 

pré-imaginal e sobrevivência de 

Coleomegilla maculata, O. 

insidiosus e Chrysoperla carnea. No 

campo, em estudo realizado por dois 

anos consecutivos, não foram observados 

efeitos adversos sobre a 

abundância de predadores de O. 

nubilalis (coccinelídeos, crisopídeos 

e antocorídeos) quando comparadas 

a áreas de milho não geneticamente 

modificado. Ainda, os números 

de predadores observados antes, 

durante e após a liberação dos 

grãos de pólen pelas plantas de 

milho-Bt sugerem que movimento 

dos inimigos naturais no campo não 

foi afetado por este tipo de pólen. 

Os efeitos de presas alimentadas 

com milho-Bt sobre a mortalidade 

e desenvolvimento de larvas do 

predador C. carnea foram estudados 

em condições de laboratório por 

Hilbeck et al. (1998a). O predador 

foi criado com lagartas de O. 

nubilalis, e Spodoptera litorallis alimentadas 

com milho contendo a 

toxina Cry1A(b). Foi observado prolongamento 

no período larval de 

crisopídeos criadas continuamente 

com presas que foram alimentadas 

com o milho geneticamente modificado 

foi significativamente maior 

comparada com a testemunha, baixo 

valor nutricional. Ainda, foi observado 

prolongamento no período 

larval de crisopídeos criados com 

lagartas de O. nubilalis alimentas 

com milho geneticamente modificado. 

Este efeito pode ser atribuído à 

exposição à toxina inseticida em 

conjunto com o uso de presas de 

baixo valor nutricional. 

O desenvolvimento e mortalidade 

de formas larvais do predador 

Orius majusculus criadas sobre 

tripes Anaphothrips obscurus, 

alimentados com milho geneticamente 

modificado expressando a 

d-endotoxina Cry1A(b), foi estudado 

por Zwahlen et al. (2000). A 

atividade inseticida das plantas de 

milho Bt foi comprovada através 

de bioensaios utilizando-se lagartas 

de O. nubilalis. Não houve 

diferença significativa na mortalidade 

e no desenvolvimento das 

formas imaturas do predador criadas 

em A. obscurus alimentados 

com milho transgênico expressando 

a toxina Cry1A(b), quando comparados 

à testemunha criada com 

tripes não expostos à proteína inseticida 

de B. thuringiensis. Os 

resultados obtidos não evidenciaram 

efeitos letais ou subletais nos 

indivíduos de O. majusculus no 

modelo de interação tritrófica (milho 

Bt – herbívoro – predador) 

elaborado pelos autores. Segundo 

os autores, a resposta de O. 

majusculus alimentados com tripes 

expostos à Cry1A(b) pode ser 

explicada pela insensibilidade deste 

percevejo à toxina ou pela baixa 

quantidade de proteína inseticida 

ingerida pelos tripes que se alimentaram 

do milho Bt. 

AlDeeb & Wilde (2003) não 

identificaram diferenças significativas 

entre parcelas com milho Bt 

Cry3Bb1 e o isogênico, com relação 

ao número de insetos não alvos de 

controle coletados em armadilhas 

do tipo alçapão. As inspeções visuais 

de adultos e formas imaturas de 

C. maculata , O. insidiosus e 

Hippodamia convergens também 

não mostraram diferenças significativas 

entre os materiais testados. 

Segundo Al-Deeb et al. (2001), não 

houve diferença significativa entre o 

número de adultos e ninfas de O. 

insidiosus em plantas milho Bt expressando 

a toxina Cry1A(b) e milho 

convencional em condições de 

campo, em duas localidades estudadas. 

Ainda os autores conduziram 

teste em laboratório para avaliar os 

efeitos de estilo-estigmas de milho- 

Bt na mortalidade de formas imaturas 

de O. insidiosus. Os resultados 

mostraram que quando criados continuamente 

sobre estilo-estigmas de 

milho convencional ou milho Bt as 

ninfas deste percevejo predador 

apresentaram 100% de mortalidade, 

sugerindo que estes insetos sofreram 

com insuficiência nutricional 

nesta dieta. Porém, não houve diferença 

significativa na mortalidade 

das ninfas do percevejo quando alimentadas 

com estilo-estigmas de milho-Bt 

ou convencional e ovos de O. 

nubilalis em dias alternados. 

Segundo Barton & Dracup et al. 

(2000), as práticas agrícolas têm causado 

impactos ambientais nos ecossistemas. 

Deste modo, os riscos e 

benefícios em potencial da adoção da 

tecnologia de plantas geneticamente 

modificadas devem ser ponderados 

tomando-se como referencial os impactos 

ambientais decorridos dos sistemas 

atuais de produção agrícola. 

Porém, os riscos ao ambiente das 

plantas geneticamente modificadas 

devem ser avaliados antes de sua 

liberação para o plantio comercial, e 

posteriormente as áreas ocupadas com 

estas culturas devem ser monitoradas. 

Portanto, conforme apontado por 

Fernandes & Martinelli (2000), os estudos 

com plantas transgênicas resistentes 

a insetos em áreas extensas 

com o objetivo de se determinar quais 

são as espécies indicadoras de impacto 

ambiental destas plantas em um 

determinado sistema devem ser 

priorizados. Ainda há a necessidade 

de se padronizar métodos de avaliação 

e interpretação de resultados, possibilitando 

a avaliação destas plantas 

por todo o Brasil. Deste modo, estes 

resultados poderiam ser levados a 

público promovendo uma ampla discussão 

sobre o tema. 

Não obstante, a evolução da resistência 

às toxinas presentes nas 


resistentes a insetos é uma das principais 

preocupações para a liberação 

comercial destas plantas. De acordo 

com Heckel (1997) a partir do momento 

em que ocorrer a liberação 

para plantio em áreas extensas, as 

toxinas de Bt representarão um importante 

fator de mortalidade para as 

populações dos insetos-alvos. Esta 

alta pressão de seleção pode conduzir 

à evolução da resistência a estas 


toxinas inseticidas nas populações 

dos insetos expostos. Existem várias 

conseqüências negativas no desenvolvimento 

de resistência às toxinas 

de Bt. Além da perda das plantas 

transgênicas que expressam tais toxinas 

como opção no controle de 

insetos, há o risco de que o uso de 

formulações comerciais de inseticidas 

à base de Bt não seja mais viável 

para a aplicação em lavouras de milho 

ou em outras culturas. Os produtores 

orgânicos perderiam uma importante 

opção para o manejo de 

pragas, o qual é certificado para o seu 

sistema de produção. Além disso, as 

possibilidades de substituição destes 

produtos de origem biológica por 

outros são mínimas. O aumento da 

utilização de inseticidas sintéticos 

também é outra conseqüência em 

potencial do desenvolvimento da resistência 

às toxinas de Bt (EPA, 1998). 

3. Evolução da Resistência 

a Produtos à Base de Bt e 

Plantas Geneticamente 

Modificadas 

A resistência é um fenômeno 

pré-adaptativo que se desenvolve 

por seleção de indivíduos raros que 

podem sobreviver à aplicação de 

um inseticida a uma determinada 

dose. Um grande número de fatores 

genéticos, bio-ecológicos e operacionais 

influenciam a taxa de evolução 

da resistência. Os fatores genéticos 

incluem a variabilidade natural 

nas populações, número de 

genes envolvidos na manifestação 

da resistência e sua freqüência inicial 

na população (Georghiou & 

Taylor, 1977), a herança da característica 

(ex: grau de dominância) e 

custo adaptativo associado à resistência 

(Van Rie & Ferré, 2000). O 

potencial das populações de insetos 

em desenvolver resistência aos 

produtos formulados com Bt utilizados 

no controle de pragas é uma 

das principais ameaças ao emprego 

desta estratégia de controle de pragas 

agrícolas. A evolução da resistência 

dos insetos para inseticidas 

químicos é bastante comum, com 

mais de 500 espécies sendo resistentes 

a um ou vários inseticidas Já 

para os bioinseticidas é comparati- 

vamente mais rara, principalmente 

devido ao fato de que estes são 

pouco utilizados, se compararmos 

com a área tratada com inseticidas 

químicos em todo mundo. 

Há dois modos de estudar a influência 

da variabilidade em populações 

naturais sobre a resistência a Bt. A 

primeira envolve os estudo das diferenças 

na suscetibilidade entre e dentro 

de populações. Trabalhos neste 

sentido foram desenvolvidos por van 

Frankenhuyzen et al. (1995) e Huang 

et al. (1997) para Choristoneura 

fumiferana e O. nubilalis, respectivamente. 

Outra estimativa da variabilidade 

para genes de resistência em populações 

naturais é medir a herdabilidade 

(h 2 ) em experimentos laboratoriais a 

partir de uma amostra da população. 

Este índice representa a proporção da 

variação fenotípica de um determinado 

caráter responsável pela variação 

genética. Tabashnik (1994a) estimou o 

h 2 para 8 espécies de insetos, com valor 

relativamente alto para Plodia 

interpunctella, mostrando abaixa variação 

fenotípica e alta variação genética 

aditiva deste inseto. 

A estimativa indireta da freqüência 

dos alelos de resistência é 

fornecida por experimentos laboratoriais 

que obtiveram êxito em selecionar 

populações resistentes a Bt 

(Van Rie & Ferré, 2000). Nestes casos, 

pelo menos uma cópia do alelo 

de resistência deve estar presente 

para o início da seleção. Em experimentos 

com lepidópteros (Gould et 

al., 1992; 1995), a freqüência de 

alelos de resistência nas populações 

testadas foi relativamente alta (de 1 

a 5 x 10 -3 ). 

Quanto à herança da resistência, 

McGaughey (1985, 1988) mostraram 

que para P. interpunctella a 

herança é autossômica de parcialmente 

a completamente recessiva. 

O mesmo foi verificado para Plutella 

xylostella por Tabashnik et al. (1992) 

e Tang et al. (1997). Em outro trabalho 

com este mesmo inseto, (Ferré 

et al., 1991) verificaram que a suscetibilidade 

da progênie F1 depende 

do sexo do inseto no cruzamento 

parental, ainda que a ligação com o 

sexo tenha sido eliminada com base 

na razão sexual 1:1 dos sobreviventes 

da F1 a várias doses da Cry1Ab. 


Já para H. virescens os trabalhos 

demostraram que os resultados dependem 

da linhagem do inseto estudada. 

Por exemplo: para a linhagem 

SEL a herança mostrou-se autossômica, 

incompletamente dominante, 

e controlado por vários fatores genéticos 

(Sims et al., 1991). 

Em relação ao número de genes 

envolvidos na resistência, para P. 

xylostella há trabalhos que indicam 

a ocorrência de mais de um gene 

envolvido (Tang et al., 1997). Porém, 

segundo Glare & OĆallagham 

(2000), a resistência deste inseto 

para Cry1Ab mostra-se recessiva 

controlada principalmente por um 

único alelo autossômico e recessivo, 

embora isto não seja sempre atribuído 

ao mesmo “loci”. Tabashnik et 

al. (1997) relatou que populações 

do Hawai e Pensilvânia dividem um 

“locus” em que uma mutação recessiva 

associada com a reduzida ligação 

ao receptor confere resistência 

extremamente alta a 4 toxinas de 

Bt. Entretanto, outra população, das 

Filipinas, mostrou um controle 

“multilocus”, de espectro mais reduzido, 

e para algumas toxinas de 

Bt, a herança genética não é recessiva 

e não está associada com a 

redução da ligação ao receptor. Já 

para Heliothis virescens é provável 

que um gene principal parcialmente 

recessivo confere resistência a 

várias toxinas: Cry1Aa, Cry1Ab, 

Cry1Ac e Cry1Fa, causando modificações 

no receptor (Gould et al., 

1995; Lee et al., 1995). 

Embora a resistência em laboratório 

seja obtida em poucas gerações 

em alguns insetos, ela é na 

maioria dos casos instável, reduzindo 

logo após a diminuição da pressão 

de seleção, como foi observado 

por Tabashnik et al. (1994) e Tang et 

al. (1997) para P. xylostella. O custo 

adaptativo associado à evolução da 

resistência é a causa mais provável 

da instabilidade da resistência em P. 

xyllostella. Groeters et al. (1994) 

mostraram tal redução no custo adaptativo, 

sendo que após 5 gerações, a 

eclosão das lagartas e fecundidade 

foram reduzidos em 10% na linhagem 

resistente em comparação com 

a suscetível. A compreensão desta 

instabilidade pode indicar porque a

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 23 

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Tabela 

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de 

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desenvolvimento 

de 

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de 

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rara e pode auxiliar na elaboração 

de estratégias para incrementar a 

utilização deste bioinseticida 

(Tabashnik et al., 1994). 

A alteração da atividade proteolítica 

(ativação da toxina) foi verificada 

em P. interpunctella para Bt 

entomocidus e Bt kurstaki (Johnson 

et al., 1990; Oppert et al., 1997). Em 

trabalho semelhante realizado por 

Van Rie et al. (1990), foi observada a 

redução de 50 vezes na afinidade da 

toxina pelo receptor. Porém, os autores 

não verificaram alteração no número 

de receptores presentes para 

Cry1Ab na linhagem resistente. Estes 

dados indicam que a resistência, neste 

caso, é devida a alterações no 

receptor de Cry1Ab, pois o mesmo 

decréscimo de afinidade não foi observado 

para Cry1Ca, que possui 3 

vezes mais receptores que a outra 

toxina. Este elevado número de receptores 

pode explicar a alta suscetibilidade 

da linhagem selecionada para 

Cry1Ca. Para H. virescens foi verificado 

por Lee et al. (1995) que a ligação 

da toxina Cry1Aa ao receptor foi 

drasticamente reduzida, mas o mesmo 

não foi verificado para Cry1Ab e 

Cry1Ac. Porém, as toxinas do grupo 

Cry1A dividem os mesmos receptores 

nesta espécie de inseto, portanto 

Cry1Ac e Cry1Ab também se ligam 

ao receptor de Cry1Aa. Consequentemente 

foi considerada a hipótese 

que o receptor alterado para Cry1Aa 

causa resistência ao 3 subclasses de 

Cry1A (Van Rie & Ferré, 2000). 

Exemplos de Resistência de Insetos 

a produtos à base de Bacillus 

thuringiensis: 

1) Em laboratório 

Existem vários relatos de evolução 

da resistência a Bt em laboratório 

(Tabela 1). Para a maioria das espécies 

testadas a resistência evolui rapidamente 

para Bt kurstaki, Bt 

entomocidus e Bt tenebrionis ou Bt 

aizawai. Quando a diferença entre 

as populações suscetíveis e resistentes 

é menor que 10, não fica claro se 

a população desenvolveu resistência, 

propriamente dita, ou se existe 

tolerância entre subgrupos ou 

genótipos da espécie em questão 

(Glare & OĆallagham, 2000). 

O primeiro exemplo de resistência 

em laboratório ocorreu com Musca 

domestica ao Bt thuringiensis, provavelmente 

envolvendo b-exotoxina. 

De modo semelhante, trabalhos mostraram 

uma evolução de resistência 

de 10 da mesma toxina para 

Drosophila melanogaster em 30 gerações 

(Harvey & Howell, 1964; Wilson 

& Burns, 1968; Carlberg & 

Lindstrom, 1987). 

A partir do primeiro relato de 

resistência de Plodia interpunctella a 

d-endotoxina (McGaughey & 

Beeman, 1988), vários relatos de desenvolvimento 

de resistência em laboratório 

foram feitos. Em alguns 

casos os estudos envolvem a suspensão 

esporo + cristal enquanto que em 

outros casos apenas toxina(s). Em 

alguns casos níveis elevados de resistência 

foram obtidos em apenas 

algumas gerações usando-se alta pressão 

de seleção, como por exemplo: 

P. interpunctella para Bt kurstaki e P. 

xylostella para Bt aizawai Cry1C, de 

3 e 6 gerações respectivamente (Glare 

& OĆallagham, 2000). 

2) Em campo 

Embora alguns trabalhos realizados 

em laboratório com alta pressão 

de seleção de Bt sobre P. 

xylostella (traça-das-crucíferas) [sic] 

não tenha sido verificado alteração 

significativa na suscetibilidade 


(Devriendt & Martouret, 1976), este 

inseto foi o primeiro a mostrar evolução 

de resistência para Bt em 

campo (Tabashnik et al., 1997), 

sendo, até o momento, o único 

exemplo em que foi verificada a 

evolução da resistência em campo 

de um inseto para Bt, embora para 

outras espécies de lepidópteros (Tabela 

1) tenha sido sugerido esta 

possibilidade, porém pouca diferença 

na suscetibilidade foi verificada 

entre as populações de campo 

(resistente) e a de referência em 

laboratório (suscetível). Segundo 

Glare & OĆallagham (2000), outros 

relatos de resistência deste inseto 

a produtos à base de Bt foram 

feitos em vários países como 

Tailândia, Havaí, Japão, Coréia, China, 

EUA e América Central. 

A espécie influencia a probabilidade 

de evolução da resistência 

devido à variabilidade genética na 

população e à possibilidade de encontrar 

o inóculo. Por exemplo, o 

hábito migratório e polífago de 

Helicoverpa punctigera leva à diluição 

de qualquer população resistente 

devido ao cruzamento de indivíduos 

resistentes com suscetíveis, 

entretanto, P. xylostella é um inseto 

com mobilidade limitada, não ocorrendo 

à diluição da resistência, pelo 

cruzamento com insetos suscetíveis 

vindos de outras áreas (Glare & 

OĆallagham, 2000). 

A incidência de resistência cruzada 

é geralmente baixa, mas foi 

verificada para várias toxinas (Tabela 

1). Esta parece estar ligada a 

composição da toxina do isolado 

utilizado. McGaughey & Johnson 

(1994) realizam um estudo detalhado 

abordando a resistência para as 

toxinas individualmente após a seleção 

para resistência aos isolados 

Bt kurstaki (HD-1), Bt aizawai (HD- 

112 e 133) e Bt entomocidus (HD- 

198). Para P. interpunctella, HD-1 

resultou em resistência para Cry1Ab 

e Cry1Ac, mas não para Cry1Aa, 

Cry1B, Cry1C e Cry2A. Resistência 

para HD-133 e HD-198 resultou em 

resistência a uma maior gama de 

toxinas: Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, 

Cry1B, Cry1C e Cry2A. Os autores 

sugeriram que o espectro relativamente 

limitado de resistência às

diferentes toxinas em Bt kurstaki 

indicou que a resistência cruzada a 

outras subespécies era menos provável 

de ocorrer, portanto produtos 

baseados em Bt kurstaki deveriam 

ser utilizados primeiro. A resistência 

de Heliothis virescens é normalmente 

relatada à toxina Cry1Ac, 

porém existem relatos de resistência 

para outras toxinas como: 

Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1F e Cry2A 

(Gould et al., 1992). 

4. Manejo da Resistência 

Os programas de manejo da 

resistência apresentam 3 objetivos 

principais: evitar, retardar e reverter 

a evolução da resistência (Croft, 

1990). Estes objetivos são os mesmos 

para o manejo da resistência a 

produtos à base de Bt sendo muitas 

táticas baseadas nos princípios 

mostrados para plantas geneticamente 

modificadas. No caso das 

plantas Bt são preconizadas várias 

estratégias, tais como plantas com 

altas doses das toxinas associadas 

a áreas de refúgio, misturas de 

plantas com diferentes toxinas, mosaicos 

de plantas geneticamente 

modificadas, combinações de toxinas 

com diferentes modos de ação, 

ou a combinação de plantas expressando 

baixas doses das toxinas 

e controle complementar das 

pragas pelos inimigos naturais e a 

expressão das toxinas em determinados 

tecidos ou em um período 

de ataque mais intenso da praga 

(Neppl, 2000). 

A estratégia empregada nos 

países com plantio de milho Bt 

onde as pragas apresentam hábito 

migratório dos adultos e alta mobilidade 

nas formas larvais tem sido 

a utilização de plantas expressando 

altas doses das toxinas associadas 

às áreas de refúgio. Esta tática 

começou a ser adotada baseandose 

no princípio de que os insetos 

suscetíveis poderiam imigrar para 

uma área com predominância de 

insetos resistentes e, por cruzamento, 

diluir os alelos de resistência 

na população da praga. Este 

princípio apenas é valido com a 

expressão das toxinas de Bt em 

altas doses de modo que a resis- 

tência seja funcionalmente recessiva. 

Deste modo, apenas restariam 

na área com plantas geneticamente 

modificadas os indivíduos 

resistentes. O refúgio pode variar 

em tamanho e disposição e servir 

como reservatório de insetos suscetíveis. 

O sucesso desta estratégia 

depende das seguintes condições: 

que o acasalamento seja aleatório 

entre os indivíduos resistentes 

e suscetíveis, que os insetos 

suscetíveis migrem da área de refúgio 

para a área com as plantas 

geneticamente modificadas e exista 

sincronia na emergência de insetos 

entre as duas áreas. 

Outra estratégia possível para 

a liberação de plantas geneticamente 

modificadas é a mistura de 

sementes transgênicas e convencionais 

na forma de linhas da cultura 

ou faixas de plantio. Uma área que 

utilize esta estratégia resulta numa 

mistura de plantas-Bt e convencionais. 

Deste modo, o refúgio de 

plantas convencionais seria disposto 

internamente na área com as 

plantas transgênicas. Este refúgio 

interno consistiria no reservatório 

de suscetibilidade para o fornecimento 

de indivíduos suscetíceis 

para acasalamento aleatório com 

os resistentes que restariam nas 

plantas geneticamente modificadas. 

A principal limitação deste 

método é a taxa de movimento 

entre plantas nas formas larvais da 

praga-alvo de controle. Esta tática 

é indicada para casos específicos 

nos quais a forma larval da praga 

que se encontra nas plantas convencionais 

não se disperse para 


resistentes causando a morte dos 

indivíduos suscetíveis. 

A mistura de sementes na forma 

de linhas de plantio com sementes 

convencionais internamente à 

área de algodão Bt têm sido utilizada 

com sucesso no Arizona, EUA, 

para o manejo de lagarta rosada 

Pectinophora gossypiella. Neste 

caso, a lagarta rosada permanece 

dentro das maçãs atacadas o que 

limita o movimento das formas 

larvais desta espécie entre as plantas 

garantindo a sobrevivência dos 

indivíduos suscetíveis. Esta estraté- 

gia não seria adequada para o manejo 

de S. frugiperda já que está 

espécie apresenta alta mobilidade 

na sua larval. A técnica do plantio 

em forma de mosaico envolve áreas 

com plantas Bt expressando diferentes 

toxinas inseticidas. Deste 

modo, os insetos estariam sofrendo 

diferentes pressões de seleção ao 

longo da faixa de plantio de áreas 

geneticamente modificadas. No 

entanto, para que esta estratégia 

funcione é importante que não ocorra 

resistência cruzada entre as toxinas 

empregadas. Além disso, existem 

críticas quanto à possível eficiência 

das diferentes áreas Bt em 

atuarem como reservatórios de suscetibilidade 

recíprocos, o que possibilitaria 

a imigração de indivíduos 

suscetíveis entre as diferentes áreas 

para a diluição dos alelos de 

resistência. 

Outra alternativa viável é a rotação 

de plantas dispondo deferentes 

toxinas inseticidas. Assim como no 

caso do mosaico, a resistência cruzada 

entre as toxinas pode comprometer 

a eficácia deste método. As bases 

teóricas na estratégia da rotação são 

que o custo adaptativo associado à 

resistência leva a redução da freqüência 

dos indivíduos suscetíveis e 

a imigração de indivíduos suscetíveis. 

(Hoy, 1988). 

A expressão da toxina de Bt em 

tecidos e estádio fenológicos adequados 

específicos é uma estratégia 

que visa diminuir a pressão de seleção 

das plantas-Bt sobre a população 

de insetos (Frutos et al., 1999). 

Esta estratégia é similar ao uso de 

áreas refúgio e mistura de sementes 

no sentido que a própria planta 

pode atuar como refúgio (Mallet & 

Porter, 1992). As plantas poderiam 

produzir as toxinas somente quando 

o nível de dano fosse alcançado ou 

em determinados tecidos mais propensos 

ao ataque. No entanto, esta 

estratégia não funcionaria para pragas 

que atacam todas as partes da 

planta. Além disso, esta tática é 

dependente de estudos avançados 

em biologia molecular a fim de se 

encontrar os promotores específicos 

que seriam responsáveis pelo 

direcionamento da expressão das 

toxinas inseticidas. 


Embora estudos conduzidos em 

laboratório relatem a casos de resistência 

as toxinas de Bt e freqüência 

inicial elevada de resistência, nos 

países que adotam a tecnologia de 

plantas Bt no manejo das pragas os 

programas de monitoramento não 

detectaram ainda aumento na 

frequência de resistência (Tabashnik 

et. al.,2003). Exemplos de programas 

de monitoramento estabelecidos 

e bem sucedidos incluem O. 

nubilalis (Estados Unidos – 6 anos), 

P. gossypiella (Arizona-5 anos), 

Helicoverpa armigera (Nordeste da 

China-3 anos) e Helicoverpa zea (Carolina 

do Norte-2 anos). 

Assim, torna-se fundamental o 

desenvolvimento de programas de 

monitoramento como parte dos programas 

que visem manejar a evolução 

da resistência. Entretanto, as 

estratégias para o manejo da resistência 

somente obtêm o êxito esperado 

se forem adequadamente 

implementadas. É importante que o 

agricultor compreenda estas estratégias, 

além do monitoramento e assistência 

técnica para o sucesso destes 

programas (Neppl, 2000). Ainda 

são necessários estudos para otimizar 

os resultados obtidos com as estratégias 

de manejo da resistência, entre 

estes, destacam-se as pesquisas 

voltadas para os hábitos dos insetos 

(migração e acasalamento) que podem 

influenciar decisivamente na 

viabilidade das táticas empregadas. 

Dificilmente pode-se assegurar o 

êxito destes programas, pois em 

campo muitas variáveis são somadas 

aos modelos propostos e, atualmente, 

nenhuma das táticas acima 

descritas são completamente aceitáveis 

em termos de eficácia. 

5. Considerações Finais 

O uso das estratégias de manejo 

implica significativa demanda de 

mão-de-obra especializada, principalmente 

no sentido de monitorar a 

evolução da resistência em áreas 

cultivadas com plantas geneticamente 

modificadas expressando 

toxinas de Bt. Geralmente, a assistência 

técnica disponível aos agricultores 

limita-se a recomendação 

de insumos para viabilizar sua ativi- 

dade agrícola, de maneira que os 

extensionistas dificilmente atuam 

como agentes introdutórios de novas 

tecnologias e conhecedores do 

seu impacto sobre o meio onde 

atuam. Além de determinar o impacto 

das plantas transgênicas sobre 

o meio ambiente, é necessário 

também instruir e qualificar tanto o 

agricultor como o extensionista sobre 

o potencial desta moderna tática 

de controle de pragas. A implementação 

de estratégias de manejo 

de resistência e programas de monitoramento 

são fundamentais para 

a exploração sustentável da tecnologia 

das plantas Bt. Estas atividades 

são exigentes em mão-de-obra 

treinada e apoio logístico pelos produtores 

rurais, órgãos de assistência 

técnica, grupos de consultores 

envolvidos com a cultura e das 

empresas produtoras de sementes 

geneticamente modificadas. 

Por fim, não é correto se pensar 

que as plantas geneticamente modificadas 

serão a alternativa definitiva 

para o controle de pragas. O sistema 

planta-inseto deve ser estudado e 

avaliada a relação custo x benefício 

da adoção destas plantas geneticamente 

modificadas resistentes a insetos. 

Deve-se conhecer toda a gama 

de alternativas existentes e escolher 

aquela que melhor viabiliza a atividade 

agrícola, porém levando-se em 

conta o seu impacto sobre o meio 

ambiente em comparação às demais 

alternativas disponíveis para o controle 

de pragas. 

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Pesquisa 

Luiz Pereira Ramos, Ph.D. 

Professor Adjunto IV, Departamento de Química, 

Universidade Federal do Paraná 

lramos@quimica.ufpr.br 

Karla Thomas Kucek, B.Sc. 

Mestranda em Química Orgânica, Departamento 

de Química, Universidade Federal do Paraná 

k.kucek@hotmail.com 

Anderson Kurunczi Domingos, B.Sc. 

Mestrando em Química Orgânica, Departamento 

de Química, Universidade Federal do Paraná 

anderson@quimica.ufpr.br 

Helena Maria Wilhelm, Ph.D. 

Pesquisadora, Unidade Tecnológica de Química 

Aplicada, Depto. de Química Aplicada, Instituto 

de Tecnologia para o Desenvolvimento, LACTEC 

helenaw@lactec.org.br 


Biodiesel 


Um projeto de sustentabilidade econômica e sócio-ambiental para o Brasil 

1 - Introdução 

Desde o século passado, os combustíveis 

derivados do petróleo têm 

sido a principal fonte de energia 

mundial. No entanto, previsões de 

que esse recurso deva chegar ao fim, 

somadas às crescentes preocupações 

com o ambiente, têm instigado a 

busca de fontes de energia renovável 

(Ghassan et al., 2003). 

O Protocolo de Quioto, concebido 

durante o fórum ambiental Rio-92 

e ratificado, desde então, por mais de 

93 países, vem tentando mobilizar a 

comunidade internacional para que 

promova uma ação conjunta com o 

objetivo de estabilizar na atmosfera a 

concentração dos gases causadores 

do efeito estufa e, assim, limitar a 

interferência antropogênica sobre o 

sistema climático global (Greenpeace 

International, 2003). Infelizmente, os 

termos do referido acordo somente 

entrarão rigorosamente em vigor 

quando o conjunto de seus signatários 

somar, no mínimo, 55% do total de 

países emissores do globo, algo que 

somente será possível com a ratificação 

de, pelo menos, uma das grandes 

potências mundiais, a Rússia ou os 

Estados Unidos. Em pronunciamentos 

recentes, o Presidente da Rússia, 

Vladimir Putin, declarou estar ainda 

avaliando as condições que levarão o 

seu país a tomar tal decisão, demonstrando 

que, apesar da evidência de 

que o acúmulo desses gases na atmosfera 

comprometa fortemente o 

equilíbrio dos diferentes ecossistemas 

terrestres, interesses geopolíticos 

e/ou comerciais têm prevalecido so- 

bre os mais eloqüentes interesses da 

humanidade. 

O Brasil, apesar de não ser um 

grande emissor de gases poluentes, 

vem promovendo medidas condizentes 

com essa nova conjuntura, através 

do desenvolvimento e da atualização 

periódica de inventários nacionais 

sobre o tema (Ministério da 

Ciência e Tecnologia, 2002). No 

momento em que o mercado de carbono 

estiver regulamentado, esses 

inventários terão uma importância 

vital para que o país possa conquistar 

espaço e usufruir dessa nova estratégia 

de redistribuição de riquezas e de 

inclusão social. 

Sabe-se que as metas estabelecidas 

pelo Protocolo de Quioto somente 

poderão ser alcançadas pelo 

uso sustentado da biomassa para 

fins energéticos. No entanto, recentes 

levantamentos demonstram que 

apenas 2,2% da energia consumida 

no mundo é proveniente de fontes 

renováveis (Pessuti, 2003), o que 

evidencia um extraordinário potencial 

para a exploração de outras 

fontes. Considerando-se apenas a 

biomassa proveniente de atividades 

agroindustriais, ou seja, resíduos 

agrícolas, florestais e agropecuários, 

calcula-se que o potencial 

combustível desse material seja 

equivalente a, aproximadamente, 

6.587 milhões de litros de petróleo 

ao ano (Staiss e Pereira, 2001). Diante 

de todo esse potencial, tem 

havido uma crescente disseminação 

de projetos e de ações voltados 

para o uso de óleos vegetais e de 

resíduos urbanos e agroindustriais

para a geração de energia, particularmente 

por meio de projetos de 

co-geração (Cenbio, 2003). 

2 - Óleos vegetais como 

fonte de energia renovável 

Por se tratar de uma fonte de 

energia renovável e por seu uso 

sustentado não provocar danos ao 

meio ambiente, a biomassa tem atraído 

muita atenção nos últimos tempos 

(Ministério da Indústria e do 

Comércio, 1985; Ministério da Ciência 

e Tecnologia, 2002; U.S. 

Department of Energy, 1998). Dentre 

as fontes de biomassa prontamente 

disponíveis, os óleos vegetais 

têm sido largamente investigados 

como candidatos a programas 

de energia renovável, pois proporcionam 

uma geração descentralizada 

de energia e um apoio à agricultura 

familiar, criando melhores condições 

de vida (infra-estrutura) em 

regiões carentes, valorizando potencialidades 

regionais e oferecendo 

alternativas a problemas econômicos 

e sócio-ambientais de difícil 

solução. 

A utilização de óleos vegetais in 

natura como combustível alternativo 

tem sido alvo de diversos estudos 

nas últimas décadas (Nag et al., 1995; 

Piyaporn et al., 1996). No Brasil, já 

foram realizadas pesquisas com os 

óleos virgens de macaúba, pinhãomanso, 

dendê, indaiá, buriti, pequi, 

mamona, babaçu, cotieira, tingui e 

pupunha (Barreto, 1982; Ministério 

da Indústria e do Comércio, 1985; 

Serruya, 1991) e nos testes realizados 

com esses óleos em caminhões e 

máquinas agrícolas, foi ultrapassada 

a meta de um milhão de quilômetros 

rodados (Ministério da Indústria e do 

Comércio, 1985). No entanto, esses 

estudos demonstraram a existência 

de algumas desvantagens no uso direto 

de óleos virgens: (a) a ocorrência 

de excessivos depósitos de carbono 

no motor; (b) a obstrução nos 

filtros de óleo e bicos injetores; (c) a 

diluição parcial do combustível no 

lubrificante; (d) o comprometimento 

da durabilidade do motor; e (e) um 

aumento considerável em seus custos 

de manutenção. 

Outros autores (Goering e Fry, 

1984; Kobmehl e Heinrich, 1998; 

Ghassan et al., 2003) demonstraram 

que a alta viscosidade e a baixa 

volatilidade dos óleos vegetais in 

natura podem provocar sérios problemas 

ao bom funcionamento do 

motor. Dentre os problemas que 

geralmente aparecem após longos 

períodos de utilização, destacam-se 

a formação de depósitos de carbono 

por combustão incompleta, a diminuição 

da eficiência de lubrificação 

do óleo pela ocorrência de polimerização 

(no caso de óleos poli-insaturados) 

e a atomização ineficiente 

e/ou entupimento dos sistemas de 

injeção (Peterson et al., 1983; Pryde, 

1983; Ma e Hanna, 1999). 

Para resolver as desconformidades 

descritas acima, houve um 

considerável investimento na adaptação 

dos motores para que o uso 

de óleos vegetais in natura pudesse 

ser viabilizado, particularmente 

na produção de energia elétrica em 

geradores movidos por motores estacionários 

de grande porte. Nesses 

casos, o regime de operação do 

motor é constante e isso facilita o 

ajuste dos parâmetros para garantir 

uma combustão eficiente do óleo 

vegetal, podendo ser utilizada, inclusive, 

uma etapa de pré-aquecimento 

(pré-câmaras) para diminuir 

a sua viscosidade e facilitar a injeção 

na câmara de combustão. No 

entanto, para motores em que o 

regime de funcionamento é variável 

(e.g., no setor de transportes), 

foi necessário desenvolver uma metodologia 

de transformação química 

do óleo para que suas propriedades 

se tornassem mais adequadas 

ao seu uso como combustível. Assim, 

em meados da década de 70, 

surgiram as primeiras propostas de 

modificação de óleos vegetais através 

da reação de transesterificação 

(Figura 1), cujos objetivos eram os 

de melhorar a sua qualidade de 

ignição, reduzir o seu ponto de 

fluidez, e ajustar os seus índices de 

viscosidade e densidade específica 

(Shay, 1993, Stournas et al., 1995; 

Ma e Hanna, 1999). 

3 - O biodiesel como 

alternativa para a matriz 

energética nacional 

Por definição, biodiesel é um 

substituto natural do diesel de petróleo, 

que pode ser produzido a 

partir de fontes renováveis como 

óleos vegetais, gorduras animais e 

óleos utilizados para cocção de alimentos 

(fritura). Quimicamente, é 

definido como éster monoalquílico 

de ácidos graxos derivados de 

lipídeos de ocorrência natural e 

pode ser produzido, juntamente com 

a glicerina, através da reação de 

triacilgliceróis (ou triglicerídeos) 

com etanol ou metanol, na presença 

de um catalisador ácido ou básico 

(Schuchardt et al., 1998; Zagonel 

e Ramos, 2001; Ramos, 1999, 2003). 

Embora essa tenha sido a definição 

mais amplamente aceita desde os 

primeiros trabalhos relacionados 

com o tema, alguns autores preferem 

generalizar o termo e associálo 

a qualquer tipo de ação que 

promova a substituição do diesel 

na matriz energética mundial, como 

nos casos do uso de: (a) óleos 

vegetais in natura, quer puros ou 

em mistura; (b) bioóleos, produzidos 

pela conversão catalítica de 

óleos vegetais (pirólise); e (c) microemulsões, 

que envolvem a injeção 

simultânea de dois ou mais 

combustíveis, geralmente 

imiscíveis, na câmara de combustão 

de motores do ciclo diesel (Ma 

e Hanna, 1999). Portanto, é importante 

frisar que, para os objetivos 

deste artigo, biodiesel é tão-somente 

definido como o produto da transesterificação 

de óleos vegetais que 

atende aos parâmetros fixados pelas 

normas ASTM D6751 (American 

Standard Testing Methods, 2003) e 

Figura 1. Reação de transesterificação de óleos vegetais e/ou gorduras animais. 


DIN 14214 (Deutsches Institut für 

Normung, 2003), ou pela Portaria 

n o 255 da ANP (Agência Nacional 

do Petróleo, 2003) que, apesar de 

provisória, já estabelece as especificações 

que serão exigidas para 

que esse produto seja aceito no 

mercado brasileiro. A grande compatibilidade 

do biodiesel com o 

diesel convencional o caracteriza 

como uma alternativa capaz de atender 

à maior parte da frota de veículos 

a diesel já existente no mercado, 

sem qualquer necessidade de 

investimentos tecnológicos no desenvolvimento 

dos motores. Por 

outro lado, o uso de outros combustíveis 

limpos, como o óleo in 

natura, as microemulsões, o gás 

natural ou o biogás requerem uma 

adaptação considerável para que o 

desempenho exigido pelos motores 

seja mantido (Laurindo, 2003). 

Do ponto de vista econômico, a 

viabilidade do biodiesel está relacionada 

com o estabelecimento de um 

equilíbrio favorável na balança comercial 

brasileira, visto que o diesel 

é o derivado de petróleo mais consumido 

no Brasil, e que uma fração 

crescente desse produto vem sendo 

importada anualmente (Nogueira e 

Pikman, 2002). 

Em termos ambientais, a adoção 

do biodiesel, mesmo que de 

forma progressiva, ou seja, em adições 

de 2% a 5% no diesel de 

petróleo (Ministério da Ciência e 

Tecnologia, 2002), resultará em uma 

redução significativa no padrão de 

emissões de materiais particulados, 

óxidos de enxofre e gases que contribuem 

para o efeito estufa 

(Mittelbach et al., 1985). Sendo assim, 

sua difusão, em longo prazo, 

proporcionará maiores expectativas 

de vida à população e, como 

conseqüência, um declínio nos gastos 

com saúde pública, possibilitando 

o redirecionamento de verbas 

para outros setores, como educação 

e previdência. Cabe aqui ainda 

ressaltar que a adição de biodiesel 

ao petrodiesel, em termos gerais, 

melhora as características do combustível 

fóssil, pois possibilita a 

redução dos níveis de ruído e melhora 

a eficiência da combustão 

pelo aumento do número de cetano 

(Gallo, 2003). 

Em diversos países, o biodiesel 

já é uma realidade. Na Alemanha, 

por exemplo, existe uma frota significativa 

de veículos leves, coletivos 

e de carga, que utilizam biodiesel 

derivado de plantações específicas 

para fins energéticos e distribuído 

por mais de 1.000 postos de abastecimento. 

Outros países também têm 

desenvolvido os seus programas nacionais 

de biodiesel e, como conseqüência, 

o consumo europeu de biodiesel 

aumentou em 200.000 ton. 

entre os anos de 1998 e 2000. Já nos 

Estados Unidos, leis aprovadas nos 

estados de Minnesotta e na Carolina 

do Norte determinaram que, a partir 

de 1º/1/2002, todo o diesel consumido 

deveria ter a incorporação de, 

pelo menos, 2% de biodiesel em 

base volumétrica. 

No Brasil, desde as iniciativas 

realizadas na década de 80, pouco se 

investiu nesse importante setor da 

economia, mas a reincidência de turbulências 

no mercado internacional 

do petróleo, aliada às pressões que o 

setor automotivo vem sofrendo dos 

órgãos ambientais, fez com que o 

Governo atual iniciasse um novo tra- 


balho com vistas à utilizar óleos vegetais 

transesterificados na matriz 

energética nacional. Esse trabalho foi 

recentemente materializado na forma 

de um programa nacional, 

intitulado PROBIODIESEL (Portaria 

n o . 702 do MCT, de 30 de outubro de 

2002), cujo lançamento solene foi 

realizado em Curitiba durante a cerimônia 

de abertura do Seminário Internacional 

de Biodiesel (24 a 26 de 

outubro, Blue Tree Towers Hotel). 

Naquela mesma ocasião, foi também 

divulgada a criação do CERBIO, Centro 

Nacional de Referência em Biocombustíveis, 

nas dependências do 

Tecpar, em Curitiba. A missão do 

CERBIO será a de desenvolver o 

conceito de biocombustíveis em sua 

plenitude, desde a certificação de 

produtos até o desenvolvimento tecnológico 

de novas rotas que contribuam 

para o aumento da viabilidade 

e competitividade técnica do biodiesel 

nacional. 

Ao longo dos últimos anos, o 

PROBIODIESEL vem se desenvolvendo 

por meio de ações integradas 

entre instituições de tecnologia, ensino 

e pesquisa, e empresas e associações 

direta ou indiretamente ligadas 

ao tema, sob a forma de grupos 

de trabalho que integram a chamada 

Rede Brasileira de Biodiesel. Esse 

programa tem como principal objetivo 

promover o desenvolvimento 

das tecnologias de produção e avaliar 

a viabilidade e a competitividade 

técnica, sócio-ambiental e econômica 

do biodiesel para os mercados 

interno e externo, bem como de sua 

produção e distribuição espacial nas 

diferentes regiões do país (Andrade, 

2003; Ministério da Ciência e Tecnologia, 

2002). 

Tabela 

1. 

Número 

de 

iodo 

e composição 

química 

em 

ácidos 

graxos 

de 

alguns 

dos 

principais 

óleos 

vegetais 

e gorduras 

animais 

disponíveis 

para 

a produção 

de 

biodiesel 

( adaptad 

o de 

Alsberg 

e Taylor, 

1928) 

. 

Fonte 

Número 

de 

Iodo 

Láurico Mirístico Principais 

Ácidos 

Graxos 

Palmítico Esteárico Oléico Linoléico Linolênico 

Sebo bovino 

38-46 - 2, 0 29, 0 24, 5 44, 5 - - 

Banha ( suíno 

s) 

46-70 - - 24, 6 15, 0 50, 4 10, 0 - 

Côco 8, 10 

45, 0 20, 0 5, 0 3, 0 6, 0 - - 

Oliva 79-88 - - 14, 6 - 75, 4 10, 0 - 

Amend oin 

83-100 - - 8, 5 6, 0 51, 6 26, 0 - 

Algodão 108-110 - - 23, 4 - 31, 6 45, 0 - 

Milho 111-130 - - 6, 0 2, 0 44, 0 48, 0 - 

Flax 173-201 - 3, 0 6, 0 - - 74, 0 17, 

0 

Soja 137-143 - - 11, 0 2, 0 20, 0 64, 0 3, 

0

4 - Principais matériasprimas 

para a produção de 

biodiesel 

De uma forma geral, pode-se 

afirmar que monoalquil-ésteres de 

ácidos graxos podem ser produzidos 

a partir de qualquer tipo de 

óleo vegetal (Tabela 1), mas nem 

todo óleo vegetal pode (ou deve) 

ser utilizado como matéria-prima 

para a produção de biodiesel. Isso 

porque alguns óleos vegetais apresentam 

propriedades não ideais, 

como alta viscosidade ou alto número 

de iodo, que são transferidas 

para o biocombustível e que o tornam 

inadequado para uso direto 

em motores do ciclo diesel. Portanto, 

a viabilidade de cada matériaprima 

dependerá de suas respectivas 

competitividades técnica, econômica 

e sócio-ambiental, e passam, 

inclusive, por importantes aspectos 

agronômicos, tais como: (a) 

o teor em óleos vegetais; (b) a 

produtividade por unidade de área; 

(c) o equilíbrio agronômico e demais 

aspectos relacionados com o 

ciclo de vida da planta; (d) a atenção 

a diferentes sistemas produtivos; 

(e) o ciclo da planta (sazonalidade); 

e (f) sua adaptação territorial, 

que deve ser tão ampla quanto 

possível, atendendo a diferentes 

condições edafoclimáticas (Ramos, 

1999, 2003). 

Dada a grandeza do agronegócio 

da soja no mercado brasileiro, 

é relativamente fácil e imediado 

reconhecer que essa oleaginosa 

apresenta o maior potencial para 

servir de modelo para o desenvolvimento 

de um programa nacional 

de biodiesel. Apenas como exemplo, 

dados divulgados pela Abiove 

(Associação Brasileira dos Produtores 

de Óleos Vegetais) demonstram 

que o setor produtivo da soja 

já está preparado para atender à 

demanda nacional de misturar até 

5% de biodiesel no diesel de petróleo, 

sendo que proporções superiores 

a esta mereceriam uma nova 

avaliação para que não haja dúvidas 

quanto ao abastecimento de 

óleo a esse novo setor da economia. 

Por outro lado, segundo da- 

dos oficiais da Embrapa (Peres e 

Junior, 2003), o Brasil apresenta 

um potencial de 90 milhões de 

hectares disponíveis, em áreas degradadas 

e/ou não exploradas, para 

a expansão da atual fronteira agrícola. 

Considerando-se apenas a utilização 

da soja como matéria-prima 

para a produção de biodiesel, 

serão necessários apenas 3 milhões 

de hectares, ou 1,8 bilhões de litros 

de óleo, para a implementação 

do B5 (mistura composta de 

5% de biodiesel e 95% do petrodiesel), 

o que culminaria na geração 

de cerca de 234 mil empregos diretos 

e indiretos. 

Além da soja, várias outras oleaginosas 

(e.g., Tabela 1), que ainda 

se encontram em fase de avaliação 

e desenvolvimento de suas cadeias 

produtivas, podem ser empregadas 

para a produção do biodiesel (Parente, 

2003). A região norte, por 

exemplo, apresenta potencial para 

uso de dendê, babaçu e soja; a 

região nordeste, de babaçu, soja, 

mamona, dendê, algodão e coco; a 

região centro-oeste, de soja, 

mamona, algodão, girassol, dendê 

e gordura animal; a região sul, de 

soja, colza, girassol e algodão; e a 

região sudeste, de soja, mamona, 

algodão e girassol (Campos, 2003; 

Peres e Junior, 2003). Várias dessas 

oleaginosas já tiveram as suas respectivas 

competitividades técnica e 

sócio-ambiental demonstradas para 

a produção de biodiesel, restando, 

na maioria dos casos, um estudo 

agronômico mais aprofundado que 

ratifique os estudos de viabilidade. 

Deve-se ainda destacar que a 

inserção do biodiesel na matriz energética 

nacional representa um poderoso 

elemento de sinergia para 

com o agronegócio da cana, cujo 

efeito será extremamente benéfico 

para a economia nacional (Ramos, 

1999, 2003). A produção de etanol 

é expressiva em, praticamente, todas 

as regiões do país, e o novo 

programa somente terá a contribuir 

para o aumento da competitividade 

do setor, valendo-se, inclusive, da 

rede de distribuição já existente e 

do excelente desempenho das tecnologias 

desenvolvidas para a ca- 

deia produtiva da cana (Campos, 

2003). Nesse contexto, o Brasil se 

encontra em uma condição que país 

algum jamais esteve na história do 

mundo globalizado. Com a evidente 

decadência das fontes fósseis, 

nenhuma outra região tropical tem 

porte e condições tão favoráveis 

para assumir a posição de um dos 

principais fornecedores de biocombustíveis 

e tecnologias limpas para 

o século XXI (Vidal, 2000). 

5 - O processo de produção 

de biodiesel por catálise 

homogênea em meio 

alcalino 

A transesterificação de óleos vegetais 

ou gordura animal, também 

denominada de alcoólise, pode ser 

conduzida por uma variedade de rotas 

tecnológicas em que diferentes 

tipos de catalisadores podem ser empregados, 

como bases inorgânicas 

(hidróxidos de sódio e potássio e 

bases de Lewis), ácidos minerais (ácido 

sulfúrico), resinas de troca iônica 

(resinas catiônicas fortemente ácidas), 

argilominerais ativados, hidróxidos 

duplos lamelares, superácidos, 

superbases e enzimas lipolíticas 

(lipases) (Schuchardt et al., 1998; Ramos, 

2003). Não há dúvidas de que 

algumas dessas rotas tecnológicas, 

particularmente aquelas que empregam 

catalisadores heterogêneos, apresentam 

vantagens interessantes como 

a obtenção de uma fração glicerínica 

mais pura, que não exija grandes 

investimentos de capital para atingir 

um bom padrão de mercado. Porém, 

é também correta a afirmação de que 

a catálise homogênea em meio alcalino 

ainda prevalece como a opção 

mais imediata e economicamente viável 

para a transesterificação de óleos 

vegetais (Zagonel e Ramos, 2001; Ramos, 

2003). Um fluxograma simplificado 

do processo de produção de 

biodiesel, utilizando a transesterificação 

etílica em meio alcalino como 

modelo, encontra-se apresentado na 

Figura 2. 

Seja qual for a rota tecnológica 

escolhida, a transesterificação de 

óleos vegetais corresponde a uma 

reação reversível, cuja cinética é 

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 31

Figura 2. Fluxograma simplificado de produção de ésteres etílicos a partir de óleos 

vegetais e gordura animal. 

regida pelo princípio enunciado em 

1888 pelo químico francês Henry- 

Louis Le Chatelier (1850-1936) (Figura 

1). Portanto, o rendimento da 

reação dependerá do deslocamento 

do equilíbrio químico em favor 

dos ésteres, através da otimização 

de fatores, tais como a temperatura 

de reação, a concentração e caráter 

ácido-base do catalisador, bem 

como o excesso estequiométrico 

do agente de transesterificação (álcool). 

Porém, conversões totais serão 

literalmente impraticáveis em 

uma única etapa reacional, pois, 

além de reversível, tem-se a ocorrência 

de reações secundárias como 

a saponificação. Para limitar a presença 

de triacilgliceróis não reagidos 

além dos limites tolerados pelo 

motor, muitos processos recorrem 

à condução da reação em duas etapas 

seqüenciais, que garantam taxas 

de conversão superiores a 98%. 

Por outro lado, a eliminação de 

sabões, catalisador residual e 

glicerol livre somente é possível 

através de etapas eficientes de lavagem. 

De acordo com a literatura, a 

reação de obtenção do éster metílico 

exige um excesso estequiométrico de 

metanol igual a 100% (razão molar 

álcool:óleo de 6:1), e uma quantidade 

de catalisador alcalino equivalente a 

0,5% a 1,0% em relação à massa de 

óleo, para que sejam obtidos rendimentos 

superiores a 95% (Freedman 

et al., 1986). No entanto, duas observações 

limitam a simples aplicação de 

uma recomendação como esta: (a) 

primeiramente, a matéria-prima a ser 


utilizada em cada região é diferente e 

isso implica na necessidade de estudos 

localizados, que permitam uma 

otimização realística ligada a avaliações 

confiáveis de toda a cadeia produtiva; 

e (b) as condições utilizadas 

para a reação de metanólise não podem 

ser transferidas para situações 

em que outros álcoois, como o etanol, 

sirvam de modelo. Com efeito, a transesterificação 

com metanol é tecnicamente 

mais viável do que a com 

etanol comercial, porque a água existente 

no etanol (4%-6%) retarda a 

reação. O uso de etanol anidro efetivamente 

minimiza esse inconveniente 

(Figura 2), embora não implique 

solução para o problema inerente à 

separação da glicerina do meio de 

reação que, no caso da síntese do 

éster metílico, é indiscutivelmente 

muito mais facilitada (Freedman et al., 

1986; Schuchardt et al., 1998; Ramos, 

1999). No entanto, basta um ajuste nas 

condições de reação para que a separação 

de fases aconteça espontaneamente, 

sendo que a eficiência do 

processo de decantação (da fração 

glicerínica) pode ser acelerada pelo 

uso de centrífugas contínuas, auxiliadas 

ou não pela adição de compostos 

tensoativos (Ramos, 2003). 

O processo de produção de biodiesel 

deve reduzir ao máximo a 

presença de contaminações no produto, 

como glicerina livre e ligada, 

sabões ou água (Figura 2). No caso 

da glicerina, reações de desidratação 

que ocorrem durante a combustão 

podem gerar acroleína, um 

poluente atmosférico muito perigoso, 

que pode, devido a sua 

reatividade, envolver-se em reações 

de condensação, que acarretam um 

aumento na ocorrência de depósitos 

de carbono no motor (Mittelbach et 

al., 1985). Sabões e ácidos graxos 

livres acarretam a degradação de 

componentes do motor, e a umidade, 

desde que acima de um limite 

tolerável, pode interferir na acidez 

do éster por motivar a sua hidrólise 

sob condições não ideais de estocagem. 

Por essas e outras razões, é 

imprescindível que sejam definidas 

especificações rígidas para o biodiesel, 

de forma que o sucesso do 

programa não venha a ser compro-

metido por ocorrências associadas 

ao mau controle de qualidade do 

produto. 

Independentemente da rota 

tecnológica, a aceitação do biodiesel 

no mercado precisa ser assegurada 

e, para isso, é indispensável 

que esse produto esteja dentro das 

especificações internacionalmente 

aceitas para o seu uso. No Brasil, 

esses parâmetros de qualidade encontram-se 

pré-fixados pela Portaria 

n o . 255 da ANP, cuja proposta foi 

baseada em normas já existentes na 

Alemanha (DIN) e nos Estados Unidos 

(ASTM). Tais características e/ 

ou propriedades, determinantes dos 

padrões de identidade e qualidade 

do biodiesel, incluem ponto de fulgor, 

teor de água e sedimentos, 

viscosidade, cinzas, teor de enxofre, 

corrosividade ao cobre, número 

de cetano, ponto de névoa, resíduo 

de carbono, número de acidez, 

curva de destilação (ou a temperatura 

necessária para a recuperação 

de 90% do destilado), estabilidade 

à oxidação, teor de glicerina livre e 

total, cor e aspecto (Agência Nacional 

do Petróleo, 2003). Dentre 

esses parâmetros, alguns têm merecido 

críticas da comunidade científica 

por não apresentarem aplicação 

direta ao biodiesel, como o 

índice de corrosividade ao cobre e 

a curva de destilação. Por essa razão, 

a especificação definida pela 

portaria é ainda provisional e poderá 

ser modificada em função de 

novas argumentações e dados experimentais 

gerados pela comunidade 

científica. 

Um aspecto extremamente importante 

da Portaria n o 255 da ANP 

está relacionado com as limitações 

que oferece para o aproveitamento 

de todos os óleos vegetais que se 

encontram disponíveis no território 

nacional. No entanto, é importante 

esclarecer que a especificação define 

a qualidade do produto a ser 

utilizado puro, ou seja, sem a sua 

diluição com diesel de petróleo. 

Por outro lado, se a concepção do 

programa nacional é a de facultar o 

uso de misturas dos tipos de B2 a 

B20, restringindo o uso de B100 

apenas a situações especiais (como 

na geração de energia elétrica em 

grupo-geradores), talvez fosse adequada 

(e possível) a flexibilização 

das especificações com vistas a uma 

maior inserção das diferentes oleaginosas 

que compõem o conjunto 

de alternativas regionais de nosso 

território. Essa flexibilização estaria, 

portanto, restrita somente ao 

uso do biodiesel em misturas, valendo-se 

do fator de diluição que a 

razão volumétrica definida pela 

mistura proporciona (Ramos, 2003). 

Vale ressaltar que a adição de um 

biodiesel de qualidade ao diesel, 

até um limite de 20% (B20), não 

modifica drasticamente as suas propriedades 

e não o desqualifica perante 

a Portaria n o . 310 da ANP, cujo 

conteúdo estabelece as especificações 

para comercialização de óleo 

diesel automotivo em todo o território 

nacional. Obviamente, tal hipótese 

precisa ser estudada em todas 

as suas implicações, pois precisam 

ser dadas garantias para que a 

credibilidade do programa não sofra 

o impacto de serem consideradas 

experiências mal sucedidas 

possíveis falhas no funcionamento 

do motor e o subseqüente aumento 

nos seus custos de manutenção. 

Da mesma forma como foram 

definidos alguns aspectos agronômicos 

essenciais para que um determinado 

óleo vegetal apresente competitividade 

como matéria-prima 

para a produção de biodiesel, importantes 

aspectos tecnológicos também 

precisam ser atendidos e estes 

estão relacionados: (a) à complexidade 

exigida para o processo de 

extração e tratamento do óleo; (b) à 

presença de componentes indesejáveis 

no óleo, como é o caso dos 

fosfolipídeos presentes no óleo de 

soja; (c) ao teor de ácidos graxos 

poli-insaturados; (d) ao tipo e teor 

de ácidos graxos saturados; e (e) ao 

valor agregado dos co-produtos, 

como hormônios vegetais, vitaminas, 

anti-oxidantes, proteína e fibras 

de alto valor comercial. 

Diferentes oleaginosas apresentam 

diferentes teores em óleos 

vegetais (Tabela 1) e a complexidade 

exigida para a extração do óleo 

pode contribuir negativamente para 

a viabilidade do processo (Alsberg 

e Taylor, 1928). Oleaginosas de 

baixo teor de óleo, como a soja, 

exigem procedimentos de extração 

caros e relativamente complexos 

que praticamente restringem a viabilidade 

dessa matéria-prima àquelas 

regiões em que já exista uma 

razoável capacidade instalada para 

o esmagamento de grãos. Porém, 

oleaginosas de maior teor em óleos 

vegetais, cujos processos de extração 

sejam mais simplificados, certamente 

apresentarão melhor competitividade 

econômica por não exigirem 

a instalação de operações 

unitárias complexas para esse objetivo. 

Por outro lado, a qualidade do 

óleo poderá exigir uma etapa de 

refino para que também a qualidade 

no produto final seja garantida. 

Esse é certamente o caso da soja, 

que depende do refino para reduzir 

a presença de gomas e fosfolipídeos 

no biodiesel. Mais uma vez, é 

provável que essa observação tenha 

pouco significado para regiões 

onde a agroindústria da soja esteja 

verticalizada ao óleo refinado, mas, 

onde não haja esse potencial 

agroindustrial, seria desejável que 

as matérias-primas selecionadas 

para a produção não apresentassem 

tal limitação e pudessem sofrer 

a alcoólise sem exigir a implantação 

de uma unidade de refino. Há 

evidências de que alguns óleos vegetais 

podem oferecer essa vantagem, 

como os de girassol e de 

várias espécies de palmáceas (óleos 

laurílicos). 

O tipo e o teor de ácidos graxos 

presentes no óleo vegetal (Tabela 

1) têm um efeito marcante sobre a 

estabilidade do biodiesel diante do 

armazenamento e da oxidação. Por 

exemplo, quedas bruscas na temperatura 

ambiente promovem o aumento 

da viscosidade e a cristalização 

de ésteres graxos saturados 

que, eventualmente, podem causar 

o entupimento de filtros de óleo e 

sistemas de injeção. A tendência à 

“solidificação” do combustível é 

medida através dos pontos de névoa 

e de fluidez (ou de entupimento), 

que devem ser tanto mais baixo 

quanto possível. Abaixamentos no 


ponto de fluidez, muitas vezes motivados 

pela aditivação de inibidores 

de cristalização (Stournas et 

al., 1995; Ramos, 2003), representam 

menores restrições do biocombustível 

à variações de temperatura, 

evitando problemas de estocagem 

e de utilização em regiões 

mais frias. Obviamente, esse problema 

não é exclusivo do biodiesel, 

pois o diesel de petróleo contém 

parafinas que apresentam tipicamente 

o mesmo comportamento. 

A formação de depósitos por 

precipitação também ocorre em função 

do envelhecimento e/ou oxidação 

do biodiesel. Testes realizados 

pela Bosch (Dabague, 2003), em 

parceria com a ANFAVEA (Associação 

Nacional dos Fabricantes de 

Veículos Automotores), AEA (Associação 

Brasileira de Engenharia 

Automotiva) e Sindipeças (Sindicato 

Nacional da Indústria de Componentes 

para Veículos Automotores), 

constataram que a degradação 

oxidativa do biodiesel gera resinificação 

que, por aderência, constitui 

uma das principais causas da formação 

de depósitos nos equipamentos 

de injeção. Em decorrência 

desse fenômeno, foi também observada 

uma queda no desempenho, 

aumento da susceptibilidade à 

corrosão e diminuição da vida útil 

dos motores. 

O ranço oxidativo está diretamente 

relacionado com a presença 

de ésteres monoalquílicos insaturados. 

Trata-se da reação do oxigênio 

atmosférico com as duplas ligações 

desses ésteres, cuja reatividade aumenta 

com o aumento do número 

de insaturações na cadeia (Moretto 

e Fett, 1989). Assim, por ser relativamente 

insaturado, o biodiesel derivado 

do óleo de soja é muito 

susceptível à oxidação. Os ácidos 

linoleico e linolênico, que, juntos, 

correspondem a mais de 61% da 

composição desse óleo, apresentam, 

respectivamente, duas e três 

duplas ligações, que podem reagir 

facilmente com o oxigênio. 

A oxidação de óleos insaturados 

representa um processo relativamente 

complexo que envolve reações 

entre radicais livres e oxigê- 

nio molecular. Todo esse processo 

é geralmente resumido em três etapas, 

denominadas de iniciação, propagação 

e finalização. O processo 

de polimerização pode ser iniciado 

por traços de metais, calor (termólise), 

luz (fotólise) ou radicais 

hidroxila e hidroperoxila, gerados 

pela cisão homolítica de moléculas 

de água expostas à radiação 

(Kumarathasan et al., 1992). 

Os peróxidos e hidroperóxidos 

produzidos através da reação 

de auto-oxidação podem se polimerizar 

com outros radicais e produzir 

moléculas de elevada massa 

molar, sedimentos insolúveis, gomas 

e, em alguns casos, pode quebrar 

a cadeia do ácido graxo oxidado, 

produzindo ácidos de cadeias 

menores e aldeídos (Prankl e 

Schindlbauer, 1998). Estudos anteriores 

(Clark et al., 1984; Tao, 1995; 

System Lab Services, 1997) constataram 

que a formação desses ácidos 

pode estar ligada à corrosão do 

sistema combustível dos motores 

porque, devido à alta instabilidade 

dos hidroperóxidos, eles apresentam 

forte tendência a atacar 

elastômeros. 

A maioria dos trabalhos até então 

realizados sobre a estabilidade 

diante da oxidação do biodiesel referem-se 

ao estudo de ésteres 

metílicos (Prankl e Schindlbauer, 

1998; Ishido et al., 2001; Pedersen e 

Ingermarsson, 1999), visto que a 

maioria dos países que instituíram o 

uso desse biocombustível não apresenta 

disponibilidade nem infra-estrutura 

para produzir etanol como o 

Brasil. Esses trabalhos têm confirmado 

que, de um modo geral, o 

biodiesel de natureza metílica se 

oxida após curtos períodos de estocagem, 

e que sua inércia química 

está diretamente relacionada com 

os óleos vegetais empregados na 

sua produção (Prankl e Schindlbauer, 

1998). 

Um dos meios mais comumente 

utilizados para se inferir sobre a 

susceptibilidade de um determinado 

óleo à oxidação é a avaliação de 

seu número de iodo. O número de 

iodo revela o número de insaturações 

de uma determinada amostra e 


esse valor constitui um dos parâmetros 

de identidade dos óleos vegetais. 

Sendo assim, diferentes tipos 

de biodiesel apresentam números 

de iodo semelhantes aos dos triglicerídeos 

de origem. No entanto, 

deve-se salientar que, quando o 

objetivo é avaliar a estabilidade à 

oxidação de um dado óleo, as informações 

obtidas através desse método 

não são adequadas, pois o 

número de iodo não discrimina que 

compostos estão contribuindo para 

o valor encontrado. Desse modo, 

há óleos diferentes com números 

de iodo semelhantes, porém, com 

estabilidades à oxidação consideravelmente 

distintas. Para se inferir 

previsões acerca da estabilidade à 

oxidação de um dado óleo é, portanto, 

necessário que se conheça a 

sua composição percentual em ácidos 

graxos, o que só é possível 

através do emprego de métodos 

cromatográficos de análise. 

Somente através do conhecimento 

pleno das propriedades que 

determinam os padrões de identidade 

e a qualidade do biodiesel é 

que será possível estabelecer parâmetros 

de controle que garantirão 

a qualidade do produto a ser 

incorporado na matriz energética 

nacional. 

6 - Aspectos ambientais 

relacionados com o uso do 

biodiesel 

Sabe-se que o aumento na concentração 

dos gases causadores do 

efeito estufa, como o dióxido de 

carbono (CO 2 ) e o metano (CH 4 ), tem 

acarretado sérias mudanças climáticas 

no planeta. Efeitos como o aumento 

da temperatura média global, 

as alterações no perfil das precipitações 

pluviométricas e a elevação do 

nível dos oceanos poderão ser catastróficos 

frente à contínua tendência 

de aumento da população mundial 

(Peterson e Hustrulid, 1998; Shay, 

1993). Nesse sentido, a inserção de 

combustíveis renováveis em nossa 

matriz energética precisa ser incentivada 

para frear as emissões causadas 

pelo uso continuado de combustíveis 

fósseis.

Vários estudos têm demonstrado 

que a substituição do diesel de 

petróleo por óleos vegetais transesterificados 

reduziria a quantidade 

de CO 2 introduzida na atmosfera. A 

redução não se daria exatamente na 

proporção de 1:1, pois cada litro de 

biodiesel libera cerca de 1,1 a 1,2 

vezes a quantidade de CO 2 liberada 

na atmosfera por um litro de diesel 

convencional. Todavia, diferentemente 

do combustível fóssil, o CO 2 

proveniente do biodiesel é reciclado 

nas áreas agricultáveis, que geram 

uma nova partida de óleo vegetal 

para um novo ciclo de produção. 

Isso acaba proporcionando um balanço 

muito mais equilibrado entre a 

massa de carbono fixada e aquela 

presente na atmosfera que, por sua 

vez, atua no chamado efeito estufa. 

Portanto, uma redução real no 

acúmulo de CO 2 somente será possível 

com a diminuição do uso de 

derivados do petróleo. Para cada 

quilograma de diesel não usado, um 

equivalente a 3,11 kg de CO 2 , mais 

um adicional de 15% a 20%, referente 

à sua energia de produção, deixará 

de ser lançado na atmosfera. Foi 

também estimado que a redução 

máxima na produção de CO 2 , devido 

ao uso global de biodiesel, será 

de, aproximadamente, 113-136 bilhões 

de kg por ano (Peterson e 

Hustrulid, 1998). 

A utilização de biodiesel no 

transporte rodoviário e urbano oferece 

grandes vantagens para o meio 

ambiente, tendo em vista que a 

emissão de poluentes é menor que a 

do diesel de petróleo (Masjuk e 

Sapuan, 1995; Clark et al., 1984). 

Chang et al. (1996) demonstraram 

que as emissões de monóxido e 

dióxido de carbono e material 

particulado foram inferiores às do 

diesel convencional, enquanto que 

os níveis de emissões de gases nitrogenados 

(NOx) foram ligeiramente 

maiores para o biodiesel. Por outro 

lado, a ausência total de enxofre 

confere ao biodiesel uma grande 

vantagem, pois não há qualquer 

emissão dos gases sulfurados (e.g., 

mercaptanas, dióxido de enxofre) 

normalmente detectados no escape 

dos motores movidos a diesel. 

Outro aspecto de interesse ambiental 

está relacionado com as emissões 

de compostos sulfurados. Sabese 

que a redução do teor de enxofre 

no diesel comercial também reduz a 

viscosidade do produto a níveis não 

compatíveis com a sua especificação 

e que, para corrigir esse problema, 

faz-se necessária a incorporação de 

aditivos com poder lubrificante. Consumada 

a obrigatoriedade na redução 

dos níveis de emissão de compostos 

sulfurados a partir da combustão 

do diesel, a adição de biodiesel 

em níveis de até 5% (B5) corrigirá 

esta deficiência viscosimétrica, que 

confere à mistura propriedades lubrificantes 

vantajosas para o motor. 

Trabalhos já desenvolvidos no 

Brasil na década de 80, quando 

foram utilizados vários óleos vegetais 

transesterificados, também demonstraram 

bons resultados quando 

utilizados em motores de caminhões 

e tratores, tanto puros quanto 

em misturas do tipo B30 (Ministério 

da Indústria e do Comércio, 

1985). Mais recentemente, foram 

realizados testes no transporte urbano 

da cidade de Curitiba com 

ésteres metílicos de óleo de soja 

(Laurindo, 2003). Cerca de 80 mil 

litros de biodiesel foram cedidos 

pela American Soybean Association 

(EUA) e testados na forma da mistura 

B20, apresentando resultados 

bastante satisfatórios em relação ao 

controle. Os testes foram realizados 

em 20 ônibus de diferentes 

marcas durante três meses consecutivos, 

no primeiro semestre de 

1998; ao final dos trabalhos, os 

resultados obtidos mostraram uma 

redução média da fumaça emitida 

pelos veículos de, no mínimo, 35% 

(Laurindo e Bussyguin, 1999). 

O caráter renovável do biodiesel 

está apoiado no fato de as matériasprimas 

utilizadas para a sua produção 

serem oriundas de fontes renováveis, 

isto é, de derivados de práticas agrícolas, 

ao contrário dos derivados de 

petróleo. Uma exceção a essa regra 

diz respeito à utilização do metanol, 

derivado de petróleo, como agente 

transesterificante, sendo esta a matéria-prima 

mais abundantemente utilizada 

na Europa e nos Estados Unidos. 

Isso significa que a prática adotada no 

Brasil, isto é, a utilização do etanol, 

derivado de biomassa, torna o biodiesel 

um produto que pode ser considerado 

como verdadeiramente 

renovável (Zagonel, 2000). Assim, por 

envolver a participação de vários segmentos 

da sociedade, tais como as 

cadeias produtivas do etanol e das 

oleaginosas, a implementação do biodiesel 

de natureza etílica no mercado 

nacional abre oportunidades para grandes 

benefícios sociais decorrentes do 

alto índice de geração de empregos, 

culminando com a valorização do campo 

e a promoção do trabalhador rural. 

Além disso, há ainda as demandas por 

mão-de-obra qualificada para o processamento 

dos óleos vegetais, permitindo 

a integração, quando necessária, 

entre os pequenos produtores e 

as grandes empresas (Campos, 2003). 

5 - Conclusão 

A intensidade com que o tema 

biodiesel tem sido abordado em reuniões 

políticas, científicas e tecnológicas 

tem dado testemunho do interesse 

com que a sociedade e o setor 

produtivo vem encarando essa nova 

oportunidade de negócios para o 

país. Com efeito, diante de tantos 

benefícios, como a criação de novos 

empregos no setor agroindustrial, a 

geração de renda, o fomento ao 

cooperativismo, a perspectiva de 

contribuição ao equilíbrio de nossa 

balança comercial e pelos comprovados 

benefícios ao meio ambiente, 

pode-se dizer que o biodiesel tem 

potencial para constituir um dos principais 

programas sociais do governo 

brasileiro, representando fator de 

distribuição de renda, inclusão social 

e apoio à agricultura familiar. No 

entanto, neste momento em que as 

bases do programa nacional estão 

sendo ainda definidas, o desenvolvimento 

de projetos de cunho científico 

e tecnológico, que possam 

oferecer maior segurança aos nossos 

tomadores de decisão, é, no 

mínino, estrategicamente imprescindível 

ao país. 

No que diz respeito à evolução 

do programa nacional de biocombustíveis, 

algumas ações governa- 


mentais poderiam ser de extrema 

importância para acelerar o atendimento 

às suas principais metas tecnológicas: 

(a) instalação de uma 

unidade-piloto, desinteressada de 

qualquer ganho comercial e preferencialmente 

estabelecida em parceria 

com instituições públicas de 

pesquisa e desenvolvimento, para 

auxiliarem nos estudos de viabilidade 

técnica e econômica do biodiesel; 

(b) estabelecimento das especificações 

a serem exigidas para o 

licenciamento do produto (processo 

já iniciado pela ANP, através da 

Portaria n o . 255); (c) ampliação 

dos testes em frota cativa para dirimir 

quaisquer dúvidas que ainda 

persistam sobre o desempenho e a 

viabilidade do biodiesel, particularmente 

de natureza etílica, seja 

puro ou em misturas do tipo B2 a 

B20; e (d) abertura de linhas de 

financiamento para o desenvolvimento 

de novas rotas tecnológicas, 

com vistas a simplificar e/ou a 

otimizar o processo, a ampliação 

das perspectivas para a utilização 

de seus subprodutos e a diversificação 

da matéria-prima para atender 

a vocações regionais. 

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Pesquisa 

Marcos Barros de Medeiros 

Doutor em Entomologia - ESALQ/USP 

Professor Adjunto Centro de Formação de 

Tecnólogos / UFPB - Campus de Bananeiras. 

barros@iwpb.com.br; 

ciagra@cft.ufpb.br 

Paulo Alves Wanderley 

Doutor em Agronomia - FCAV/UNESP, 

Professor nível E do Centro de Formação de 

Tecnólogos / UFPB - Campus de Bananeiras 

Maria José Araújo Wanderley 

Doutora em Agronomia - FCAV/UNESP, 

Bolsista de Desenvolvimento Científico Regional 

CNPq, UFPB Departamento de Ciências Básicas e 

Sociais, Campus de Bananeiras 


Biofertilizantes 

Líquidos 


Processo trofobiótico para proteção de plantas em cultivos orgânicos 

1 - Introdução 

Nos países desenvolvidos e em 

vários outros em desenvolvimento, 

como o Brasil, os organoclorados foram 

proibidos para o uso agrícola. 

Porém, essa foi apenas uma medida 

isolada, uma vez que tais produtos 

circulam hoje por toda a biosfera 

(Paschoal, 1995). O uso de produtos 

químicos sem a observação da complexidade 

de fatores que interagem 

nos agroecossistemas tem sido a maior 

causa de desequilíbrio nesses sistemas, 

tais como o desenvolvimento de 

resistência ao pesticida, ressurgimento 

e desencadeamento de pragas secundárias 

e quebra de cadeias alimentares 

a partir da eliminação de seus 

inimigos naturais (parasitóides e predadores) 

(Medeiros, 1998). 

Até 1945 os ácaros fitófagos eram 

tidos como pragas secundárias da 

agricultura. No entanto, o desenvolvimento 

destas espécies nocivas vem 

atingindo, cada vez mais, uma elevada 

significação econômica, ao mesmo 

tempo em que sua lista não pára 

de crescer. Antes de 1946, havia 

apenas 10 espécies de insetos e carrapatos 

resistentes, todas a produtos 

inorgânicos minerais. Em 1969 a resistência 

foi confirmada para 424 espécies, 

sendo 97 de importância 

médica ou veterinária e 127 de importância 

agrícola e florestal e de 

produtos armazenados (Paschoal, 

1979; Chaboussou 1980). Na década 

de 90, pelo menos 504 espécies de 

insetos e ácaros foram dadas como 

resistentes a pelo menos um pesticida. 

Destas, 23 espécies são benéficas e 

481 são nocivas, sendo 283 de impor- 

tância agrícola e 198 de importância 

médico-veterinária (Georghiou & 

Lagunes-Tejeda, 1991). 

Uma nova teoria, hoje amplamente 

difundida, converge ao explicar 

que, além destes fatores, estes 

desequilíbrios também estão fortemente 

associados ao estado de 

proteólise dominante nos tecidos da 

planta. Estudos comprovam que produtos 

químicos sintéticos, tais como 

agrotóxicos e fertilizantes minerais 

solúveis, contêm substâncias que interferem 

na proteossíntese, provocam 

o acúmulo de aminoácidos livres e 

açúcares redutores nos tecidos da planta, 

reduzindo sua resistência às pragas 

e doenças (Alves et al., 2001; 

Chaboussou, 1999; Tokeshi, 2002). 

Segundo Primavesi (1998), três 

condições são necessárias para que 

uma planta seja atacada por pragas e 

doenças: 1) a planta deve ser deficientemente 

nutrida, oferecendo alguma 

substância utilizável para o agente; 

2) o agente possa se multiplicar 

livremente sem controle biológico, o 

que ocorre mais facilmente em 

monoculturas; 3) o sistema de autodefesa 

da planta deve estar desequilibrado, 

em função da nutrição e do 

uso de agrotóxicos. Estes princípios 

convergem com os fundamentados 

por Francis Chaboussou, então diretor 

do “Institut National de la 

Recherche Agronomique” (INRA) na 

França, que em 1979 formulou a 

Teoria da Trofobiose. Segundo essa 

teoria, todo processo vital está na 

dependência da satisfação das necessidades 

dos organismos vivos, 

sejam eles vegetais ou animais. Dessa 

forma, a planta, ou mais precisa-

Figura 01. Simulação da cinética de crescimento celular e da produção de metabólitos 

ao longo da fermentação aeróbica do biofertilizante no processo de CLC. Metabólitos 

primários: (Etapas de anabolismo e catabolismo): Açúcares, aminoácidos, ácidos 

graxos, proteínas, lipídeos, bases nitrogenadas (nucleotídeos e ácidos nucleicos), 

precursores moleculares etc. Metabólitos secundários: (Biossíntese de macromoléculas 

de elevado peso molecular): toxinas, antibióticos, fitoreguladores (IAA 

e giberelinas), ácidos graxos de cadeia longa, fosfolipídeos, polissacarídeos, terpenos 

fenóis, polifenois, citoquininas, etc. 

mente o órgão vegetal, será atacado 

somente quando seu estado bioquímico, 

determinado pela natureza e 

pelo teor de substâncias nutritivas 

solúveis, corresponder às exigências 

tróficas (de alimentação) da praga ou 

do patógeno em questão. 

Estudando-se a relação entre o 

estado nutricional de plantas e sua 

resistência às doenças constatou-se 

que toda circunstância desfavorável 

ao crescimento celular tende a provocar 

um acúmulo de compostos 

solúveis não utilizados, como açúcares 

e aminoácidos, diminuindo a 

resistência da planta ao ataque de 

pragas e doenças (Dufrenoy, 1936). 

Comprovou-se mais tarde que a ação 

dos agrotóxicos na planta resulta na 

inibição da proteossíntese, resultando 

num aumento de ácaros, pulgões 

e lepidópteros e de doenças 

(Chaboussou, 1999; Tokeshi, 2002). 

Espécies de pulgões, cochonilhas, 

cigarrinhas, cigarras, tripes, outros 

insetos sugadores e várias espécies 

de ácaros fitófagos, não são capazes 

de desdobrar proteínas em aminoácidos 

para serem posteriormente 

recombinados à conveniência de 

cada um. Por isso, eles dependem 

de aminoácidos livres existentes na 

seiva das plantas ou suco celular e 

de microrganismos simbiontes 

(Chaboussou, 1980; Panizzi & Parra, 

1991; Pinheiro & Barreto, 1996; Gallo 

et al., 2002) Os adubos minerais 

solúveis, especialmente os nitrogenados, 

e os agrotóxicos orgânicos 

sintéticos, que quando absorvidos 

pelas plantas e translocados em seu 

interior, são capazes de interferir 

com a fisiologia vegetal, reduzem a 

proteossíntese, desencadeando processo 

de acúmulo de aminoácidos 

livres e açúcares redutores, substâncias 

prontamente utilizáveis pelas 

pragas e agentes fitopatogênicos, o 

que foi correlacionado positivamente 

com o aumento populacional desses 

organismos (Chaboussou, 1985). 

Na agricultura orgânica o uso de 

biofertilizantes líquidos, na forma de 

fermentados microbianos enriquecidos, 

têm sido um dos processos mais 

empregados no manejo trofobiótico 

de pragas e doenças. Essa estratégia 

é baseada no equilíbrio nutricional 

da planta (trofobiose), onde a resistência 

é gerada pelo melhor equilíbrio 

energético e metabólico do vegetal 

(Chaboussou, 1985; Pinheiro & 

Barreto, 1996). Os biofertilizantes funcionam 

como promotores de crescimento 

(equilíbrio nutricional) e como 

elicitores na indução de resistência 

sistêmica na planta. Além disso, ajudam 

na proteção da planta contra o 

ataque de doenças, por antibiose 

(Bettiol et al, 1998) e contra o ataque 

de pragas, por ação repelente, 

fagodeterrente (inibidores de alimen- 

tação) ou afetando o seu desenvolvimento 

e reprodução. 

2 - Biofertilizantes líquidos 

e sua aplicação na 

proteção de plantas 

Os biofertilizantes possuem compostos 

bioativos, resultantes da 

biodigestão de compostos orgânicos 

de origem animal e vegetal. Em seu 

conteúdo são encontradas células vivas 

ou latentes de microrganismos 

de metabolismo aeróbico, anaeróbico 

e fermentação (bactérias, leveduras, 

algas e fungos filamentosos) e também 

metabólitos e quelatos organominerais 

em soluto aquoso. Segundo 

Santos & Akiba (1996), os metabólitos 

são compostos de proteínas, enzimas, 

antibióticos, vitaminas, toxinas, 

fenóis, ésteres e ácidos, inclusive de 

ação fitohormonal produzidos e liberados 

pelos microrganismos. 

Na citricultura paulista, os biofertilizantes 

vêm sendo produzidos 

pelo método de compostagem líquida 

contínua em “piscinas” escavadas 

no solo, revestidas de lona plástica 

de polietileno, com capacidade de 

até 50 mil litros. No processo são 

utilizados água não clorada e o 

inoculante à base de esterco fresco 

bovino, e posteriormente enriquecido 

com um composto orgânico nutritivo. 

O Microgeo é um composto 

orgânico, com registro no Ministério 

da Agricultura e certificado pelo IBD, 

preparado à base de diversas fontes 

orgânicas e inorgânicas, sendo enriquecido 

com rochas moídas que contêm 

cerca de 48% de silicatos de 

magnésio, cálcio, ferro e outros 

oligoelementos, fundamentais para 

estimulação do metabolismo primário 

e secundário das plantas. Segundo 

Alves et al. (2001) biofertilizantes 

obtidos com o Microgeo vêm sendo 

utilizados, em pulverização sobre as 

plantas, em mais de 8 milhões de pés 

de laranja no estado de São Paulo. 

A potência biológica de um biofertilizante 

é expressa pela grande 

quantidade de microrganismos ali 

existentes, responsáveis pela liberação 

de metabólitos e antimetabólitos, 

entre eles vários antibióticos e 

hormônios vegetais. Castro et al. 

(1992) e Bettiol et al. (1998) isolaram 


Figura 2. Produção de biofertilizantes pelo sistema de compostagem líquida contínua 

a céu aberto, em recipientes plásticos. 

várias leveduras e bactérias, destacando 

Bacillus subitilis, reconhecido 

produtor de antibióticos. Atualmente 

os biofertilizantes vêm sendo aplicados 

em diversas culturas associadas 

com o fungo entomopatogênico 

Beauveria bassiana, importante inimigo 

natural de pragas. 

Os efeitos do biofertilizante no 

controle de pragas e doenças de plantas 

têm sido bem evidenciados. Efeitos 

fungistático, bacteriostático e repelente 

sobre insetos já foram constatados. Santos 

& Sampaio (1993) verificaram uma 

propriedade coloidal do biofertilizante 

que provoca a aderência do inseto 

sobre a superfície do tecido vegetal. Os 

autores destacaram também o efeito 

repelente e deterrente de alimentação 

contra pulgões e moscas-das-frutas. 

Medeiros et al. (2000b) verificaram que 

o biofertilizante à base de conteúdo de 

rúmen bovino e o composto orgânico 

Microgeo Ò reduziu a fecundidade, período 

de oviposição e longevidade de 

fêmeas do ácaro-da-leprose dos citros, 

Brevipalpus phoenicis, quando pulverizado 

em diferentes concentrações. Esses 

mesmos autores comprovaram que 

este biofertilizante agiu sinergicamente 

com Bacillus thuringiensis e o fungo B. 

bassiana, reduzindo a viabilidade dos 

ovos e sobrevivência de larvas do bicho-furão-dos-citros 

(Ecdytolopha 

aurantiana) (Medeiros et al. 2000c). 

Estudos recentes comprovaram a redução 

de até 95% da fecundidade do ácaro 

rajado Tetranychus urticae, de hábito 

polífago, em concentrações entre 5 e 

50% (Medeiros et al., 2000a; Berzaghi et 

al., 2001). Também verificou-se redução 

de até 64% da população do pulgão 

Aphis sp., quando utilizado o biofertilizante 

(10%) associado aos inseticidas 

Boveril ® e Metarril ® , 5 kg/ha, em cultivo 

de acerola (Medeiros et al., 2001). Aplicações 

do biofertilizante associadas à 

calda viçosa ou com o Bacillus 

thuringiensis reduziram significativamente 

o ataque da traça (Tuta absoluta) 

e a broca pequena (Neoleucocinodes 

elegantalis) em tomateiros (Picanço et 

al., 1999; Nunes & Leal, 2001). Também 

foi constatado menor severidade de 

oídio e de cigarrinha verde em plantas 

de feijoeiro pulverizadas com diferentes 

misturas de biofertilizantes (Cunha 

et al., 2000). Trabalhos conduzidos por 

Medeiros (2002) no Laboratório de Patologia 

e Controle Microbiano de Insetos 

da ESALQ/USP comprovaram que o 

biofertilizante líquido reduziu de modo 

crônico e significativamente a fecundidade 

e o potencial de crescimento populacional 

e o tempo de desenvolvimento 

de descendentes dos ácaros da 

leprose dos citros Brevipalpus phoenicis, 

criados sobre plantas tratadas com biofertilizantes. 

O estudo comprovou que 

o biofertilizante testado agiu por conta- 


to direto e residual e também funcionou 

de forma sistêmica na planta. 

A ação antibiótica e indução de 

resistência sistêmica da planta são 

provavelmente os principais mecanismos 

de ação do biofertilizante 

sobre a praga (DÁndréa & Medeiros, 

2002). Os fenômenos podem estar 

diretamente associados à complexa 

e pouco conhecida composição química 

e biológica dos biofertilizantes. 

Compostos metabólitos (micro e 

macromoléculas), tais como enzimas, 

antibióticos, vitaminas, toxinas, fenóis 

e outros voláteis, ésteres e ácidos, 

inclusive de ação fitohormonal têm 

sido identificados nos biofertilizantes 

(Santos, 1992). Um composto 

coloidal, de consistência mucilaginosa 

(goma) e de composição ainda 

não conhecida, foi observado por 

Medeiros (2002) causando a imobilização 

e morte do ácaro B. phoenicis 

sobre a folha devido à obstrução de 

seu sistema digestivo. 

3 - Processos envolvidos na 

produção de 

biofertilizantes 

Não existe uma fórmula padrão 

para produção de biofertilizantes. 

Receitas variadas vêm sendo testadas, 

utilizando-se componentes minerais 

para o enriquecimento do meio de 

cultivo (Santos, 1992; Magro, 1994). 

O processo de fermentação é 

complexo e os microrganismos existentes 

passam quatro fases distintas 

de crescimento celular: 1) Latência - 

Compreende o período de adaptação 

dos microrganismos, após o qual as 

células dão início à fermentação. 2) 

Crescimento exponencial – Nessa fase 

ocorre elevado processo de divisão 

celular, com a produção de biomassa 

e liberação dos metabólitos primários: 

carboidratos, aminoácidos, 

lipídeos, nucleotídeos, vitaminas e 

proteínas e enzimas. 3) Fase estacionária 

– As células param de se dividir 

e as colônias, após juntarem-se, iniciam 

um processo de diferenciação 

celular produzindo metabólitos secundários 

como forma de defesa (antibióticos, 

toxinas, fenóis, ácidos orgânicos 

e outras proteínas de cadeia 

longa, de alto interesse biotecnológico). 

4) Morte Celular-Esgotadas to-

Figura 3. Detalhes do experimento utilizando-se ácaros de B. phoenicis criados em 

arena, sobre a folha a planta de Canavalia ensiformis. Fonte: Medeiros (2002) 

das as reservas de energia, as células 

começam a morrer numa velocidade 

exponencial. 

Cada microrganismo participante 

degrada alimento para outro, numa 

relação de interdependência mútua e 

harmônica e, assim, o processo de 

fermentação acaba sendo contínuo, 

desde que seja alimentado com meio 

nutritivo, o que fundamentou o processo 

de compostagem líquida descrito 

por D’Andréa & Medeiros (2002). 

4 - Produção do 

biofertilizante pelo 

processo de Compostagem 

Líquida Contínua (CLC) 

4.1 - Dimensionamento da 

Produção 

Tanques para compostagem do 

biofertilizante podem ser utilizados 

para volumes de até 1.000 litros, caixas 

de fibrocimento ou plásticas. Para 

volumes maiores constrói-se diretamente 

no solo, ‘piscinas’ com as dimensões 

do volume pretendido, e 

com a profundidade máxima de um 

metro, as quais são revestidas com 

lona plástica. A localização do tanque 

deve ser em área ensolarada, mantendo-o 

descoberto. Para o dimensionamento 

do volume do tanque, deverá 

ser considerado um consumo diário 

máximo de 10% de biofertilizante, da 

sua capacidade. Exemplo: Para um 

consumo diário de 100 litros de biofertilizante, 

o tanque deverá ter o 

volume de 1.000 litros. 

4.2- CLC com uso de esterco e 

composto orgânico enriquecido 

Início da CLC: Para início da 

produção do biofertilizante, adicionase 

no tanque o esterco fresco de gado 

(inoculante), um composto orgânico 

enriquecido com minerais (Ex.: 

MICROGEO MCO) e água (não 

clorada). No caso do Microgeo, 

pesquisado e desenvolvido pela equipe 

do Laboratório de Patologia e Controle 

Microbiano da ESALQ, o preparo 

é feito nas seguintes proporções:1,0 

quilo do composto orgânico / 4,0 

litros esterco de gado / 20,0 litros água 

(completando o volume ). Exemplo: 

Para a produção de 1.000 litros de 

biofertilizante, adiciona-se no tanque 

50 quilos do composto, mais 200 litros 

de esterco de gado de qualquer origem, 

completando com água o 

volume de 1.000 litros do tanque. 

Agitar duas vezes ao dia manualmente 

com um ‘rodo’, que também permitirá 

determinar a espessura da camada 

orgânica (biomassa) depositada no 

fundo do tanque, com o objetivo de se 

quantificar a reposição do esterco de 

gado no processo CLC. Iniciar o uso 

do biofertilizante com aproximadamente 

15 dias, após a mistura inicial 

dos insumos. Manutenção da CLC: 

Para manter a compostagem em meio 

líquido de forma contínua, contabilizar 

diariamente os volumes de biofertilizante 

consumidos repondo no tanque 

os insumos nas seguintes proporções: 

a) Reposição do composto orgânico: 

para cada 30,0 a 40,0 litros de biofertilizante 

usado, repor 1,0 quilo do 

composto/inoculante. O intervalo de 

reposição poderá ser semanal até 

mensal, ou seja, intervalos menores 

quanto maior o volume de biofertilizante 

utilizado. b) Reposição do esterco 

de gado: adicionar um volume de 

esterco de gado (fresco) suficiente 

para manter a mesma proporção 

biomassa/ água do início do processo, 

sempre quando se verificar com 

ajuda do ‘rodo’ a diminuição da camada 

orgânica no fundo do tanque. c) 

Reposição da água: está em função do 

volume de biofertilizante consumido, 

da evaporação e das chuvas. O volume 

de água a ser adicionado deverá 

ser o suficiente para a manutenção do 

nível inicial do tanque. A freqüência 

de reposição poderá ser diária, usando-se 

registro bóia ou até mensal, 

também em função do volume de 

biofertilizante usado. Nos períodos de 

chuvas, recomenda-se fechar os tanques 

de até 1.000 litros nos momentos 

de ocorrência delas. Manter descobertos 

os tanques maiores de 1.000 litros, 

retirando para uso posterior o volume 

do biofertilizante que eventualmente 

poderá transbordar, armazenando-o 

em tambores. É importante sempre 

manter as proporções de composto 

inoculante e esterco de gado, descritas 

acima, evitando o uso do biofertilizante 

muito diluído (Microbiol, 2001; 

D’Andréa & Medeiros, 2002). 

5 - Recomendações de uso 

Segundo Pinheiro & Barreto 

(1996), devido aos elevados efeitos 

hormonais e altos teores das substâncias 

sintetizadas, o uso de biofertilizantes 

em pulverizações foliares normalmente 

são feitos com diluições 

entre 0,1 e 5%. Concentrações maiores, 

entre 20 e 50%, foram utilizadas 

por Santos & Akiba (1996) com o 


Figura 4. Caracterização de cadáveres do ácaro da leprose dos citros Brevipalpus 

phoenicis: (a) control, (b) Ácaro morto por ação de contato do biofertilizante; (c) e (d) 

Foco microbiano e vista ventral e dorçal do gnatosoma e pernas anteriores aderidas 

por uma substancia coloidal (goma). Fonte: Medeiros (2002). 

biofertilizante “Vairo”. Porém, em 

concentrações muito elevadas, o biofertilizante 

pode causar estresse fisiológico 

na planta retardando seu 

crescimento, floração ou frutificação. 

Isso se deve provavelmente ao excessivo 

desvio metabólico para produção 

de substâncias de defesa. Para 

hortaliças recomendam-se pulverizações 

semanais, utilizando entre 0,1 e 

3 % de concentração do biofertilizante, 

considerando que as plantas são 

de ciclo vegetativo curto e possuem 

maior velocidade de crescimento, com 

demanda constante de nutrientes. 

Em fruteiras, pulverizações entre 1 e 

5% do biofertilizante com Microgeo 

produziram resultados significativos 

na sanidade na cultura. Este biofertilizante 

também vem sendo empregado 

sobre o solo em concentrações de 

até 20%. Este quando aplicado sobre 

o mato roçado, como “input” 

microbiano, é capaz de aumentar a 

compostagem laminar, isto é diretamente 

no campo, acelerando os processos 

bioquímicos e potencializando 

maior atividade microbiana sobre o 

solo (D’Andréa & Medeiros, 2002). 

As aplicações de biofertilizantes 

deverão ser realizadas durante as 

fases de crescimento e/ou produção, 

evitando-se no florescimento. Devese 

dar preferência pelos dias de chu- 

va ou irrigação e os horários vespertino 

ou noturno, evitando-se os períodos 

secos e as horas mais quentes 

do dia. Altas concentrações do biofertilizante 

podem provocar na planta 

demanda de água muito maior 

para o seu equilíbrio. Mesmo assim, 

pulverizações com o biofertilizante, 

na diluição de 1%, nos períodos secos 

são possíveis. Apesar de estarem 

sob os efeitos do estresse hídrico, as 

plantas estarão recebendo energia 

entrópica (não utilizável pelos insetos) 

e outros fatores de proteção. 

6 - Biofertilizantes, 

bioinseticidas e 

biorremediação 

O aumento da população e a 

maior atividade industrial fizeram com 

que o problema da poluição do ambiente 

atingisse níveis alarmantes. 

Além de contaminação por detritos 

pouco biodegradáveis, como plásticos 

e detergentes, soma-se o problema 

dos resíduos de industrias e, principalmente, 

dos resíduos agroindustriais, 

como a vinhaça ou o vinhoto, 

resultante da produção de etanol em 

grande escala. Estes problemas podem 

ser atacados pelo desenvolvimento 

de linhagens microbianas capazes 

de degradar ou assimilar esses 


compostos para uso como agentes 

de biorremediação. 

O processo da biorremediação 

consiste na descoberta e procriação 

de bactérias capazes de “comer” os 

agrotóxicos que ficam por muitos anos 

no solo e na água. Estas bactérias 

devoram os componentes químicos 

existentes nos venenos, fazendo com 

que o produto perca sua capacidade 

de poluir o solo, a água e até mesmo 

o organismo humano. Estas bactérias 

também não são prejudiciais ao meio 

ambiente. Caso os resultados da pesquisa 

sejam confirmados, será um 

grande avanço para a preservação do 

meio ambiente, pois o uso do veneno 

é um grande vilão que prejudica o 

solo, a água, os animais e o homem 

(Azevedo, 1998). Uma saída promissora 

para esses problemas seria a 

multiplicação em massa desses agentes 

de biodegradação de agentes químicos, 

em tanques abertos, adotandose 

a técnica de cultura em compostagem 

líquida contínua. A produção de 

biofertilizantes líquidos, à base de 

resíduos oriundos da agricultura e da 

indústria, modificados por microorganismos, 

gerarão substratos úteis como 

fertilizantes de solo e como bioprotetores 

de plantas para a agricultura. 

A partir de compostos ricos em 

nutrientes, facilmente acessíveis e de 

baixo custo operacional, como os 

resíduos sólidos e líquidos oriundos 

da agricultura e da indústria, é possível 

a adição de microrganismos (leveduras, 

bactérias e actinomicetos, 

por exemplo) previamente selecionadas, 

com as condições necessárias 

de ecologia nutricional, que promoverem 

o rápido crescimento populacional, 

resultando em alta produção 

de massa microbiana. 

Técnicas sofisticadas, porém com 

o mesmo princípio, têm sido utilizadas 

em laboratórios, sob condições 

controladas em biofermentadores, na 

produção líquida de inseticidas à base 

de microrganismos entomo patogênicos 

(fungos, vírus, bactérias e 

nematóides) capazes de controlar as 

pragas em níveis aceitáveis, econômicos 

e ecológicos (Alves, 1998). 

A preocupação em se gerar alternativas 

ecológicas ao problema dos 

rejeitos líquidos e sólidos na agricultura, 

transformá-los em insumos de bai-

Figura 5. Crescimento do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana em meio 

de biofertilizante líquido 

Figura 6. Leveduras isoladas de um biofertilizante produzido por compostagem 

líquida contínua 

xo custo e capazes de serem aplicados 

na atividade produtiva primária, em 

cultivos orgânicos, representa um grande 

avanço na preservação do meio 

ambiente. Contudo, serão necessários 

alguns anos de investigação e desenvolvimento, 

para que se produzam 

metodologias de elevado alcance social, 

e grandes esforços no sentido de se 

consolidar o emprego desses processos 

bioquímicos como forma de se 

promover a sustentabilidade dos ambientes 

agrícolas. 

7 - Referências 

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Pesquisa 

Paulo Dejalma Zimmer, Dr. 

Professor do Departamentode de Fitotecnia 

FAEM / UFPel 

djzimmer@ufpel.tche.br 

Gaspar Malone 

Doutorando do Programa de Pós Graduação em 

Ciência e Tecnologia de Sementes / FAEM / UFPel 

malone@gaspar.com.ar 

Fernando Irajá Félix de Carvalho, PhD. 

Professor do Departamento de Fitotecnia 

FAEM / UFPel 

carvalho@ufpel.tche.br 

José Fernandes Barbosa Neto, PhD. 

Professor do Departamento de Plantas de Lavoura 

Faculdade de Agronomia / UFRGS 

jfbn@ufrgs.br 

Antonio Costa de Oliveira, PhD. 

Professor do Departamento de Fitotecnia 

FAEM / UFPel 

acosta@ufpel.tche.br 


Iniciativas 

Genômicas 

Aplicações da ciência genômica no melhoramento de plantas para as regiões de várzea do sul do Brasil 

melhoramento genético 

de plantas 

tem contribuído de 

forma decisiva para 

o incremento da 

produção mundial 

de grãos (BORLAUG, 1983). Entretanto, 

a necessidade e os desafios 

para as próximas duas décadas são 

imensos, o ganho genético para a 

produtividade está se reduzindo a 

cada ano e já não acompanha mais o 

aumento da demanda por alimentos 

(BORLAUG, 1997; MANN, 1997 e 

1999). Atualmente, grandes esforços 

estão sendo direcionados no 

sentido de elucidar o potencial genético 

das espécies cultivadas, 

objetivando incrementar a produtividade 

e a qualidade. Para o lançamento 

de novos cultivares que atendam 

à demanda crescente por alimentos, 

os programas de melhoramento 

de plantas necessitam de grandes 

mudanças, principalmente no 

que tange à estrutura, à estratégia e 

à própria ciência envolvida (STUBER 

et al., 1999; KOORNNEEF & STAM, 

2001). Além do foco na qualidade e 

na produtividade, o melhoramento 

genético também pode ser direcionado 

no sentido de aumentar a adaptabilidade 

das espécies. Essa também 

pode ser considerada uma forma 

de incrementar a produção de 

alimentos, pois áreas marginais podem 

ser incorporadas ao sistema 

produtivo mediante o desenvolvimento 

de genótipos adaptados. No 

Sul do Brasil, há cerca de 6,8 milhões 

de hectares de terras baixas, 

caracterizadas por solos hidromórficos, 

que têm o seu sistema agrícola 

alicerçado na pecuária extensiva e 

no plantio do arroz irrigado. A exploração 

inadequada dessa região, 

possivelmente associada às dificuldades 

operacionais, não tem permitido 

uma apropriada rotação de culturas 

nem o requerido tempo de 

pousio, o que favorece a infestação 

da cultura por espécies daninhas, 

principalmente o arroz vermelho. A 

degradação das características físicas 

do solo provocada pela intensa 

movimentação de máquinas e equipamentos 

extremamente pesados 

também impõe a necessidade de 

pousio (Figura 1). 

Dessa forma, extensas áreas 

estão sendo inviabilizadas a cada 

ano, tornando-se, muitas vezes, extremamente 

árdua a sua recuperação. 

A busca de alternativas para 

compor o sistema agrícola regional 

tem motivado iniciativas importantes 

nas Universidades Federais de 

Pelotas e do Rio Grande do Sul 

(UFPel e UFRGS) e na Embrapa 

Clima Temperado (PORTO et al., 

1998). A inclusão de novas culturas, 

como a aveia, o milho e o 

azevém, no sistema agrícola das 

áreas de várzea tem recebido atenção 

especial, porém a simples introdução 

de genótipos não é suficiente 

para a correção, em função da 

inexistência de constituições genéticas 

adaptadas à condição de encharcamento 

dos locais. Desse 

modo, há uma grande demanda por 

iniciativas voltadas para a geração 


de variabilidade genética, seleção de 

constituições genéticas adaptadas às 

condições do ambiente e aumento da 

eficiência dos programas de melhoramento 

de plantas. 

Advento das Técnicas 

Moleculares 

Até a década de 70, pouco se 

conhecia sobre a organização do 

DNA. A composição dos pequenos 

segmentos com função conhecida, 

os genes, era a jóia mais desejada 

naquela época. Nos últimos anos, 

com o surgimento das técnicas 

moleculares, e entre elas a técnica 

de clonagem molecular, tornou-se 

possível o isolamento e a purificação 

de porções genômicas. Esses 

avanços contribuíram para tornar a 

molécula de DNA o foco das principais 

investigações nos últimos anos. 

A clonagem molecular consiste no 

isolamento e na multiplicação de 

moléculas de DNA idênticas, e compreende, 

pelo menos, dois estágios 

importantes: primeiro, o fragmento 

do DNA de interesse, chamado de 

inserto, é ligado a uma outra molécula 

de DNA, denominada vetor, 

para formar o que se chama de DNA 

recombinante; segundo, a molécula 

do DNA recombinante é introduzida 

numa célula hospedeira compatível, 

num processo chamado 

transformação bacteriana. A célula 

hospedeira que adquiriu a molécula 

do DNA recombinante passa, 

então, a ser chamada transformante 

ou célula transformada. Atualmente, 

as fronteiras da Tecnologia do 

DNA recombinante, principalmente 

para fins comerciais, parecem ser 

ilimitadas. Além dos reflexos diretos, 

a tecnologia do DNA recombinante 

proporcionou avanços em 

todas as áreas da bioquímica, da 

fisiologia e da genética. Esses avanços 

permitiram a caracterização, a 

identificação e a clonagem de uma 

série de genes de enzimas, que se 

tornaram ferramentas decisivas para 

o surgimento de técnicas como a de 

marcadores moleculares e de seqüenciamento 

de DNA, o que con- 

tribuiu para a elucidação de importantes 

vias de biossíntese. 

No que tange aos desafios para 

tornar eficiente o melhoramento de 

plantas e para incrementar a produção 

mundial de grãos, várias ferramentas 

moleculares podem ser incorporadas 

aos programas de melhoramento 

de plantas com o objetivo de 

otimizar a obtenção de genótipos 

superiores, por exemplo, a transgenia 

(YE et al., 2000), a seleção assistida 

por marcadores (FRARY et al., 2000), 

a mutação induzida (MALUSZYNSKI, 

1998) e a genômica (LIU, 1998; 

McCOUCH, 2001). 

A busca por soluções para diversificar 

o sistema agrícola nas áreas de 

várzea do sul do Brasil passa pela 

elucidação dos mecanismos fisiogenéticos 

envolvidos na tolerância dos 

cereais ao encharcamento. Embora já 

tenham sido relatadas (DANTAS et al., 

2001), algumas respostas à deficiência 

de oxigênio no solo provocada 

pelo excesso de água (encharcamento), 

ainda permanecem muitas dúvidas 

relacionadas com as interações 

genéticas que facultam algumas espécies 

ou variedades a suportarem solos 

com hipoxia decorrente do excesso 

de água. A incorporação de tecnologias 

moleculares e a formação de 

melhoristas treinados para selecionar 

genes poderão se refletir em grandes 

ganhos de eficiência nos programas 

de melhoramento de plantas. 


Figura 1 - Sistema de preparação do solo para plantio de arroz pré-germinado em solos 

de várzea, utilizando máquinas extremamente pesadas em solos inundados. Essa 

associação afeta negativamente a estrutura física do solo. Cortesia Prof. Silmar Peske. 

Sintenia e Genomas 

Modelos 

A sintenia é caracterizada pela 

conservação na ordem e no conteúdo 

de genes, ou grupos gênicos, 

entre espécies relacionadas. Essa 

característica também é denominada 

colinearidade, e poderá ser altamente 

informativa para estudos 

comparativos de função, ação e 

regulação gênica entre diferentes 

genomas (Figura 2). Embora não 

seja uma condição estável, pois a 

sintenia pode ser perdida no decorrer 

da evolução, vários trabalhos 

evidenciam a importância das regiões 

cromossômicas conservadas 

para estudos genéticos comparativos 

(BENNETZEN et al., 1998; GALE 

& DEVOS, 1998; DEVOS et al., 1999; 

FEUILLET & KELLER, 2002). 

A sintenia é bastante estudada 

na família Brassicaceae e na família 

Gramineae, atualmente denominada 

Poaceae. Essa família é constituída 

por muitas espécies, entre elas 

algumas das principais espécies agrícolas 

como milho, arroz, trigo, sorgo, 

cevada, centeio e aveia (cereais). 

Além das variações fenotípicas e 

genotípicas existentes entre os cereais, 

há muitas variações na estrutura 

desses genomas. A variação pode 

ser no número de cromossomos, no 

nível de ploidia e no tamanho do 

genoma - estimado em pares de

Figura 2 – Sintenia entre os genomas do arroz, milho, cevada e trigo. As informações 

provenientes do genoma menor podem ser utilizadas para guiar ações no sentido de 

localizar, mapear e clonar genes em genomas maiores. Os pontos em amarelo 

indicam o posicionamento de alguns genes e os números indicam o cromossomo 

(Modificado de GALE & DEVOS, 1998). 

bases (pb), podendo existir genomas 

muito grandes como o genoma do 

trigo, com cerca de 16 bilhões de 

bases, como também pode ocorrer 

genomas muito pequenos, como é o 

caso do do arroz, com cerca de 430 

milhões de bases. A estratégia atual 

está sendo estudar e caracterizar os 

sistemas gênicos em genomas pequenos 

(arabidopsis e arroz) e, considerando 

a sintenia existente, inferir 

sobre os genomas grandes (milho 

– 2 500 Mpb, trigo – 16 000 Mpb e 

cevada - 4 800 Mpb, por exemplo). 

Características de um 

Genoma Modelo 

A presença de determinadas características 

numa espécie pode 

torná-la altamente atraente para a 

ciência. Sob esse enfoque, as características 

mais atraentes numa espécie 

vegetal, as quais poderão contribuir 

para que ela se torne um modelo, 

estão relacionadas com a duração 

do ciclo, com o número de 

sementes produzidas, com o tamanho 

do seu genoma, com a capacidade 

de multiplicação em diferentes 

ambientes, com a facilidade de manipulação 

da polinização (direcionamento 

de cruzamentos), com a 

capacidade de cultivo in vitro e com 

a disponibilidade de informações já 

existentes (banco de dados para a 

espécie). Essas características geralmente 

definem a facilidade de se 

obterem resultados, bem como o 

seu volume e sua qualidade. A primeira 

espécie vegetal utilizada como 

modelo para estudos genéticos foi a 

ervilha (Pisum sativum L.), quando 

Gregor Mendel publicou os resultados 

dos primeiros estudos genéticos, 

no ano de 1865. É lógico que 

naquela época Mendel não considerou 

os critérios utilizados atualmente, 

mas certamente escolheu a ervilha 

pela familiaridade que ele tinha 

com o cultivo daquela espécie. Embora 

as leis de Mendel não tenham 

sido validadas até o seu redescobrimento, 

no início do século XX, cons- 

tituíram a base científica dos estudos 

realizados até hoje. Na história 

recente da Biologia de Plantas, uma 

outra espécie apresentava muitas 

características atraentes e surgia 

como modelo entre as dicotiledôneas; 

tratava-se da Arabidopsis 

thaliana. Essa espécie vegetal é 

membro da família Brassicaceae, a 

qual inclui espécies cultivadas como 

o repolho, o rabanete e a canola. 

Embora a arabidopsis não possua 

importância agronômica, essa espécie 

apresenta vantagens importantes 

para a pesquisa básica em genética 

e biologia molecular. Além disso, 

ou como conseqüência disso, 

essa espécie possui o maior volume 

de informação disponível dentre todos 

os vegetais. No entanto, o modelo 

genético Arabidopsis thaliana 

limitava-se principalmente ao sistema 

genético das dicotiledôneas, 

quando um complemento para as 

monocotiledôneas começou a ser 

procurado. Nos últimos anos, está 

sendo dispensada muita atenção a 

uma outra espécie, o arroz (Oryza 

sativa L.), por ele possuir também 

bons atributos para se tornar um 

modelo genético vegetal. Embora 

seu genoma seja pouco maior, cerca 

de três vezes maior que o genoma 

de Arabidopsis thaliana L., ainda 

assim é cerca de 40 vezes menor do 

que o genoma do trigo (Triticum 

aestivum L.). Entretanto, a estratégia 

de direcionar os esforços para 

tornar o arroz um genoma modelo 

está alicerçada no interesse de se 

obter um modelo entre as gramíneas, 

principalmente aquelas produtoras 

de grãos, pois, praticamente, todas 

as ações dos programas de melhoramento 

de plantas estão voltadas para 

produtividade, resistência a moléstias 

e adaptabilidade. Outro fator 

fundamental no interesse de tornar 

o arroz um genoma modelo é a 

existência de sintenia ou colinearidade 

entre os genomas dessa família. 

Atividades voltadas para a identificação 

e a clonagem de genes com 

a utilização de genomas modelos, 

como o arroz, são bem mais eficientes 

do que em genomas grandes. 


Portanto, atualmente a estratégia 

mais racional será estudar o arroz, 

identificar, clonar e caracterizar seus 

genes e, quando tudo estiver 

mensurado, atingir os genomas mais 

complexos, como os do trigo e do 

milho. Dessa forma, os programas de 

melhoramento de plantas poderão 

aumentar em muito sua eficiência. 

A particularidade que o arroz 

possui, de ser cultivado sob irrigação 

por inundação (várzeas) e sequeiro 

(terras altas), também torna essa espécie 

modelo para o entendimento 

dos mecanismos que controlam a adaptabilidade 

das plantas. O Centro de 

Genômica e Fitomelhoramento (CGF) 

da UFPel está buscando, mediante a 

utilização de tecnologias modernas, o 

entendimento do sistema de raízes do 

arroz (modelo genético). A identificação 

de mecanismos morfofisiológicos 

e os respectivos controles genéticos 

permitirão a identificação e a clonagem 

dos genes envolvidos. A sintenia e a 

utilização de ferramentas genômicas 

adequadas conduzirão à rápida utilização 

desse conhecimento para o desenvolvimento 

e lançamento de 

genótipos superiores, de diversas espécies 

que poderão ser adaptadas aos 

solos encharcados do sul do Brasil. 

Seqüenciamento de 

Genomas 

Os primeiros passos para o seqüenciamento 

de DNA foram dados 

por Sanger, em 1977, com o desenvolvimento 

do método de seqüenciamento 

manual conhecido também 

como método da cadeia interrompida. 

Hoje o método de Sanger baseiase 

na amplificação, por PCR, de fragmentos 

de DNA clonados previamente 

dentro de vetores conhecidos. Dessa 

forma, oligonucleotídeos iniciadores 

(primers), complementares à seqüência 

do vetor, são utilizados para 

amplificar o inserto do DNA a ser 

seqüenciado. A metodologia foi chamada 

de “cadeia interrompida” em 

função de que são utilizados dNTPs 

(deoxi-Nucleotídeos Trifosfatos) modificados, 

os ddNTPs (dideoxi-Nucleotídeos 

Trifosfatos), os quais, quando 

incorporados pela enzima Taq polimerase 

(a enzima que amplifica o 

DNA), não permitem a inclusão do 

nucleotídeo seguinte por não apresentarem 

a hidroxila no carbono 3 da 

dideoxi-ribose do nucleotídeo 

terminador. Portanto, a síntese da 

molécula de DNA pára nesse ponto 

(Figura 3). 

Pelo método de Sanger, o processo 

de seqüenciamento é realizado 

em quatro reações independentes. 

Em cada uma delas é adicionado um 

ddNTP diferente (ddATP, ddCTP, 

ddGTP e ddTTP), geralmente marcados 

radiativamente com 32 P. Na cópia 

de cada fita de DNA, a partir do 

molde, as moléculas são sintetizadas 

até que incorporem o nucleotídeo 

terminador (ddNTP). O acúmulo de 

moléculas terminadas numa mesma 

base possibilita sua visualização no 

gel. A geração aleatória de moléculas 

terminadas nas bases distintas de uma 

fita molde de DNA permitirá o estabelecimento 

da seqüência de nucleotídeos 

do referido molde. A leitura da 

seqüência de bases é realizada mediante 

a separação, num gel de poliacrilamida 

de alta resolução, dos fragmentos 

amplificados por PCR. Nesse 

tipo de técnica, é possível identificar 

cerca de 200 a 300 nucleotídeos. A 

Figura 3 apresenta um esquema sintetizado 

dessa metodologia. 


Figura 3 – Esquema representativo do método de seqüenciamento desenvolvido por 

Sanger (A) e do método de seqüenciamento automatizado (B). Consulte o texto para 

conferir os detalhes de cada método. 

Na última década, o surgimento 

dos seqüenciadores automáticos, aliado 

à elevada capacidade de processar 

informações que a informática 

proporcionou, revolucionou a 

genômica, dando origem a bioinformática. 

O seqüenciamento automático 

mantém o mesmo princípio do 

método de seqüenciamento manual 

proposto por Sanger, mas a possibilidade 

de utilizar ddNTPs marcados 

fluorescentemente com cores distintas 

para cada um deles (ddCTP, 

ddGTP, ddATP e ddTTP) permitiu 

automatizar o processo (veja Figura 

3). Outra grande vantagem do seqüenciamento 

automático é a incorporação 

de metodologias laser e programas 

computacionais que fazem a 

leitura dos resultados. As moléculas 

fluorescentes utilizadas nos ddNTPs, 

quando sensibilizadas pelo laser, emitem 

um comprimento de onda, que é 

capturada por uma câmera acoplada 

ao seqüenciador. A informação é processada 

e transformada em seqüências 

nucleotídicas por softwares adequados. 

Devido à baixa capacidade de 

produção proporcionada pelo método 

de Sanger, as primeiras seqüências 

nucleotídicas foram geradas para estudos 

pontuais, como o estabelecimento 

da seqüência de alguns genes 

e de pequenas regiões cromossômi-

Figura 4 – Detalhes de um exemplar de 

Arabidopsis thaliana L. cultivado em 

laboratório. Cortesia Dra. M. E. Alvarez. 

CIQUIB – CONICET, Universidad Nacional 

de Córdoba – Argentina. 

cas. À medida que foram desenvolvidos 

os seqüenciadores de nucleotídeos 

automatizados, a capacidade de 

produção de seqüências foi aumentada 

muito rapidamente. Em função 

disso, surgiram, mediante a associação 

de grupos de pesquisa, várias 

iniciativas voltadas para o seqüenciamento 

de alguns genomas. Os primeiros 

esforços foram direcionados para 

alguns microorganismos e, em seguida, 

para a Arabidopsis thaliana (The 

Arabidopsis Genome Initiative*, 2000) 

e para a Drosophila melanogaster 

(ADAMS et al., 2000), dois organismos 

utilizados como modelo na biologia. 

Na seqüência, apresentaremos o 

que já foi realizado com o intuito de 

gerar informações genéticas das principais 

espécies, com vistas ao melhoramento 

vegetal. 

Arabidopsis thaliana - o 

genoma da Arabidopis (125 milhões 

de nucleotídeos – 125 Mpb) foi 

seqüenciado por uma associação internacional 

de pesquisadores cha- 

Figura 5 – Esquema representativo das principais etapas na geração de bibliotecas 

de seqüenciamento. A – Para seqüenciamento estrutural via construção de biblioteca 

BAC (Bacterial Artificial Chromosomes). 1 – DNA genômico; 2 – Alinhamento de 

fragmentos de 100 a 200 kb em mapa físico (Biblioteca BAC); 3 – Fragmentação 

individual dos BACs; 4 – Subclonagem de fragmentos entre 2 e 5 kb. B – Para 

seqüenciamento de ESTs (Expressed sequence tags) ou do transcriptoma. 1 – Extração 

de RNA mensageiro; 2 – Síntese reversa utilizando RT-PCR; 3 – Síntese de cDNA dupla 

fita; 4 – Clonagem dos cDNAs. 

mada de Iniciativa Genoma da Arabidopsis 

(The Arabidopsis Genome 

Initiative * , 2000). A seqüência, o mapa 

e as anotações disponíveis atualmente 

são resultado de esforços conjuntos 

do TIGR (The Institute for 

Genomic Research), MIPS (Munich 

Information Center for Protein 

Sequences) e TAIR (The Arabidopsis 

Information resource). Veja uma foto 

dessa espécie vegetal observando a 

Figura 4. 

Arroz (Oryza sativa L.) – Foram 

empregados esforços públicos e 

privados para seqüenciar essa espécie. 

O primeiro esforço privado foi 

realizado pela Monsanto (PENNISI, 

2000). Mais tarde, os resultados gerados 

seriam somados aos resultados do 

IRGSP (International Rice Genome 

Sequencing Project). O segundo esforço 

privado, uma associação entre 

duas empresas, a Myriad Genetics e a 

Syngenta, utilizou o método whole 

genome shotgun, e não acrescentou 

resultados significativos ao conjunto 

de dados disponibilizados pelos outros 

projetos (GOFF et al., 2002). 

Foram implementados também dois 

esforços públicos para o seqüenciamento 

do arroz. O primeiro deles, o 

Projeto Internacional de Seqüenciamento 

do Genoma do Arroz (IRGSP – 

International Rice Genome Sequencing 

Project), teve como objetivo seqüenciar 

a subespécie japonica. Essa associação 

teve início no ano de 1997, em 

uma reunião do Simpósio Internacional 

de Biologia Molecular de Plantas 

realizado em Singapura. Naquela ocasião, 

o objetivo da comunidade científica 

era socorrer o idealizador do 

projeto de seqüenciamento estrutural 

do arroz, o RGP (Rice Genome Project) 

do Japão. O segundo esforço público 

foi liderado pela Academia Chinesa 

de Ciências (Chinese Academy of 

Sciences) de Beijing, China. Esse projeto 

iniciou-se em abril de 2000 e, dois 

anos mais tarde, seus resultados foram 

publicados pela revista Science 

(YU et al., 2002). A grande distinção 

estabelecida entre as subespécies 

seqüenciadas por esses dois esforços 

públicos foi em relação à importância 

econômica e geográfica que elas apresentam. 

A subespécie seqüenciada 

pelo grupo liderado pelos japoneses, 

spp japonica, é amplamente cultivada 

no Japão, nos Estados Unidos, na 

Coréia do Sul e em parte da China. Por 

outro lado, a subespécie seqüenciada 

pelos chineses, spp indica, é bastante 

cultivada na China e no Sudeste Asiático, 

bem como no Sul do Brasil. Além 

disso, as estratégias de seqüenciamento 

utilizadas pelos dois grupos 

foram distintas; enquanto o grupo dos 

chineses focava a anotação de genes, 

pois utilizou a estratégia whole genome 

shotgun, o grupo liderado pelo RGP 


Figura 6 – Detalhes de uma lavoura de 

arroz irrigado do cultivar BRS 7 “Taim”. 

Cortesia Prof. Silmar Peske. 

Figura 7 – Detalhes de uma lavoura de 

trigo (Triticum aestivum). Cortesia Prof. 

Silmar Peske. 

focou, além da anotação dos genes, a 

geração de informações precisas ao 

nível de estruturação e organização 

do genoma, pois utilizou a técnica de 

seqüenciamento estrutural via construção 

de bibliotecas BAC (Bacterial 

Artificial Chromosomes) (Figura 5 A). 

Veja uma foto dessa espécie vegetal 

observando a Figura 6. 

Trigo (Triticum aestivum) – 

os esforços para determinar a seqüência 

de nucleotídeos do trigo 

depararam-se com duas grandes barreiras. 

A primeira delas se refere ao 

tamanho do genoma, que é, aproximadamente, 

de 16 bilhões de nucleotídeos 

(16.000 Mpb) - cerca de 40 

vezes maior que o genoma do arroz. 

A segunda delas é que o seu genoma 

é diferente do do arroz e da 

arabidopsis, ambos diplóides, enquanto 

o trigo é hexaplóide. Esses 

impedimentos impuseram uma estratégia 

preliminar para que fossem 

determinadas as seqüências transcritas: 

o transcriptoma (bibliotecas 

de cDNA) de diferentes estádios do 

desenvolvimento da planta (Figura 

5 B) Portanto, considerando a estrutura 

e o tamanho do genoma do 

trigo essa ação é mais lógica do que 

pensar num inexeqüível projeto de 

seqüenciamento estrutural dessa espécie. 

De uma forma geral, a estratégia 

visa a gerar seqüências nucleotídicas 

dos genes transcritos em 

determinados estádios de desenvolvimento 

ou sob determinados 

estresses do ambiente. O esboço de 

uma associação internacional voltada 

para a geração dessas informações 

começou a ser definido em 

1998, com a criação de uma ação 

Internacional Cooperativa para a produção 

de ESTs (Expressed Sequence 

Tags) de trigo. Atualmente, as ações 


Figura 8 - Detalhes de uma lavoura de cevada (Hordeum vulgare), safra 2003, da 

Linhagem CEV 97043 da propriedade do Produtor Adelar Crespi. 

com a intenção de determinar a 

posição no mapa dos transcritos são 

coordenadas pelo International 

Triticeae Mapping Initiative. Os principais 

esforços para a criação de 

uma coleção de ESTs representativos 

do trigo estão sendo liderados 

pelos EUA (U. S. Wheat Genome 

Project), pelo Canadá (AAFC – 

Agriculture and Agri-Food Canada) 

e pela Inglaterra (BBSRC – 

Biotechnology and Biological 

Sciences Research Council). Veja uma 

foto dessa espécie vegetal observando 

a Figura 7. 

Cevada (Hordeum vulgare) – 

os esforços para determinar a seqüência 

de nucleotídeos da cevada 

também sofrem impedimentos devido 

ao tamanho do seu genoma ~ 4,8 

bilhões de nucleotídeos (4800 Mpb). 

O primeiro passo para contornar esse 

impedimento foi a produção de mapas 

físicos do genoma da cevada com 

alta densidade de marcadores; isso 

proporcionará a realização de comparações 

com o genoma do arroz. O 

próximo passo será a criação do 

transcriptoma da espécie. Essas decisões 

estão sendo implementadas em 

um esforço combinado entre cientistas 

da América do Norte (North 

American Barley Genome Mapping

Figura 9 – Detalhes de uma lavoura de milho (Zea mays) e de espigas maduras 

(direita inferior). Cortesia Prof. Silmar Peske. 

Project, USA e North American Barley 

Genome Mapping Project, Canadá) e 

da Europa (Plant Genome Resource 

Centre, Alemanha e Scottish Crop 

Research Institute, Inglaterra), para 

criar uma biblioteca de ESTs 

(Expressed Sequence Tags) o mais 

completa possível (Figura 5 B). Veja 

uma foto dessa espécie vegetal observando 

a Figura 8. 

Milho (Zea mays) – a principal 

iniciativa para seqüenciamento do 

genoma do milho foi anunciada em 

setembro de 2002 pelo NFS (National 

Science Foundation) dos Estados 

Unidos. No entanto, há muito tempo 

os geneticistas da área do milho 

buscavam somar esforços com esse 

objetivo (BENNETZEN et al., 2001). 

Quatro fatores contribuíram para que 

essa iniciativa fosse retardada até 

2002. Primeiro, os avanços na 

tecnologia de seqüenciamento reduziram 

consideravelmente o custo 

em comparação com o passado. Segundo, 

novas metodologias de 

fingerprinting, de alta resolução e 

produção, permitiram aumentar a 

eficiência na seleção de clones para 

o seqüenciamento, reduzindo ao mínimo 

a sobreposição de regiões 

seqüenciadas. Terceiro, foram desenvolvidas 

novas metodologias para 

preparar frações do genoma do milho 

ricas em genes (YUAN et al., 

2002). Quarto, análises comparativas 

do milho com o arroz (Oryza 

sativa) ou Arabidopsis sugerem que 

a seqüência do genoma dessas duas 

espécies não serão suficientes para 

entender detalhadamente o conteúdo 

de genes do milho e sua expressão 

(BENNETZEN et. al., 2001; 

CHANDLER & BRENDEL, 2002). 

Além disso, algumas características 

no genoma do milho sempre dificultaram 

a implementação de projetos 

de seqüenciamento da espécie. Destaca-se 

a existência de várias 

subespécies importantes (Zea mays 

spp. Huehuetenangensis, Zea mays 

spp. mays (mayze), Zea mays spp. 

mexicana (teosinto), e Zea mays 

spp. Parviglumis); o elevado conteúdo 

de DNA repetitivo (regiões 

duplicadas) presente no genoma do 

milho (HELENTJARIS, 1995) e o tamanho 

do seu genoma, cerca de 

2500 Mpb. 

Da mesma forma que está ocorrendo 

na geração de seqüências 

nucleotídicas da cevada e do trigo, o 

foco para o milho também será a 

geração de seqüências dos genes (o 

transcriptoma). As interações do sistema 

gênico poderão ser obtidas em 

genomas como o arroz, principalmente 

devido à ocorrência da 

sintenia entre os cereais. Veja uma 

foto dessa espécie vegetal observando 

a Figura 9. 

Reflexos da Tecnologia na 

Produção de Cereais 

Os grandes avanços na produção 

mundial de grãos, gerados a 

partir de meados do século passado, 

são decorrentes de uma contribuição 

decisiva do melhoramento clássico 

de plantas (BORLAUG, 1983). Ao 

contrário do que alguns entusiastas 

esperavam, as grandes expectativas 

decorrentes das inovações científicas 

dos últimos 30 anos não se refletiram 

em significativos incrementos na produção 

de grãos. Para que as 

tecnologias moleculares possam render 

os resultados esperados, algumas 

barreiras precisam ser superadas. 

A principal delas diz respeito à 

mudança de cultura nos programas 

de melhoramento de plantas, sendo 

necessário selecionar genes ao invés 

de selecionar plantas (KOORNNEEF 

& STAM, 2001). Superadas as barreiras 

culturais, a eficiência na implementação 

de ferramentas moleculares 

em programas de melhoramento 

de plantas poderá ser incrementada 

mediante a automatização dos processos 

de extração de DNA, a geração 

de um maior número de seqüências 

ligadas (marcadores) a caracteres 

de importância agronômica e o barateamento 

dos equipamentos e 

insumos utilizados. O treinamento 

de novos melhoristas também deverá 

merecer atenção especial, pois, 

além da sólida formação em melhoramento 

clássico e em estatística, é 

recomendado que esses profissionais 

sejam treinados em genética 

molecular e técnicas moleculares 

aplicadas ao melhoramento de plantas. 

Principalmente por que é através 

desses novos profissionais que os 

programas de melhoramento clássicos 

poderão incorporar as novas ferramentas 

da biologia molecular. 

O setor de melhoramento de 

plantas também necessita se articular 

para melhorar a capacidade de 

processamento das informações já 

disponíveis, principalmente aquelas 

decorrentes dos diferentes projetos 

de seqüenciamento de genomas. 

Atualmente, dois fatores contribu- 


em para que as informações disponíveis 

não sejam aplicadas rotineiramente. 

A primeira delas é que há 

carência de bons sistemas de 

informática capazes de trocar informações 

com os bancos de dados 

com a agilidade requerida; a segunda 

é que poucos profissionais estão 

habilitados a realizarem buscas e a 

fazerem comparações de seqüências 

através de computadores. 

Buscando alternativas para compor 

o sistema agrícola das várzeas do 

Sul do Brasil, sugerimos a implementação 

de ferramentas moleculares e 

de bons sistemas de informática para 

os programas de melhoramento locais. 

Essas ações devem estar voltadas 

para a: i) identificação de genes 

de tolerância a estresses abióticos em 

genomas “modelo” (arroz), com posterior 

caracterização em espécies de 

interesse (trigo, milho, cevada, sorgo, 

aveia e azevém); ii) caracterização 

molecular do germoplasma local; iii) 

identificação de “genes maiores”, responsáveis 

pela adaptação do arroz 

ao encharcamento; e, iv) criação de 

um banco de mutantes para o sistema 

de raízes. 

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_______________________________________ 

* A autoria deste trabalho deverá ser “The Arabidopsis Genome Iniative”. Uma lista completa dos colaboradores aparece no final do artigo original 

(Nature, 408: 796-815).

Pesquisa 

Paulo Henrique Machniewicz 

Biólogo - Faculdades Integradas “Esprírita” 

Especialista em Genética Humana PUC-PR, 

Responsável pelos laboratórios de Genética, 

Imunologia e Microbiologia do Centro Universitário 

Campos de Andrade - UniAndrade - Curitiba-PR 

paulo.mach@bol.com.br 

Fábio Rueda Faucz, Dr 

Biologo - UFPR 

Mestrado em Ciências Biológicas - UFPR 

Doutorado em Genética - UFPR 

Professor adjunto - PUC-PR 

Professor Titular - UNICEMP-PR 

fabiogenetica@yahoo.com 


Associação de mutações nos 

genes BRCA1 e BRCA2 

Associação de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 causadoras do câncer de mama hereditário 

Resumo 

Cerca de 10% dos cânceres de 

mama podem ser associados a mutações 

na linhagem germinativa. Em 

1990, foi identificado, no cromossomo 

17, o gene BRCA1, composto de 

24 exons e codifica para uma proteína 

de 1.863 aminoácidos. Mutações neste 

gene são responsáveis por metade 

de todos os casos familiares de câncer 

de mama. Já em 1995, identificaram o 

BRCA2, com 27 exons, codificando 

para uma proteína de 3.350 aminoácidos. 

Este gene encontra-se no cromossomo 

13. Mutações neste gene 

são responsáveis por cerca de 35% 

dos casos familiares precoces de câncer 

de mama. Estes dois genes, associados 

a outras proteínas, desencadeiam 

a doença que mais mata mulheres. 

No Brasil, registram-se cerca de 35.000 

novos casos de câncer de mama por 

ano. O câncer representa uma proliferação 

maligna das células ou lóbulos 

epiteliais que revestem os ductos 

ou lóbulos da mama. O câncer feminino 

é raramente encontrado antes dos 

25 anos de idade, exceto em casos 

hereditários. A transmissão hereditária 

de câncer de mama segue o clássico 

padrão mendeliano de transmissão 

autossômica dominante, com 50% das 

crianças de carreadoras, herdando mutações 

BRCA1. As portadoras femininas 

de mutações são estimadas a 

terem um risco de 85% de desenvolvimento 

de câncer de mama e ovário, 

com maior incidência de câncer bilateral 

e mais de 50% dos cânceres de 

mama, ocorrendo, antes dos 50 anos. 

A prevalência de mutações de BRCA1 

e BRCA2 é ocasionalmente mais alta 

que o esperado, devido à transmissão 

aumentada de algumas mutações, em 

certas populações, devido ao efeito 

do fundador. A população de Judeus 

Askenazi é a que representa um exemplo 

claro de mutações, devido ao 

efeito do fundador, por cultivarem 

suas tradições de união restrita. Por 

conseqüência, as mutações encontradas 

nesta população são iguais em 

inúmeros países para onde migraram. 

Outras populações, como Espanhóis, 

Indianos, Paquista-neses, Russos e até 

tribos Aborígines do Canadá, também 

apresentam algumas mutações que 

são mais freqüentes e que podem ser 

atribuídas ao efeito do fundador. 

1. Introdução 

O nosso organismo é constituído 

por trilhões de células, que se reproduzem 

pelo processo de divisão celular. 

Este é um processo ordenado e 

controlado, responsável pela formação, 

crescimento e regeneração de 

tecidos saudáveis do corpo. Algumas 

vezes, no entanto, as células perdem 

a capacidade de limitar e comandar 

seu próprio crescimento, passando, 

então, a se multiplicarem muito rapidamente 

e de maneira aleatória e 

desordenada, formando nódulos. 

O câncer surge por causa de 

alterações no DNA, que resulta na 

proliferação incontrolável de células. 

A maioria dessas alterações envolve 

modificações seqüenciais reais 

de DNA. Elas podem surgir como 

conseqüência de erros de replicação 

aleatórios, exposição a carcinógenos, 

ou processos defeituosos de reparo 

do DNA. 


As lesões da mama limitam-se, 

predominantemente, ao sexo feminino 

por possuir uma estrutura mamária 

mais complexa, volume mamário 

maior e extrema sensibilidade 

às influências endócrinas predispõem 

esse órgão a diversas condições 

patológicas (COTRAN, KUMAR, 

COLLINS, 2001). 

As neoplasias constituem as lesões 

mais importantes da mama feminina, 

apesar de não serem as mais 

comuns. Elas podem surgir a partir 

de epitélio escamoso, estruturas glandulares 

e tecido conjuntivo. 

Existem três grupos de influências 

importantes no câncer de mama: 

• Fatores genéticos; 

• Influências hormonais; 

• Fatores ambientais. 

No Brasil, registram-se 35.000 

novos casos de câncer de mama por 

ano, 11.000 deles, só no Estado de São 

Paulo. Fatores de risco de câncer na 

família, alimentação rica em gorduras, 

início precoce da menstruação, menopausa 

tardia, 1ª gestação após os 30 

anos e o fato de a mulher nunca ter 

engravidado são alguns dos fatores 

que influenciam para desenvolver um 

tumor maligno na mama. 

O câncer de mama representa 

uma proliferação maligna das células 

epiteliais que revestem os ductos 

ou lóbulos da mama. É considerado 

o mais comum em mulheres, podendo 

existir por um longo período, 

como doença não-invasiva ou 

invasiva, mas não-metástica. Este 

fato torna-se mais urgente a necessidade 

do diagnóstico precoce e da 

conduta apropriada. 

Cerca de 10% dos cânceres de 

mama podem ser associados a mutações 

na linhagem germinativa. Esta 

área tem sofrido uma elevação notável 

com a identificação de genes 

responsáveis por casos em famílias 

(BATES, HOCKELMAN, 1982 ). 

KING, et al. (1990), usou análise 

genética de ligação para identificar o 

gene BRCA1 localizado no cromossomo 

17q21. Ele é responsável por 

aproximadamente metade de todos 

os casos familiares precoces de câncer 

de mama, bem como pela maioria 

dos casos familiares de câncer de 

mama e ovário. 

SCHUTTE, et al. (1995), identificou 

um gene na região 13q12-q13, 

com seis mutações diferentes em famílias 

com câncer de mama e identificou 

como BRCA2. Mutações nesse gene 

são responsáveis por aproximadamente 

35% dos casos familiares precoces de 

câncer de mama. Estão ainda associados 

a um risco aumentado de câncer de 

mama e de próstata em homens, e de 

câncer ovariano e pancreático. 

Estes dois genes associados a 

outras proteínas desencadeiam a doença 

que mais mata mulheres. 

Para que se tenha uma avaliação 

precisa do risco de desenvolver um 

câncer é necessário que se obtenha 

uma história da paciente, uma 

genealogia do câncer precisa, onde é 

possível confirmar os tipos de cânceres 

através de documentos hospitalares 

e exames. 

Devido aos altos custos e dificuldades 

para testar mutações em 

BRCA1 e BRCA2, são realizadas provas 

nas mutações mais prováveis 

nas populações. Nas famílias de Judeus 

as três principais mutações de 

fundador mais freqüentes, 185 del 

AG, 5382 ins C em BRCA1 e 617 del 

T em BRCA2. Estas três mutações 

mais freqüentes respondem por mais 

de 90% da população. Quando uma 

mutação de fundador é encontrada, 

esta já é suficiente para autorizar a 

blindagem para todos as três mutações 

(BAST, et al 2000). 

2. Localização da mama 

A mama está localizada entre a 

2ª e a 6ª costela, entre a margem 

esternal e a linha medioaxilar. O 

tecido mamário possui três componentes 

principais: 

• Tecido glandular: é organizado 

em 12 a 20 lobos, onde cada 

qual termina num canal que se 

abre na superfície do mamilo. 

• O tecido glandular é sustentado 

por tecido fibroso, incluindo 

os ligamentos suspensórios que 

estão conectados tanto à pele 

quanto à fascia que fica por 

debaixo da mama. 

• A gordura circunda a mama e 

predomina tanto superficialmente, 

quanto na periferia 

(SPENCER, 1991). 


Os vasos linfáticos de grande 

parte da mama drenam para a axila. 

A borda anterior da axila é formada 

pelos músculos peitorais; as bordas 

posteriores incluem o subescapular e 

o grande dorsal; a borda interna pelo 

quadril cortal e músculo denteado 

anterior; e a borda externa pela parte 

superior do braço. 

Os gânglios axilares na parte 

alta da axila, perto das costelas e do 

denteado anterior. Para dentro deles, 

drenam canais provenientes de três 

outros grupos de gânglios linfáticos: 

1. o grupo peitoral ou anterior; 

2. o grupo subescapular (posterior); 

3. o grupo lateral; 

Convém observar que nem todos 

os linfáticos da mama drenam 

para a axila. Dependendo da localização 

de uma lesão no seio, a disseminação 

pode se processar diretamente 

para os gânglios infraclaviculares, 

para dentro dos canais profundos 

existentes no interior do tórax ou 

do abdômen, e até para a mama 

oposta (BATESE, HOCKENAM, 1982). 

Na glândula mamária, os lobos 

possuem muitas subdivisões que 

são chamadas de lóbulos; estes terminam 

em dezenas de pequenos 

bulbos produtores de leite. Os lobos, 

lóbulos e bulbos são interligados 

por tubos finos denominados 

ductos. Estes ductos vão até o mamilo 

(papilo), localizado no centro 

da área escura da pele que se chama 

auréola. 

Somente com o início da gravidez 

é que a mama assume a 

maturação morfológica e atividade 

funcional completa. Após a cessação 

da lactação, os lóbulos regridem 

e sofrem atrofia, havendo uma redução 

notável no tamanho total da 

mama. A maioria das neoplasias 

mamárias não contém tecido 

adiposo e, em exames como a mamografia, 

elas aparecem como massas 

de maior densidade, contrastando 

com o estroma circundante. 

Por conseguinte, a mamografia é 

menos sensível em mulheres jovens, 

nas quais essas massas podem 

ser obscurecidas por tecido 

denso circundante (COTRAN, 

KUMAR, COLLINS, 2001).

3. Sinais visíveis de Câncer 

Mamário 

BATES, HOCKELMAN, (1982) 

descreveram alterações na mama que 

caracterizam um tumor, entre elas 

destacam-se: 

• Produção de fibrose, ou formação 

de tecido cicatricial; 

• Sinais de retração que incluem 

covas cutâneas, alterações 

nos contornos mamários e achatamento 

ou desvio do mamilo; 

• Aparecimento de nódulo ou 

endurecimento da mama ou embaixo 

do braço; 

• Mudanças no tamanho e ou 

formato da mama; 

• Alteração na coloração ou na 

sensibilidade da pele da mama 

ou da auréola; 

• Secreção contínua por um 

dos ductos; 

• Retração da pele da mama ou 

do mamilo; 

• Inchaço significativo ou 

distorção da pele. 

• As alterações no contorno 

são identificadas por inspeção 

cuidadosa das superfícies normalmente 

convexas das mamas 

e comparando uma mama 

com a outra. 

• Edema de pele, produzindo 

por bloqueio linfático. 

4. Classificação dos tipos 

de Câncer de Mama 

O câncer de mama é subdividido 

em dois grandes grupos: 

• Carcinomas: que podem ser 

diferenciados em câncer lobular 

onde começa nos bulbos (pequenos 

sacos que produzem 

leite); ou câncer dos ductal, 

que se formam nos ductos que 

levam o leite dos lóbulos para o 

mamilo (papila). 

• Sarcomas: formam-se nos 

tecidos conjuntivos, onde é mais 

comum o câncer se dissipar 

para outras partes do corpo. 

O carcinoma é o mais comum. 

Ele é mais comumente encontrado e 

diagnosticado na mama esquerda do 

que na mama direita. 

Os cânceres são bilatérias ou 

seqüenciais na mesma mama em 4% 

ou mais dos casos. Entre os carcinomas 

de mama pequenos o suficiente para 

identificar sua área de origem, cerca de 

50% surgem no quadrante superior 

externo, 10% em cada um dos 

quadrantes restantes e cerca de 20% na 

região central ou subareolar, o local de 

origem influência de modo considerável 

o padrão de metástase linfonodal. 

Os carcinomas são divididos em 

carcinomas não–inflitrantes ou in situ 

e carcinomas inflitrantes. 

♦ Carcinomas in situ: 

• Carcinoma ductal in situ; 

• Carcinoma lobular in situ; 

♦ Carcinomas Invasivos (infiltrante): 

• Carcinoma ductal infiltrante 

sem tipo específico; 

• Carcinoma lobular invasivo 

ou infiltrante; 

• Carcinoma medular; 

• Carcinoma colóide; 

• Carcinoma tubular; 

• Carcinoma papilar invasivo. 

5. Estágios de 

desenvolvimento do 

Câncer de Mama 

Os diferentes tipos de câncer de 

mama, quando são diagnosticados e 

confirmados com exame laboratorial, 

são classificados conforme o seu tamanho 

e presença de metástases nos 

linfonodos e a distância. Esta classificação 

foi criada para que o médico 

possa saber indicar qual o tratamento 

mais adequado para o paciente ( 

HARRISON, et al. 1998 ). 

• TX: tumor primário que não 

pode ser demonstrado. 

• T0: não existe evidência de 

tumor primário. 

• TIS carcinoma in situ: carcinoma 

intraductal e carcinoma 

lobular in situ. 

• T1: tumor de até 2 cm. 

• T1a: tumor de até 0,5 cm. 

• T1b: tumor 0,5 > 1 cm. 

• T1c: tumor 1cm > 2 cm. 

• T2: tumor com mais de 2 cm 

e menos de 5 cm. 

• T3: tumor com mais de 5 cm. 

• T4: tumor de qualquer tamanho 

com possível extensão direta 

a parede do tórax. 

• T4a: extensão a parede do 

tórax. 

• T4b: edema, ou ulceração, ou 

nódulos satélites na parede da 

mesma mama. 

• T4c: quando encontra-se T4a 

e T4b. 

• T4d: carcinoma inflamatório. 

Gânglios Linfáticos (N) 

• NX: quando não se pode afirmar 

o comprometimento dos gânglios. 

• N0: sem metástase em gânglios 

regionais. 

• N1: metástase em gânglios axilares 

unidos uns aos outros e a outras 

estruturas. 

• N3: metástase em gânglios linfáticos 

da mama interna. 

Classificação Patológica 

• PNX: quando não se pode 

excluir a presença de gânglios. 

• PN0: sem metástase em gânglios 

regionais. 

• PN1: metástase em gânglios 

regionais laterais móveis. 

• PN1a: somente micrometástases 

< 0,2 cm. 

• PN1b: metástase em gânglios 

maiores de 0,2 cm. 

• PN1b1: metástase de 1 a 3 

gânglios > 0,2 < 2 cm. 

• PN1b2: metástases de 4 ou 

mais gânglios > 0,2 a < 2 cm. 

• PN1b3: quando atravesa a 

parede do gânglio < 2 cm. 

• PN1b4: metástase a gânglios 

linfáticos de 2 cm ou massa e 

dimensão maior. 


axilares unidos uns aos outros e 

a outras estruturas. 


linfáticos da mama interna. 

Metástase a Distância (M) 

• MX: presença de metástase à 

distância, mas que não pode ser 

demonstrado. 

• M0: não há evidência de 

metástase à distância. 

• M1: presença de metástase 

supraclaviculares. 


São considerados cinco estágios 

de desenvolvimento de tumor segundo 

o Comitê Americano de Câncer. 

• Estágio 0:Carcinoma ductal in 

situ e carcinoma lobular in situ. 

Sem evidência de tumor nos 

linfonodos e metástase à distância. 

• Estágio 1: Quando o tumor 

tem até 2 cm , mas sem qualquer 

evidência de ter se espalhado 

pelos gânglios linfáticos 

próximos. 

• Estágio 2: Inclui tumores de 

até 2 cm, mas com envolvimento 

de gânglios linfáticos, ou, 

então, um tumor primário de 

até 5 cm, com linfonodos axilares 

afetados, porém móveis, sem 

metástase à distância, ou tumor 

com mais de 5 cm sem comprometimento 

linfonodal nem 

metástases distantes. 

• Estágio 3: Quando o tumor 

tem mais de 5 cm e há envolvimento 

dos gânglios linfáticos 

da axila do lado da mama afetada. 

• Estágio 4: Quando existem 

metástases distantes, como no 

fígado, ossos, pulmão, pele ou 

outras partes do corpo. 

6. Frequência e 

epidemiologia 

O câncer de mama feminino é 

raramente encontrado antes dos 25 

anos de idade, exceto em casos 

familiares. A idade habitual que se 

identifica gira em torno dos 30–80 

anos, sendo mais comum na meia 

idade e velhice. 

Encontra-se entre as doenças 

mais comuns e a que mais mata 

mulheres no Brasil. Dados do Instituto 

Nacional do Câncer –I NCA 

mostram que foram diagnosticados 

neste ano cerca de 30 mil casos 

novos e oito mil morreram por causa 

da doença. 

Este tipo de tumor foi considerado 

o 3º que mais mata no Brasil. A 

obtenção de uma história familiar 

constitui um fator de risco para desenvolvimento 

do câncer de mama; 5 

a 10% dos casos são atribuíveis á 

herança de um gene autossômico 

dominante. 

A probabilidade de herança genética 

aumenta se houver vários parentes 

afetados e se for constatada a 

ocorrência do câncer numa idade 

jovem. 

Dois genes são responsáveis pela 

maioria dos cânceres de mama hereditário: 

o BRCA1 e BRCA2. 

O BRCA1, localizado no cromos-somo 

17, quando mutante, é 

capaz de produzir alto risco (talvez 

até 85% ao longo da vida) de câncer 

de mama e também de câncer ovariano 

(talvez50% de risco ao longo da 

vida). Cerca de 1/500 mulheres carregam 

uma mutação BRCA1 na linhagem 

germinativa, com freqüência, 

dando origem a uma história familiar 

consistente. Homens com mutações 

BRCA1 podem ter um aumento modesto 

no risco de câncer de próstata. 

“... há uma série de heterogeneidade 

mutacional descrito para o 

BRCA1, como em geral é o caso nos 

distúrbios genéticos. Uma exceção são 

as populações Judia Askenazi, em 

que um de 100 indivíduos carregam 

uma deleção 2-pb particular a 185 

del AG no BRCA1.” 1 

Mutações em outro gene no cromossomo 

13, o BRCA2 também 

confere alto risco de câncer de mama, 

e um risco um pouco menor de 

câncer ovariano; em homens essas 

mutações também os tornam propensos 

ao desenvolvimento de câncer 

de mama. 

“Estima-se que a freqüência das 

Mutações BRCA 2 seja cerca da 

metade da freqüência do BRCA 1 . 

Cerca de 1% de Judeus Askenazi 

outra vez tem uma mutação comum 

há 6174 del T .” 2 

A incidência global do câncer de 

mama é menor em mulheres negras. 

As mulheres nesse grupo desenvolvem 

câncer com uma idade mais 

avançada e apresentam um aumento 

da taxa de mortalidade, em comparação 

com as caucasóides. 

Os Estados Unidos e a Europa 

Setentrional apresentam a maior incidência 

da doença. 

Tumores de mama associados 

ao BRCA1 são mais prováveis em 

mulheres com filhos, possuem uma 


fase S maior, e quantidade elevada 

de estrógeno e baixos receptores de 

progesterona. 

7. Hereditariedade 

A transmissão hereditária de câncer 

de mama segue o clássico padrão 

mendeliano de transmissão autossômica 

dominante, com 50% das crianças 

de carreadoras herdando mutações 

BRCA1. 

As portadoras femininas de mutações 

são estimadas a ter um risco 

de 85% de desenvolvimento de câncer 

de mama e/ou ovariano, com 

uma maior incidência de câncer bilateral 

e mais de 50% dos cânceres de 

mama ocorrendo antes dos 50 anos. 

(BIESECKER, et al. 1993). 

“... o câncer de mama genético 

incide, geralmente, em mulheres jovens, 

antes dos 50 anos de idade. A 

ocorrência de mais de 2 casos em 

uma família de mulheres jovens, 

com menos de 50 anos, sugere que 

existe a possibilidade de que seja um 

defeito genético na família. Além disso, 

estes tumores costumam ser bilaterais; 

é freqüente que surjam nas 

duas mama, ás vezes não ao mesmo 

tempo. A ocorrência de múltiplos casos 

em mulheres jovens de tumores 

bilaterais, chama a atenção para 

que esta seja pela falta de risco . 

Outro sinal se dá pelo fato de o câncer 

de mama estar associado, nestes casos 

genéticos, ao câncer de ovário. A 

incidência, em uma mesma família, 

de uma mutação genética que predisponha 

à ocorrência do câncer. 

Estes casos constituem, aproximadamente, 

de 6% a 10% dos casos genéticos 

de câncer de mama. De 90% a 

94% não temos uma história familiar.” 

3 

CROOP, et al (1990), constataram 

que mutações na linhagem germinativa 

do BRCA1 são responsáveis 

por 2% a 4% de todos os cânceres 

mamários. Embora mais que 90% 

deles sejam casos esorádicos ocorrendo 

em mulheres sem evidências 

de susceptibilidade hereditária, análises 

de espécies de tumores mamá- 

_________________________________________________________________ 

1 COLLINS,Francis S. 1998. 

2 TRENT, Jeffrey M. 1998. 

3 Revista Hands nº3 , 2002.

ios sugerem que anormalidades 

somáticas adquiridas no BRCA1 possam 

também desempenhar um papel 

em muitos desses cânceres. 

8. Estudo de associação 

Os dois principais genes responsáveis 

pela transmissão hereditária do 

câncer de mama, o BRCA1 e BRCA2, 

codificam proteínas de 1.863 e 3.350 

aminoácidos, respectivamente (Anexo 

03). Ambos os genes são complexos 

formados por mais de 20 exons. 

O BRCA1 foi identificado no 

lócus 17q21. Este gene codifica uma 

proteína zíncica cujo produto pode, 

portanto, atuar como fator de transcrição. 

(FAUCI, et al 1998) descreveu 

que este gene possui 22 exons codificantes 

e 2 exons não-codificantes, 

estendendo-se por cerca de 100 kb 

de seqüência genômica. Seu produto 

é uma proteína de 1.863 aminoácidos. 

O BRCA2, localizado no cromos-somo 

13q12-q13, está associado 

com uma maior incidência de câncer 

da mama em homens do que em 

mulheres, (FAUCI, et al 1998). Este 

gene possui 27 exons dispersos por 

70 kb de DNA genômico, e seu transcrito 

estende-se por cerca de 10 à 12 

kb codificando para uma proteína de 

3.418 aminoácidos. 

Acredita-se que o BRCA1 e o 

BRCA2 se comportam como genes 

supressores de tumores clássicos, e 

que com a perda de uma cópia predispõem 

o portador ao desenvolvimento 

do câncer (BAST, et al. 2000). 

WOOSTER, et al. (1994), estudaram 

o acoplamento do genoma em 

15 famílias com alto risco de câncer 

de mama no BRCA1 em 17q21. Esta 

análise descobriu um segundo lugar 

suscetível ao câncer de mama, o 

BRCA2 no cromossomo 13q12–q13. 

O estudo em BRCA2 confere um alto 

risco de câncer de mama e não confere 

um risco substancialmente elevado 

de câncer ovariano, como é o 

risco do BRCA1. 

Várias pesquisas indicaram uma 

associação entre BRCA1 e a proteína 

p53, e o encarecimento subseqüente 

de atividade de p53 incrimina BRCA1. 

O BRCA1 forma complexos com 

BRCA2 e Rad 51, que é homólogo do 

gene Rec A da E. coli em humanos e 

que é essencial à recombinação normal 

e estabilidade do genoma (BAST, 

et al 2000). 

O BRCA1 também pode fazer 

um papel de regulação na transcri- 

ção, controle do ciclo celular e desenvolvimento. 

O BRCA1 foi associado 

com a RNA polimerase holoenzima 

32 e fita CREB33, que implica na 

regulação de transcrição. 

Em uma mulher que desenvolve 

câncer de mama, antes dos 40 anos, a 

chance que ela leva uma mutação em 

BRCA1 pode ser tão alta quanto 10%. 

O que não é aplicado para BRCA2, 

que pode ser associado a uma idade 

ligeiramente mais elevada. 

A prevalência de certas mutações 

de BRCA1 e BRCA2 é ocasionalmente 

mais alta que o esperado, 

devido à transmissão aumentada de 

algumas mutações, em certas populações, 

devido ao efeito do fundador 

(BAST, et al. 2000). 

Foram identificadas mutações de 

fundador características para BRCA1 

e BRCA2 em famílias de Judeus 

Ashkenazi e de descendentes na Islândia, 

Finlândia, Hungria, Rússia, 

França, Holanda, Bélgica, Suécia, Dinamarca 

e Noruega. A maioria dos 

estudos realizados em BCRA1 e 

BCRA2 foram feitos em caucasóides 

dos Estados Unidos e Europa (BAST, 

et al. 2000). 

Significantemente, existem menos 

dados sobre as taxas de muta- 

Tabela 

1: 

Quadro 

comparativo 

mostrand 

o as 

propriedades 

e funções 

dos 

genes 

BRCA1 

e BRCA2 

BCRA1 BCRA2 

Cromo s 

omo 

17q21 13q12 

Gene 100kb 70kb 

Prote ína 

1. 

863 

amino 

ácidos 

Compo 

nente 

da 

holoen 

zima 

RNA-polime 

rase 

3. 

418 

amino 

ácidos 

Funçã o 

Supre 

s 

or 

tumo 

ral 

Inter 

age 

com 

Supre 

ssor 

tumo 

ral 

Inter 

age 

com 

prot 

eínas 

nucle 

ares 

Possí 

vel 

papel 

no 

prot 

eínas 

nucle 

aresP 

ossív 

el 

papel 

no 

repa 

ro 

do 

DNA 

repa 

ro 

do 

DNA 

Mutaçõ es 

> 500 

identi 

ficadas 

> 200 

identi 

ficadas 

Risc o de 

cânce 

r de 

mama 

Mais de 

70% 

aos 

80 

anos 

de 

idade 

Mais 

de 

60% 

aos 

70 

anos 

de 

idade 

Idade de 

iníci 

o 

Idade 

mais 

jovem 

( quart 

a á quinta 

década 

de 

vida) 

50 

anos; 

mais 

idosa 

do 

que 

o BCRA1. 

Risc o de 

outro 

s tumo 

res 

Risc 

o de 

cânce 

r ovari 

ano 

de 

30-60% 

aos 

Câncer 

de 

mama 

masc 

ulina 

, ovári 

o, 

70 

anos 

de 

idade 

Próst 

ata, 

cólon. 

bexig 

a, 

prós 

tata, 

pâncr 

eas. 

Mutaçõ 

es 

no 

cânce 

r não 

- 

famil 

iar 

M uito 

rara 

s ( < 5% 

) 

< 5% 

Epidemi ologia 

Mutaçõ 

es 

especí 

ficas 

mais 

comun 

s em 

Mutaçõ 

es 

especí 

ficas 

mais 

comun 

s em 

alguns 

grupo 

s étnic 

os 

( p. 

ex. 

, pres 

ença 

de 

uma 

muta 

ção 

em 

20 

a 30% 

dos 

cânce 

res 

de 

mama 

em 

mulhe 

res 

Judias 

Ashke 

nazi) 

. 

alguns 

grupo 

s étnic 

os 

Patolo 

gia 

dos 

cânce 

res 

de 

Maior 

incid 

ência 

: 13% 

de 

carc 

inoma 

s Tipos 

variá 

veis 

podend 

o depend 

er 

de 

mama 

medula 

res 

e tumo 

res 

de 

maior 

grau 

Carci noma 

ductal in 

situ 

meno 

s 

freqü 

ente. 

muta 

ções 

especí 

ficas. 

Fonte 

: COTRAN, 

R. 

S. 

; KUMAR, 

V. 

; COLLINS, 

T. 

2001. 


ções de BRCA1 e BRCA2 em famílias 

de outros grupos étnicos e raciais 

(BAST, et al 2000). 

TRAVTIGIAN, et al (1996), observaram 

como o BRCA1, a proteína 

de BRCA2 é altamente carregada, 

¼ dos resíduos é ácido ou básico. 

Porém, havia poucas pistas sobre 

a função bioquímica de BRCA2. 

Foram observados níveis mais altos 

de expressão em mama e timo, e 

ligeiramente níveis mais baixos em 

pulmão, ovário e baço. Em estudo 

de 18 famílias, em 9 foi observado 

a deleção de 3 nucleotídeos que 

altera a armação de leitura, e conduzem 

a mutilação da proteína 

BRCA2. Os autores notaram que o 

BRCA2 é notavelmente semelhante 

a BRCA1. Ambos possuem o exon 

11 grande; em ambos a tradução 

começa no exon 2; ambos têm sucessões 

de codificação que são ricas 

em Adenina; e são compostos 

de aproximadamente 70 Kb de Dna 

genômico. O BRCA2 é composto de 

27 exons. 

WEBER, et al. (1996), estudaram 

3 exons de BRCA2 ( exons 10, 11 e 

27) em 69 amostras aleatórias de 

tumor de mama congelados. Eles 

identificaram uma mutação somática 

truncada de BRCA2 em carcinoma 

ductal primário: deleção de 1 par de 

bases e substituídas pela adição de 9 

aminoácidos modernos e terminação 

da tradução no códon 894. 

CONNOR, et al. (1997), em seus 

estudos com ratos observaram que o 

BRCA1 e BRCA2 são altamente expressos 

proliferando células ao limite 

de G1/S do ciclo celular da mama 

comum vistos em pacientes com 

mutações nestes genes, sugere que 

BRCA1 e BRCA2 possam estar agindo 

no mesmo tempo. 

SARAN, et al. (1997), identificaram 

uma interação de proteína de 

BRCA2 com a proteína de DNA conserto 

Rad51. DAVIS, et al. (2001) 

mostrou que o BRCA2 faz um papel 

duplo na regulação da Rad51, que é 

uma proteína essencial para a recombinação 

homóloga e conserto de DNA. 

Primeiramente, as interações de 

Rad51 e o BCR3, ou regiões de BCR4 

do BRCA 2, bloqueiam a formação de 

filamentos nucleoprotéicos por 

Rad51. Alterações para a região de 

BCR3 que imitam mutações associa- 

das ao câncer de BRCA2 não exibem 

este efeito. 

Em segundo, o transporte de 

Rad51 para o núcleo estava defeituoso 

em células que carregam uma 

mutação associada ao câncer de 

BRCA2. Assim, BRCA2 regula a localização 

intracelular e a habilidade de 

ligação de DNA de Rad51. 

STRUEWING, et al. (1997), estudaram 

120 portadoras de mutações 

em BRCA1 e BRCA2. As mutações 

em BRCA1 estudadas eram 185delAG, 

e 5382insC; a mutação de BRCA2 

estudada era 6174delT. O risco calculado 

de câncer de mama em pacientes 

com até 70 anos era de 56%, de 

câncer ovariano 16%; e de câncer de 

próstata 16%, não havia diferença 

significante no risco de câncer de 

cólon entre os parentes dos portadores. 

Concluíram que de 2% de Judeus 

Ashkenazi levam mutações em 

BRCA1 e BRCA2, o que confere um 

risco aumentado de câncer de mama, 

ovário e próstata. 

NEUHAUSEN, et al. (1998), analisaram 

famílias Judias e identificou 3 

mutações mais freqüentes, possivelmente 

através do efeito do fundador 

que são: 185del AG e 5832 ins C em 

BRCA1 e 6174 del T em BRCA2. 

JERNISTON, et al. (1999), concluíram 

em seus estudos que os portadores 

do BRCA1 e mutações do 

BRCA2, que têm filhos, estão mais 

suscetíveis a desenvolverem câncer 

de mama, antes dos 40 anos, que as 

portadoras que são nulíparas. Cada 

gravidez aumenta o risco de desenvolver 

câncer de mama. 

As mutações da linhagem germinativa 

do BRCA1 são responsáveis 

por 2% a 4% de todos os cânceres 

mamários. Embora mais que 90% 

deles sejam casos esporádicos, ocorrendo 

em mulheres sem evidências 

de susceptibilidade hereditária, análises 

de espécies de tumores mamários 

sugerem que anormalidades 

somáticas adquiridas no BRCA1 possam 

também desempenhar um papel 

em muitos desses cânceres (CROOP, 

et al. 1990). 

FODOR, et al. (1998) determinando 

a freqüência do BRCA1 comum 

e mutações de BCRA2: 185 del 

AG, 5382 ins C e 6174 del T, o DNA 

foi analisado para as 3 mutações 

através de hibridização de oligonu- 


cleotídeos alelo–específicos (ASO). 

Oito pacientes (3%) eram heterozigotos 

para a mutação 185 del AG, 

dois pacientes (0,75%) para 5382 ins 

C e oito pacientes (3%) para 6174 

del T. O risco vitalício para câncer 

de mama em Judeus Ashkenazi portadores 

do BCRA1 185del AG ou 

BRCA2 6147 del T foram calculadas 

para ser 36%, aproximadamente 3 

vezes o risco global para a população 

em geral. 

Na Austrália, BAHAR, et al. 

(2001), encontraram em Judeus 

Ashkenazi a mesma prevalência alta 

de 4 mutações do fundador, da mesma 

forma que acha em Judeus 

Ashkenazi nos Estados Unidos e Israel. 

As quatro mutações analisadas era 

185 del AG e 5182 ins C em BRCA1; 

6174 del T em BRCA2 e 11307K em 

APC. 

STRUEWING, et al. (1995) declarou 

que mais de 50 mutações sem 

igual tinham sido descobertas no gene 

BRCA1, em indivíduos com câncer 

de mama e ovário. Em genealogias 

de alto risco, portadoras femininas 

de uma mutação de BRCA1 tiveram 

80 a 90% de risco vitalício em câncer 

de mama e 40 a 50% de risco de 

câncer de ovário. 

STRUEWING, et al. (1995), determinaram 

a freqüência da mutação 

185 del AG em 858 Ashkenazi, que 

buscam prova genética para condições 

sem conexão para câncer, e em 

815 pessoas de referência não selecionadas 

pela origem étnica. Eles acharam 

a mutação 185 del AG em 0,9% 

de Ashkenazi . Os resultados sugeriam 

que 1/100 mulheres de descendência 

Ashkenazi possam ter alto 

risco de desenvolver câncer de mama 

ou ovário. 

Entre as 39 mulheres Judias com 

câncer de mama antes dos 40 anos, 

(FITZ, et al. 1996) acha que 8 (2%) 

carregam a mutação 185 del AG. 

Em câncer de mama esporádico, 

(THOMPSON, et al. 1995) acha o 

RNAm do BRCA1 em níveis notadamente 

diminuídos durante a transcrição 

de carcinoma in situ para câncer 

invasivo. 

THOMPSON, et al. (1995), acharam 

que aquela inibição experimental 

da expressão de BRCA1 com oligonucleotídeos 

antisense produziu 

crescimento acelerado de células nor-

mais e células malignas, mas não 

teve nenhum efeito em células 

epiteliais não mamárias. Eles interpretaram 

estes resultados como indicado 

que o BRCA1, normalmente 

pode servir como um regulador negativo 

de crescimento de células 

epiteliais mamárias. 

HEDENFALK, et al. (2001), 

usando a tecnologia de microarray 

para determinar a expressão de 

genes em câncer de mama, foi achado 

BRCA1 positivos como constatado 

com cânceres de mama BRCA2 

positivos. A suspeita de que uma 

diferença poderia ser achada veio 

do fato que os 2 tipos de tumores 

são freqüentemente distintos, 

histologicamente. Além disso, tumores 

com mutações de BRCA1 são 

geralmente negativos para estrógeno 

e receptores de progesterona, 

considerando que a maioria dos 

tumores, com mutações de BRCA2, 

é positivo para receptores de 

hormônios. Amostras de RNA de 

tumores primários de 7 portadores 

da mutação de BCRA1 e 7 portadores 

da mutação de BCRA2 foi com 

um microarray de 6.512 clones de 

cDNA de 5.361 genes. 

ROA, et al. (1996), observaram a 

mutação 185 del AG em 1,09% de 

aproximadamente 3000 Judeus 

Ashkenazi, e a mutação 5382 ins C 

em 0,13%, a análise do BCRA2 em 

3.058 indivíduos da mesma população 

mostraram uma freqüência de 

portador de 1,52% pela 6174 del T. 

Estes dois alelos são os mais freqüentes, 

que predispõem o câncer de 

mama hereditário entre Judeus 

Ashkenazi . 

BAR–SADE, et al. (1997), em 

estudo com 639 Judeus Iraquianos 

saudáveis, que são um grupo de 

pouco risco para a mutação 185 del 

AG, que é predominantemente em 

Ashkenazi, foram identificados 3 indivíduos 

portadores da mutação 185 

del AG . As análises de haplótipo 

iraquiano mostram que 2 compartilham 

um haplótipo em comum com 6 

portadores Ashkenazi, e um terço 

teve um haplótipo que diferiu por um 

único marcador. Isto sugeriu que a 

mutação 185 del AG do BCRA1 pode 

ter sugerido antes da dispersão das 

pessoas judias no Diáspora, pela 

mesma época de Cristo. 

Alelos mutantes de genes 

supressores de tumores, quando herdados, 

predispõem os indivíduos a 

tipos particulares de câncer. Além 

de um envolvimento na suscetibilidade 

herdada para câncer, estes 

genes de supressão tumoral são 

objetivos para mutações somáticas 

em tipos de câncer esporádicos. Uma 

exceção é o BRCA1, que contribui 

com uma fração significante de câncer 

de mama e ovário, mas sofre 

mutação a taxas baixas em câncer 

de mama e ovário esporádicos. Este 

achado sugere que outros genes 

possam ter como objetivo principal 

causar mutações somática em carcinoma 

de mama. O outro gene BRCA2 

conta, neste estudo, com uma proporção 

quase igual a do BRCA1. O 

BRCA1 e o BRCA2 se comportam de 

forma dominante, tendo em vista 

que herda um alelo mutante e têm 

um risco maior de desenvolver um 

tumor; tumores que eles desenvolverem 

perdem o alelo do tipo selvagem 

através da perda da heterogozidade. 

(TENG, et al. 2002.) 

STEPHENSON, em (2003), estudou 

mulheres com mutações no 

BRCA1 e BRCA2, que têm um risco 

mais elevado de desenvolverem câncer 

de mama, se fizeram uso de 

métodos contraceptivos orais, por, 

pelo menos, 5 anos ou antes de 1975 

(quando preservativos orais geralmente 

tinham um conteúdo de estrógeno 

mais alto que os produzidos 

depois). Estas têm um risco vitalício 

de 50 a 80% de desenvolverem câncer 

de mama. O estudo contou com 

1311 pares de mulheres que eram 

portadoras de mutações danosas, em 

um ou ambos genes, a metade de 

quem teve câncer de mama e a metade 

de quem não tiveram. 

LLORT, et al. (2002), em seus 

estudos com pacientes espanholas, 

analisando mutações em BRCA1 e 

BRCA2 têm uma proporção hereditária 

significativa baixa, no que diz 

respeito ao câncer de mama. O espectro 

mutacional nestes genes é muito 

grande, com centenas de mutações de 

BRCA diferentes mundialmente informadas. 

Mutações devido ao efeito do 

fundador têm uma fração significativa 

de todas as mutações de grupos étnicos. 

Em estudo com 35 famílias espanholas 

que desenvolveram câncer de 

ovário e mama, foram achadas 13 

mutações, das quais se tinham notícias 

de apenas 3, na Espanha. As dez 

mutações modernas são: IVS5+1G>A, 

1491delA Leu 1086 Ter, e Gln 895Ter 

em BRCA1; Glu 49 Ter, 5373del GTAT, 

5947del CTCT, 6672 del TA, 8281 ins 

A, e Pro 3039 Leu em BRCA2. Este 

estudo, comparado com outros realizados 

no país, mostra que das várias 

mutações encontradas na Espanha, 

nenhuma parece ter relação, com efeito, 

do fundador. 

KUMAR, et al. (2002), analisaram 

a sucessão de codificação do 

gene BRCA1 e BRCA2 em 14 pacientes 

de câncer de mama hereditário 

em mulheres Indianas. A análise foi 

realizada em gel de eletroforese sensível 

(CSGE), seguido de seqüenciamento. 

Três mutações delas modernas 

no exon 7, enquanto a outra é um 

apagamento de par básico no exon 

11 que resulta em mutilação de proteína. 

A mutação 185 del AG, previamente 

descrita, em Judeus Askenazi, 

também foi encontrada nesta população. 

Mesmo este sendo o 1º estudo 

realizado com famílias da Índia (14 

no total) sugestiona uma baixa 

prevalência, mas com um envolvimento 

definitivo de mutações no 

gene BCRA1, entre mulheres Indianas 

com câncer de mama. 

A população do Paquistão possui 

uma taxa de câncer de mama 

extremamente alta para populações 

Asiáticas e uma das taxas mais altas, 

mundialmente, do câncer ovariano. 

Neste estudo com 341 casos de câncer 

de mama, 120 casos de câncer 

ovariano e 200 controles femininos. 

A prevalência de mutações no BRCA1 

e BRCA2 em pacientes com câncer 

de mama são de 6,7%, de câncer 

ovariano são 15,8%. Mutações no 

gene BRCA1 respondem por 84% das 

mutações de câncer ovariano e 65% 

das mutações de câncer de mama. A 

maioria das mutações descobertas 

são novas para o Paquistão. Cinco 

mutações de BRCA1: 2080 ins A, 

3889 del AG, 4184 del 4, 4284 del AG, 

e IVS14 – 1A>G , e uma mutação de 

BRCA2 3337C>T, foram encontradas 

em múltiplos casos e representam 

fortes candidatos ao efeito do fundador, 

segundo (LIEDE, et al. 2002). 

TERESCHENKO, et al. (2002), estudaram 

25 famílias Russas com cân- 


cer de mama e ovário, onde analisaram 

mutações nos genes BRCA1 e 

BRCA2, usando análise de heteroduplex 

e multiplex. Além disso, foram 

testadas 22 pacientes com câncer de 

mama diagnosticados antes dos 40 

anos, sem história familiar e 6 pacientes 

com câncer de mama bilateral. A 

freqüência de mutações no BRCA1 

era de 16%. Uma mutação de BRCA1, 

5382 ins C, foi achada em 3 famílias. 

Este estudo juntamente com outro 

sugere que 5382 ins C no BRCA1 é 

uma mutação de fundador na população 

Russa. No BRCA2 foram encontradas 

3 mutações em pacientes com 

câncer de mama sem história familiar, 

2 em pacientes jovens e 1 em pacientes 

com câncer bilateral. Foram encontradas 

4 mutações modernas : 695 

ins T, 1528 del 4, 9318 del 4, S1099X. 

No ano de 2000 foram diagnosticados 

quase 80.000 casos novos de 

câncer de mama na Índia. Embora a 

identificação de BRCA1 e BRCA2 aumentou 

a compreensão na genética 

do câncer de mama em populações de 

descendência da Europa Ocidental, o 

papel destes genes no restante da 

população indiana é inexplorado. A 

análise de 20 pacientes com câncer de 

mama com qualquer história familiar, 

ou idade precoce, conduziu a identificação 

de duas variantes (331+1G>T; 

4476+2T>C) em BRCA1 (10%) 

(SAXENA, et al. 2002). 

RUIZ, et al. (2002), analisaram 

heteroduplex de pacientes mexicanos 

com câncer de mama, onde 

identificaram mutação truncada em 

BRCA1 e BRCA2 (3857 del T; 2663 – 

2664 ins A) e oito variantes raras de 

significação desconhecida, principalmente 

no gene BRCA2, um caso 

de câncer de mama masculino também 

foi identificada. A maioria das 

alterações parecia ser distinta com 

uma única observada em mais de 

uma família. 

LIEDE, et al. (2002), encontraram 

duas famílias de descendência 

aborígines, ambas com as mesmas 

alterações de BRCA1 (1510 ins G; 

1506 A>G). As famílias representam 

duas Aborígines de tribos canadenses, 

embora uma origem ancestral 

comum é provável. Esta é a primeira 

evidência de uma mutação de BRCA1, 

específica para pessoas aborígines 

do Norte da América. 

A detecção de mutações nos genes 

BRCA1 e BRCA2 é feita por técnicas de 

biologia molecular capazes de identificar 

a alteração de uma única base na 

seqüência de DNA. Devido ao grande 

tamanho das seqüências de BRCA1 e 2, 

primeiramente, busca-se identificar qual 

exon contém o sítio mutado, antes de 

se proceder ao sequenciamento do 

DNA. A seqüência de DNA correspondente 

aos vários exons é amplificada 

por PCR (reação em cadeia da polimerase) 

para a realização desses testes. 

Para o screening inicial de mutações, 

uma técnica muito utilizada é a 

de single strand conformation 

polymorphism - SSCP, combinada 

com heteroduplex analysis. A técnica 

de SSCP baseia-se no fato de que a 

conformação tridimensional de fragmentos 

de DNA de fita simples 

depende da seqüência de nucleotídeos, 

sendo que a diferença de um 

nucleotídeo altera o padrão de migração 

eletrofo-rética. A técnica de 

heteroduplex analysis deriva da observação 

de que, em reações de PCR, 

onde estão presentes moléculas de 

DNA selvagens e mutantes, durante 

os últimos ciclos, podem ser formados 

heteroduplex entre essas duas 

espécies de moléculas, os quais terão 

um padrão de migração eletroforética 

diferente dos homoduplexes. Utilizando-se 

fragmentos de tamanho entre 

100 e 350 pares de bases, a taxa de 

detecção de mutações para o SSCP 

como para o heteroduplex analysis, e 

a associação dos dois métodos pode 

elevar essa taxa para perto de 100% 

(sob condições bem controladas e 

processamento semi-automatizado). 

Após a identificação do exon, 

que a abriga a mutação, esta é caracterizada 

pelo sequenciamento do 

DNA. Conhecida a mutação, torna-se 

possível, também, por sequenciamento, 

pesquisá-lo em outros membros 

da família do paciente, com vistas ao 

aconselhamento genético. 

9. Discussão 

Com a identificação dos dois 

principais genes responsáveis pelo 

câncer de mama hereditário, o BRCA1 

e o BRCA2, a genética deu um grande 

salto em busca da cura de doenças 

que são estritamente comuns e que 

mais matam mulheres. 


Em muitas populações, algumas 

mutações tornam-se mais freqüentes 

devido ao efeito do fundador. Uma 

das populações que teve suas mutações 

amplamente estudadas foi o de 

Judeus Askenazi, onde cerca de 2% 

da população leva mutações em 

BRCA1 e BRCA2 o que confere um 

risco aumentado de câncer de mama, 

ovário e próstata. 

Em Judeus Askenazi, as principais 

mutações encontradas devido 

ao efeito do fundador e que já 

foram descritas em inúmeros países, 

são a 185 del AG e 5382 ins C 

no gene BRCA1, e no BRCA2 a 6174 

del T. A prevalência alta destas 

mutações de fundador na linhagem 

germinativa são responsáveis por 

2% a 4% de todos os tipos de câncer 

mamário. 

Em pacientes Espanholas, das 

inúmeras mutações já analisadas em 

BRCA1 e BRCA2 tem uma proporção 

hereditária significativa baixa. A comparação 

com outros estudos realizados 

no país mostra que nenhuma tem 

relação, com efeito, do fundador. 

Em mulheres indianas, 3 mutações 

modernas foram encontradas e 

a 185 del AG foi amplamente encontrada. 

Existe uma baixa prevalência, 

mas com um envolvimento definitivo 

de mutações no gene BRCA1. 

No Paquistão, dentre as muitas 

mutações já descritas, a 3337 C>T no 

BRCA2 representam uma forte 

candidata ao efeito do fundador. 

Na Rússia, a mutação no BRCA1 

5382 ins C foi caracterizada por ser 

uma mutação de fundador, e tribos 

do Canadá também têm 2 mutações 

que são estritamente freqüentes. 

A identificação de portadoras de 

mutações BRCA1 está limitada a um 

número contado de laboratórios, com 

acesso para raras famílias, na qual a 

análise de vários parentes oferece 

informação suficiente para identificar 

carreadores com um alto grau de 

certeza. Com base na taxa de 

carreadoras de uma em 200 a 400 

mulheres, a demanda para um 

rastreamento populacional será provavelmente 

substancial. 

A atenção deve ser voltada para 

os riscos sociais do teste genético, 

como potencial perda de seguro, 

estigmatização e discriminação do 

empregado.

Uma vez que o gene BRCA1 e 

BRCA2 tenham sido identificados e 

um teste clínico para mutações comuns 

esteja disponível, os problemas 

levantados no aconselhamento 

de uma única família irão assumir 

enormes proporções. A prevalência 

de carreadoras de mutações BRCA1, 

com um risco de aproximadamente 

85% de desenvolverem câncer de 

mama, em muito excedem a incidência 

de qualquer outra doença 

genética para qual o rastreamento 

pré-sintomático esteja atualmente 

disponível. 

O rastreamento para mutação 

BRCA1 é provavelmente o 1º teste 

pré-sintomático que terá lugar na 

prática clínica geral, e um sucesso 

ou falha desses esforços trará um 

grande impacto no futuro deste campo, 

com todo o seu potencial para o 

avanço da medicina preventiva, 

evitando doenças e reduzindo os 

custos da saúde. Tem-se a esperança 

de que, com o rastreamento genético, 

a suscetibilidade ao câncer 

de mama, muitas armadilhas possam 

ser evitadas. 

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Pesquisa 

Márcia Nitschke 

Doutoranda em Ciência de Alimentos 

Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP 

nitschke@bol.com.br 

Gláucia Maria Pastore 

Prof a Dr a - Laboratório Bioquímica de Alimentos 

Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP 

glaupast@fea.unicamp.br 


Biosurfatantes a partir de 

resíduos agroindustriais 

Avaliação de resíduos agroindustriais como substratos para a produção de biosurfatantes por Bacillus 

Introdução 

Os surfatantes constituem uma 

classe importante de compostos químicos 

amplamente utilizados em diversos 

setores industriais. Estima-se 

que a produção mundial de surfatantes 

exceda 3 milhões de toneladas 

por ano (Banat, 2000), sendo utilizados 

principalmente como matériaprima 

na fabricação de detergentes 

de uso doméstico. 

A grande maioria dos surfatantes 

disponíveis comercialmente é 

sintetizada a partir de derivados de 

petróleo. Entretanto, o crescimento 

da preocupação ambiental dos consumidores 

combinado com novas 

legislações de controle do meio ambiente 

levaram os cientistas a 

pesquisar surfatantes biológicos 

como alternativa para os produtos 

existentes. 

Os biosurfatantes produzidos 

por microrganismos vêm, nos últimos 

anos, despertando considerável 

interesse devido à sua natureza 

biodegradável, baixa toxicidade e 

diversidade de aplicações. Entre as 

aplicações comerciais dos biosurfatantes 

destacam-se a recuperação 

do petróleo, biorremediação de 

poluentes, formulação de lubrificantes, 

além de diferentes utilizações 

na indústria têxtil, cosmética, alimentícia 

e farmacêutica. 

Atualmente, os biosurfatantes 

ainda não são amplamente utilizados 

pela indústria, devido ao seu alto 

custo de produção, associado a métodos 

ineficientes de recuperação do 

produto e ao uso de substratos caros. 

Porém, o problema econômico da 

produção de biosurfatantes pode ser 

significativamente reduzido por meio 

do uso de fontes alternativas de nutrientes 

facilmente disponíveis e de 

baixo custo. 

Uma possível alternativa para 

a produção de biosurfatantes seria 

o uso de subprodutos agrícolas ou 

de processamento industrial. Atualmente, 

o aproveitamento de resíduos 

vem sendo incentivado por 

contribuir para a redução da poluição 

ambiental, bem como por permitir 

a valorização econômica dos 

resíduos que seriam simplesmente 

descartados. 

O que são biosurfatantes? 

Os biosurfatantes possuem uma 

estrutura comum: uma porção 

lipofílica, usualmente composta por 

cadeia hidrocarbonada de um ou mais 

ácidos graxos, que podem ser 

saturados, insaturados, hidroxilados 

ou ramificados, ligados a uma porção 

hidrofílica, que pode ser um éster, 

um grupo hidróxi, fosfato, carboxilato 

ou carbohidrato (Cameotra & Makkar, 

1998; Bognolo, 1999). Os microrganismos 

produtores distribuem-se em 

diversos gêneros, sendo a maioria 

produzida por bactérias. As principais 

classes de biosurfatantes incluem 

glicolipídios, lipopeptídios e 

lipoproteínas; fosfolipídios e ácidos 

graxos; surfatantes poliméricos e surfatantes 

particulados (Desai & 

Desai,1993). 

Em relação aos surfatantes convencionais, 

os biosurfatantes apre- 


sentam vantagens como (Bognolo, 

1999): 

• elevada atividade superficial e 

interfacial, o que os torna comparáveis 

ou superiores aos sintéticos 

(detergentes aniônicos 

sulfatados) em termos de 

efetividade e eficiência; 

• maior tolerância a pH, temperatura 

e força iônica; 

• biodegradabilidade; 

• baixa toxicidade. 

Os biosurfatantes apresentam 

ainda a vantagem de poder ser sintetizados 

a partir de substratos 

renováveis e de possuir grande diversidade 

química, possibilitando 

aplicações específicas para cada caso 

particular (Desai & Banat, 1997). 

Outra vantagem dos biosurfatantes 

reside no fato de não serem compostos 

derivados de petróleo, fator 

importante à medida que os preços 

do petróleo aumentam. Além disso, 

a estrutura química e as propriedades 

físicas dos biosurfatantes podem 

ser modificadas através de manipulações 

genéticas, biológicas ou 

químicas, permitindo o desenvolvimento 

de novos produtos para necessidades 

específicas. 

Substratos não convencionais 

O sucesso da produção industrial 

de biosurfatantes depende do 

desenvolvimento de processos mais 

baratos e do uso de matérias-primas 

de baixo custo, uma vez que estas 

representam entre 10% a 30% do 

custo total (Cameotra & Makkar, 

1998). Apesar disso, poucos trabalhos 

têm sido publicados com vistas 

a produzir biosurfatantes a partir de 

resíduos (Tabela 1). A dificuldade 

na seleção de um resíduo está em 

encontrar a composição adequada 

de nutrientes que permita o crescimento 

celular e o acúmulo do produto 

de interesse. Em geral, substratos 

agroindustriais que contenham 

altos níveis de carbohidratos ou de 

lipídeos suprem a necessidade de 

fonte de carbono para a produção 

de biosurfatantes. O estabelecimento 

de um processo biotecnológico a 

partir desses substratos alternativos 

também apresenta outra dificuldade, 

que é a padronização devido às 

variações naturais de composição, 

bem como os custos de transporte , 

armazenagem e tratamento prévio 

necessários. Entretanto, a utilização 

de resíduos pode diminuir os custos 

de produção para níveis competitivos 

em relação aos similares obtidos 

por via petroquímica e, ao mesmo 

tempo, reduzir os problemas ambientais 

relativos ao descarte e aos 

custos do tratamento (Mercade & 

Manresa, 1994; Makkar & Cameotra, 

1999a; Makkar & Cameotra, 2002). 

Finalmente, deve-se considerar que 

o Brasil é um país essencialmente 

agrícola e que, portanto, a quantidade 

e a facilidade de acesso aos 

subprodutos agroindustriais é bastante 

significativa. 


Biosurfatantes produzidos por 

Bacillus 

Algumas bactérias do gênero 

Bacillus produzem diversos lipopeptídeos 

que demonstram atividade 

tensoativa ( Rosenberg & Ron, 

1999). As culturas de Bacillus 

subtilis produzem um lipopeptídeo 

cíclico conhecido como surfactina 

ou subtilisina (Arima et al., 1968), 

considerado um dos mais potentes 

biosurfatantes conhecidos (Figura 

1). A surfactina também demonstrou 

atividade anticoagulante, antitumoral, 

antimicrobiana, e, mais recentemente, 

estudos comprovaram 

atividade antiviral e antimicoplasma 

(Vollenbroich et al, 1997a, 

1997b). 

O objetivo deste estudo foi verificar 

a potencialidade do uso de substratos 

alternativos para a produção 

de biosurfatante por isolados de 

Bacillus. 

Materiais e Métodos 

Foram utilizados cinco isolados 

de Bacillus sp. produtores de 

biosurfatante pertencentes à coleção 

de culturas do Laboratório de 

Bioquímica de Alimentos. Para a 

Figura 1. Estrutura da surfactina produzida por Bacillus subtilis. 

Tabela 

1. 

Exemplos 

de 

utilização 

de 

resíduo 

s na 

produção 

de 

biosurfatan 

tes 

Substrato s 

Classe química 

Microrganismo Referência 

Efluente extração 

óleo 

oliva 

r hamnolipídeos 

Pseudomonas sp. 

M ercade 

et al. 

, 1993 

Residuos refino 

óleo 

de 

soja 

rhamnolipídeos P. aeruginosa 

Abalos et al, 

2001 

Água lavagem 

de 

batatas 

lipopeptídeos B. subtilis 

Fox & Bala, 2000 

Melaço lipopeptídeos B. subtilis 

Makkar 

& Cameotra, 

1997 

Soro de 

leite 


Koch et al, 

1988 

Água de 

turfa 

lipopeptídeos B. subtilis 

Sheppard& 

Mulligan 

1987 

Óleo de 

fritura 

usado 


Haba et al, 

2000 

Óleo lubrificante 

usado 

g licolipídeos 

Rhodococcus sp. 

Mercade et al, 

1996 

Soro leite 

desproteinizado 

sophorolipídeos C. bombicola 

Daniel et al, 

1998 

Manipueira lipopeptídeos B. subtilis 

Santos et al, 

1999

produção de biosurfatante foram 

utilizados: 

• melaço (3% v/v sólidos solúveis) 

pH 6,0; 

• manipueira (resíduo líquido 

proveniente da fabricação de farinha 

de mandioca) pH 5,8-5,9; 

• soro de leite (fabricação de 

queijo mussarela) pH 6,4 ; 

• meio sintético proposto por 

Cooper et al. (1981) pH 6,8-6,9. 

A manipueira foi tratada previamente 

com aquecimento a 100°C, 

por 3 minutos e centrifugação a 

10.000 rpm, por 20 minutos, para 

remoção de sólidos. O pH dos resíduos 

não foi ajustado. Os meios 

foram esterilizados em autoclave a 

121°C, por 20 minutos. 

Uma alçada das culturas mantidas 

a 4°C foi transferida para erlenmeyer de 

50 mL, com 20 mL de caldo nutriente e 

incubada em agitador rotatório a 120 

rpm, 30°C, por 24 horas. Após, 1 mL de 

cada cultura a ser testada foi inoculado 

em frascos erlenmeyers de 50 mL contendo 

15 mL dos respectivos meios, 

que foram incubados em agitador 

rotativo tipo shaker a 30°C e 150 rpm, 

por 72 horas. Os meios foram centrifugados 

a 10.000 rpm, por 15 minutos, e 

o sobrenadante, livre de células, utilizado 

para determinações analíticas. 

A tensão superficial foi determinada 

em tensiômetro Krüss, modelo 

K12, utilizando o método da placa. O 

biosurfatante foi isolado do meio de 

cultivo por precipitação ácida a pH 

2,0, seguida de extração com clorofórmio/metanol 

(65:15), segundo 

Makkar & Cameotra (1999b). A atividade 

emulsificante (E 24 ) foi realizada 

em tubos com tampa rosca contendo 

4 mL de solução aquosa, 1mg/mL de 

biosurfatante (obtido em manipueira) 

adicionados de 6 mL de hidrocarbonetos, 

sendo que cada tubo foi submetido 

a vortex máximo por 2 minutos 

e deixado em repouso por 24 

horas. O índice E 24 foi determinado 

medindo-se a altura da camada emulsionada 

(cm) dividindo-a pela altura 

total de líquido x 100. A remoção de 

petróleo de areia contaminada foi 

testada através da saturação de 60g de 

areia com 5 mL de petróleo. Porções 

de 20g da areia contaminada foram 

Figura 2. Percentagem de redução na tensão superficial obtida por isolados de Bacillus 

sp. em diferentes substratos. 

Figura 3. Atividade emulsificante (E 24 ) de solução de biosurfatante frente à diferentes 

hidrocarbonetos. (1) Hexano, (2) Tolueno, (3) Heptano, (4) Decano, (5) Querosene, 

(6) Tetradecano, (7) Hexadecano, (8) Óleo de soja, (9) Gordura de côco. 

colocadas em erlenmeyer de 250 mL, 

adicionando-se-lhe 20 mL de água 

(frasco controle) e 20 mL de solução 

aquosa 1mg/mL de biosurfatante obtido 

(frasco teste). Os frascos foram 

agitados a 150 rpm, por 12 horas em 

temperatura ambiente. Retirou-se 

deles o líquido da primeira lavagem e 

procedeu-se a uma segunda adição de 

20 mL de água e biosurfatante, incubando-os 

nas mesmas condições acima. 

O líquido da segunda lavagem foi 

removido e a areia foi retirada do 

frasco sendo colocada em estufa a 

50°C até a secagem. 

Resultados e Discussão 

Os resultados obtidos nos ensaios 

de produção de biosurfatante em 

diferentes substratos alternativos são 

mostrados na Figura 2. Nota-se que 

todos os isolados testados demonstraram 

capacidade de produzir biosurfatante 

e, conseqüentemente, de reduzir 

a tensão superficial dos meios testados, 

sendo que a manipueira forneceu 

as maiores percentagens de redução , 

na ordem de 42% , para todos os 

isolados testados; entretanto, o soro de 

leite apresentou uma redução média 


Figura 4. Capacidade de remoção de petróleo de amostra de areia utilizando solução de biosurfactante. 

(1) Biosurfatantes, (2) controle, (3) água. 

Tabela 

2. 

Atividade 

emulsificante 

do 

biosurfatan 

te 

obtido 

em 

manipueira 

H idrocar 

boneto 

E24 

( % ) 

Hexano 66, 

6 

Tolueno 72, 

7 

Heptano 66, 

6 

Decano 70, 

4 

Querosene 70, 

4 

Tetradeca no 

70, 

9 

Hexadecano 69, 

0 

Óleo de 

soja 

74, 

0 

Gordura e côco 

70, 

9 

Petróleo 69, 

0 

de 10% , ressaltando que o isolado 

LB5a não produziu surfatante nesse 

resíduo. O melaço também demonstrou 

boa potencialidade como substrato 

para produção de biosurfatante pelos 

microrganismos testados e apresentou 

redução média de, aproximadamente, 

33%. O meio sintético utilizado 

como padrão foi definido por 

Cooper et al. (1981), para a produção 

de surfactina por Bacillus subtilis ATCC 

21332 e vem sendo utilizado, desde 

então, como uma referência para a 

produção de biosurfatantes de Bacillus. 

Nota-se que, apesar de permitir a produção 

de biosurfatante por todos os 

isolados, esse meio mostrou resultados 

inferiores (com redução média de 

21,5%) aos da manipueira e do melaço, 

sugerindo que estes dois resíduos 

possuem uma composição de nutrientes 

adequada para a produção de biosurfatantes. 

Embora a composição química 

varie de acordo com a época do ano e 

com o tipo de cultivar de mandioca, a 

manipueira possui em sua composição 

uma grande quantidade de carbohidratos 

(40-60 g/L ) destacando-se ainda a 

presença de frutose, glicose e sacarose, 

além de nitrogênio (1-2 g/L) e mine- 

rais como P, K, Mg, Mn, S, Fe, Cu, Zn, 

Ca (Cereda, 1994). Segundo Cooper et 

al. (1981), os sais minerais, principalmente 

Fe e Mn, são fatores nutricionais 

importantes para a produção de surfatantes 

por linhagens de Bacillus. A 

presença desses minerais, além de 

fontes de carbono e nitrogênio, seja, 

provavelmente, o principal motivo de 

haver maior produção de biosurfatantes 

nesse resíduo. 

Em adição à tensão superficial, 

a estabilização de emulsões é freqüentemente 

utilizada como um indicador 

da atividade superficial (Abu-Ruwaida 


Figura 5 . Águas de lavagem da areia impregnada com petróleo. 

A1-A2: água; BS1-BS2: solução biosurfatante 1mg/mL. 

et al, 1991). A capacidade emulsificante 

do biosurfatante obtido em manipueira 

pelo isolado LB5a foi avaliada através 

do índice E 24 com diferentes hidrocarbonetos 

(Tabela 2). Os índices obtidos 

(60%-80%) revelam alta especificidade 

do biosurfatante contra todos os 

hidrocarbonetos testados, formando 

emulsões estáveis do tipo A/O (Figura 

3). O composto obtido possui potencial 

para uso na biorremediação, recuperação 

de petróleo e emulsificação de 

óleos e gorduras. 

Com vistas a avaliar a capacidade 

do biosurfatante produzido em

manipueira pelo isolado LB5a em remover 

petróleo de areia contaminada, 

procedeu-se a um experimento 

ilustrado nas Figuras 4 e 5, onde se 

observa que a areia tratada com solução 

de biosurfatante apresenta aspecto 

mais claro e as respectivas águas de 

lavagem demonstram maior capacidade 

de recuperação do petróleo em 

relação ao tratamento sem tensoativo. 

Conclusões 

Entre os resíduos agroindustriais 

testados, a manipueira foi que demonstrou 

a maior potencialidade para 

uso como substrato alternativo na 

produção de biosurfatantes por isolados 

de Bacillus, sendo que o composto 

obtido apresentou capacidade para 

uso em biorremediação de poluentes 

e em recuperação de petróleo. 

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Pesquisa 

Gabrielle Mouco 

Aluna de graduação em Farmácia - UNIP 

gabimouco@yahoo.com.br 

Maira Jardim Bernardino 

Aluna de graduação em Farmácia - UNIP 

mjb@ajato.com.br 

Melânia Lopes Cornélio, Ph.D 

Farmacêutica, Ph.D- Química de Produtos Naturais 

Professora Titular da Disciplina de Farmacognosia 

UNIP - Universidade Paulista-SP 

melaniacornelio@yahoo.com.br 


Controle de qualidade 

de ervas medicinais 


Controle de qualidade de Phyllanthus niruri L. (quebra-pedra) 

Introdução 

O controle de qualidade da 

droga vegetal é imprescindível, 

pois muitas espécies vegetais são 

vendidas sem nenhuma garantia 

de qualidade, o que favorece desde 

a venda de espécies falsificadas 

até o armazenamento inadequado 

da droga vegetal durante a sua 

comercialização. A análise aqui descrita 

foi realizado com a droga 

vegetal adquirida e conhecida popularmente 

como quebra-pedra. O 

controle de qualidade dessa droga 

vegetal foi feito a começar da sua 

descrição microscópica, para verificar 

a autenticidade da espécie a 

fim de evitar equívocos. Também 

foram realizados testes químicos 

para confirmar as principais classes 

de seus constituintes químicos 

descritos na literatura (De Souza 

et. al., 2002; Duke, 2000). Os interesses 

terapêuticos do Phyllanthus 

niruri L. provêm principalmente 

de suas propriedades diuréticas 

para o combate de cálculos renais. 

Devido a isso, estão sendo desenvolvidos 

vários estudos para isolar 

a substância responsável por tais 

propriedades, além de elucidar a 

melhor maneira de tratamento 

(Teske et. al., 1995). 

Estudos experimentais com as 

folhas e as sementes também têm 

demonstrado a sua ação hipoglicemiante, 

antibacteriana e anticancerígena. 

Em ensaios especiais, mostrou-se 

que é ativa contra o vírus da 

hepatite B in vivo e in vitro. Além 

disso, possui a virtude de dissolver 

cálculos renais, impedindo a contração 

do ureter e promovendo a 

sua desobstrução. Desenvolve atividade 

diurética pela elevação da 

filtração glomerular e excreção 

urinária dos sais de uratos (Tona et. 

al., 2001; Teske et. al., 1995; Ogata 

et. al., 1992). 

Outro estudo realizado mostrou 

o efeito do Phyllanthus niruri 

sobre a cristalização do oxalato de 

cálcio in vitro. Por meio desse estudo, 

pôde-se concluir que o extrato 

de quebra-pedra interfere no crescimento 

e na agregação dos cristais 

na urina humana, sugerindo que 

essa planta tem um papel potencial 

na prevenção de cálculo renal ou 

do desenvolvimento (Barros, 2002; 

Freitas et. al., 2002; Campos et. al., 

1999; Dias et. al., 1995). 

Materiais e Métodos 

1 - Dados da Amostra 

A amostra analisada foi adquirida 

em uma farmácia comercial e 

apresentava as folhas secas em fragmentos 

de 0,5 cm a 1,0 cm. 

Apresentava uma coloração 

esverdeada que indicava que a 

amostra havia passado por processo 

de secagem. 

2 - Controle Físico 

Processo de Catação - 

Determinação da Pureza 

Esse processo visou a avaliar 

se a amostra apresentava material

estranho, partículas que não correspondessem 

à droga analisada. A 

quantidade de amostra analisada 

foi de 25 g de material vegetal. 

3 - Descrição 

microscópica 

Os fragmentos da parte da folha 

foram submetidos a estudo 

histológico, e neles foram realizados 

cortes do tipo paradérmico e 

transversal 

4 - Análise química 

As folhas secas foram submetidas 

a processos químicos de identificação 

das seguintes classes de 

constituintes químicos: taninos, 

heterosídeos flavanoídicos, heterosídeos 

saponínicos, heterosídeo 

antraquinônicos, alcalóides e óleos 

voláteis (Costa, 2001). 

A seguir serão apresentadas as 

metodologias dos ensaios de identificação 

das classes dos constituintes 

químicos mencionados. Vale 

lembrar que são testes qualitativos 

com vistas a somente verificar a 

presença ou a ausência do constituinte 

químico em questão. 

4.1 - Métodos de Identificação 

4.1.1 - Taninos 

Os taninos são substâncias 

polifenólicas, polihidroxiladas, de 

alto peso molecular, de origens vegetais, 

capazes de precipitar proteínas, 

pectinas, alcalóides e metais 

pesados em solução aquosa (Simões 

et. al., 2001). 

A estrutura química é complexa 

na sua maioria, apresenta características 

adstringentes ao paladar e são 

capazes de curtir a pele dos animais, 

transformando-a em couro. 

Os taninos são sólidos, amorfos 

na sua maioria, solúveis em água, 

álcool, glicerina e polietilenoglicol. 

São insolúveis em solventes orgânicos 

apolares. 

Classifica-se em gálicos, hidrolisáveis, 

catequínicos ou condensados. 

Extração Genérica de Taninos 

Pesou-se cerca de 2g da droga 

(quebra-pedra) pulverizada; 

Extraíram-se os taninos com 

cerca de 40 mL de água destilada, 

deixando-a ferver durante, aproximadamente, 

2 minutos; 

Filtrou-se em papel de filtro, 

procurando manter o pó no fundo 

do recipiente; 

Repetiram-se mais duas extrações, 

com cerca de 10 mL de água cada; 

Filtrou-se novamente, como indicado 

anteriormente; 

Utilizou-se o filtrado para as 

reações de identificação seguintes. 

Reação com Cloreto Férrico 

Em um tubo de ensaio colocou-se 

cerca de 1,0 mL da solução 

extrativa e adicionaram-se-lhe 5,0 

mL de água destilada e uma gota de 

cloreto férrico 2% (escorrendo-o 

pela parede do tubo). 

Foi necessário que se observasse 

a formação de um precipitado 

ou o aparecimento de colorações: 

preta, verde, azul, conforme o 

tipo de estrutura química. 

Reação com Solução Aquosa de 

Alcalóides 


1,0 mL da solução extrativa, 

diluída a uma proporção 1:5. Adicionaram-se-lhe 

5 gotas de ácido clorídrico 

a 5% e 1 ou 2 gotas de 

solução de sulfato de alcalóides. 

Esperou-se para observar a formação 

de um precipitado branco 

ou castanho esbranquiçado. 

Reação com Acetato Neutro de 

Chumbo 


1,0 mL da solução extrativa 

diluída na proporção 1:5. Adicionaram-se-lhe 

1 ou 2 gotas de solução 

aquosa de acetato neutro de 

chumbo a 10%. 


de um precipitado castanho 

avermelhado volumoso e denso. 

Reação com Solução de Acetato 

de Cobre 


cerca de 1,0 mL de solução 

extrativa diluída na proporção de 

1:5. Adicionaram-se-lhe 1 ou 2 gotas 

de solução aquosa de acetato de 

cobre a 5%. 

Esperou-se para se observar a 

formação de um precipitado castanho 

avermelhado. 

Reações Específicas de 

Taninos: 

Reação com Acetato de 

chumbo e Ácido Acético 

Glacial 

Em um tubo de ensaio colocaram-se 

cerca de 3 mL de solução 

extrativa e adicionaram-se-lhe cerca 

de 2 ml de ácido acético glacial 

a 10% e 3 mL da solução de acetato 

de chumbo a 10%. 


de um precipitado castanho 

avermelhado que indicasse a presença 

de taninos gálicos. 

Obs: A adição de ácido acético 

impede a precipitação de taninos 

catequínicos. 

Reação com Reativo de 

Wasicky 

Eliminou-se o precipitado da 

reação com acetato de cobre (anterior) 

por filtração e utilizou-se o 

filtrado. 

Adicionaram-se cerca de 0,5 

mL de solução de poli-metil-aminobenzaldeído. 

Esperou-se para observar 

a formação de um precipitado 

carmim ou róseo que indicasse a 

presença de tanino catequínico. 

4.1.2– Saponinas 

Saponinas são glicosídeos de 

esteróides ou terpenos policíclicos. 

Esse tipo de estrutura, que possui 

uma parte lipofílica (triterpeno ou 

esteróide) e outra hidrofílica (açúcares), 

determina a propriedade de 

redução da tensão superficial da 


água, característica de suas ações 

detergente e emulsificante (Simões 

et. al., 2001). 

Extração Genérica das 

Saponinas 

Em um aparelho de refluxo 

colocaram-se 90 mL de extrato aquoso 

1% da droga. 

Adicionaram-se-lhe cerca de 10 

mL de ácido clorídrico. 

Deixou-se o processo em refluxo 

por aproximadamente uma 

hora para, em seguida, desligá-lo e 

deixá-lo esfriar. 

Transferiu-se o líquido para um 

funil de separação de 200 mL e 

adicionaram-se-lhe 50 mL de clorofórmio. 

Repetiu-se a extração com 

clorofórmio por mais duas vezes. 

Reduziu-se o volume a 75 mL 

em banho-maria. 

Processos Gerais de 

Identificação de Saponinas 

Obs.: Para cada reação de identificação, 

evaporou-se cerca de 5 

mL da fase orgânica obtida anteriormente. 

Reação de Rossol: No tubo de 

ensaio onde se realizou a evaporação 

de 5 mL da fase orgânica, adicionou-se 

uma gota de ácido sulfúrico 

concentrado. 

Esperou-se para observar o 

aparecimento de uma coloração vermelha 

ou violeta que indicasse a 

presença da sapogenina. 

Reação de Mitchell: No tubo 

de ensaio onde se realizou a evaporação 

de 5 mL da fase orgânica, 

adicionou-se uma gota de ácido 

sulfúrico concentrado e vestígios 

de nitrato de prata. 

Esperou-se para observar o aparecimento 

de uma coloração avermelhada 

que indicasse a presença 

de sapogenina. 

Reação de Rosenthalen: No 

tubo de ensaio onde se realizou a 

evaporação de 5 mL da fase orgânica, 

adicionaram-se uma ou duas 

gotas de solução de vanilina a 1% 

em ácido clorídrico. 


aparecimento de coloração azul que 

se desenvolvesse somente a quente. 

Reação com Reativo de 

Sulfo-vanílico: No tubo de ensaio 

onde se realizou a evaporação 

de 5 mL da fase orgânica, 

adicionaram-se uma ou duas gotas 

de solução de vanilina 1% em 

ácido sulfúrico. 


aparecimento de coloração violetaazulada. 

Reação de Liebermann: No 

tubo de ensaio onde se realizou 

a evaporação de 5 mL da fase 

orgânica, dissolveu-se o resíduo 

em 2 mL de ácido acético glacial. 

Adicionaram-se-lhe 1 ou 2 gotas 

de cloreto férrico a 3%. Em seguida, 

verteram-se , pela parede 

do tubo, 1 ou 2 mL de ácido 

sulfúrico sem agitar . Na superfície 

de contato entre os dois líquidos, 

poderia formar-se um 

anel com coloração pardo-avermelhada 

ou verde, que indicaria 

a presença de derivados esteroidais, 

ou com coloração azul, que 

indicaria a presença de derivados 

triterpenóides. 

4.1.3- Flavonóides 

Os flavonóides, biossintetizados 

a partir da via dos fenilpropanóides, 

constituem uma importante 

classe de polifenóis, presentes com 

relativa abundância entre os 

metabólitos secundários de vegetais 

(Simões et. al. 2001). 

Extração Genérica de 

Compostos Flavonoídicos: 

Pesaram-se cerca de 2,0 g da 

droga; 

Colocada em um béquer, adicionaram-se-lhe 

cerca de 15 mL de 

etanol a 75%; 

Foi fervida por alguns minutos; 

Em seguida, foi esfriada e filtrada 

em papel de filtro; 


Reservou-se esse extrato para 

executar as reações gerais de identificação. 

Reações Genéricas de 

Identificação de Flavonóides 

Reação de Shinoda: Adicionaram-se 

cerca de 5 mL do extrato 

em um tubo de ensaio que continha 

uma pitada de magnésio metálico. 

Acrescentaram-se-lhe 0,5 - 1,0 mL 

de ácido clorídrico. 

Observou-se o desenvolvimento 

de coloração rósea-avermelhada 

indicaria a presença de flavonóis; 

violeta indicaria a presença de 

flavanonas e laranja indicaria a presença 

de flavonas. 

Obs.: O desenvolvimento da 

cor pode ocorrer imediatamente ou 

após algum tempo. 

Reação com Cloreto de Alumínio: 

Sobre um papel de filtro, 

demarcaram-se duas áreas A e B. 

Depositaram-se em cada uma delas 

algumas gotas do extrato da 

droga e esperou-se secar. Em seguida, 

colocou-se em uma das áreas 

1 gota de solução de cloreto de 

alumínio 5% em etanol. Eliminouse 

o etanol. Verificou-se o comportamento 

da substância nas duas 

áreas frente à luz ultravioleta. Observou-se 

o aspecto fluorescente 

que indicasse a presença de 

flavonóides. 

Reação com Cloreto Férrico: 

Diluiu-se o extrato com água na 

proporção de 1:5, em seguida, colocaram-se 

em dois tubos de ensaio 

5 mL do extrato diluído. Adicionouse 

pela parede de um dos tubos 1 

gota de cloreto férrico 2%. 

Esperou-se para observar o desenvolvimento 

de cor, que poderia 

variar entre verde, amarelo-castanho 

e violeta, de acordo com o tipo 

de composto flavonoídico. 

Reação com Hidróxido de 

Sódio: Diluiu-se o extrato na proporção 

de 1:5. Colocaram-se 5 mL 

desse extrato diluído em um tubo 

de ensaio e adicionaram-se-lhe 1

ou 2 gotas de NaOH 5%. 

Observou-se o desenvolvimento 

de coloração amarela, que varia 

de intensidade. 

4.1.4- Glicosídeos 

Antraquinônicos 

São compostos naturais encontrados 

sob forma glicosídica ou 

livres derivados do núcleo antracênico. 

Relacionam-se diretamente 

com antraquinona, uma dicetona 

insaturada. Possuem ação catártica 

e são classificadas, como catártico 

estimulante (Akisue, 2002). 

Extração dos glicosídoes 

antraquinônicos 

Reação de Bornträeger: Pesouse 

cerca de 1g da droga, adicionaram-se-lhe 

cerca de 20 mL de etanol 

a 75% e foi aquecida durante 2 

minutos em banho-maria. 

Em seguida, realizou-se a filtração 

em funil simples e adicionaram-se 

ao filtrado cerca de 2mL 

de ácido sulfúrico que foi levado 

ao banho-maria durante 1 minuto. 

Deixou-se o filtrado acidificado 

esfriar. 

Realizou-se a extração em um 

funil de separação com 10 mL de 

acetato de etila, e repetiu-se a extração 

por mais duas vezes. 

Mediram-se cerca de 5 mL da 

fase orgânica e adicionaram-se-lhe 

cerca de 1 ou 2 gotas de hidróxido 

de amônio. 


de uma coloração amarela, 

que indicasse a presença da antraquinona 

na forma reduzida, ou vermelha, 

que indicasse a presença da 

antraquinona na forma oxidada. 

Reação com Hidróxido de 

sódio: Pesaram-se 0,5 g de droga, 

que foi colocada em um vidro 

de relógio e adicionaram-se-lhe 

algumas gotas de hidróxido de 

sódio a 0,5%. 


aparecimento de uma coloração 

amarelada, que indicasse a pre- 

sença da antraquinona na forma 

reduzida, ou de uma coloração 

avermelhada que indicasse a presença 

da antraquinona na forma 

oxidada. 

4.1.5 - Alcalóides 

Os alcalóides que contêm um 

átomo de nitrogênio em um anel 

heterocíclico são chamados de 

alcalóides verdadeiros e são classificados 

de acordo com o sistema 

anelar presente na molécula. As 

substâncias com o átomo de nitrogênio 

que não pertença a um sistema 

heterocíclico são denominados 

de protoalcalóides. 

Compostos nitrogenados com 

e sem anéis heterocíclicos, que não 

são derivados de aminoácido, são 

chamados de pseudoalcalóides 

(Simões et. al., 2001). 

Métodos de Identificação de 

Alcalóides 

Pesar cerca de 1g da droga em 

um béquer, adicionar 30 mL de 

solução de HCL 1,5% e aquecer por 

aproximadamente 3 minutos. Em 

seguida, filtrar o sobrenadante em 

algodão e transferir o filtrado para 

um funil de separação. 

Testes de Identificação 

Alcalinizar o filtrado obtido 

anteriormente com solução de 

Hidróxido de Amônio (NH 4 OH) 

até atingir um pH entre 9 e 10 

(utilizar papel tornassol para determinar 

o pH). 

Em seguida, adicionar ao filtrado 

alcalinizado cerca de 15 mL de 

Clorofórmio (CHCl 3 ) e agitar para 

que os alcalóides presentes passem 

para a porção orgânica. Colocar 

cinco gotas do extrato em cada 

cápsula de porcelana, colocá-las em 

uma chapa e esperar secar, após 

isso, dissolver o resíduo com 4 gotas 

de solução de HCl 1,5% em 

todas as cápsulas e em cada uma 

adicionar o reagente de identificação 

de alcalóides: 

Reagente de Sheibler - Adicio- 

nar algumas gotas sobre o resíduo e 

observar desenvolvimento de coloração 

amarelo claro. 

Reagente de Bourchardat - Adicionar 

algumas gotas sobre o resíduo 

e observar o desenvolvimento 

de coloração amarelo tijolo. 

Reagente de Bertrand - Adicionar 

algumas gotas sobre o resíduo e 

observar o desenvolvimento de coloração 

amarelo tijolo. 

Reagente de Mayer - Adicionar 

algumas gotas sobre o resíduo e 

observar desenvolvimento de um 

precipitado floculoso branco. 

Reagente de Dragendorff - Adicionar 

algumas sobre o resíduo e 

observar desenvolvimento de coloração 

amarelo tijolo. 

4.1.6 - Óleos voláteis 

Os óleos voláteis são definidos 

como produtos obtidos de partes de 

planta por meio da destilação por 

arraste com vapor d’água. São misturas 

complexas de substâncias voláteis 

lipofílicas, geralmente odoríferas 

e líquidas (Simões et. al., 2001). 

Pesar cerca de 1 g da droga a 

ser analisada, colocar em um gral 

de vidro, adicionar cerca de 1 mL de 

etanol absoluto e triturar. Pingar 

uma gota em um papel de filtro, 

evaporar e sentir o aroma, o qual 

indica a presença de óleos voláteis. 

5 - Resultados 

Na amostra continha fragmentos 

de folhas e caules de tamanhos 

que variavam de 0,1 a 1,0 cm de 

tamanho. 

Observou-se que em 25 g da 

amostra que 0,75 g correspondia a 

fragmentos de materiais estranhos 

à planta. A Farmacopéia Brasileira 

recomenda que a porcentagem de 

material estranho de outra parte da 

planta tenha um limite de tolerência 

em torno de 10%. 

A análise microscópica da droga 

vegetal através dos cortes 

histológicos e a sua descrição 

macroscópica foram comparadas 

com dados da literatura, o que permitiu 

confirmar que a droga vegetal 


Tabela 1- 

Resultados 

das 

reações 

indicativas 

da 

presença 

ou 

ausência 

de 

taninos 

em 

P. 

niruri 

Reativos Anacardium occidentale 

Phyllanthus 

niruri 

Reação com 

clore 

to 

Fér 

r ico 

( Gerai 

s) 

PRECIPI TADO 

AZUL 

- 

Reação 

com 

Solução 

Aquosa 

de 

Alcaló 

ides 

PRECIPI TADO 

CASTANH 

O 

- 

Reação 

com 

Acetat 

o Neutro 

de 

Chumb 

o 

PRECIPI TADO 

CASTANH 

O 

- 

Reação 

com 

Solução 

de 

Acetat 

o de 

Cobre 

PRECIPI TADO 

CASTANH 

O 

- 

Reação 

com 

Acetat 

o de 

Chumb 

o e 

Ácido 

acétic 

o Glacial 

PRECIPI TADO 

CASTANH 

O 

- 

Reati vo 

de 

WASICK 

Y 

PRECIPI TADO 

ROSA 

- 

Reação 

com 

Clore 

to 

Fér 

r ico 

( Especí 

fica) 

( -) 

ausênc 

ia 

COLORAÇÃO VERDE 

- 

Tabela 

2- 

Resultados 

das 

reações 

indicativas 

da 

presença 

ou 

ausência 

de 

glicosídeos 

saponínicos. 

Reativos Quilaia saponaria 

Phyllanthus 

niruri 

R ossol 

+ - 

M itche 

ll 

+ - 

R osent 

halen 

+ - 

R eativo 

Sulfo-Vaníl 

ico 

+ - 

L ieberm 

ann 

( + ) pres 

ença 

( -) 

ausênc 

ia 

+ - 

Tabela 

3- 

Resultado 

das 

reações 

indicativas 

da 

presença 

ou 

ausência 

de 

glicosídeos 

flavanoídicos. 

Reativos Ginkgo biloba 

Phyllanthus 

niruri 

S hino 

da 

V ERDE 

( flavona 

s) 

VERDE 

( flavona 

s) 

Clore 

to 

de 

Alumí 

nio 

FLORESC 

ÊN 

CIA 

AMARELO 

- 

ACASTAN 

HADO 

( flavono 

l) 

FLORESC 

ÊN 

CIAAMARE 

LO-ACASTA- 

NHADO 

( flavono 

l) 

Clore 

to 

Fér 

r ico 

AMARELO 

-ACASTAN 

HADO 

( flavono 

l) 

VERDE 

( flavona 

s) 

H idró 

xido 

de 

sódio 

A MARELA 

( flavono 

l) 

AMARELA 

( flavono 

l) 

Tabela 

4- 

Resultado 

das 

reações 

da 

presença 

ou 

ausência 

de 

glicosídeos 

antraquinônicos. 

Reativos Dimorphandra mollis 

Phyllanthus 

niruri 

Bornt räege 

r 

verme lho 

verme 

lho 

Hidró xido 

de 

Sódio 

verme lho 

verme 

lho 

Tabela 

5- 

Resultados 

das 

reações 

indicativas 

da 

presença 

ou 

ausência 

de 

alcalóides. 

Reativos Chichona calisaya 

Phyllanthus 

niruri 

Sheibl er 

AMARELO CLARO 

AMARELO 

CLARO 

Bourch ardat 

AMARELO TIJOLO 

AMARELO 

TIJOLO 

Dragen dorff 


AMARELO 

TIJOLO 

Bertr and 


AMARELO 

TIJOLO 

Mayer BRANCO BRANCO 

em análise era mesmo a espécie 

Phyllanthus niruri L (Souza, 2003). 

Nos testes realizados para identificar 

os taninos, foi usada como 

droga padrão o cajueiro (Anacardium 

occidentale), droga vegetal que tem 

como principais constituintes químicos 

os taninos, e a droga em estudo 

não indicou a presença de taninos 

nos testes realizados (Tabela-1). 

5.1 - Saponinas 

Para as reações de identificação 

de heterosídeos saponínicos 

foi utilizada como droga padrão a 

quilaia (Quilaia saponaria) para 

compará-la com a droga em estudo. 

Os resultados demonstraram que a 

P. niruri não possui saponinas (Tabela-2). 


5.2 - Flavonóides 


de flavonóides, utilizou-se como droga 

padrão a Ginkgo (Ginkgo biloba 

). Os resultados das análises mostraram 

que a espécie P. niruri apresentou 

flavonóides na sua composição 

química, de acordo com que se pode 

observar na tabela (Tabela-3).

5.3 - Glicosídeos 

Antraderivados 

Para os resultados das reações 

indicativas da presença ou 

ausência foi utilizada como droga 

padrão o faveiro (Dimorphandra 

mollis ) e a droga vegetal em 

análise - P. niruri – apresentou, 

na sua composição química, 

indicativo da presença de glicosídeos 

antraquinônicos na forma 

oxidada, como podemos observar 

na tabela (Tabela-4). 

5.4 - Alcalóides 


de alcalóides, utilizou-se como 

droga padrão a quina (Chichona 

calisaya) e a espécie P. niruri em 

estudo apresentou resultado positivo 

na presença dos reativos para 

alcalóides, como se pode observar 

na tabela (Tabela-5). 

5.5 - Óleos Voláteis 

No teste realizado para indicar 

a presença ou ausência de 

óleos voláteis, não foi possível, 

por meio dele, verificar a presença 

de óleos voláteis na espécie em 

análise - P. niruri 

6 - Discussão 

Por meio das análises realizadas, 

foi possível identificar a droga 

vegetal em estudo como 

Phyllanthus niruri (quebra-pedra). 

Antes de se utilizar qualquer 

droga no preparo de medicamentos, 

deve-se submetê-la a uma 

análise rigorosa. A identificação e 

a pureza da droga, bem como a 

avaliação de seus princípios ativos 

são tarefas indispensáveis 

àqueles que buscam produtos de 

qualidade. 

De acordo com a literatura, o 

Phyllanthus niruri apresenta em 

sua constituição substâncias como 

glicosídeos antraquinônicos, flavonóides 

e alcalóides, além de 

outras que não foram investigadas 

no presente trabalho, mas que se 

sabe fazem parte da constituição 

química da planta. Acredita-se que 

algumas dessas substâncias sejam 

responsáveis pelo efeito terapêutico 

atribuído ao quebra-pedra, 

porém não se sabe ao certo qual 

dessas substâncias é especificamente 

a responsável por tal propriedade. 

Assim, os constituintes 

identificados na análise 

fitoquímica foram suficientes para 

afirmarmos que a planta utilizada 

era realmente o Phyllanthus 

niruri, sendo identificada a droga 

como verdadeira. 


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TONA, L., MESIA, K., NGIMBI, N. 

P., CHRIMWAMI, B., 

OKOND’AHOKA, C. K., 

BRUYNE, T., APERS, S., 

HERMANS, N., TOTTE, J., 

PIETERS, L., VLIETINCK, A. 

J., In-vivo antimalarial activity 

of Cassia occidentalis, 

Morinda morindoides e 

Phyllanthus niruri. Ann. 

Trop. Med. Parasitol, 95(1): 

47-5, 2001. 


Pesquisa 

Jorge Fernando Pereira 

Biólogo, MS em Microbiologia Agrícola, 

Doutorando em Microbiologia Agrícola; 

Universidade Federal de Viçosa. 

dgfernando@yahoo.com 

Juliana Oliveira Lima 

Bióloga; Mestranda em Microbiologia Agrícola; 


ju.olima@bol.com.br 

Rodrigo Barros Rocha 

Biólogo; Mestrando em Genética e Melhoramento; 


rodrigobarrosrocha@yahoo.com.br 

Pilar Ximena Lizarazo Medina 

Bacteriologista; MS em Microbiologia Agrícola; 

Doutoranda em Microbiologia Agrícola; 


pixilime@hotmail.com 

Elza Fernandes de Araújo 

Bióloga; DS em Genética UFRGS; 

Profª Titular do Departamento de Microbiologia; 


ezfa@ufv.br 

Marisa Vieira de Queiroz 

Bióloga; DS em Genética e Melhoramento ESALQ- 

USP; Professora Adjunta do Departamento de 

Microbiologia; Universidade Federal de Viçosa. 

mvqueiro@ufv.br 


Nitrato Redutase em 

Fungos Filamentosos 

O potencial multifuncional da nitrato redutase em pesquisas com biologia molecular de fungos 

Introdução 

ungos filamentosos podem 

metabolizar uma série de 

compostos nitrogenados 

para obterem o requerimento 

nutricional necessário 

para seu desenvolvimento. 

Nesses organismos, o metabolismo 

do nitrogênio é um processo 

altamente controlado por um complexo 

de proteínas reguladoras, que 

assegura grande eficiência na utilização 

das fontes de nitrogênio disponíveis. 

Esse complexo é constituído 

por uma série de proteínas que são 

requeridas para que vários compostos 

secundários sejam assimilados 

quando as fontes preferenciais de 

nitrogênio, isto é, o amônio ou a 

glutamina, não estão disponíveis 

(Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997). 

Entre os compostos secundários, o 

nitrato inorgânico é uma excelente 

fonte utilizável por muitos fungos 

filamentosos. Seu transporte para o 

meio intracelular é mediado pela 

permease do nitrato, e após sua assimilação, 

ocorre a redução seqüencial 

do nitrato a nitrito e do nitrito a 

amônio, catalisada, respectivamente, 

pelas enzimas nitrato e nitrito 

redutase. O amônio é considerado o 

ponto de partida para o metabolismo 

anabólico do nitrogênio em fungos e 

a sua incorporação em moléculas 

orgânicas é, então, realizada por dois 

sistemas: glutamato desidrogenase 

(GDH) ou glutamina sintase (GS)/ 

Glutaminaamida: 2-oxoglutarato 

amino transferase (GOGAT), que produzem 

glutamato e glutamina (Griffin, 

1994) (Figura 1). A enzima nitrato 

redutase de fungos é um grande 

complexo multiredox, que possui 


duas subunidades idênticas, cada uma 

composta de três grupos prostéticos 

em domínios separados. Na extremidade 

C-terminal, localiza-se o domínio 

FAD, mais ao centro da proteína, 

o domínio heme, e, na extremidade 

N-terminal, o domínio molibdênio. A 

reação catalítica envolve a transferência 

de um par de elétrons do 

NADH ou NADPH para os domínios 

FAD, heme e molibdênio e, então, 

para o nitrato. A especificidade pelo 

doador de elétrons é utilizada para 

classificar as nitrato redutases 

eucarióticas em 3 grupos: NADHespecífica 

(EC 1.6.6.1), que está presente 

na maioria das plantas superiores 

e em algumas algas, NADPHespecífica 

(EC 1.6.6.2), que é encontrada 

em fungos e NAD(P)Hbiespecífica, 

que é encontrada em 

algumas plantas e em algumas algas 

(Losada, 1976; Shen et al., 1976; 

Renosto et al., 1982). 

Em 1989, foi descrito o isolamento 

do primeiro gene da nitrato 

redutase de fungos filamentosos utilizando-se 

o organismo modelo 

Aspergillus nidulans (Malardier et al., 

1989). Desde então, genes que codificam 

para a enzima nitrato redutase 

vêm sendo clonados e seqüenciados 

em diversas espécies de fungos 

filamentosos representados por organismos 

modelos de estudos genéticos 

em eucariotos, espécies com 

potencial de aplicação industrial ou 

com importância fitopatológica e 

micorrízica. O interesse na clonagem 

desse gene é baseado, principalmente, 

no estabelecimento de protocolos 

de transformação genética cujo valor 

biotecnológico é muito importante 

por representar um método de seleção 

geral e conveniente. Mas, além

de marca de seleção para transformação, 

esse gene também pode ser 

utilizado para estudos de organização 

e regulação gênica, análises 

filogenéticas, obtenção de mutantes, 

estudos de grupos de compatibilidade 

vegetativa e como isca para 

detecção e isolamento de elementos 

transponíveis. Baseado nesse contexto, 

este trabalho tem como objetivo 

apresentar resultados que contribuam 

para esse potencial multifuncional 

do gene da nitrato redutase em 

fungos filamentosos. Mesmo que, 

muitas vezes, dentro de uma mesma 

espécie, esse gene possa não ser 

utilizado com toda essa potencialidade, 

ele representa uma das maiores 

versatilidades de uso na micologia 

molecular. 

Organização dos genes de 

assimilação do nitrato 

O seqüenciamento e a comparação 

das seqüências de genes que 

codificam para nitrato redutase têm 

contribuído para estudos de organização 

gênica em fungos filamentosos, 

sendo esses estudos imprescindíveis 

para o conhecimento de características 

importantes como número 

e tamanho de íntrons, seqüências 

envolvidas com mecanismo de 

splicing, tamanho de regiões promotoras, 

ligação de genes e sentido da 

transcrição entre genes ligados. Um 

quadro comparativo da organização 

gênica entre os genes da nitrato 

redutase de 16 diferentes espécies de 

fungos filamentosos é apresentado 

na Figura 2. 

A análise de seqüências do gene 

da nitrato redutase revela a ausência 

de íntrons nos fungos Ustilago maydis 

(Banks et al., 1993) e Botryotinia 

fuckeliana (Levis et al., 1997a) e um 

máximo de 12 íntrons para Hebeloma 

cylindrosporum (Jargeat et al., 2000). 

Em Aspergillus fumigatus, A. 

nidulans, A. niger, A. oryzae, A. 

parasiticus, Penicillium chrysogenum 

e P. griseoroseum, ocorre a presença 

de 6 íntrons que, embora possuam 

tamanhos diferentes, estão localizados 

nas mesmas posições (Johnstone 

et al., 1990; Unkles et al., 1992; 

Kitamoto et al., 1995; Chang et al., 

1996; Haas et al., 1996; Amaar e 

Moore, 1998; Pereira, 2001). Em 

Leptosphaeria maculans e 

Stagonospora nodorum, esse gene é 

interrompido por 4 íntrons que correspondem 

aos íntrons II, III, IV e VI 

de Aspergillus e Penicillium (Williams 

et al., 1994; Cutler et al., 1998), enquanto 

em Beauveria bassiana (número 

de acesso no Genbank X84950), 

Fusarium oxysporum, Gibberella 

fujikuroi, Metarhizium anisopliae 

(número de acesso no Genbank 

AJ001141) e Neurospora crassa, apenas 

1 íntron está presente na mesma 

posição do íntron VI de Aspergillus e 

Penicillium (Okamoto et al. 1991; 

Diolez et al., 1993; Tudzynski et al., 

1996). O gene da nitrato redutase de 

H. cylindrosporum parece ser o único 

que possui íntrons (11 e 12) na 

região correspondente ao domínio 

FAD (Jargeat et al., 2000). Pode-se 

observar na Figura 2 que o tamanho 

médio dos íntrons é de, aproximadamente, 

58 pares de bases (pb), sendo 

o menor de 46 pb e o maior de 92 pb. 

Na grande maioria das vezes, esses 

íntrons não apresentam similaridade 

a não ser nas seqüências envolvidas 

com o processo de sua retirada 

(splicing). Os íntrons encontrados 

Figura 1 - Assimilação de nitrato em fungos filamentosos. 

nos genes que codificam a nitrato 

redutase em eucariotos não interrompem 

a seqüência codificadora 

em éxons com os respectivos domínios 

funcionais da enzima, sendo 

que a maioria deles parece estar 

dentro e não entre os domínios funcionais 

(Zhou e Kleinhofs, 1996). A 

localização dos íntrons é conservada 

dentro de fungos, algas e plantas 

superiores, em relação a genes para 

nitrato redutase, mas, mesmo assim, 

difere entre esses grupos. Em algas, 

os genes da nitrato redutase de 

Chlamydomonas reinhardtii e Volvox 

carteri possuem 15 e 9 íntrons, respectivamente, 

localizados nos domínios 

molibdênio, heme e FAD. A 

posição de 8 dos 10 íntrons em Volvox 

é idêntica à de Chlamydomonas. Os 

quatro íntrons presentes em Oryzae 

sativa, Phaseolus vulgaris, Lypersicon 

esculentum e Nicotiana tobacum estão 

localizados, precisamente, na mesma 

posição (Zhou e Kleinhofs, 1996). 

Com base no número e na posição 

dos íntrons presentes nos genes da 

nitrato redutase de fungos filamentosos, 

algas e plantas, Zhou e Kleinhofs 

(1996) não puderam afirmar se, durante 

a evolução, os íntrons foram 

incorporados (gain hypotheses) ou 

perdidos (loss hypotheses). Então, os 

íntrons podem ter sido inseridos no 

gene da nitrato redutase após a divergência 

entre fungos e plantas, ou o 

ancestral desses grupos possuía todos 

os íntrons e esses foram perdidos 

independentemente após a divergência. 

Ainda, segundo esses autores, a 

hipótese de embaralhamento de 

éxons (exon shuffling), em que as 

seqüências que codificam regiões estruturais 

ou funcionais da proteína 

estariam delimitadas por íntrons, não 

parece se aplicar a esse caso, pois as 

seqüências que codificam os domínios 

funcionais das proteínas nitrato 

redutase apenas são separadas por 

íntrons em H. cylindrosporum (íntron 

9 entre domínios molibdênio e heme). 

Além dos íntrons, a organização 

dos três genes relacionados com a 

assimilação do nitrato em fungos filamentosos 

pode ser separada em, pelo 

menos, quatro grupos diferentes (de 

A a D). No grupo A, os três genes 

estão ligados, mas os genes da nitrato 

e nitrito redutase são transcritos em 

direções opostas, sendo o gene do 

transportador transcrito na mesma 


Figura 2 - Comparação da organização dos genes de assimilação do nitrato em fungos filamentosos. Em alaranjado, a região 

promotora intergênica dos genes nos quais foram relatadas ligação entre nitrito e nitrato redutase. As setas representam o sentido 

da transcrição nesses genes. As caixas abertas indicam a região estrutural com tamanho e posição dos íntrons em relação às regiões 

codificadoras dos domínios molibdênio, heme e FAD. O tamanho da região promotora e dos íntrons é dado em pares de bases. 

O número de aminoácidos das respectivas proteínas é dado à direita. 

direção da nitrito redutase. Essa organização 

é encontrada em A. nidulans, 

A. niger, A. parasiticus, A. fumigatus 

e P. chrysogenum (Johnstone et al., 

1990; Unkles et al., 1992; Chang et al., 

1996; Amaar e Moore, 1998; Haas e 

Marzluf, 1995). O tamanho da região 

intergênica é de 1.262 pb em A. 

nidulans (Johnstone et al., 1990), 1.668 

pb em A. niger (Unkles et al., 1992), 

1.670 pb em A. parasiticus (Chang et 

al., 1996), 1.229 pb em A. fumigatus 

(Amaar e Moore, 1998) e 661 pb em P. 

chrysogenum (Haas e Marzluf, 1995). 

No grupo B, os três genes também 

estão ligados, mas o gene do transportador 

está entre os genes da nitrato e 

da nitrito redutase, sendo transcritos 

na mesma direção descrita no grupo 

A. Essa organização é encontrada em 

H. cylindrosporum (Jargeat et al., 

2003). No grupo C, os genes da nitrato 

e da nitrito redutase estão ligados, são 

transcritos na mesma direção, mas o 

gene do transportador não está ligado, 

como é observado em L. maculans 

e S. nodorum (Williams et al., 1994; 

Cutler e Caten, 1999). O tamanho da 

região intergênica é de 1.438 pb em L. 

maculans (Williams et al., 1994) e 829 

pb em S. nodorum (Cutler e Caten 

1999). No grupo D, apesar da posição 

do transportador ainda não ter sido 

determinada, os três genes não parecem 

estar ligados, como ocorre em 

Neurospora crassa (Exley et al., 1993) 

e em Gibberella fujikuroi (Tudzynski 

et al., 1996). 


Regulação do gene da 

nitrato redutase 

As maiores contribuições para o 

conhecimento da regulação do metabolismo 

do nitrogênio em fungos 

filamentosos baseiam-se nos trabalhos 

realizados com os organismos A. 

nidulans e Neurospora crassa 

(Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997), 

sendo que, nos últimos anos, estudos 

também têm sido relatados para outras 

espécies como, por exemplo, 

Penicillium chrysogenum (Haas e 

Marzluf, 1995; Haas et al., 1996). 

A utilização de fontes de nitrogênio 

secundárias é controlada de maneira 

positiva e negativa, existindo 

um sistema de controle global e um

específico. A desrepressão de mais de 

100 genes estruturais, incluindo, por 

exemplo, genes que codificam transportadores 

de aminoácidos, transportadores 

de purinas, proteases 

extracelulares e enzimas catabólicas, 

é dependente da presença do indutor 

e da ausência de fontes preferenciais 

de nitrogênio (amônio e glutamina). 

Essa desrepressão é realizada tanto 

pelo regulador global positivo areA 

em A. nidulans e seus correspondentes 

nit-2 em N. crassa e nre em P. 

chrysogenum, quanto por reguladores 

específicos. O gene areA codifica 

uma proteína reguladora de 876 resíduos 

de aminoácidos que contém um 

único domínio de ligação ao DNA, o 

qual reconhece e se liga a seqüências 

que contêm o core GATA (Kudla et 

al., 1990; Langdon et al., 1995). As 

proteínas AREA, NIT-2 e NRE possuem 

somente 30% de homologia, mas, 

considerando apenas o domínio de 

ligação ao DNA, a identidade é de 

98% (Haas e Marzluf, 1995). Em AREA, 

o domínio de ligação ao DNA é constituído 

por um único dedo de Zn com 

quatro cisteínas, seguido de um domínio 

terminal básico, que apresenta 

uma estrutura compacta formada por 

dois pares de folhas-β seguidas por 

uma α-hélice e uma cauda não 

estruturada. As cadeias laterais ao 

dedo de Zn fazem contato altamente 

hidrofóbico no sulco maior da molécula 

de DNA e a cauda carboxi-terminal 

faz contato com o esqueleto de 

fosfato (Scazzocchio, 2000). Elementos 

com, pelo menos, duas cópias de 

seqüências GATA, que podem estar 

na mesma direção, ou em direções 

opostas, e com espaço de, pelo menos, 

30 pb, são considerados fortes 

sítios de ligação para NIT-2 (Chiang e 

Marzluf, 1994). Para P. chrysogenum, 

Haas e Marzluf (1995) descreveram 

fortes sítios de ligação de NRE como 

regiões com, pelo menos, duas seqüências 

GATA com espaçamento 

entre 5 e 27 pb, configuradas na 

mesma direção ou em direções opostas. 

Elementos GATA separados por 

74 ou 96 pb não demonstraram ser 

fortes sítios de ligação NRE (Haas e 

Marzluf, 1995). Para A. parasiticus, 

Chang et al. (2000) relataram a ligação 

de AREA a segmentos de 42 pb da 

região promotora dos genes da nitrato 

e da nitrito redutase que continham 

um ou dois elementos GATA. 

Outro gene importante para o 

metabolismo do nitrogênio é o nmr 

(do inglês nitrogen metabolism 

repressor), que atua de maneira negativa, 

reprimindo a síntese de vários 

genes. O gene nmr codifica uma 

proteína de 54,8 KDa, que não possui 

domínio de ligação ao DNA, mas 

é capaz de se ligar a uma pequena 

região do domínio de ligação ao 

DNA e à região carboxi-terminal da 

proteína NIT-2 (e possivelmente de 

AREA), impedindo a ação dessa proteína, 

sendo a glutamina o possível 

sinal para essa ligação (Xiao et al., 

1995). Pelo menos para AREA, ainda 

existem outros dois níveis de 

regulação: a transcrição de areA é 

auto-regulada e a estabilidade do 

mRNA de areA é menor em células 

que crescem em fontes de nitrogênio 

preferenciais (Platt et al., 1996). Dessa 

forma, na presença de fontes preferenciais, 

além de uma menor estabilidade 

do mRNA do gene areA, o 

regulador NMR se liga à proteína 

AREA já sintetizada e impede que 

essa proteína se ligue aos promotores 

e induza a transcrição dos genes 

relacionados com o metabolismo de 

fontes secundárias de nitrogênio. Assim, 

a célula assegura a assimilação 

de nitrogênio a partir de compostos 

que são prontamente metabolizáveis. 

A indução do gene da permease 

do nitrato e dos genes da nitrato 

redutase (niaD para Aspergillus sp. e 

P. chrysogenum ou nit-3 para N. 

crassa) e nitrito redutase (niiA para 

Aspergillus sp. e P. chrysogenum ou 

nit-6 para N. crassa) requer síntese 

de novo, sendo necessária a ausência 

das fontes preferenciais e a presença 

de nitrato como indutor. Nesse caso, 

além do fator de regulação global, é 

necessária a presença de um fator 

específico chamado nirA em A. 

nidulans e nit-4 em N. crassa 

(Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997). 

A proteína NIRA liga-se ao DNA a 

partir de um domínio na sua região 

amino-terminal (Burger et al., 1991). 

Essa proteína se liga à seqüência 5’- 

CTCCGHGG-3’, sendo que foram detectados 

sítios putativos ou já comprovados 

para essa proteína em várias 

espécies de ascomicetos (Punt et 

al., 1995). Para o reconhecimento de 

cis-elementos e expressão do gene 

nit-3 em N. crassa (Feng e Marzluf, 

1998), é requerida uma interação 

específica entre os fatores de 

regulação NIT-2 e NIT-4. Em N. crassa, 

um acúmulo máximo de mRNA 

de nit-3 ocorre apenas 15 minutos 

após a indução por nitrato, sendo 

que o acúmulo máximo de proteína 

ocorre após 60 minutos, e em P. 

chrysogenum transcritos de niaD são 

detectados com 15 minutos de 

indução, e atingem um nível máximo 

após 60 minutos (Okamoto et al., 

1991; Haas et al., 1996). Até a presente 

data, a única exceção é o 

basidiomiceto H. cylindrosporum, 

onde o gene da nitrato redutase possui 

alto nível de transcrição na presença 

de nitrato, uréia, serina e glicina, 

sendo possível, neste caso, a 

inexistência de fatores de regulação 

específicos. Entretanto, na presença 

de amônio, ocorre uma forte, mas 

incompleta, repressão desse gene, 

indicando a existência de um sistema 

de regulação geral (Jargeat et al., 

2000). Recentemente, foi reportado, 

para H. cylindrosporum, que a transcrição 

dos genes da permease do 

nitrato e da nitrito redutase também 

não é induzida por nitrato, mas é 

completamente reprimida por amônio 

(Jargeat et al., 2003). 

Relações filogenéticas 

baseadas na proteína 


Apesar da proteína nitrato redutase 

apresentar regiões comprovadamente 

importantes para seu funcionamento, 

outras regiões parecem poder sofrer 

variação sem acarretar perda de funcionalidade 

para a proteína. A região Nterminal 

e 2 regiões curtas, entre os 

domínios molibdênio e heme e heme e 

FAD, apresentaram menor identidade 

entre 17 outras proteínas nitrato redutase 

de plantas, algas e fungos quando foram 

comparadas por Zhou e Kleinhofs 

(1996). Essa característica de apresentar 

regiões conservadas que flanqueiam 

regiões que podem sofrer variação é 

interessante para estudos de filogenia. 

Esses mesmos autores verificaram que 

o gene da nitrato redutase pode ser 

utilizado como relógio molecular, pois 

genes de diferentes espécies evoluem 

em uma taxa constante, e, baseados 

nesse gene, estimaram o tempo de 

divergência entre fungos e plantas, em 

torno de 1 bilhão de anos e, entre algas 

e plantas superiores, em torno de 750 


milhões de anos. Além do uso como 

relógio molecular, estudos filogenéticos 

com a proteína nitrato redutase de fungos 

filamentosos têm revelado uma 

tendência de agrupar espécies que pertençam 

a categorias taxonômicas comuns 

(Williams et al., 1994; Cutler et al., 

1998). Assim, esse gene possui características 

interessantes para uso em estudos 

evolucionários. Na Figura 3 é apresentada 

uma árvore filogenética não 

enraizada baseada na seqüência de 

aminoácidos da proteína nitrato redutase. 

Para a construção dessa árvore, seqüências 

da proteína nitrato redutase de 16 

fungos filamentosos e 1 planta foram 

retiradas do GenBank na página do 

National Center for Biotechnology 

Information (www.ncbi.nlm.nih.gov) 

por meio dos seguintes números: 

Aspergillus fumigatus (AF336236), A. 

nidulans (M58291), A. niger (M77022), 

A. oryzae (D49701), A. parasiticus 

(U38948), Arabdopsis thaliana 

(P11832), Beauveria bassiana 

(X84950), Botryotinia fuckeliana 

(U43783), Fusarium oxysporum 

(Z22549), Gibberella fujikuroi 

(X90699), Hebeloma cylindrosporum 

(AJ238664), Leptosphaeria maculans 

(U04445), Metarhizium anisopliae 

(AJ001141), Neurospora crassa 

(X61303), Penicillium chrysogenum 

(U20779), P. griseoroseum (AY255803), 

Stagonospora nodorum (AJ009827) e 

Ustilago maydis (AJ315577). O alinhamento 

de toda a seqüência de aminoácidos 

foi realizado no programa 

Clustal X (Thompson et al., 1997), 

sendo o alinhamento resultante analisado 

pelo método de parsimônia no 

programa PAUP* versão 3.1 (Swofford, 

1993). Foi feita uma busca heurística 

e análise de bootstrap com 1.000 réplicas 

para gerar índices de confiabilidade 

para cada ramo. 

Pode-se observar claramente a 

tendência de se agruparem as espécies 

analisadas pela ordem à qual 

essas pertencem de acordo com a 

Figura 3 - Árvore filogenética não enraizada, baseada em análises pelo método de 

parsimônia da seqüência de aminoácidos da proteína nitrato redutase de vários fungos 

filamentosos. Os números indicam porcentagem dos valores de bootstrap em análise 

com 1.000 réplicas. 


taxonomia clássica. Dessa forma, a 

seqüência de aminoácidos da proteína 

nitrato redutase apresenta uma 

aplicação para estudos filogenéticos, 

com forte reflexo da história natural 

dos fungos filamentosos. 

Obtenção de mutantes 

deficientes na enzima 


Uma das grandes vantagens na 

aplicação do gene da nitrato redutase 

é a fácil obtenção de mutantes espontâneos 

por seleção positiva via 

resistência ao clorato. Essa seleção 

positiva, que favorece o crescimento 

do mutante em relação ao selvagem, 

é baseada na “similaridade” entre a 

molécula de nitrato e seu análogo 

tóxico, o clorato. Da mesma forma 

que o nitrato, o clorato presente no 

meio de cultura é transportado para 

o meio intracelular pela permease do 

nitrato e é reduzido a clorito pela 

ação da enzima nitrato redutase. Entretanto, 

diferentemente do nitrito, o 

clorito é um composto tóxico que 

promove a morte da célula. A teoria 

de que o clorato por si só não é 

tóxico, mas se torna tóxico pela conversão 

a clorito como resultado da 

ação da nitrato redutase, foi primeiramente 

sugerida por Aberg (1947) e 

tem sido confirmada por uma série 

de trabalhos. Análises do efeito do 

clorito de sódio, tanto in vitro como 

in vivo, sugerem que o clorito cause 

estresse oxidativo em células de fungos 

e, por causar oxidação de 

biomoléculas importantes, torna-se 

tóxico (Ingram et al., 2003). Dessa 

maneira, a célula que apresenta uma 

enzima nitrato redutase funcional 

morre e aquela que apresenta uma 

forma não-funcional sobrevive, pois 

não é capaz de reduzir o clorato a 

clorito. 

Nesse momento, a colônia 

mutante, que cresce no meio de cultura, 

é resistente ao clorato, mas não 

necessariamente é mutante para a 

enzima nitrato redutase. Mutações 

em, pelo menos, cinco genes podem 

levar ao fenótipo de resistência ao 

clorato: (i) mutação no gene da 

permease do nitrato (crnA), que incapacite 

a célula de absorver o clorato 

do meio extracelular; (ii) mutação no 

gene do regulador específico da assimilação 

de nitrato (nirA), que impos-

Figura 4 - Obtenção de mutantes nitrato redutase. 1-) Esquema do protocolo para obtenção de mutantes resistentes ao clorato e 

testes de crescimento para anotação da mutação; 2-) Vias metabólicas envolvidas com o fenótipo de resistência ao clorato (possíveis 

genes mutados são mostrados em laranja); 3-) Fenótipo de crescimento em placas contendo MM + nitrato (A), MM + nitrito (B) e 

MM + hipoxantina (C) de mutantes de Penicillium griseoroseum resistentes ao clorato. Colônias que não crescem em A mas crescem 

em B e C são mutantes nitrato redutase; S indica o tipo selvagem utilizado como controle positivo. 

sibilite a célula de expressar a enzima 

nitrato redutase; (iii) mutação no gene 

do regulador geral da assimilação de 

nitrogênio (areA), que também impossibilite 

a célula de expressar a 

enzima nitrato redutase; (iv) mutação 

em algum gene envolvido na 

biosíntese do cofator molibdênio 

(cnxA-J), que, não estando presente, 

torna ineficazes a enzima nitrato 

redutase e outras enzimas dependentes 

desse cofator; e (v) mutação 

no próprio gene da nitrato redutase 

(niaD), impossibilitando a célula de 

sintetizar essa enzima (Cove, 1976; 

Cove, 1979). Dessa forma, após a 

obtenção das colônias resistentes ao 

clorato, é necessário fazer uma discriminação 

do fenótipo mutante por 

meio de um fácil teste de crescimento 

em meio mínimo contendo as 

seguintes fontes de nitrogênio: nitrato, 

nitrito, hipoxantina, glutamato e 

amônio . O crescimento ou não nes- 

Tabela 

1 - Testes 

de 

crescimento 

de 

mutantes 

resistentes 

ao 

clorato, 

em 

diferentes 

fontes 

de 

nitrogênio. 

Mutação 

Designação 

do 

mutante* 

Testes 

de 

crescimento 

Clorato Nitrato Nitrito Hipoxantina Glutamato Amônio 

Nenhu ma 

Selvagem - + + + + + 

Nitra to 

redut 

ase 

n iaD 

+ - + + + + 

Regula dor 

especí 

fico 

n irA 

+ - - + + + 

Cofator molib 

dênio 

c nxA-J 

+ - + - + + 

Regula dor 

geral 

a reA 

+ - - - - + 

Perme ase 

c rnA 

+ + + + + + 

* denomi 

nação 

dos 

genes 

para 

A spe 

rgillus 

nidulan 

s; 

+ 

indic 

a cres 

cime 

nto 

e - indic 

a ausênc 

ia 

de 

cres 

cime 

nto. 


sas diferentes fontes (Tabela 1) é, 

então, correlacionado com a mutação 

em um dos cinco possíveis genes 

acima relacionados (Figura 4). Como 

em todas as espécies de fungos 

filamentosos estudadas até o momento, 

apenas uma cópia funcional 

do gene da nitrato redutase foi encontrada, 

mutantes nitrato redutase 

são reportados com alta freqüência. 

A razão do teste de crescimento 

em hipoxantina é que, além do requerimento 

por NAD(P)H, as 

enzimas nitrato redutase são dependentes 

de uma molécula chamada 

cofator molibdênio. A ausência desse 

cofator impossibilita a célula de 

utilizar o nitrato como também 

purinas como adenina, hipoxantina 

e xantina como única fonte de nitrogênio. 

Os mutantes incapazes de 

crescer em nitrato e hipoxantina 

apresentam uma perda pleiotrópica 

da atividade das enzimas nitrato 

redutase e xantina desidrogenase, 

respectivamente. Como esses 

mutantes são defectivos na síntese 

de um cofator comum, tanto para a 

nitrato redutase como para xantina 

desidrogenase, os genes envolvidos 

na síntese desse cofator foram denominados 

cnx (do inglês common 

component for nitrate reductase and 

xanthine dehydrogenase) (Pateman 

et al., 1964; Cove, 1979). Por meio 

de testes de complementação entre 

diferentes mutantes, Pateman et al. 

(1964) reportaram a existência de 

vários loci (cnx ABC, E, F, G e H) 

relacionados com vários genes responsáveis 

pela produção do cofator 

molibdênio, e Arst et al. (1982) relataram 

a existência de outro locus 

(cnxJ). Unkles et al. (1997) comprovaram 

que o locus cnxABC é parte 

de um único gene que codifica uma 

proteína com dois domínios catalíticos 

requeridos para a síntese de um 

intermediário do cofator molibdênio. 

Um protocolo para obtenção de 

mutantes deficientes na enzima nitrato 

redutase é apresentado a seguir 

e está esquematizado na Figura 4. 

Esse protocolo baseia-se em espécies 

que apresentam reprodução 

assexual e/ou sexual possibilitando 

o uso de esporos na análise. Como na 

grande maioria das espécies de fungos 

filamentosos os esporos são 

uninucleados e contêm genoma 

haplóide, a mutação é expressa sem 

efeito de dominância. Mesmo assim, 

algumas espécies de fungos não produzem 

esporos in vitro, e esse protocolo 

pode ser modificado para obtenção 

de mutantes por intermédio 

de fragmentos de micélio, onde setores 

resistentes ao clorato apresentam 

crescimento mais vigoroso. Entretanto, 

em algumas espécies de fungos, a 

resistência ao clorato parece ser natural, 

o que impossibilita a obtenção 

de mutantes por essa técnica. 

Protocolo para obtenção de 

mutantes nitrato redutase (segundo 

Cove, 1976; Cove, 1979; Unkles et 

al., 1989): 

• Preparar uma suspensão de 

esporos em tween 80 0,05% 

contendo cerca de 10 7 .ml -1 

esporos; 

• Plaquear 0,1 ml dessa solução 

em meio mínimo (MM) sólido 

(Pontecorvo et al., 1953) sem 

nitrato e acrescido de 470 mM 

de clorato de potássio e 10 mM 

de glutamato de sódio (clorato 

de potássio 57,6 g; glutamato 

de sódio monobásico 1,87 g; 

KH 2 PO 4 1,5 g; KCl 0,5 g; MgSO 4 

0,5 g; FeSO 4 0,01 g; ZnSO 4 0,01 

g; glicose 10 g; ágar 15 g; água 

destilada 1.000 ml; pH 6,8); 

• Incubar as placas a 25 o C por 

cerca de 7 a 10 dias; 

• Transferir as colônias resistentes 

ao clorato para placas 

contendo meio completo (MC) 

sólido, Pontecorvo et al. (1953) 

modificado por Azevedo e Costa 

(1973) [meio mínimo adicionado 

de peptona 2,0 g; caseína 

hidrolisada 1,5 g; extrato de 

levedura 2,0 g; solução de vitaminas 

1,0 ml; (biotina 0,2 mg; 

ácido p-aminobenzóico 10,0 mg; 

piridoxina 50,0 mg; tiamina 50,0 

mg; ácido nicotínico 100,0 mg; 

riboflavina 100,0 mg; água destilada 

100 ml); ágar 15 g; água 

destilada 1.000 ml; pH 6,8]; 

• Fazer purificação monospórica 

dos mutantes; 

• Inocular as colônias resistentes 

em placas de MM contendo 

10 mM das seguintes fontes de 

nitrogênio : nitrato de sódio, 

nitrito de sódio, cloreto de 

amônio, hipoxantina e glutamato 

de sódio; 

• Incubar a 25 o C por 3 a 5 dias; 


• Verificar o crescimento e anotar 

os fenótipos mutantes; 

• Separar e identificar os 

mutantes nitrato redutase. 

Assim, o sistema nitrato redutase 

apresenta vantagens sobre outros 

sistemas, como a fácil obtenção de 

mutantes espontâneos por seleção 

positiva via resistência ao clorato, e, 

como não há emprego de mutagênese, 

a possibilidade de mutações 

secundárias que atinjam genes importantes 

ou de interesse é reduzida. 

Também esses mutantes apresentam 

um único fenótipo desejável, 

não utilizar nitrato como única 

fonte de nitrogênio, sendo que esse 

fenótipo é dispensável sem alterar o 

crescimento ou fluxos metabólicos 

importantes. 

Utilização de mutantes 

deficientes na utilização do 

nitrato em estudos de 

grupos de compatibilidade 

vegetativa 

Isolados de uma espécie fúngica 

podem ser caracterizados pela compatibilidade 

ou incompatibilidade vegetativa. 

A compatibilidade ocorre 

quando micélios de diferentes isolados 

podem sofrer anastomoses e originar 

heterocários (hifas que contêm 

núcleos geneticamente diferentes), 

enquanto a incompatibilidade ocorre 

quando não há formação de heterocários. 

Nem sempre é possível formar 

essas anastomoses, principalmente 

quando os cruzamentos são 

interespecíficos ou intergenéricos, 

pois o fator determinante da interação 

entre as células pode estar na 

parede celular manifestando-se como 

bloqueio da fusão celular (Peberdy, 

1991). Os isolados que apresentem 

compatibilidade podem ser colocados 

dentro de um mesmo grupo, 

formando um grupo de compatibilidade 

vegetativa (GCV). Em fungos 

de reprodução assexuada, isolados 

de um mesmo GCV são mais similares 

geneticamente que isolados de 

diferentes GCV. 

A heterocariose também é a primeira 

etapa para que fungos 

assexuados troquem material genético 

por meio de um ciclo alternativo 

chamado parassexual. Nesse ciclo, 

os diferentes núcleos no heterocário 

se fundem, originando diplóides he-

terozigotos, e, a seguir, ocorre a produção 

de recombinantes por meio de 

recombinação mitótica e haploidização 

(Pontecorvo & Roper, 1952). 

A detecção de heterocários pode 

ser alcançada pelo cruzamento de 

indivíduos portadores de diferentes 

mutações. Quando são formadas 

anastomoses entre as hifas desses 

diferentes mutantes, o heterocário 

pode ser visualizado já que o núcleo 

de um indivíduo contém o gene selvagem 

que complementa a mutação 

do outro. As diferentes mutações 

podem estar relacionadas, por exemplo, 

à coloração da colônia, mas a 

obtenção de mutantes por técnicas 

de mutagênese tradicionais é muito 

trabalhosa, o que torna esse procedimento 

difícil de ser empregado para 

estudo com muitos isolados de campo. 

Assim, vários trabalhos reportam 

o estudo de GCVs utilizando mutações 

auxotróficas que incapacitem a 

célula de utilizar nitrato como única 

fonte de nitrogênio (Puhala, 1985; 

Correl et al., 1986; Brooker et al., 

1991). Nesses estudos, é suficiente 

fazer a triagem de populações utilizando 

indivíduos que contenham mutações 

únicas em diferentes genes da 

assimilação do nitrato, que possam 

ser testados para a sua habilidade de 

complementar as mutações e de formar 

heterocário em meio contendo 

nitrato como única fonte de nitrogênio. 

Como o isolamento de mutantes 

resistentes ao clorato gera mutações 

de diferentes tipos, essas mutações 

podem ser utilizadas como marcas 

de seleção para a formação dos heterocários. 

Assim, esse sistema tornase 

simples e rápido para ser utilizado 

para essa finalidade. 

Estudos de compatibilidade vegetativa 

são de particular interesse 

em fungos que se reproduzem 

assexuadamente, já que os indivíduos 

dentro de um GCV podem trocar 

informações genéticas por meio de 

heterocariose e de ciclo parasexual. 

Em fungos fitopatogênicos, os GCVs 

podem ser correlacionados com a 

patogenicidade, embora essa correlação 

não esteja sempre ligada. 

Puhalla (1985) utilizou mutantes deficientes 

na assimilação de nitrato 

para testar a compatibilidade vegetativa 

entre 21 isolados de F. oxysporum, 

reportando que membros do mesmo 

GCV pertenciam à mesma formae 

speciales. Correl et al. (1986) também 

utilizaram mutantes incapazes de 

metabolizar nitrato em testes de compatibilidade 

vegetativa para identificar 

F. oxysporum f. sp. apii raça 2 de 

uma população de raças de F. 

oxysporum que colonizava raízes de 

aipo. Assim, o teste de compatibilidade 

vegetativa é uma ótima ferramenta 

para estudos de diversidade 

genética constituindo marcadores genéticos 

naturais que podem ser utilizados 

para diferenciar isolados. Além 

disso, em fungos que se reproduzem 

sexuadamente, esses estudos também 

são importantes para determinar 

genes relacionados com o tipo 

sexual (mating type), importantes no 

reconhecimento e desenvolvimento 

do ciclo sexual. 

Transformação genética 

baseada no gene da nitrato 

redutase 

Um dos principais passos no desenvolvimento 

de uma tecnologia para 

manipulação e análise molecular de 

um organismo é o estabelecimento de 

um protocolo que permita introduzir 

seqüências de DNA clonadas em uma 

linhagem recipiente. A disponibilidade 

de um sistema de transformação 

oferece possibilidade de adição e de 

deleção de rotas metabólicas em um 

organismo de interesse, alterando o 

fenótipo selvagem para uma aplicação 

específica. As seqüências a serem 

introduzidas têm interesses distintos, 

dependendo do tipo de organismo 

estudado. Dessa forma, o principal 

objetivo da clonagem de genes que 

codificam nitrato redutase é o estabelecimento 

de protocolos de transformação 

baseados na complementação 

de mutações no gene da nitrato 

redutase. Nesse ponto, além das vantagens 

inerentes a esse sistema, outra 

característica importante é ser baseado 

na complementação de uma mutação 

auxotrófica, o que evita a introdução 

de genes de seleção baseados na 

resistência a drogas. 

A transformação é realizada pela 

introdução do gene da nitrato redutase 

em um mutante nitrato redutase por 

biobalística ou Agrobacterium 

tumefaciens, sendo que o método 

mais comum é o da transformação de 

protoplastos pela técnica do polietilenoglicol 

(PEG)/CaCl 2 . Após a trans- 

formação, os protoplastos são 

plaqueados por pour-plate em meio 

mínimo contendo estabilizador 

osmótico e nitrato como única fonte 

de nitrogênio. Apenas aquelas células 

mutantes onde o gene da nitrato 

redutase se integrar, serão capazes 

de crescer (Figura 5). Para tanto, 

pode-se utilizar um gene da nitrato 

redutase já isolado de um organismo 

em uma espécie de interesse. Quando 

o gene é de uma espécie diferente 

da espécie receptora, o sistema é dito 

heterólogo, e quando o gene foi 

isolado do organismo receptor, o 

sistema é dito homólogo. 

Nos sistemas heterólogos, geralmente 

há baixa similaridade entre o 

vetor de transformação e o genoma 

do organismo receptor, o que resulta 

em baixa freqüência de transformação, 

integração aleatória e alto número 

de cópias do vetor. Esse padrão de 

integração aleatório pode ser interessante 

para obtenção de mutantes pela 

técnica de REMI (do inglês restriction 

enzyme-mediated integration), descrita 

por Schiestl e Petes (1991), que é 

uma variação da técnica de transformação, 

onde enzima de restrição é 

adicionada à mistura de transformação 

juntamente com o plasmídeo linear. 

Queiroz et al. (1998) verificaram 

que o gene da nitrato redutase de F. 

oxysporum se integrava aleatoriamente 

no genoma de P. griseoroseum, 

sendo essa característica utilizada por 

Soares (2002) para obtenção de 

mutantes de P. griseoroseum pela técnica 

de REMI. 

Mesmo assim, sistemas de transformação 

homólogos têm sido desenvolvidos 

para vários fungos filamentosos, 

incluindo A. oryzae 

(Unkles et al., 1989), Cephalosporium 

Figura 5 - Seleção de transformantes baseada 

no gene da nitrato redutase. Placas com 

meio mínimo contendo nitrato como única 

fonte de nitrogênio. (A) Controle negativo 

- protoplastos do mutante nitrato 

redutase que não foram transformados; 

(B) protoplastos do mesmo mutante que 

foram transformados com gene homólogo 

da nitrato redutase. 


acremonium (Whithead et al., 1990), 

P. chrysogenum (Gouka et al., 1991), 

Fusarium oxysporum (Diolez et al., 

1993), G. fujikuroi (Tudzynski et al., 

1996), B. cinerea (Levis et al., 1997a), 

S. nodorum (Cutler et al., 1998) e P. 

griseoroseum (Pereira, 2001). Na literatura, 

existem relatos para A. oryzae 

(Unkles et al., 1989) e S. nodorum 

(Cutler et al., 1998) de 100% de 

integração do vetor no locus da nitrato 

redutase, sendo que nesses estudos 

foram analisados 22 transformantes 

para A. oryzae e 13 transformantes 

para S. nodorum. Para B. 

cinerea (Levis et al., 1997a), a análise 

de 36 transformantes revelou 34 

integrações homólogas, sendo 29 

eventos de troca gênica. Mesmo que 

a utilização de genes homólogos aumente 

a probabilidade de ocorrência 

de integração em sítios homólogos, 

para fungos filamentosos e outros 

organismos eucariotos, parecem ser 

mais comuns eventos de integração 

heteróloga. Sistemas de transformação 

homólogos, baseados na complementação 

de mutações nitrato 

redutase, desenvolvidos para 

Cephalosporium acremonium 

(Whitehead et al., 1990) e P. 

chrysogenum (Gouka et al., 1991) 

resultam, na maioria dos transformantes, 

na integração do vetor em 

sítios diferentes do locus da nitrato 

redutase, enquanto que G. fujikuroi 

(Tudzynski et al., 1996) e F. 

oxysporum (Diolez et al., 1993) ocorreu 

um número similar de integrações, 

dentro e fora desse locus. 

Um sistema de transformação com 

alta incidência de integração homóloga, 

especialmente troca gênica, pode 

ser utilizado para estudos de regiões 

importantes, tanto em nível de 

regulação como em nível estrutural. 

Assim, mutações geradas in vitro, 

como alteração dos sítios de ligação 

de proteínas reguladoras, podem ser 

introduzidas e avaliadas in vivo no 

exato local onde reside o gene. Além 

disso, essa alta taxa de integração 

homóloga é interessante em experimentos 

de co-transformação, pois diminui 

a probabilidade de integrações 

em sítios heterólogos que sejam importantes 

para o metabolismo celular 

e/ou de interesse biotecnológico. 

Vários trabalhos relatam a utilização 

de vetores de transformação 

que carregam o gene da nitrato 

redutase como marcadores de seleção 

em experimentos de co-transformação 

para introduzir genes de 

interesse biotecnológico. Por exemplo, 

Ribeiro (2001) relatou a obtenção 

de transformantes com até 89% 

de aumento na produção de poligalacturonase 

quando co-transformou 

um mutante nitrato redutase de P. 

expansum com o plasmídeo pPE 15, 

que carrega o gene homólogo de 

poligalacturonase, e o plasmídeo 

pNH24, contendo o gene da nitrato 

redutase de F. oxysporum como 

marcador de seleção. Linhagens 

transformantes de A. oryzae apresentaram 

a produção de poligalacturonase 

aumentada em até 3,2 vezes 

quando transformadas com um gene 

de poligalacturonase de Penicillium 

janthinellum, sendo os transformantes 

selecionados pela complementação 

de uma mutação nitrato 

redutase (Ishida et al. 1997). Cardoso 

et al. (2003) utilizaram o gene 

homólogo da nitrato redutase de P. 

griseoroseum para introduzir uma 

construção do gene da pectina liase 

e obtiveram transformantes com aumento 

expressivo na atividade dessa 

enzima. 

Utilização do gene da 

nitrato redutase como 

vetor de expressão 

Uma outra perspectiva na aplicação 

biotecnológica do gene da nitrato 

redutase é sua utilização como 

vetor de expressão. Isso é baseado 

nas análises de expressão onde são 

observadas grandes quantidades de 

transcrito do gene da nitrato redutase 

apenas poucos minutos após sua 

indução por nitrato (Okamoto et al., 

1991; Haas et al., 1996), sendo esse 

indutor acessível e de baixo custo. 

Essa perspectiva é importante uma 

vez que muitos genes de valor biotecnológico 

somente são expressos 

na presença de um indutor específico 

que, muitas vezes, é oneroso e 

acarreta a inviabilidade da aplicação 

industrial. Para tanto, a região estrutural 

do gene de interesse pode ser 

clonada sob controle do promotor do 

gene da nitrato redutase, abrindo a 

possibilidade para a indução do gene 

por uma fonte mais acessível e apenas 

no momento em que o indutor 

estiver presente. 


Uso da nitrato redutase 

para detecção e isolamento 

de elementos 

transponíveis 

Elementos transponíveis são seqüências 

de DNA que podem se 

mover no genoma integrando-se 

em regiões não homólogas, e que 

constituem importantes agentes de 

mutação e reorganização gênica, 

sendo também utilizados em sistemas 

de inativação de genes. Assim, 

detectar e isolar esses elementos é 

um importante passo para estudos 

de biologia básica e aplicada em 

um organismo. Diferentes estratégias 

são empregadas para o isolamento 

de elementos transponíveis 

em fungos filamentosos. Entre essas 

diferentes estratégias, o método 

de armadilha para transposons 

(“transposons trapping”) é o melhor 

método para detecção e isolamento 

de elementos transponíveis 

ativos. Esse método requer, além 

de um sistema de seleção positiva 

de mutantes espontâneos, que o 

gene alvo esteja clonado e caracterizado. 

Conforme discutido anteriormente, 

um dos melhores sistemas 

para seleção positiva de 

mutantes espontâneos é o sistema 

nitrato redutase. Dessa maneira, 

esse sistema vem sendo empregado 

com muito sucesso para o isolamento 

de vários elementos transponíveis 

em fungos filamentosos. 

Os elementos Fot1, impala, Ant1, 

Vader, Flipper e hupfer, são exemplos 

de transposons clonados pela 

seleção de mutações espontâneas 

no gene da nitrato redutase em 

Fusarium oxysporum, Aspergillus 

niger, A. fumigatus, Botrytis cinerea 

e Beauveria bassiana (Daboussi et 

al., 1992; Langin et al., 1995; Glayzer 

et al., 1995; Amutan et al., 1996; 

Levis et al., 1997b; Maurer et al., 

1997). 

Para isolar esses elementos utilizando-se 

o sistema nitrato redutase, 

é necessário isolar mutantes nitrato 

redutase e caracterizar, por hibridização 

com o gene alvo, o tipo de 

mutação que originou o fenótipo 

mutante. Nos mutantes isolados podem 

ocorrer mutações de diferentes 

tipos no gene da nitrato redutase, 

como, por exemplo, mutações pontuais, 

deleções ou inversões. Além

Figura 6 - Esquema da detecção e isolamento de elementos transponíveis utilizando o gene da nitrato redutase como isca. 

desses tipos, também pode ocorrer a 

inserção de um fragmento de DNA, 

como a inserção de um elemento 

transponível. Assim, espera-se que o 

resultado da hibridização apresente 

algum mutante com o fragmento do 

gene alvo maior quando comparado 

ao tipo selvagem (Figura 6). Após a 

obtenção de um mutante com a inserção, 

pode-se fazer um teste de 

estabilidade plaqueando-se esporos 

do mutante em meio mínimo contendo 

nitrato como única fonte de nitrogênio. 

Se a inserção for oriunda de 

um transposon ativo, esse pode saltar 

e reconstituir o fenótipo selvagem, 

apresentando maior instabilidade. 

O fragmento inserido, ou parte 

dele, pode ser recuperado por meio 

de bancos genômicos parciais ou de 

amplificação com oligonucleotídeos 

específicos e, então, seqüenciado e 

caracterizado. 

Mesmo que o gene da nitrato 

redutase não tenha sido clonado para 

uma espécie de interesse, há possibilidade 

de usar um gene heterólogo 

conforme realizado com sucesso por 

Daboussi et al. (1992). Esses autores 

introduziram o gene da nitrato redutase 

de A. nidulans em uma linhagem 

mutante para nitrato redutase de F. 

oxysporum e isolaram o elemento 

Fot1 inserido no gene heterólogo. 

Assim, a fácil seleção de mutantes 

nitrato redutase têm-se mostrado uma 

ótima ferramenta no isolamento de 

elementos transponíveis ativos em 

diferentes espécies de fungos filamentosos. 


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Pesquisa 

Carla M. Y. Lemos 

Lab. de Bioquímica e Microbiologia aplicada 

IBILCE - UNESP, Pós Graduação em Microbiologia 

Aplicada IB/UNESP - Rio Claro-SP 

Erica Fuchs 

Department of Food Science and Human Nutrition 

Iowa State University, IA-USA 

Eleni Gomes 

Lab. de Bioquímica e Microbiologia aplicada 

Departamento de Biologia 

IBILCE - UNESP - São José Rio Preto-SP 

Roberto Da Silva 

Lab. de Bioquímica e Microbiologia aplicada, 

Departamento de Química e Ciências Ambientais, 

IBILCE - UNESP - São José Rio Preto-SP 

dasilva@qca.ibilce.unesp.br 


Glucoamilase: 

Estrutura e termoestabilização 


Estrutura e termoestabilização de glucoamilase por técnicas moleculares 

Resumo 

A glucoamilase (GA) é uma 

enzima hidrolítica que catalisa a liberação 

sucessiva de β-D-glucose a partir 

do amido e oligossacarídeos relacionados. 

A GA catalisa eficientemente 

a reação de sacarificação do amido 

dentro de uma faixa estreita de temperatura. 

A sua termoestabilidade limitada 

afeta seu uso no processo 

industrial, onde a incubação prolongada 

em altas temperaturas é necessária. 

As estratégias tradicionais para 

melhorar a termoestabilidade da GA 

de Aspergillus, tais como a imobilização 

e modificação química têm falhado 

no uso industrial. Atualmente, as 

técnicas de evolução dirigida utilizando 

a biologia molecular proporcionam 

uma importante ferramenta para 

melhorar ou mesmo criar novas propriedades 

nas enzimas existentes, em 

um curto espaço de tempo. Esta revisão 

apresenta a importância, estrutura 

e função da glucoamilase e as recentes 

estratégias da biologia molecular 

como ferramenta para melhorar a termoestabilidade 

desta enzima. 

1. Glucoamilase de 

Aspergillus 

A glucoamilase (α-1,4-glucan 

glucohidrolase, EC 3.2.1.3), também 

conhecida como amiloglucosidase, é 

uma enzima hidrolítica que catalisa a 

quebra das ligações glicosídicas α- 

1,4 a partir de uma extremidade não 

redutora das moléculas de amilose 

ou amilopectina do grânulo de amido 

e oligossacarídeos relacionados 

liberando β-D-glucose. Em uma ve- 

locidade menor, a glucoamilase também 

atua hidrolisando as ligações α- 

1,6 (Fleetwood e Weigel, 1962). Sugere-se, 

portanto, que a ação da 

glucoamilase ocorra através de um 

mecanismo multisseriado no qual a 

enzima atua aleatoriamente em toda 

a molécula de substrato (James e Lee, 

1997). 

A glucoamilase (GA) é amplamente 

usada na indústria alimentícia 

para a produção de xaropes com alto 

teor de glucose e também é empregada 

na produção de álcool e xaropes 

com alto teor de frutose (1989; 

Brumm, 1998; Mathewson, 1998). 

Vários microrganismos, plantas 

e animais produzem glucoamilase. 

Estas enzimas disponíveis comercialmente 

são, na sua maior parte, produzidas 

por linhagens dos fungos 

Aspergillus e Rhizopus. Dentre estas, 

a glucoamilase de Aspergillus é a 

mais termoestável, apresentando a 

máxima atividade em torno do pH 

4,5, em temperaturas de 50 a 55°C, 

mas ela é rapidamente inativada em 

temperaturas próximas a 60°C 

(Manjunath et al.,1983; Brumm, 1998). 

A glucoamilase catalisa eficientemente 

a reação de sacarificação 

dentro de um limite relativamente 

estreito de temperatura, porque a 

sua conformação cataliticamente ativa 

muda com o aumento da temperatura. 

Esta termoestabilidade limitada 

afeta seu uso no processo industrial, 

onde a atuação prolongada 

em altas temperaturas é necessária. 

Na produção de xaropes com alto 

teor de glucose, uma pasta de amido 

(30-40% BS) é primeiro liquefeita a 

105°C por 5 minutos e em seguida,

Figura 1. Imagem da estrutura estendida da glucoamilase de Aspergillus niger idêntica a glucoamilase de Aspergillus awamori. 

No lado esquerdo o domínio catalítico (DC), ao centro o filamento ligante ou “linker” (L) e à direita o domínio de ligação ao 

substrato (amido) (DLS). 

http://nte-serveur.univ-lyon1.fr/nte/heyde/www.public.iastate.edu/_pedro/glase/glase.html (10/10/03) 

a 95°C por 2 horas, usando a aamilase 

bacteriana termoestável, em 

pH 6.0-6.5. Finalmente, o amido 

liquefeito é resfriado a 60°C e 

hidrolisado por mais 48 a 72 horas 

usando a glucoamilase (James e Lee, 

1997, Brumm, 1998). Está claro que 

a termoestabilidade da glucoamilase 

determina a velocidade do processo 

como um todo. Trabalhar em 

altas temperaturas não apenas pode 

acelerar a taxa da reação e consequentemente 

diminuir o tempo do 

processo, como também pode prevenir 

a contaminação microbiológica, 

além de reduzir a viscosidade da 

mistura de reação. Portanto, o desenvolvimento 

de uma glucoamilase 

mais termoestável poderá contribuir 

para a otimização do processo 

de sacarificação do amido. Entretanto, 

o conhecimento da estrutura da 

proteína e o processo de termoinativação 

da enzima são necessários 

para elaboração de prognósticos racionais 

e planos efetivos de experimentos 

de estabilização da estrutura 

proteica. 

A glucoamilase de Aspergillus é 

codificada por um único gene, mas 

existem duas ou três formas variáveis 

da enzima produzidas por proteólise 

limitada (Svensson et al., 1986). Pazur 

et al (1971) constatou que as formas 

da glucoamilases de Aspergillus niger 

são glicoproteinas que possuem quantidades 

diferentes de glicosilações. 

Como em outras proteínas, após a 

síntese no citoplasma, a GA é transportada 

em um estado desdobrado 

através da membrana do retículo 

DC L DLS 

endoplasmático (RE). Durante o subseqüente 

processo de dobramento, 

ocorre a O-glicosilação do “linker”, 

filamento que liga o domínio catalítico 

(CD) ao domínio de ligação ao substrato 

(DLS), e pontes dissulfetos são 

formadas (Pryer et al, 1992; Gaut e 

Hendershot, 1993). Assim, a GA, na 

sua conformação nativa estendida, 

assume uma forma de alteres, onde 

dois domínios volumosos, o domínio 

catalítico e o domínio de ligação ao 

amido, estão ligados por um filamento 

fino como mostra a figura 1. Esta é 

uma imagem simplificada ilustrativa, 

uma vez que a estrutura real da GA 

completa ainda não está disponível. 

A organização dos domínios da molécula 

tem sido deduzida através das 

diferentes técnicas biofísicas e relatos 

disponíveis (Coutinho, 1997; 

Sauer, 2000). 

As inúmeras proteínas desdobradas, 

que entram no lúmem do RE, 

devem ser protegidas de quaisquer 

agressões e serem mantidas em um 

estado de dobramento-competente. 

Dobramentos ineficientes ou mutações 

em proteínas secretadas resultam 

em enzimas com conformação 

incorreta e defeito na atividade 

(Bonifacino e Klausner, 1994). 

Em Aspergillus awamori, o gene 

codifica uma GAI de tamanho completo 

contendo de 615 a 616 resíduos 

de aminoácidos (figura 2), bem como 

o peptídeo sinalizador de secreção 

no N-terminal. O peptídeo sinalizador 

é cortado após a secreção da proteína 

pela célula. O outro maior produto 

de proteólise da GAI (diz-se da GA 

competente) é a GAII resultante da 

perda do sítio de ligação ao substrato 

localizado na extremidade C-terminal. 

A GAII é uma mistura de 

polipeptídeos de tamanhos entre 512 

e 514 resíduos de aminoácidos, com 

atividade catalítica normal mas sem a 

habilidade para se ligar ao amido no 

estado natural, não gelatinizado 

(Svensson et al., 1986). 

As proteínas originais de 

Aspergillus niger e Aspergillus 

awamori, cujas seqüências são idênticas 

(Svensson et al., 1989; Nunberg 

et al., 1984), consistem de três principais 

áreas funcionais (Coutinho e 

Reilly, 1994 a-b, Coutinho e Reilly, 

1997): (1) o domínio catalítico, constituído 

dos resíduos 1 ao 440, (2) o 

filamento ligante, formado pelos resíduo 

441 ao 512, que é altamente Oglicosilado, 

e (3) um domínio de 

ligação ao amido no estado natural 

na extremidade C-terminal, contendo 

os resíduo 513 a 616 (Svensson et 

al., 1986; et al., 1989). Além da região 

de O-glicosilação do “linker”, dois 

outros sítios de N-glicosilação estão 

localizados nos resíduos Asn 171 e 

Asn 395 (Svensson et al., 1989; Aleshin 

et al., 1992). Acredita-se que os resíduos 

de carboidratos desempenham 

uma importante função na estabilização 

da glucoamilase (Manjunath et 

al.,1983, Svensson et al.,1989; 

Williamson et al., 1992a). Em altas 

temperaturas, a GA de A. niger, quimicamente 

desglicosilada, (Shenoy 

et al., 1984) e a glucoamilase de A. 

awamori, geneticamente truncada, 

sem parte da região de O-glicosilação 


(Evans et al, 1990), deterioraram-se 

mais rapidamente do que as suas 

formas selvagens. Além disso, a GAII 

em que falta apenas do domínio de 

ligação ao substrato, tem termoestabilidade 

similar a da GAI (Svensson 

et al., 1986), enquanto que uma 

glucoamilase especial (GAI’), na qual 

faltam parte da região O-glicosilada e 

o domínio de ligação ao amido, é 

menos estável do que a sua forma 

original (Hayashida et al., 1989). A 

região de O-glicosilação também facilita 

a secreção de GA (Evans et al., 

1990). 

A estrutura da GA nativa é muito 

difícil de determinar em função do 

alto grau de glicosilação. Aleshin et 

al (1992) determinou a estrutura cristalina 

de uma GA muito próxima da 

forma nativa denominada A. awamori 

var. X100 (GA’) (figura 3), a qual foi 

obtida por proteólise limitada com 

subtilisina e apresenta os primeiros 

470 resíduos de aminoácidos da proteína 

original. Esta seqüência de aminoácidos 

da GA’ é 99,4% similar a 

GAI de A. niger e A. awamori, com 

uma deleção no resíduo 102 (Aleshin 

et al, 1992, 1994a). Assim, o estudo 

desta estrutura cristalina elucidou a 

conformação do domínio catalítico 

completo e a conformação da primeira 

metade N-terminal da região Oglicosilada 

da glucoamilase de 

Aspergillus. A estrutura cristalina da 

GA de A. awamori var. X100 mostrou 

que o domínio catalítico consiste 

de treze a-hélices que compreendem 

cerca de 51% dos resíduos de 

aminoácidos do polipeptídeo total, e 

regiões menores de β filamentos 

antiparalelos. Doze das α-hélices 

estão arranjadas dentro de uma estrutura 

denominada barril α/α, consistindo 

de seis α-hélices externas e seis 

internas que envolvem o sítio 

catalítico em forma de funil, constituído 

por seis segmentos α/α altamente 

conservados (Sauer, 2000). O sítio 

catalítico da GA possui uma barreira 

de resíduos hidrofóbicos no centro, 

os quais separam o núcleo em duas 

regiões de volume morto (void), contendo 

apenas água. Uma serve como 

o sítio ativo propriamente dito e a 

outra, tem uma função ainda não 

conhecida (Aleshin et al., 1994a). O 

sítio ativo contém Glu179 e Glu400 

como os dois resíduos de aminoácidos 

catalíticos localizados no fundo 

do sítio (Harris et al., 1993; Sauer, 

2000). A estrutura em barril α/α do 

DC da GA de A. awamori, A. niger e 

de Saccharomyces fibuligera são similares, 

sendo que esta última apresenta 

14 α-hélices, 12 das quais estão 

na conformação barril α/α (Sevcik et 

al, 1998; Sauer et al, 2000). Esta 

conformação contrasta com a 

topologia de organização em barril 

α/β encontrada em outras enzimas 

amilolíticas tais como α e β-amilases 

(Buisson et al., 1987; e Mikami et al., 

1993) e ciclodestrina glucosiltransferases 

(Klein e Schulz, 1991). Observou-se 

uma pequena similaridade 

entre a estrutura da GA e proteínas 

transportadoras de glucose. Assim, a 

organização das hélices na GA pode 

ser relevante para a conformação de 

proteínas que transportam glucose 

(Aleshin et al, 1994a). 

O segmento O-glicosilado está 

numa conformação de cinto estendido 

em torno do barril α/α catalítico. 

Isto sugere que este segmento serve 

como um elo de ligação estrutural 

entre o domínio catalítico e o domínio 

de ligação. A primeira parte (aminoácidos 

441 a 471) desta região Oglicosilada 

possui cerca de 10 resíduos 

de manoses expostos, que juntos 


Figura 2. Seqüência de aminoácidos (1 letra) da GA de A. niger. Letras vermelhas: αhelice; 

letras azuis: fita-β; C dentro dos retângulos: resíduos de cisteínas envolvidos 

em pontes dissulfetos; N dentro dos retângulos: sitios N-glicosilados; T e S dentro dos 

retângulos: sítios O-glicosilados; E dentro dos retângulos: resíduos dos aminoácidos 

catalíticos glutâmico 179 e 400; seqüências sombreadas: regiões conservadas S1 a S5; 

seqüência sublinhada: sitio de ligação ao substrato. Fonte: Flory, 1993. 

com 2 unidades de glucoses ligadas 

N-glicosidicamente nos resíduos Asn 

171 e Asn 395, formam um cinto de 

glicosilações ao redor do domínio 

catalítico (Aleshin et al, 1992). Foi 

sugerido que a outra parte altamente 

O-glicosilada (aminoácidos de 472 a 

512) envolva o domínio catalítico 

como uma continuação do resíduo 

471, fazendo com que o domínio de 

ligação ao amido fique próximo ao 

sítio ativo (Sauer et al, 2000). O 

segmento C-terminal do “linker” contém 

cerca de 30 aminoácidos, principalmente 

serina e treonina, sendo, 

portanto, muito O-glicosilado. A esta 

parte particular do linker tem sido 

atribuída papéis na estabilidade, secreção 

e na digestão do amido cru 

(Libby et al, 1994; Sauer et al, 2000). 

Embora algumas características como 

a compactação da conformação do 

barril α/α, a proteção dos carboidratos 

e a região O-glicosilada, façam a 

GA de Aspergillus mais estável do 

que algumas proteínas, uma maior 

estabilidade ainda é requerida para 

os processos industriais, como explicado 

anteriormente. 

O domínio de ligação ao amido 

possui este nome por causa da sua 

capacidade de se ligar ao grânulo de 

amido nativo e permitir sua digestão 

pelo domínio catalítico (Svensson et

Figura 3. Esquema da glucoamilase (GA’) de Aspergillus awamori var. X100 (Aleshin 

et al., 1992). α- hélices (H1 a H13) são simbolizadas por cilindros, sítios de Oglicosilação 

são representados por hexágonos simples, e sítios de N-glicosilação são 

simbolizados por cadeias de três hexágonos. 

al., 1983). Este domínio parece ter a 

capacidade de ligar a GA à parede da 

célula isto porque tem afinidade por 

α-1,4 e α-1,6 glucanos que pertencem 

à parede celular. Esta afinidade aumenta 

a concentração de GA próxima 

da micromembrana da célula 

(Neustroev et al., 1993). A GAII, na 

qual faltam os resíduos 513 a 616, tem 

uma habilidade semelhante a GAI 

para digerir amido solúvel, mas possui 

uma habilidade drasticamente reduzida 

para se ligar e hidrolisar o 

amido nativo (Svensson et al., 1989). 

Recentemente, foi demonstrado que 

o DLS isolado, atuando em grânulos 

de amido juntamente com a GAII, 

apresentaram um efeito sinergístico 

na degradação do substrato insolúvel, 

sugerindo que o domínio de ligação 

ao substrato se liga ao amido como 

uma porção individual e rompe a 

compacta estrutura do grânulo de 

amido facilitando a hidrólise pelo 

domínio catalítico (Southall et al, 1999; 

Sauer et al, 2000). O domínio de 

ligação ao amido da GA possui uma 

significante similaridade de seqüência 

de aminoácidos com o domínio de 

ligação ao amido da ciclodextrina glicosiltransferase 

(CGTase) (Svensson 

et al., 1989). A estrutura tridimensional 

da CGTase é globular, contendo de 6 

a 8 fitas β (Klein e Schulz, 1991). A 

estrutura do domínio de ligação ao 

amido da GA revela uma estrutura 

bem definida em fitas β consistindo 

de um par paralelo e 6 pares 

antiparalelos que formam um barril β 

aberto na lateral. Dois sítios de ligação 

para outros ligantes foram encontrados 

neste domínio, sendo cada um 

no final da molécula em faces opostas 

(Sorimachi et al., 1996). O mecanismo 

proposto de ligação deste domínio 

aos grânulos de amido, parece envolver 

a formação de um complexo de 

inclusão entre os resíduos hidrofóbicos 

do domínio de ligação e os grânulos 

de amido (Goto et al., 1994). 

Existem quatro pontes dissulfetos 

na GA, das quais três estão no 

domínio catalítico e uma no domínio 

de ligação. No domínio catalítico, as 

pontes estão entre os resíduos 210 e 

213 (conectando o N-terminal com o 

meio da hélice 7), 262 e 270 (contendo 

um filamento β antiparalelo) e 222 

e 449 (associando o trigésimo resíduo 

O-glicosilado do “cinto” com o 

domínio catalítico) (Aleshin et al., 

1992). Experimentos sugerem que 

existe uma ligação dissulfeto entre os 

resíduos 509 e 604 que conecta o Nterminal 

com o C-terminal do domínio 

de ligação ao substrato (Coutinho 

e Reilly, 1994 b). 

Existem dois resíduos N-glicosilados 

(Asn 171 e Asn 395) na GA, nos 

arredores do sítio ativo. Em cada 

caso, o N da Asn está ligado à posição 

C1 do primeiro resíduo de açúcar (Nacetil-D-glucosamina), 

que está ligado 

por β (1→4) ao segundo (Nacetil-D-glucosamina) 

que por sua 

vez se liga ao terceiro resíduo (Dmanose) 

(Aleshin et al., 1992). O 

número total de resíduos de açúcares 

para formar a cadeia glicosil ligada a 

Asn 171 e Asn 395 é 5 e 8 respectivamente 

(Aleshin et al., 1994 a). A 

mutação Asn 395→ Gln que removeu 

o sítio de N- glicosilação no resíduo 

395, diminuiu drasticamente tanto a 

secreção como a termoestabilidade, 

mas não alterou a atividade específica 

(Chen et al., 1994 b). 

Embora a GA de A. awamori 

primariamente catalise a clivagem 

hidrolítica de ligações a (1,4) com 

liberação de β-glucose a partir de 

uma extremidade não redutora da 

cadeia de amido e oligossacarídeos, 

ela também cliva ligações glicosídicas 

a (1,6) com uma eficiência catalítica 

(Kca t / Km) por volta de 500 vezes 

menor do que para as ligações a (1,4) 

(Fleetwood e Weigel, 1962). 

2. Termoestabilização da 

Glucoamilase 

2.1. Estratégias tradicionais 

A modificação química e a imobilização 

são as duas principais estratégias 

tradicionais que têm sido exploradas 

para melhorar a termoestabilidade 

da GA. 

Modificação química: altera um 

grupo funcional específico nas proteínas, 

tal como um grupo carboxila, 

por reação química. Embora esta 

técnica tenha aumentado a estabilização 

da a α-quimotripsina em 1000 

vezes (Moshaev et al., 1988), ela 

geralmente tem um rendimento negativo 

ou relativamente muito pequeno 

na termoestabilização da GA 

(Sinitsyn et al.,1978; Munch e Tritsch, 

1990). 


Imobilização: geralmente resulta 

em alguma perda da atividade 

enzimática (Lee et al., 1976; Svensson 

e Ottesen, 1981; Lenders e Crichton, 

1988), mas apesar disso, foi usada 

em GA porque ela permite o processo 

contínuo de operação. Embora 

muitas GAs imobilizadas tenham 

melhor estabilidade do que as formas 

solúveis, elas ainda não substituíram 

estas últimas no uso industrial, isto 

porque as GAs imobilizadas devem 

ser usadas em temperaturas operacionais 

baixas a fim de serem preservadas 

por vários meses, e continuarem 

viáveis (Lee et al., 1976). Desde que 

a energia de ativação para a atividade 

enzimática deva ser menor do que 

para a inativação da enzima, uma 

temperatura de 38 a 40°C é recomendada 

para a GA imobilizada. Entretanto, 

o decréscimo na temperatura 

operacional resulta numa baixa taxa 

de reação e em contaminação 

microbiológica, que é menos facilmente 

controlado em fábricas do que 

em laboratório. Lee et al., (1976) 

relataram que a GA imobilizada rendeu 

xaropes com teores mais baixo 

de glucose, 1,0-1,5%, e de Dextrose 

Equivalente (DE), 1,0-1,5 unidades, 

do que aqueles produzidos por 

enzimas solúveis. Isto é atribuído a 

limitação da difusão de partículas de 

glucose, que resulta em um gradiente 

de concentração de glucose e, 

consequentemente, leva a uma maior 

incidência de reações reversíveis 

do que se o gradiente não estivesse 

presente (Lee et al., 1980). Além 

disso, numa aplicação real, as altas 

concentrações do substrato estabilizam 

tão bem a GA que o aumento da 

termoestabilização proporcionado 

pela imobilização torna-se relativamente 

insignificante (Klesov e 

Gerasimas, 1979). 

2.2. Estratégias 

moleculares (Evolução 

Dirigida de Enzimas) 

O advento da engenharia de 

proteínas, empregando técnicas de 

biologia molecular, proporcionou 

novas estratégias para a termoestabilização 

de enzimas. O gene da GA de 

A. awamori foi clonado e expressado 

em Saccharomyces cerevisiae (Innis 

et al., 1985) e em Pichia pastoris 

(Fierobe et al. 1997), o que permitiu 

o emprego da manipulação genética 

como uma maneira de modificar a 

enzima para melhorar suas propriedades 

catalíticas ou físicas. 

Estas estratégias para criar novas 

ou melhoradas propriedades em 

enzimas, atualmente podem ser separadas 

em duas estratégias complementares 

1) desenho racional e 2) 

evolução dirigida. O desenho racional 

de proteínas é baseado no conhecimento 

detalhado da seqüência primaria, 

estrutura, função e mecanismo 

de catálise. Através destes conhecimentos, 

alterações são introduzidas, 

principalmente, por mutação sitio 

dirigida, como será discutido abaixo. 

A evolução dirigida, (Zhang, 1997) 

não exige conhecimento da relação 

estrutura-função da enzima. A evolução 

dirigida é também chamada de 

biotecnologia evolutiva (Arnold e 

Volkov, 1999; Reetz e Jaeger, 1999; 

Sutherland,2000). O termo evolução 

dirigida subtende uma série de experimentos 

que reproduzem, de forma 

acelerada e em tubos de ensaios, a 

evolução da diversidade natural e 

adaptação ambiental. Mutações e 

recombinações são feitas dando ao 

processo uma direção no sentido de 

atingir a otimização de uma propriedade 

específica (Lehman e Wyss, 

2001). Muitas pistas de como melhorar 

enzimas vêm dos estudos de como 

as enzimas evoluem na natureza. Assim, 

esta poderosa técnica objetiva 

otimizar o processo de melhoramento 

das enzimas utilizando mecanismos 

envolvidos na evolução natural (mutação, 

recombinação e seleção natural). 

Entretanto, a evolução dirigida 

difere do processo natural no sentido 

em que são os pesquisadores que 

definem as propriedades a serem 

otimizadas e o processo biotecnológico 

acontece em um período curto de 

tempo (semanas ou meses) (Reetz, 

1999). 

Num experimento de evolução 

dirigida, primeiramente é induzida 

uma alteração no DNA visando uma 

resposta específica. Isto resulta em 

uma biblioteca de populações com 

diferentes graus de possíveis respostas, 

incluindo ou não a resposta esperada. 

O próximo passo é encontrar 


dentre as milhões de possibilidades, 

a solução ou as soluções corretas, ou 

seja, a enzima que exibe a propriedade 

desejada (Arnold, 1996). 

Em suma, este processo consiste 

na combinação de técnicas da biologia 

molecular apropriadas para a 

mutação e expressão do gene, 

acopladas a um eficiente e rápido 

sistema de seleção. (Reetz e Jaeger, 

2000). A idéia é partir de uma enzima 

selvagem, realizar a mutagênese no 

gene que codifica a enzima e selecionar 

os melhores mutantes de acordo 

com a característica fenotípica 

desejada (Zhang, 1997). Após a seleção 

dos mutantes, segue-se novos 

ciclos de mutações buscando melhores 

mutantes. 

Quando a taxa de mutação, tamanho 

da biblioteca e o processo de 

seleção são adequados, o fenótipo 

desejado de uma enzima geralmente 

aumenta a cada ciclo de mutações 

(Zhang, 1997). 

Existe um grande número de 

diferentes estratégias de mutagênese 

para criar diversidade de seqüências, 

tais como a mutação pontual ao acaso 

por PCR mutagênico (error-prone 

PCR), e o embaralhamento de DNA 

(DNA shuffling). Combinações destas 

técnicas também vêm sendo utilizadas. 

Tais estratégias serão discutidas 

a seguir: 

2.2.1 Mutação Sítio Dirigida 

(MSD) 

É uma poderosa técnica na qual 

apenas um ou poucos aminoácidos 

específicos são substituídos por outros 

aminoácidos, por alteração nos 

correspondentes nucleotídeos no 

gene codificador da proteína. Quando 

realizada com sucesso, ela tem a 

vantagem de melhorar a característica 

desejada da enzima sem afetar 

outras propriedades e até mesmo de 

criar mutantes carregando várias características 

melhoradas. 

Nesta ferramenta, as mudanças 

precisas, efetuadas na seqüência dos 

aminoácidos, são baseadas no conhecimento 

detalhado da estrutura da 

proteína, função e mecanismo (Chen, 

1999). Por exemplo, um resíduo particular 

de aminoácido pode ser identificado 

como sendo importante para

a atividade catalítica da enzima (Reetz, 

1999), sendo assim, uma substituição 

individual deste aminoácido poderia 

provocar mudanças na estrutura secundária 

resultando em enzimas com 

características desejáveis (Chen, 1999). 

Entretanto, seria impossível predizer 

qual dos 19 aminoácidos remanescentes 

seria o melhor alvo para a 

mutação que resultaria em subsequente 

melhoria da propriedade procurada 

(Reetz, 1999). Muitas tentativas para 

alterar especificamente algumas das 

propriedades das enzimas através 

desta técnica falharam, isto porque a 

introdução de aminoácidos substitutos 

têm efeitos inesperados na estrutura 

e função da enzima. (Kikuchi, 

1999). Além disso, tem sido observado 

que em muitos estudos de mutação 

sítio dirigida, o aumento da termoestabilidade 

está vinculada ao decréscimo 

da atividade catalítica (Carrea 

e Colombo, 2000). As falhas também 

podem ser porque este processo requer 

conhecimento de detalhes da 

estrutura tridimensional da enzima, 

de seu mecanismo de catálise, bem 

como um certo grau de intuição na 

escolha do aminoácido a ser substituído 

(Reetz, 1997). Em muitos casos, 

estas substituições foram feitas sem 

levar em consideração as propriedades 

estruturais da proteína (Chen, 1999). 

2.2.2. PCR mutagênico (Errorprone 

PCR): 

A introdução de mutações através 

desta técnica envolve uma modificação 

no protocolo de PCR (Jaeger 

e Reetz, 2000). Uma reação de PCR é 

normalmente realizada de modo a 

amplificar qualquer dado DNA com 

alta fidelidade. A atividade de correção 

de erro 3’ → 5’ da DNA polimerase 

assegura que a amplificação do 

DNA siga de maneira precisa. Ocasionalmente, 

nucleotídeos errados são 

incorporados durante a amplificação 

levando a mutações com uma freqüência 

de 0,1 a 2x 10 -4 por 

nucleotídeo para a DNA polimerase 

termoestável do Thermus aquaticus 

(Taq polimerase). Esta baixa taxa de 

erro pode ser aumentada para 7x 10 -3 

por nucleotídeo através de um ou 

mais dos seguintes procedimentos: 

aumento da concentração de MgCl 2 , 

adição de MnCl 2 , aumento na concentração 

de dCTP e dTTP e aumento 

na quantidade taq polimerase. Para o 

propósito de evolução dirigida de 

enzima, estas condições devem ser 

modificadas a fim de se obter uma 

taxa média de 1 a 2 nucleotídeos 

mutados por gene, levando a uma 

mudança média de 1 aminoácido por 

enzima mutante (Reetz, 1999). A vantagem 

de tal processo é que pode ser 

realizado rapidamente envolvendo 

qualquer proteína, mesmo sem o 

conhecimento preciso de sua estrutura 

(Zhang et al, 1997 e Jaeger e 

Reetz, 2000). 

2.2.3. Embaralhamento de DNA 

(DNA shuffling) 

Este poderoso processo de evolução 

dirigida, que gera diversidade 

por recombinação, é baseado na combinação 

de mutações úteis de genes 

individuais. Bibliotecas de genes quiméricos 

podem ser geradas por fragmentação 

aleatória de um gene, seguido 

por recombinação dos fragmentos 

em uma reação de PCR 

(Crameri, 1998). 

O embaralhamento de DNA 

combinado com uma seleção para a 

atividade pode acelerar a evolução 

dirigida das características desejadas. 

Nesta técnica, a diversidade é 

introduzida a partir de uma biblioteca 

de mutações pontuais aleatórias 

(Christians et al, 1999). Os genes 

selecionados podem ser submetidos 

a mais ciclos de mutações (reembaralhamento) 

e melhorar ainda mais a 

sua mutação benéfica original 

(Stemmer, 1994a) simulando de forma 

acelerada, o processo natural de 

recombinação sexual (Christians et 

al, 1999). 

A técnica consiste basicamente 

na fragmentação de um gene com 

diferentes mutações pontuais por 

DNAse I. A recombinação dos fragmentos 

aleatoriamente resulta em 

moldes trocados e recombinados. Um 

gene recombinante contendo 4 

“crossovers” pode ser selecionado da 

biblioteca de recombinantes baseado 

na função melhorada. O conjunto 

selecionado promove o ponto de 

partida para outro ciclo de mutações 

e recombinações. Este processo iso- 

lado causa um baixo número de 

mutações pontuais, mas se for desejado, 

mutações adicionais podem ser 

incorporadas por PCR mutagênico 

ou mutagênese por UV no “pool” de 

genes (Stemmer, 1994a). 

A técnica de embaralhamento 

pode ser realizada com mutantes do 

mesmo gene e também com genes 

homólogos de diferentes espécies 

(family shuffling) (Reetz e Jaeger, 

1999). Esta recente adaptação permite 

que duas ou mais seqüências que 

ocorram naturalmente sejam usadas 

como material genético iniciador. 

Neste método, genes similares são 

misturados, fragmentados aleatoriamente 

e recombinados sob condições 

que permitam o anelamento e a 

extensão de fitas complementares 

não idênticas (Christians et al, 1999). 

A recombinação que ocorre nesta 

técnica é causada pela incorporação 

de um fragmento derivado de uma 

seqüência dentro de outra, baseado 

na homologia. 

Análises evolutivas de famílias 

de enzimas sugerem que mudanças 

drásticas na função da enzima exigem 

uma considerável mudança na 

seqüência de aminoácidos de um 

polipeptídeo. Tais mudanças provavelmente 

não ocorrem durante o processo 

de evolução in vitro, no qual as 

enzimas são principalmente melhoradas 

por mutações de ponto com 

uma tendência a transições e 

transversões limitando o acesso a um 

amplo espectro de substituições. Em 

contraste, a mutação natural, tipicamente 

resultante de recombinação 

sexual ou homóloga, gera deleções, 

inserções, duplicações ou fusões. 

Neste último processo, tais mutações 

alteram o espaçamento entre 

os resíduos de aminoácidos e segmentos 

de cadeias de polipeptídeos 

e pode resultar em mudanças na 

especificidade e novas atividades 

catalíticas (Chen, 2001). 

“Screening” e Seleção: Grandes 

bibliotecas de mais de 10 10 genes 

mutantes podem facilmente ser criadas 

usando as técnicas acima. Portanto, 

o desenvolvimento de um 

sistema apropriado de seleção é de 

importância chave no processo de 

evolução dirigida de enzimas (Reetz, 

1999). Seleções efetivas, nas quais 


apenas aqueles clones carregando a 

característica desejada sobrevivam 

ou cresçam mais rápido são raras 

(Arnold e Volkov, 1999). No caso do 

emprego de vetores (plasmídios), o 

“screening” é feito para obter os 

mutantes que incorporaram o vetor 

contendo o gene desejado. O vetor 

geralmente carrega um gene para 

resistência a algum antibiótico, por 

isso utiliza-se o plaqueamento das 

linhagens submetidas ao processo 

de mutagênese em um meio contendo 

o antibiótico. As colônias que 

crescerem neste meio, certamente 

incorporaram o vetor e podem ser 

escolhidas para a próxima etapa. Em 

outros casos, a mutação positiva 

resulta em reparo de algum defeito 

que poderá ser usado como ferramenta 

para a seleção. Por exemplo, 

a recuperação da habilidade de produção 

de enzimas formadoras de 

halos na placa de seleção. A etapa 

seguinte é a escolha de colônias que 

tenham a característica desejada, por 

exemplo, o aumento na termoestabilidade 

enzimática. Assim, as 

enzimas das colônias positivas no 

“screening” serão submetidas a testes 

de termoinativação a fim de se 

isolar as colônias produtoras de 

enzimas termoestáveis. 

2.3. Enzimas 

termoestabilizadas por 

estratégias moleculares 

Akanuma et al (1998) introduziram 

o gene leuB (que codifica para a 

3-isopropilmalato desidrogenase envolvida 

na biossíntese de leucina) no 

microrganismo termofílico Thermus 

thermophilus usando técnicas de evolução 

dirigida de enzimas. Após mutação 

no gene da enzima, eles obtiveram 

uma variante termoestável. A 

estabilidade térmica da enzima 

mutante foi 10°C acima da observada 

na enzima selvagem. 

A técnica da evolução dirigida 

foi aplicada à kanamicina nucleotidiltransferase 

(KNTase), uma enzima 

que confere resistência ao antibiótico 

kanamicina. Variantes desta 

enzima apresentaram resistência a 

kanamicina a uma temperatura de 

63°C e foram produzidas por dois 

ciclos seguidos de mutações resul- 

tando em duas substituições de aminoácidos 

(Reetz e Jaeger, 1999). 

Kikuchi et al (1999) aplicaram 

esta técnica nos genes xylE e nahH 

que codificam para a enzima catecol 

2,3-dioxigenase. Mais de 2000 clones 

híbridos foram criados e posteriormente 

selecionados para estabilidade 

térmica. A melhor enzima quimérica 

selecionada foi testada a 50°C e 

a vida média foi de 70 min, muito 

maior do que a enzima codificada 

pelos genes selvagens xylE (2,7min) 

e nahH (5,4min). 

Yang et al (2000) criaram um 

mutante para o gene da subtilisina E 

através da técnica de PCR mutagênico. 

Análises do seqüenciamento revelaram 

apenas uma substituição (A→G). 

O tempo de vida médio da atividade 

da enzima mutante, quando encubada 

a 65°C, foi de aproximadamente 80 

min enquanto que uma outra linhagem 

mutante (mutante original usado 

no PCR mutagênico) e a linhagem 

selvagem apresentaram um tempo de 

13 e 15 min respectivamente. 

Miyazaki et al (2000) usaram a 

técnica de embaralhamento de DNA 

em uma subtilisina S41 psicrofílica 

com o objetivo de aumentar sua termoestabilidade 

e atividade. Após a 

terceira geração de bibliotecas criadas 

por PCR mutagênico, três variantes 

termoestáveis foram identificadas. 

Das três, uma enzima mutante 

em particular teve a maior atividade 

residual após incubação a 70°C. Esta 

subtilisina S41 variante contém 7 substituições 

de aminoácidos, todas contribuindo 

para o aumento da sua 

termoestabilidade. 

A temperatura ótima da lipase 

foi aumentada em até 15°C através 

da mutagênese aleatórea utilizando a 

técnica de PCR com tendência ao 

erro (Kohno et al, 2001). 

Utilizando-se da técnica de embaralhamento 

de DNA Hayashi et al. 

(2001), obtiveram quimeras de βglucosidase 

com a termoestabilidade 

aumentada em até 16°C quando comparadas 

com a enzima original. 

A evolução dirigida foi também 

usada para melhorar a termoestabilidade 

da galactose oxidase (Sun et 

al, 2001). Foi observado que as 

enzimas mutantes obtidas, mantinham 

a atividade enzimática e a 


especificidade pelo substrato semelhantes 

às da enzima selvagem, entretanto, 

a termoestabilidade foi aumentada. 

O T 50 (temperatura na qual 

as enzimas perdem 50% da sua atividade) 

foi aumentado para 67°C para 

os dois mutantes mais termoestáveis 

enquanto que a selvagem não ultrapassou 

63°C. 

Experimentos com a GA usam 

na sua grande maioria a MSD como 

ferramenta para a obtenção de características 

desejadas melhoradas, uma 

boa revisão neste assunto foi apresentada 

por Ford (1999). Várias abordagens 

preconizadas para estabilização 

podem ser acessadas pela MSD, 

como por exemplo, as substituições 

dos resíduos flexíveis de glicina em 

α-helices, substituições de seqüências 

susceptíveis a desamidação e quebra 

Asn-Gly, alterações em ligações 

frágeis como Asp-X, introdução de 

prolina que reduz o número de conformações 

no estado desdobrado, 

acréscimo cisteínas para aumentar o 

número de pontes dissulfetos, além 

de combinações destas abordagens 

em mutantes múltiplos etc. (Ford, 

1999; Sauer, 2000). 

Libby et al (1994) testaram o 

efeito de deleções de aminoácidos 

na região O-glicosilada da GA de 

Aspergillus awamori. Foram feitas 

deleções para remover os resíduos 

de 466 a 512 (GAI), de 485 a 512 

(GAII) e de 466 a 483 (GAIII). Analisando 

as frações intracelulares e 

extracelulares, observou-se que a 

região deletada da GAIII afetou a 

secreção enquanto que a deleção da 

GAII contribuiu para a produção e 

uma estrutura estável da proteína. 

Para todos os mutantes foram encontradas 

atividades catalíticas similares 

à selvagem indicando que as deleções 

não afetaram o sítio catalítico. 

Chen et al. (1994) substituíram 

a seqüência susceptível a desamidação, 

Asn182-Gly, por Ala182-Gly, o 

que resultou em decréscimo de 2,5 

vezes na taxa de termoinativação a 

60 e 65°C. 

O efeito da substituição de resíduos 

flexíveis de glicina por alanina 

em quatro diferentes α-hélices na GA 

de Aspergillus awamori foram estudados 

(Chen et al, 1996). Substituições 

simples de Gly137 e Gly139 e

no mutante múltiplo contendo ambas 

as mutações estabilizaram a GA contra 

a termoinativação irreversível. 

Com o objetivo de estudar o 

papel das regiões conservadas na GA 

de Aspergillus awamori, Sierks et al 

(1993) realizaram substituições nos 

resíduos de Leu177, Trp178 e Asn182 

por His, Arg e Ala, respectivamente. 

Quando se substituiu Leu177 por His 

houve um grande aumento na energia 

de ativação para substratos com 

ligação α(1→4) e α(1→6); na substituição 

Trp178 por Arg, a energia 

aumentou para substratos com ligações 

α(1→6), mas não para α(1→4). 

Estas substituições indicaram que os 

resíduos de aminoácidos Leu177 e 

Trp178 estão localizados no subsítio 

1 e 2 respectivamente. Por outro 

lado, a substituição Asn182 por His 

não alterou os valores de energia de 

ativação para nenhum tipo de ligação 

do substrato, sugerindo que este 

resíduo não é crucial para o mecanismo 

catalítico da GA. 

Fiorobe et al. (1996) substituiram 

Ala246 por Cys, criando mais 

uma ponte dissulfeto entre este resíduo 

e o resíduo Cys320. O mutante 

apresentou maior atividade residual 

e atividade catalítica por 15 minutos 

comparado a linhagem selvagem. 

Fiorobe et al. (1998) produziram um 

mutante substituindo o Glu 400 por 

Cys. A atividade do mutante, após 

oxidação da cisteina para acido 

cisteinosulfínico, elevou a atividade 

do mutante para 160% em relação a 

linhagem selvagem. Entretanto, não 

houve ganho de termoestabilidade. 

Uma ponte dissulfeto foi criada 

substituindo Asn20 e Ala27 por Cys 

na GA de Aspergillus awamori e 

observou-se um aumento na termoestabilidade 

de 1,2 kJ/mol a 65°C (Li 

et al, 1998). 

Mutantes contendo prolina em 

substituição a vários aminoácidos foram 

estudados por Allen et al. (1998). 

O maior sucesso com mutação simples 

foi obtido no mutante Ser30→Pro, 

resultando em um aumento da energia 

livre de termoinativação de 1,6 kJ/ 

mol a 65°C. Os autores ainda combinaram 

diferentes mutações termoestáveis 

e obtiveram um triplo mutante 

contendo Gly137→Ala, Ser30→Pro e 

Asn20→Cys/Ala27→Cys que apresen- 

tou aumento cumulativo de termoestabilidade 

de 4,4 kJ/mol. 

Estes experimentos, embora tenham 

como objetivo principal a melhora 

em propriedades da enzima, 

paralelamente desempenham um papel 

de extrema importância, o de 

elucidar as funções de inúmeros segmentos 

da cadeia polipeptídica da 

proteína. 

3. Conclusão e 

perspectivas futuras 

As técnicas de evolução dirigida 

disponíveis, associadas a considerações 

teóricas e às várias experiências 

relatadas de sucesso ou não, disponíveis 

na literatura, têm levado a uma 

crescente seleção de mutações bem 

sucedidas para termoestabilização da 

GA. Todavia, este sucesso ainda não 

refletiu significativamente na produção 

de enzima industrialmente satisfatória, 

deixando o campo ainda aberto 

para novas experiências. 

Os organismos atualmente disponíveis 

para clonagem e expressão 

da GA são mesofílicos, criando dificuldades 

para a seleção de enzimas 

mais termoestáveis. Além disso as 

linhagens de E. coli utilizadas são 

deficientes em glicosilação e formação 

de pontes dissulfetos, essenciais 

para a GA ativa. Pesquisas com 

bacterias termofílicas e/ou bacterias 

competentes para a clonagem e expressão 

da GA estruturalmente ativa, 

podem ser alternativas viáveis para 

reduzir tempo e manipulação. 

A maior parte das informações 

sobre seqüências de GA são dos 

fungos mesofílicos, A. niger e A. 

awamori. Informações de seqüências 

de GAs termoestáveis, seriam importantes 

para orientação racional de 

desenhos de experimentos de evolução 

dirigida. Entretanto, poucas GAs 

termoestáveis de fungos termofílicos 

foram relatadas. Dentre estes estão 

Humicola grisea var. thermoidea 

(Tosi et al. 1993), Aspergillus 

fumigatus (Brandani e Peralta, 1998) 

e Thermomyces lanuginosus (Li et al 

1998). Informações sobre seqüências 

genéticas são ainda mais raras. A 

procura por novas fontes de GAs 

termoestáveis, bem como informações 

sobre a proteína e seu gene 

codificador são um campo aberto e 

com enormes perspectivas futuras. 

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Pesquisa 

Valdir Marcos Stefenon 

Biólogo – Mestre em Biotecnologia 

Depto. de Ciências Biológicas e da Saúde – UNIPLAC 

gene_mol@hotmail.com 

Rubens Onofre Nodari 

Eng. Agrônomo – Doutor em Genética 

Departamento de Fitotecnia – CCA – UFSC 


Marcadores Moleculares 

no Melhoramento Genético 

de Araucária 

Caracterização da diversidade genética em Araucaria angustifolia 

Introdução 

A exploração florestal foi uma 

importante alavanca para o desenvolvimento 

econômico do Sul do Brasil 

desde o início do século XX, com 

intensidade crescente nas décadas de 

1950 a 1970 (Guerra et al., 2002). 

A principal espécie explorada nesse 

ciclo foi a Araucaria angustifolia 

(Bert.) O. Ktze., única representante 

da Família Araucariaceae no Brasil e 

principal espécie que compõe a floresta 

ombrófila mista ou mata de 

araucária (Guerra et al., 2002). No 

Brasil, a distribuição natural dessa 

espécie se dá em amplas áreas nos 

estados do Rio Grande do Sul, Santa 

Catarina e Paraná, e em alguns pontos 

mais elevados de São Paulo, Rio de 

Janeiro e Minas Gerais (Reitz e Klein, 

1966). 

Todavia, a alta qualidade de sua 

madeira para os mais diversos fins, 

desde a construção civil até a produção 

de celulose e de papel, fez com 

que essa espécie fosse exaustivamente 

explorada, tendo como conseqüência 

uma drástica redução das grandes reservas 

de A. angustifolia no sul do país. 

Além dessa exploração desordena-da, 

o avanço das fronteiras agrícolas 

foi outro fator responsável pela 

redução das populações naturais dessa 

importante espécie florestal. 

Em função desses acontecimentos, 

a araucária encontra-se hoje na 

Lista Oficial de Flora Ameaçada de 

Extinção (IBAMA, 2002) e os remanescentes 

de floresta ombrófila mista 

estão reduzidos a fragmentos isolados 

de diversos tamanhos. 

Em alguns desses fragmentos, estima-se 

que grande parte da diversidade 

genética tenha sido perdida (Schögl, 

2000; Auler et al., 2002), fato que 

inviabiliza a regeneração natural da 

espécie, devido à endogamia acentuada 

e à redução do fluxo gênico entre 

suas populações. 

Nos últimos anos, diversas discussões 

a respeito desse tema vêm 

apontando para a necessidade de se 

desenvolver o melhoramento genético 

dessa conífera, com vista a regenerar 

a Floresta de Araucária e disciplinar 

os plantios com finalidade lucrativa, 

seja pela exploração da madeira, 

seja pela venda das sementes comestíveis 

ou de outros subprodutos. 

Entretanto, antes de os programas 

de melhoramento genético serem 

implementados, é necessário que se 

conheça a diversidade genética existente 

entre as populações remanescentes 

e dentro delas. Esses estudos 

são importantes para que se interprete 

o efeito da fragmentação dos remanescentes 

sobre a estrutura genética 

das populações: informação essencial 

para o planejamento de programas de 

melhoramento. 

Esse conhecimento, além de reduzido, 

tem sido produzido basicamente 

a partir de marcadores morfológicos 

(Shimizu e Higas, 1980; 

Monteiro e Spelz, 1980; Kageyama e 

Jacob, 1980) e isoenzimas (Shimizu et 

al., 2000; Auler et al., 2002; Mantovani 

et al., 2002). 

Considerando a utilização de marcadores 

RAPD (Williams et al., 1990; 

Welsh e McClelland, 1990) e AFLP 

(Vos et al., 1995) para estudos genéticos 

em diversas espécies florestais, o 

objetivo deste estudo foi determinar a 

capacidade informativa desses marcadores 

para a caracterização da diversidade 

genética de populações naturais 

de A. angustifolia. 


Material e Métodos: 

Material vegetal e 

Extração de DNA 

O material vegetal utilizado neste 

estudo foi composto por amostras foliares 

de trinta indivíduos adultos de uma 

população natural do Parque Ecológico 

Municipal de Lages, Estado de Santa 

Catarina, coletados e acondicionados 

em sacos plásticos que continham sílica 

gel. Inicialmente, foram testados sete 

protocolos para extração de DNA vegetal 

com base na utilização do detergente 

CTAB. Com esses testes, chegou-se à 

conclusão de que era necessário otimizar 

um protocolo específico para a espécie, 

a fim de eliminar os compostos contaminantes 

do DNA presentes nas folhas de 

araucária (principalmente proteínas e 

polifenóis) e a fim de evitar a liofilização 

do material vegetal. 

Aproximadamente 150 mg de folhas 

foram congeladas em nitrogênio 

líquido e maceradas completamente em 

gral de porcelana. Ao pó resultante, 

acrescentou-se 1,5 mL de tampão de 

extração [CTAB 2%; NaCl 1,5 M; EDTA 20 

mM; Tris-HCl (pH 8,0) 100 mM; PVP 2%; 

2-mercaptoetanol 1%]. O material foi 

transferido para tubos eppendorf de 2 mL 

e mantido em banho-maria (60°C) por 40 

min. A cada 15 minutos, o material foi 

homogeneizado por inversão. Após essa 

etapa, o material foi deixado sobre a 

bancada até alcançar a temperatura ambiente, 

quando lhe foram acrescidos, em 

cada tubo, 600 µL de CIA [clorofórmio: 

álcool isoamílico 24:1]. O material foi 

homogeneizado durante três minutos, 

por inversão, e centrifugado a 13.000 

RPM, por 5 min. A porção aquosa que 

continha o DNA foi transferida para dois 

novos tubos e foram acrescidos a ela 5 µL 

de RNAse A (10 µg/mL). Após 40 min, a 

34°C, realizou-se uma segunda extração 

orgânica com CIA. Após a centrifugação 

(13.000 RPM, por 5 min), a porção 

aquosa foi transferida para novos tubos, 

aos quais adicionaram-se 50 µL de solução 

de CTAB 10% [CTAB 10%; NaCl 1,4 

M], a 60°C. Após a homogeneização, 

realizou-se uma terceira extração orgânica 

com CIA. A porção aquosa foi 

transferida para novos tubos e o DNA foi 

precipitado pela adição de 2/3 do volume 

de álcool isopropílico gelado(-20°C). 

O material foi mantido por 30 min a - 

20°C e, posteriormente, centrifugado a 

7.000 RPM, por 5 min . O álcool 

isopropílico foi descartado e o DNA 

desidratado novamente com 1 mL de 

álcool etílico 95%. O material permaneceu 

por 10min a -20°C e centrifugado a 

8.000 RPM, por 5 min. O álcool etílico foi 

descartado e deixou-se o precipitado 

secar a temperatura ambiente. O DNA foi 

diluído em 100 µL de TE, a temperatura 

ambiente, por um período de 12 a 16 

horas, e armazenado a -20°C. 

A concentração de DNA foi determinada 

pela comparação com quantidades 

conhecidas de DNA de fago 

lambda (20, 50, 100 e 200 ng/µL), após 

eletroforese em gel de 0,8% de agarose, 

corado com solução de 0,02% de 

brometo de etídio. A leitura espectrofotométrica 

da razão OD260/OD280 

foi utilizada para determinar a pureza 

das amostras frente à contaminação 

por proteínas. 

Reações RAPD 

Para reações RAPD, foram utilizados 

seis iniciadores comercializados 

pela Operon Technologies ® (OPA04, 

OPA09, OPA17, OPC06, OPF16, 

OPAN15). O coquetel da reação constou 

de tampão de PCR 1X, 3,8 mM de 

MgCl 2 , 0,4 mM de dNTPs, 0,4 µM de 

iniciadores, 1 U de Taq DNA polimerase 

e 1,5 ng/ µL de DNA. As reações de PCR 

foram desenvolvidas em termociclador 

PTC-100 (MJ Research Inc.) em um 

volume de 13 µL. O programa utilizado 

foi composto de uma etapa inicial de 

desnaturação (4 min. a 92°C), seguida 

de 35 ciclos de amplificação (45 s. a 

92°C; 45 s. a 35°C; 1 min e 15 s. a 72°C), 

e terminada com uma etapa final de 

elongação das cadeias de DNA (3 min a 

72°C). Os produtos amplificados foram 

separados por eletroforese horizontal 

submersa em tampão TBE 1X, em gel de 

1,5% de agarose, corado com solução 

de 0,02% de brometo de etídio. As 

bandas foram visualizadas sob luz ultravioleta 

e os géis fotografados com filme 

Polaroid preto e branco. 


Figura 1: Polimorfismo revelado em marcadores RAPD em A. angustifolia, entre os trinta 

indivíduos da população do Parque Ecológico Municipal de Lages, utilizando o iniciador 

OPA04. Linhas 1 a 30: indivíduos da população. M= marcador de peso molecular 1kb. 

Reações AFLP 

Sete combinações de iniciadores 

para reações AFLP foram selecionadas 

aleatoriamente no kit AFLP ® Analysis 

System I / Life Technologies ® (E- 

ACG+M-CAC, E-ACT+M-CAA, E- 

ACA+M-CTT, E-ACG+M-CAG, E- 

AAG+M-CTG, E-ACC+M-CAT e E- 

ACC+M-CAC) e as reações foram desenvolvidas 

de acordo com o protocolo de 

Vos et al. (1995), com pequenas modificações. 

Inicialmente, realizou-se a restrição 

do DNA com as enzimas EcoRI e 

MseI, durante duas horas, a 36°C. A 

ligação dos oligonucleotídeos adaptadores 

foi realizada por 2 horas, a 20°C, 

em um volume de 25 µL. Na etapa 

seguinte (pré-amplificação), o DNA foi 

amplificado com a utilização de iniciadores 

com uma base seletiva (EcoRI-A e 

MseI-C). O DNA pré-amplificado foi 

diluído em uma razão de 1:25 e amplificado 

novamente, utilizando-se iniciadores 

com três bases seletivas (EcoRI- 

ANN e MseI-CNN). As etapas de restrição 

enzimática, de ligação dos adaptadores 

e de amplificações foram realizadas 

em termociclador PTC-100 (MJ 

Research Inc.). Os produtos amplificados 

foram separados por eletroforese 

vertical em tampão TBE 1X, em gel de 

6% de poliacrilamida. As bandas foram 

visualizadas após coloração com nitrato 

de prata. 

Para a coloração, os géis foram 

fixados com solução de 0,5% de ácido 

acético + 5% de etanol, por 10 min., e 

com solução de 1% de ácido nítrico, 

por três minutos. Posteriormente, foram 

impregnados com solução de nitrato 

de prata 0,2%, durante trinta minutos. 

Após esse tempo, uma solução 

de 3% de carbonato de sódio + 0,2% de 

formaldeído foi utilizada para a revelação 

das bandas, durante o tempo necessário. 

As revelações foram finalizadas 

com a utilização de uma solução 

de 5% de ácido acético. Após cada

etapa, os géis foram lavados durante 20 

segundos com água destilada. Todos 

os tratamentos foram realizados sob 

leve agitação. Após a secagem dos géis 

em temperatura ambiente, as bandas 

foram visualizadas sob luz branca e os 

géis fotografados com máquina digital. 

Caracterização da 

Diversidade Genética e 

Capacidade Informativa 

Os índices de diversidade estimados 

foram: a similaridade genética, 

o número médio de bandas, a porcentagem 

de bandas polimórficas e a 

diversidade genética. Os padrões de 

bandas obtidos com os marcadores 

RAPD e AFLP foram analisados e para 

eles construiu-se uma matriz binária, 

que identificava sua presença ou sua 

ausência, codificadas por 1 ou 0, respectivamente. 

A partir dessa matriz 

de dados, com o auxílio do software 

NTSYS-pc 2.02 (Rohlf, 1990), foi determinado 

o índice de similaridade 

genética de Jaccard entre os indivíduos 

e pelo método de agrupamento 

UPGMA (método das médias das distâncias), 

foram gerados, separadamente 

e de maneira agrupada, os 

dendrogramas para marcadores RAPD 

e AFLP. Para determinação da diversidade 

genética, foi utilizado o índice 

de Shannon, dado pela fórmula H= - 

Σ pi ln(pi), onde pi corresponde à 

freqüência de cada alelo (Lewontin, 

Figura 2: Dendrograma de similaridade genética entre indivíduos, estimado pelo 

índice de Jaccard para a população de A. angustifolia do Parque Ecológico Municipal 

de Lages, gerado a partir de 18 marcadores RAPD (r=0,83). 

1970). Como ambos os marcadores 

apresentam característica dominante, 

considerou-se cada banda amplificada 

como sendo um loco com dois alelos, 

presente ou ausente no gel. 

Para determinar a capacidade informativa 

dos marcadores RAPD e 

AFLP, foram utilizados para a comparação 

dados gerados a partir de marcadores 

isoenzimáticos (Auler et al., 

2002) e PCR-RFLP (Schögl, 2000) provenientes 

da mesma população. Devido 

à diferente natureza dos marcadores, 

o índice de diversidade de 

Shannon foi determinado para todos 

os dados e usado como parâmetro de 

comparação. 

Resultados e Discussão: 

A partir dos seis iniciadores utilizados 

para as reações RAPD, foram 

obtidos dezoito marcadores polimórficos, 

de um total de 62 bandas 

amplificadas, com uma média de 11,16 

bandas amplificadas por iniciador. A 

média de bandas polimórficas foi de 

3,0 por iniciador, com uma porcentagem 

média de 26,9%. O índice de 

diversidade de Shannon foi igual a 0,53 

(Tabela 1). A figura 1 apresenta o 

padrão de bandas obtido com o iniciador 

OPA04, para reações RAPD. 

As sete combinações empregadas 

para as reações AFLP revelaram 62 

Tabela 

1: 

Iniciadores 

utilizado 

s nas 

reações 

RAPD 

e respectivo 

s índices 

de 

diversid 

ade 

genética 

para 

a 

população 

de 

A. 

angustifo 

lia 

do 

Parque 

Ecológico 

Municipal 

de 

Lages. 

Iniciadores 

Número 

total 

de 

bandas 

Bandas polifórmicas 

Q uantidad 

e 

% 

Índice 

de 

diversid 

ade 

( H) 

OPA4 12 0 3 

25, 0% 

0, 

58 

OPA9 13 0 2 

15, 4% 

0, 

59 

OPA17 06 0 1 

16, 7% 

0, 

58 

OPC6 09 0 3 

33, 3% 

0, 

52 

OPF16 13 0 5 

38, 5% 

0, 

56 

OPAN15 09 0 4 

44, 4% 

0, 

43 

Médias para 

marcadores 

RAPD 

11, 16 

3 , 0 

26, 9 % 

0, 

53 

Tabela 

2: 

Combinaçõ 

es 

de 

iniciadores 

utilizado 

s nas 

reações 

AFLP 

e respectivo 

s índices 

de 

diversid 

ade 

genética 

para 

a população 

de 

A. 

angustifo 

lia 

do 

Parque 

Ecológico 

Municipal 

de 

Lages. 

Iniciadores 

Número 

total 

de 

bandas 

Bandas polimórficas 

Q uantidad 

e 

% 

Índice 

de 

diversid 

ade 

( H) 

E-AGC + M-CAC 

90 4 4, 4% 

0, 

65 

E-ACT + M-CAA 

100 1 0 

10, 0% 

0, 

45 

E-ACA + M-CTT 

60 3 5, 0% 

0, 

68 

E-ACG + M-CAG 

100 2 1 

21, 0% 

0, 

55 

E-AAG + M-CTG 

80 6 7, 5% 

0, 

56 

E-ACC + M-CAT 

105 7 6, 6% 

0, 

55 

E-ACC + M-CAC 

90 1 1 

12, 2% 

0, 

50 

Médias para 

marcadores 

AFLP 

89, 3 

8 , 8 

9, 8% 

0, 

54 


marcadores polimórficos, em um total 

de 625 bandas amplificadas. A média 

de bandas totais amplificadas foi de 

89,3 e de bandas polimórficas foi de 

8,8 por combinação de iniciadores. A 

porcentagem média de bandas 

polimórficas foi de 9,8%. Para marcadores 

AFLP, o índice de diversidade 

de Shannon foi de 0,54 (Tabela 2). 

Quando os dois tipos de marcadores 

foram analisados conjuntamente, 

o total de bandas amplificadas foi 

de 687, com 80 bandas polimórficas, 

que correspondiam a 11,6%. As médias 

de bandas totais e polimórficas 

amplificadas foram de 52,8 e 6,15 por 

iniciador, respectivamente. A diversidade 

genética determinada pelo índice 

de Shannon foi de 0,54 (Tabela 3). 

Marcadores isoenzimáticos (Auler 

et al., 2002) empregados na mesma 

população acessaram uma diversidade 

genética de Shannon de H=0,29, ao 

passo que marcadores PCR-RFLP de 

DNA de cloroplastos (Schögl, 2000) 

detectaram um único haplótipo na 

população, correspondendo a uma 

diversidade virtualmente inexistente. 

Nesse caso, marcadores RAPD e AFLP 

mostraram-se altamente eficientes, detectando 

uma diversidade genética 

quase duas vezes maior (1,8 x) que 

aquela determinada por isoenzimas. 

Apesar de caracterizar-se pela análise 

da molécula de DNA da mesma 

forma que as técnicas RAPD e AFLP, a 

técnica PCR-RFLP aplicada a genomas 

de cloroplastos não possibilitou a 

detecção de diversidade nesta população. 

Já as técnicas RAPD e AFLP não 

demonstraram limitações para acessar 

a diversidade genética em populações 

altamente exploradas, como a utilizada 

nesta pesquisa. 

Quando os valores obtidos no 

presente trabalho são comparados a 

outros estudos que utilizaram as técnicas 

RAPD e AFLP, estes podem ser 

considerados baixos. Contudo, há de 

se considerar que os estudos com 

isoenzimas e PCR-RFLP utilizados como 

parâmetro para a comparação também 

apresentaram valores baixos para essa 

população, quando comparados a ou- 

tras populações de A. angustifolia analisadas 

antes. 

Por outro lado, uma criteriosa 

seleção de combinações de iniciadores 

permite que a técnica AFLP apresente 

um polimorfismo muito maior 

(Stefenon, 2003). 

A similaridade genética foi analisada 

em função dos três dendrogramas 

gerados: um, a partir dos 18 marcadores 

RAPD polimórficos (Figura 2), o 

segundo, a partir dos 62 marcadores 

AFLP polimórficos (Figura 3) e o terceiro, 

a partir dos 80 marcadores RAPD 

e AFLP polimórficos agrupados (Figu- 


Figura 3: Dendrograma de similaridade genética entre indivíduos, estimado pelo 

índice de Jaccard para a população de A. angustifolia do Parque Ecológico Municipal 

de Lages, gerado a partir de 64 marcadores AFLP (r=0,83). 

Figura 4: Dendograma de similaridade genética entre indivíduos, estimado pelo índice 

de Jaccard para a população de A. angustifolia do Parque Ecológico Municipal de Lages, 

gerado a partir de 18 marcadores RAPD e 62 marcadores AFLP agrupados (r=0,80). 

ra 4). A maior similaridade genética 

entre indivíduos foi de 86% (indivíduos 

L11 e L13), com marcadores RAPD; 

81 % (indivíduos L5 e L26), com 

marcadores AFLP e 71% (indivíduos 

L6 e L7), com o agrupamento dos dois 

tipos de marcadores. Nesse ponto, 

percebe-se que o maior número de 

marcadores permite uma maior discriminação 

entre os indivíduos analisados. 

A comparação entre os três 

dendrogramas permite ainda perceber 

que, no agrupamento dos marcadores, 

o maior número de bandas 

Tabela 

3: 

Médias 

para 

os 

índices 

de 

diversid 

ade 

genética 

estimados 

para 

a população 

de 

A. 

angustifo 

lia 

do 

Parque 

Ecológico 

Municipal 

de 

Lages, 

a partir 

de 

marcadores 

RAPD 

e AFLP. 

Marcadores 

Número 

total 

de 

bandas 

Bandas polimórficas 

Q uantidad 

e 

% 

Índice 

de 

diversid 

ade 

( H) 

Médias para 

marcadores 

RAPD 

11, 16 

3 , 0 

26, 9% 

0, 

53 

Médias para 

marcadores 

AFLP 

89, 3 

8 , 8 

9, 8% 

0, 

54 

Médias RAPD 

+ AFLP 

52, 8 

6 , 15 

11, 6% 

0, 

54

AFLP fez com que o dendrograma 

ficasse muito semelhante ao gerado 

unicamente dos marcadores AFLP. 

Utilizando-se um valor máximo 

de 50% para a similaridade genética 

entre os indivíduos, o dendrograma 

gerado a partir de marcadores RAPD 

(Figura 2) dividiu-se em doze grupos. 

A maior similaridade genética foi observada 

entre os indivíduos L11 e L13, 

com 86% de similaridade e o ponto de 

união de todos os grupos apresenta 

30,5% de similaridade. 

O dendrograma gerado de marcadores 

AFLP (Figura 3) dividiu-se em 

quinze grupos, utilizando-se 50% 

como similaridade máxima; o ponto 

de união de todos os grupos apresenta 

24% de similaridade. Com esses 

marcadores, a similaridade genética 

entre pares de indivíduos variou de 

24% a 81%. 

Deve-se considerar que existe uma 

relação entre o número dado a cada 

planta e sua proximidade geográfica, 

sendo mais próximos geograficamente 

os indivíduos cujos números são mais 

próximos. Dessa forma, pode-se observar 

que os argumentos de plantas 

são aleatórios, formados por indivíduos 

dispersos pelo Parque, em uma área 

de 2,34 km 2 . Esse dado sugere que 

indivíduos geograficamente, os quais 

podem ser aparentados, não apresentam 

grande similaridade genética. 

Considerações Finais 

Um aspecto importante a ser considerado 

é que a A. angustifolia provavelmente 

possuía uma grande diversidade 

genética antes da exploração ocorrida 

durante o ciclo da madeira no sul 

do Brasil (Auler et al., 2002). 

Dessa forma, antes de qualquer 

previsão de melhoramento genético é 

essencial conhecer a diversidade genética 

existente nas populações remanescentes, 

para possibilitar a seleção 

de plantas e sementes a serem utilizadas, 

tanto para a produção de mudas, 

quanto para cruzamentos controlados. 

A exemplo do ocorrido no Parque 

Ecológico Municipal de Lages, 

durante o ciclo da madeira, a seleção 

promovida pelo homem até o momento, 

foi a retirada dos melhores 

fenótipos, em detrimento dos demais. 

Devido ao acesso aleatório a amplas 

regiões genômicas praticamente 

livres da ação da seleção natural, as 

técnicas RAPD e AFLP geram um gran- 

de número de marcadores virtualmente 

neutros. Neste caso, dos resultados 

obtidos no presente trabalho, 

pode-se concluir que essas técnicas 

apresentam-se como poderosas ferramentas 

para a caracterização da diversidade 

genética dos remanescentes de 

A. angustifolia, com vistas ao melhoramento 

genético da espécie. 


Ao CNPq, UNIPLAC e FUNCITEC 

pelo apoio financeiro e à Prefeitura 

do Município de Lages, pelo apoio na 

obtenção do material vegetal. 


AULER, N.M.F.; REIS, M.S.; GUERRA, 

M.P.; NODARI, R.O. The genetics 

conservation of Araucaria 

angustifolia: I: genetic structure 

and diversity of natural 

populations by means of nonadaptative 

variation in the state 

of Santa Catarina, Brazil. Genetics 

and Molecular Biology, 25 

(3):329-338, 2002. 

GUERRA, M.P.; SILVEIRA, V.; REIS, 

M.S.; SCHNEIDER, L. Exploração, 

manejo e conservação da araucária 

(Araucaria angustifolia). in: 

SIMÕES, L.L.; LINO, C.F. Sustentável 

Mata Atlântica: a exploração 

de seus recursos florestais. 

São Paulo: Ed. SENAC São Paulo, 

2002. p.85-101. 

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ameaçada de extinção. Disponível 

em acessado em 21/ 

06/02 

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progênies de uma população de 

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uma população de Araucaria 

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Águas de Lindóia, Brasil, cdrom, 

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REITZ, R.; KLEIN, R.M. Araucariáceas. 

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ROHLF, F. J. 1990. NTSYS-PC: Numerical 

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SCHLÖGL, P.S. Análise da diversidade 

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Florianópolis, 2000. [Dissertação 

de Mestrado, Universidade Federal 

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SHIMIZU, J.Y.; HIGAS, A.R. Variação 

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STEFENON, V.M. Adaptação e otimização 

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angustifolia. Florianópolis, 2003. 

[Dissertação de Mestrado, Universidade 

Federal de Santa Catarina] 

VOS, P.; HOGERS, R.; BLEEKER, M.; 

REIJANS, M.; VANDELEE, T.; 

HORNES, M.; FRIJTERS, A.; POT, J.; 

PELEMAN, J.; KUIPER, M.; ZABEAU, 

M. AFLP: a new technique for DNA 

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Research, 23:4407-4414, 1995. 

WELSH, J.; MCCLELLAND, M. 

Fingerprinting genomes using PCR 

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Acids Research, 18(24):7213- 

7218, 1990. 

WILLIAMS, J. G. K.; KUBELIK, A. R.; 

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amplified by arbitrary primers are 

useful as genetic markers. Nucleic 

Acids Research, 18(22):6531- 

6535, 1990. 


Pesquisa 

Monita Fiori de Abreu 

Acadêmica do curso de Agronomia, 

Bolsista PIBIC/BIP/CNPq - Laboratório de 

Morfogênese e Bioquímica Vegetal - CCA/UFSC. 

monitaf@yahoo.com 

Enio Luiz Pedrotti 

Ph.D., Prof. Adjunto IV , Departamento de 

Fitotecnia - Laboratório de Morfogênese e 

Bioquímica Vegetal -CCA/UFSC. 

pedrotti@cca.ufsc.br 


Micropropagação 

de Macieira 

Introdução 

A cultura da macieira possui papel 

de destaque no cenário frutícola 

brasileiro. Atualmente, a área cultivada 

no Brasil está estimada em 30 mil 

hectares, com uma produção aproximada 

de 967 mil toneladas (ABPM, 

2003). Visando atender às demandas 

de mudas da pomicultura nacional, 

faz-se necessária a aplicação de métodos 

eficientes para garantir grande 

quantidade de material vegetal de alta 

qualidade genética e fitossanitária. 

A produção de mudas da macieira 

tradicionalmente é efetuada através 

de técnicas de propagação vegetativa, 

como a enxertia de cultivares 

copa sobre um porta-enxerto. Tradicionalmente 

a muda é obtida através 

de mergulhia de cepa (Driessen & 

Souza Filho, 1986). Porém, esse método 

restringe o número de mudas 

obtidas, requer muito tempo, além 

de poder resultar em mudas de baixa 

qualidade fitossanitária. 

Diante da problemática relacionada 

às técnicas convencionais de 

propagação, a biotecnologia através 

do aperfeiçoamento das técnicas de 

cultivo in vitro, tem sido uma excelente 

opção para a multiplicação desta 

frutífera (Figura 1). Possibilita a 

produção de mudas de alta qualidade 

sanitária oriundas da cultura de 

meristemas livres de vírus, evitando, 

desta forma, os problemas de disseminação 

de vírus e outros patógenos 

durante a fase de propagação. 

Diversos trabalhos vêm sendo 

conduzidos no Laboratório de 

Morfogênese e Bioquímica Vegetal 

(CCA/UFSC) a partir de projetos fi- 


Avanços nos protocolos de micropropagação 

nanciados pelo CNPq e FINEP. As 

principais linhas de pesquisa foram 

no sentido de desenvolver metodologias 

que abrangem desde o isolamento 

e inoculação in vitro de 

meristemas, até a aclimatização das 

plantas micropropagadas. 

Metodologia 

1 - Isolamento e Inoculação 

in vitro 

A introdução e o estabelecimento 

de meristemas in vitro é uma 

das fases mais delicadas da micropropagação. 

O isolamento de 

meristemas é um processo oneroso 

(Nunes et al., 1999) mas é primordial, 

pois é uma condição que garante 

a produção de brotações livres de 

patógenos. A oxidação e a contaminação 

provocam grandes perdas do 

material. Os meristemas extraídos 

das gemas apicais apresentam taxas 

de oxidação acima de 40%. A percentagem 

de contaminação é constatada 

em cerca de 35% dos 

explantes. Num trabalho conduzido 

com o porta-enxerto M.9, todos os 

tubos de ensaio com meio de cultura 

contaminado apresentaram oxidação 

(Tabela 1). Os agentes contaminantes 

como fungos e bactérias liberam 

compostos que causam a oxidação. 

O estabelecimento in vitro é 

executado segundo metodologias 

consideradas clássicas para esta fase 

(Pedrotti, 1993; Nunes et al. 1999). 

As gemas são extraídas com o auxílio 

de um bisturi e estas, são submetidas 

à lavagem com água destilada/ 

autoclavada e detergente Tween

Tabela 

1. 

Contaminação, 

oxidação, 

números 

de 

gemas 

e brotos 

e 

percentual de 

calos 

no 

porta-enxerto 

de 

macieira 

'M-9' 

( Malus 

p umilla 

M. 

) , a partir 

da 

cultura 

de 

meristemas 

e gemas 

axilares. 

Parâmetro 

s Analisados 

Meristemas Tratamen 

tos 

G emas 

CV 

( % ) 

Conta mina 

ção 

( % ) 

38, 6 a 32, 2 a 14, 

1 

Oxidaç ão 

( % ) 

42, 3 b 58, 4 a 12, 

5 

Nº médi 

o de 

gema 

s por 

brot 

o 3, 0 b 5, 0a 

12, 

6 

Nº médi 

o de 

brot 

os 

form 

ados 

3, 0 a 4, 0 a 9, 

6 

Calos ( % ) 

62, 3 a 12, 4 b 14, 

1 

Figura 1: Frascos do cultivo in vitro de macieira 

20®por 20 minutos. Em seguida, as 

gemas são imersas em solução de 

Anfotericina B®(25 mg.L -1 ) por 10 

minutos. Em câmara de fluxo laminar, 

as gemas são imersas em etanol 70% 

por 1 minuto, seguida de solução de 

hipoclorito de sódio 4%, por 10 minutos. 

Durante este processo os frascos 

são mantidos sob agitação contínua. 

Posteriormente, faz-se uma 

tríplice lavagem com água destilada/autoclavada 

e as gemas permanecem 

em uma solução de ácido 

ascórbico 15% por 10 minutos até 

serem inoculadas em sais e vitaminas 

de MS (Murashige e Skoog, 1962), 

sacarose (30 g.L -1 ), ágar (6 g.L -1 ) sem 

suplementação de fitorreguladores 

(Souza et al.,2003). 

As gemas axilares introduzidas 

in vitro têm apresentado oxidação 

acima de 50%, enquanto que os meios 

de cultura contaminados com fungos 

e bactérias são normalmente acima 

de 30% (Tabela 1). Da mesma 

forma, todos os tubos contendo meio 

de cultura contaminados apresentaram 

oxidação. Quando os explantes 

não apresentam oxidação nem contaminação, 

são transferidos de tubos 

de ensaio com novos meios de cultura 

para eliminar resíduos fenólicos 

liberados pelas plantas no meio de 

cultura inicial (Zanol, 1996). Nos tra- 

balhos conduzidos no laboratório, 

após a transferência dos meristemas 

provenientes de gemas apicais e segmentos 

nodais com gemas axilares, 

não ocorrem mais problemas de contaminação 

nem oxidação. 

O crescimento e desenvolvimento 

dos meristemas e gemas axilares 

são normalmente lentos até 30 dias 

após a inoculação, não sendo observado 

o crescimento de brotações. 

Aos 60 dias, é possível observar o 

desenvolvimento de brotações. Para 

o porta-enxerto M.9, os meristemas e 

gemas axilares introduzidos in vitro, 

formam um número médio de 3 e 5 

gemas por broto, respectivamente 

(Tabela 1). 

As diferenças observadas na introdução 

in vitro e multiplicação podem 

ser consequência do estado fisiológico 

das plantas matrizes, onde 

foram coletados os explantes como 

salientaram Grattapaglia & Machado 

(1990). Quando material vegetal coletado 

é retirado das matrizes no final 

do verão, possivelmente, as gemas já 

iniciam o processo de entrada em 

dormência, o que diminui a sobrevivência 

dos meristemas e gemas introduzidos 

in vitro. Desta forma, a época 

mais interessante para a introdução 

in vitro é aquela que corresponde 

a um intenso crescimento 

vegetativo nas condições naturais. 

2 - Multiplicação do 

material vegetal 

A composição salina mais utilizada 

nos meios de cultura é a MS 

(Murashige & Skoog, 1962), geralmente 

suplementada com reguladores 

de crescimento que permitem 

direcionar as respostas morfogenéticas 

(George, 1996). Para a 

fase de multiplicação in vitro da 

macieira, Ribas & Zanette (1992) 

Tabela 

2. 

Efeito 

de 

diferentes 

concentraçõ 

es 

de 

BAP 

em 

meio 

de 

cultura 

MS 

sobre 

a resposta 

de 

na 

fase 

de multiplicação 

i n vitro 

de macieira 

( M alus 

platycarpa) 

após 

45 

dias 

de 

cultura. 

Concentraç 

ão 

de 

BAP 

Nº 

de 

brotações 

por 

explante 

Altura 

das 

brotações 

( cm) 

Comprimento 

dos 

entrenós 

( cm) 

Vitrificação 

( % ) 

0, 00 

µ M 

1, 0 c 

2, 3 a 

0, 59 

b 

42, 

0 a 

1, 11 

µ M 

2, 0 b 

2, 6 a 

0, 59 

b 

18, 

0 c 

2, 22 

µ M 

3, 0 a 

2, 6 a 

0, 54 

c 

18, 

0 c 

4, 44 

µ M 

2, 0 b 

2, 9 a 

0, 65 

a 

24, 

0 b 

CV ( % ) 

14, 2 

15, 3 

13, 3 

18, 

9 

Médias 

seguid 

as 

de 

mesm 

a letra 

na 

verti 

cal 

não 

difere 

m signi 

ficati 

vament 

e entre 

si, 

ao 

nível 

de 

5% 

de 

prob 

abilid 

ade, 

pelo 

teste 

de 

Duncan. 


utilizaram o meio MS suplementado 

com 1,0 mg.L -1 de BAP e 1,0 

mg.L -1 de tiamina, e Modgil et al. 

(1999) obtiveram a maior taxa de 

multiplicação de brotações da cultivar 

Tydeman´s Early Worcester adicionando 

ao meio de cultura 4,4 µM 

de BAP e 5,0 µM de KIN. Para o 

porta-enxerto Marubakaido Nunes 

et al. (1999) utilizaram concentrações 

de BAP entre 1,11 e 4,44 µM. 

Quando se pretende estudar o 

comportamento de um novo genótipo, 

os explantes são repicados para tubos 

de ensaio (2,5 x 15,0 cm) contendo 15 

mL de sais e vitaminas de MS, suplementado 

com diferentes concentrações 

de benzilaminopurina (BAP) (0; 

0,25; 0,50 e 1.0 mg.L -1 ), 30,0g.L -1 de 

sacarose, 6,0 g.L -1 de ágar. Para um 

genótipo usado com planta indicadora 

de viroses, é possível verificar que as 

concentrações de BAP influenciam sua 

resposta in vitro (Tabela 2). O material 

é mantido no escuro por 48 horas, após 

este período, é transferido para a sala 

de crescimento sob fotoperíodo de 16 

horas e temperatura de 25 ± 2°C e 40 

µmol.m -2 .s -1 de radiação luminosa, 

fornecidas por lâmpadas fluorescentes 

Phillips® Super 84. 

3 - Microenxertia 

Tendo em vista as características 

da cultura, a associação das técnicas 

de micropropagação e microenxertia 

permite combinar as vantagens da 

rápida multiplicação in vitro, com a 

união de dois genótipos diferentes: 

um clone copa, selecionado para 

produzir frutos de alta qualidade, e 

um clone de porta-enxerto, que confere 

à cultivar copa características 

relevantes, como: vigor, produtividade, 

qualidade de frutos, resistência a 

fatores adversos como a patógenos 

do solo, além de realizar funções 

básicas de suporte da planta, fornecimento 

de água e nutrientes e a adaptação 

às condições de solo, clima e 

doenças. 

A micronexertia foi inicialmente 

desenvolvida por Murashige et al. 

(1972) e posteriormente melhorada 

por Navarro et al.(1975), buscando a 

produção de citrus livres de viroses. 

Esta técnica permite a obtenção de 

plantas livres de patógenos, aplica- 

Figura 2: Fenda do microenxerto de macieira., 

início de brotação na copa, 30 dias após 

a microenxertia. 

ção de quarentena em espécies vegetais 

cuja disponibilidade seja de 

apenas algumas gemas vegetativas, 

separação entre viroses e outras doenças, 

além de estudos fisiológicos, 

histológicos e histoquímicos nas 

enxertias. Porem ainda é um desafio 

promover com sucesso a enxertia de 

um material tão pequeno e frágil 

como aquele proveniente de plantas 

produzidas in vitro. (Obeidy & Smith, 

1991). Para garantir a viabilidade do 

microenxerto é necessário que as 

células da base do microenxerto da 

cultivar copa, entrem novamente em 

divisão, pois são diferenciadas, ou 

seja, já deixaram o ciclo celular e 

não sofrem mais desdiferenciação. 

Na retomada do ciclo celular é possível 

induzir novas competências e 

diferenciar para estabelecer os tecidos 

estruturais e condutores (Taiz & 

Zeiger, 1991). O estabelecimento de 

novos tecidos condutores é o resultado 

do sucesso do método. 

Nos trabalhos desenvolvidos no 

Laboratório de Morfogênese e Bioquímica 

Vegetal, como modelo, foram 

utilizados dois porta-enxertos 

(M9 e Marubakaido) e uma cultivar 

copa (Gala) de macieira. O portaenxerto 

M9 (Malus pumila Mill.) é o 

mais utilizado no sul do Brasil, tendo 

como característica principal diminuir 

o vigor da planta. Além de redu- 


Figura 3: Detalhes dos pontos de conexão 

observados no corte histológico do microenxerto 

de macieira, 90 dias após a microenxertia. 

zir o porte da planta, o M9 aumenta 

a precocidade e é um dos poucos 

porta-enxertos que apresenta boa 

resistência à podridão do colo 

(Phytophthora cactorum) (Barrit, 

1999). O porta-enxerto Marubakaido 

(Malus prunifolia Borkh.) é de origem 

japonesa, sendo bastante utilizado 

como porta-enxerto comercial 

no Japão, Europa bem como no Brasil 

(Bessho et al., 1993). É vigoroso, 

apresenta resistência à podridão-docolo, 

relativa resistência a Rosellinia 

sp. e é muito sensível a viroses 

(Denardi, 1986). A culitvar copa Gala 

(Malus domestica Borkh.) é a primeira 

em volume de produção no Brasil, 

apresenta frutificação precoce, alta 

produtividade e boa adaptação a altitudes 

superiores a 1000m (Denardi, 

1986). 

4 - Estudos histológicos 

A microenxertia é realizada em 

fenda simples conforme a metodologia 

proposta por Hartmann et al. 

(1990). Em câmara de fluxo laminar, 

a parte apical das plântulas dos 

porta-enxertos é retirada e a altura 

das plantas uniformizada em 5 cm 

de altura. Para a variedade copa 

Gala sãopreparados microgarfos 

com uma única gema lateral. Através 

de um corte em fenda simples

Tabela 

3. 

Número 

e comprimento 

de 

raízes 

em 

plantas 

micropropagad 

as 

dos 

porta-enxertos 

de 

macieira 

M. 

7, 

M. 

9 e Marubakaido, 

submetidos 

a diferentes 

concentraçõ 

es 

e formas 

de 

aplicação 

de 

Ácido 

Indolbutírico 

( AIB) 

e ao 

crescimento 

das 

raízes 

em 

diferentes 

substrato 

s. 

N úmero 

de 

raízes 

Comprimento 

das 

raízes 

( cm) 

T ratamento 

s " M. 

7" 

" M. 

9" 

" Marubakaido" 

" M. 

7" 

" M. 

9" 

" Marubakaido" 

1 4, 0 ± 1, 

0 c 5, 0 ± 1, 

0 a 10, 0 ± 2, 

0 a 1, 7 ± 0, 

1 b 2, 7 ± 0, 

5 a 1, 

8 ± 0, 

4 b 

2 6, 0 ± 0, 

5 b 3, 0 ± 1, 

0 b 3, 0 ± 1, 

0 b 1, 9 ± 0, 

1 ab 

0, 5 ± 0, 

2 c 0, 

5 ± 0, 

3 c 

3 8, 0 ± 1, 

0 a 0, 0 ± 0, 

0 c 2, 0 ± 0, 

5 c 2, 2 ± 0, 

2 a 0, 0 ± 0, 

0 d 0, 

4 ± 0, 

3 c 

4 9, 0 ± 1, 

0 a 5, 0 ± 1, 

0 a 13, 0 ± 2, 

0 a 2, 2 ± 0. 

2 a 1, 6 ± 0, 

2 b 3, 

4 ± 0, 

5 a 

Médias 

na 

coluna 

seguid 

as 

da 

mesm 

a letra 

não 

difere 

m estat 

isti 

camen 

te 

entre 

si, 

ao 

nível 

de 

5 % de 

prob 

abilid 

ade, 

pelo 

teste 

de 

Tukey. 

Trata 

ment 

os: 

1 - Induçã 

o in vitro 

em 1. 

5 µ M de 

AIB 

em 

ágar 

e cres 

cime 

nto 

das 

raíz 

es 

i n vitro 

em 

ágar; 

2 - Induçã 

o in vitro 

em 1. 

5 µ M de 

AIB 

em 

ágar 

e cres 

cime 

nto 

das 

raíz 

es 

i n vitro 

em 

subst 

rato 

mine 

ral; 

3 - Induçã 

o in vitro 

com 0, 

49 

M de 

AIB 

e cres 

cime 

nto 

i n vitro 

em 

subst 

rato 

mine 

ral; 

4 - Induçã 

o ex vitro 

com 

0, 

49 

M de 

AIB 

e cres 

cime 

nto 

das 

raíz 

es 

em 

subst 

rato 

mine 

ral 

conco 

mita 

nte 

com 

a fase 

de 

aclima 

tizaçã 

o. 

Tabela 

4. 

Enraizamen 

to, 

número 

e comprimento 

de 

raízes 

de 

microestacas 

do 

porta-enxerto 

de 

macieira M. 

9 ( Malus pumila) 

, tratadas 

com 

AIB 

e submetidas 

ao 

enraizamen 

to 

ex vitro, 

em 

substrato 

de 

casca 

de 

arroz 

carbonizad 

a e vermiculita 

1: 

1 ( v/ 

v) 

, por 

um 

período 

de 

30 

dias. 

A IB( 

mg/ 

L) 

Enraizamen to( 

% ) 

N úmero 

deraízes 

Comprimento 

das 

raízes 

( cm) 

0 64 b 

3, 5 b 

3, 

5 a 

500 82 a 

6, 0 a 

4, 

1 a 

1000 84 a 

6, 0 a 

4, 

5 a 

1500 30 c 

7, 5 a 

4, 

7 a 

* Médias 

seguid 

as 

de 

mesm 

as 

letra 

s nas 

coluna 

s não 

difere 

m signi 

ficati 

vament 

e pelo 

teste 

de 

Duncan 

a 5% 

. 

ns 

- não 

signi 

ficati 

vo. 

realizado nas plântulas dos portaenxertos, 

e um corte em bisel no 

minigarfo da cultivar copa, é realizada 

a enxertia com o auxílio de 

duas pinças. Os microenxertos são 

então inoculados em frascos com 

meio de cultura MS (Murashige & 

Skoog, 1962) e transferidos para a 

sala de crescimento, com temperatura 

de 25±2ºC, fotoperíodo de 16 

horas e luminosidade de 40 µmol.m - 

2 .s -1 , onde permanecem até as coletas 

dos segmentos. Para os estudos 

histológicos, de ambas as combinações 

enxerto-porta-enxerto, Gala sobre 

Marubakaido e Gala sobre M9, 

são realizadas 120 microenxertias, 

o que diminuem os erros experimentais. 

O material vegetal coletado 

é fixado em glutaraldeído 2,5% 

em tampão fosfato de sódio 0,1M – 

pH7,2, desidratado em série etílica 

e emblocado em parafina (Johansen, 

1940). Os cortes são corados com 

azul de toluidina e montados, entre 

lâmina e lamínula, com bálsamo do 

Canadá. A análise dos cortes 

histológicos é feita em microscopia 

óptica e em lupa, 30 e 90 dias após 

a microenxertia (Figuras 2 e 3). A 

conexão dos microenxertos é 

vizualizada a partir de duas etapas. 

O primeiro momento se dá em poucos 

dias e é caracterizado pela morte 

de camadas celulares da interface 

do enxerto e pela formação de células 

parenquimáticas que preenchem 

o ponto de enxertia, resultando 

no desenvolvimento de uma 

camada necrótica na fenda. Na segunda 

etapa, ocorre a proliferação 

de um calo em associação com a 

região vascular da copa e do portaenxerto, 

formando uma ponte na 

interface do enxerto. Posteriormente, 

há a diferenciação de algumas 

células do calo em novas células 

cambiais. Ocorre, então, a união 

entre os tecidos afins da copa e do 

porta-enxerto resultando no estabelecimento 

de uma conexão cambial 

contínua. Na última fase, a 

continuidade da epiderme no ponto 

de enxertia é restaurada. O posterior 

desenvolvimento da copa pelo 

alongamento e desenvolvimento de 

brotações caracteriza o sucesso da 

microenxertia, observado em até 

30 dias em macieira (Abreu et al., 

2003). 

5 - Enraizamento de 

plantas micropropagadas 

O enraizamento de microestacas 

é considerado por vários autores 

um dos estágios mais críticos do 

processo de propagação massal de 

plantas perenes (Wang, 1991), pois 

depende do genótipo e de sua condição 

fisiológica no momento da 

indução ao enraizamento (Martins & 

Pedrotti, 2001). A emissão de raízes 

por uma microestaca pode ser dividida 

em três fases, que compreendem 

a desdiferenciação celular, a indução 

e a organização dos primórdios 

radiculares (Hartmann et al., 1997; 

Blakesley et al., 1991). Na maioria 

dos protocolos estabelecidos para a 

micropropagação de plantas, o enraizamento 

é induzido in vitro, utilizando 

meios de cultura contendo uma 

auxina (Harbage & Stimart, 1996; 

Deklerk et al., 1997; Ferri et al., 1998). 

Para a maioria das espécies, a auxina 

é necessária na fase de indução das 

raízes enquanto que, na fase de diferenciação 

dos primórdios e no crescimento 

das raízes, a presença de 

auxinas no meio de cultura pode 


inibir o processo (Deklerk et al.,1995). 

A concentração de auxina a ser adicionada 

ao meio de cultura para o 

estágio de indução, depende da concentração 

endógena deste hormônio 

em cada genótipo utilizado (Blakesley 

et al., 1991), sendo que altas concentrações, 

por períodos de exposição 

prolongados, podem determinar a 

formação de calos na base das microestacas. 

Para Pasqual & Ishida (1992), 

o melhor enraizamento in vitro foi 

obtido em meio MS, geleificado, contendo 

1 mg/L de AIB. 

As condições de temperatura, a 

luminosidade da câmara de crescimento 

e a disponibilidade de oxigênio 

junto à base das microestacas, 

além de fatores anatômicos inerentes 

ao genótipo, podem inibir a evolução 

do processo morfogenético induzido 

pelas auxinas. Apesar de 

Harbage & Stimart (1996), Deklerk et 

al. (1997) e outros autores utilizarem 

o processo de indução e crescimento 

das raízes in vitro, McClelland et al. 

(1990) ressaltam que as raízes produzidas 

in vitro não são funcionais quando 

transferidas para a fase de aclimatização. 

Para garantir a sobrevivência 

nesse estágio, é necessário que a 

planta produza novas raízes, o que 

demanda um grande consumo de 

reservas que deveriam ser utilizadas 

para o crescimento da parte aérea. 

Além disto, Debergh & Maene (1981) 

salientam a necessidade de desenvolver 

sistemas de indução que permitam 

a produção de raízes funcionais 

para o processo de aclimatização 

e para o aumento da qualidade 

das plântulas. 

5.1 - Enraizamento in vitro 

Os resultados obtidos com a 

indução in vitro de raízes em portaenxertos 

de macieira, mostraram diferenças 

em relação aos parâmetros 

avaliados, em função do genótipo e 

da concentração e forma de aplicação 

da auxina (Martins & Pedrotti, 

2001). (Tabela 3). Resultados semelhantes 

foram obtidos com macieira 

por Harbage et al. (1998), os quais 

concluíram que a capacidade de emitir 

raízes e de estabelecer um sistema 

radicular, é uma condição intrínseca 

de cada genótipo 

No caso do porta-enxerto M.7, o 

enraizamento realizado in vitro em 

ágar apresentou resultados inferiores 

quanto ao número de raízes. Provavelmente 

as concentrações de AIB utilizadas 

não possibilitaram a indução do 

mesmo número de raízes que foi observado 

para o ‘Marubakaido’, já que as 

respostas são dependentes do genótipo 

(Blakesley et al., 1991). É possível que, 

para este porta-enxerto, o pH do meio 

de cultura não tenha favorecido a absorção 

de auxinas pelas células da 

base da microestaca, tendo em vista 

que a penetração de auxinas nas células 

depende do equilíbrio entre ácidos 

livres e formas aniônicas, que são 

dependentes do pH (Harbage et al., 

1998). O maior número de raízes obtido 

para as microestacas do ‘M.9’ e do 

‘Marubakaido (Tabela 4), induzidas ex 

vitro com o AIB dissolvido em água e 

transferidas diretamente para o substrato 

mineral para a aclimatização, reforça 

as conclusões emitidas por Rogers 

& Smith, (1992). Estes autores aumentaram 

a eficiência no enraizamento de 

roseiras quando utilizaram substratos 

minerais para o crescimento das raízes, 

comparados com meios de cultura 

geleificados. Estes resultados abrem 

perspectivas concretas para o uso de 

substratos porosos para o enraizamento 

in vitro, o que diminui os custos de 

produção de plantas micropropagadas. 

Com esta metodologia é possível 

substituir os meios de cultura contendo 

ágar por substratos minerais, o que 

diminui custos e produz raízes de 

melhor qualidade do que as produzidas 

in vitro. 

Figura 4 : Crescimento de raízes em 

porta-enxertos de macieira, após indução 

ao enraizamento 


5.2 - Enraizamento ex vitro 

Em função dos custos da fase de 

enraizamento e aclimatização das 

plantas micropropagadas, uma série 

de trabalhos foram conduzidos no 

Laboratório de Morfogênese e Bioquímica 

Vegetal (Pedrotti & Voltolini, 

2001). Os principais objetivos foram 

de induzir o enraizamento ex vitro 

em substratos porosos que servem 

apenas de suporte para as plântulas 

como acontece na estaquia tradicionalmente 

usada para a propagação 

de várias espéceis. Para isto, são 

utilizadas miniestacas do porta-enxerto 

M.9, de 2 a 2,5 cm de comprimento, 

com dois pares de folhas, 

preparadas a partir de brotações micropropagadas. 

A indução ao enraizamento 

é efetuada submergindo 

10mm da base das miniestacas durante 

10 segundos em diferentes concentrações 

de ácido indolbutírico (0, 

500, 1000, ou 1500 mg/L ). Em seguida, 

as miniestacas são transferidas 

para bandejas alveoladas contendo o 

substrato terra roxa e casca de arroz 

carbonizada 1:1 (v/v.). As bandejas 

são então colocadas dentro de caixas 

plásticas com uma lâmina de água de 

5 mm para manter a umidade relativa 

elevada. As caixas são cobertas com 

uma lâmina de vidro, conforme metodologia 

descrita por Pedrotti (1993). 

Durante 30 dias essas caixas são 

mantidas em câmara de aclimatização 

com temperatura de 27±2 °C, 

fotoperíodo de 16 horas com intensidade 

luminosa de 30 µmol.m -2 .s -1 . 

Após esse período, as plantas são 

avaliadas quanto ao percentual de 

enraizamento, número e comprimento 

das raízes emitidas. 

As maiores percentagens de enraizamento 

com 82 e 84 % são observadas 

nas miniestacas tratadas com 

500 e 1000 mg/L de AIB, respectivamente 

O menor percentual de enraizamento 

(29,6%) é obtido com 1500 

mg/L de AIB. As microestacas-controle 

produzem em média 3,4 raízes. 

Estes valores são inferiores 

àqueles observados nos tratamentos 

com AIB. Para os níveis de AIB de 

500, 1000 e 1500 mg/L, o resultado é 

a produção de 5,6 a 7,6 raízes respectivamente, 

não diferindo estatisticamente 

entre si.

Considerando que o porta-enxerto 

M.9 é de difícil enraizamento 

é possível sugerir que o mesmo 

necessite de níveis maiores de 

auxinas ou outros coofatores para 

aumentar o enraizamento, já que 

James & Thurnbon (1981) só obtiveram 

45% de enraizamento com 

este porta-enxerto quando adicionaram 

fluoroglucinol no meio de 

cultura. Possivelmente as condições 

de indução in vitro, utilizadas por 

estes autores dificultaram a absorção 

da auxina, como constatado 

por Harbage et al. (1998). Além 

disto, a intensidade luminosa da 

câmara de crescimento pode ter 

contribuído para inativar parte da 

auxina aplicada. Khosh-khui & Sink 

(1982) obtiveram aumento no enraizamento 

de roseira com o 

sombreamento da base das estacas. 

Valores mais elevados no enraizamento 

de pereira (Wang, 1991) e 

em macieira (Fortes & Leite,1993) 

foram obtidos com a manutenção 

das plantas no escuro. A maior porosidade 

e aeração dos substratos 

utilizados também podem favorecer 

a indução e o crescimento de 

raízes, como foi observado por Jay- 

Allemand et al. (1992). 

Os níveis de AIB superiores a 

500 mg/L não aumentam a percentagem 

de enraizamento do porta-enxerto 

M.9. Estes resultados podem 

estar relacionados com os teores 

endógenos de auxinas produzidas 

por gemas e folhas jovens, como 

sugerem Hartmann et al. (1997), pois 

mesmo sem aplicação de AIB, as 

percentagens de enraizamento do 

porta-enxerto M.9 foram de 63,5 %. 

A exposição das miniestacas ao AIB 

por 10 segundos é suficiente para a 

indução de primórdios radiculares e 

o desenvolvimento e crescimento 

posteriores das raízes (Figura 4). 

Jarvis et al. (1983) observaram um 

aumento na síntese de RNA 20 horas 

após a aplicação de auxina o que 

corresponde às primeiras divisões 

celulares. 

6 - Aclimatização 

Durante a fase de aclimatização, 

as plantas micropropagadas devem 

se adaptar a um ambiente completamente 

diferente das condições em 

que ela foi produzida in vitro. Durante 

este período a planta deve compor 

uma estrutura anatômica e fisiológica 

capaz de suportar as condições de 

alta demanda evaporativa da atmosfera 

e de alta radiação luminosa. 

Quando transferidas para condições 

ex vitro, as mudas normalmente apresentam 

altas taxas de transpiração, 

em função da alta condutividade hidráulica 

de suas folhas e a funcionalidade 

dos estômatos (Brainerd & 

Fuchigami, 1981; Schakel et al., 1990), 

o que, na maioria das situações, provoca 

elevado déficit hídrico, podendo 

provocar a morte das mudas (Díaz- 

Pérez et al., 1995). 

Apesar dos avanços nos protocolos 

de multiplicação in vitro, poucos 

trabalhos foram realizados no sentido 

de elucidar problemas ligados à aclimatização 

das plantas (Avanzato & 

Cherubini, 1993). Para Ziv (1995), a 

aclimatização pode comprometer o 

processo de micropropagação por envolver 

a neoformação de um sistema 

radicular e a passagem para condições 

de cultivo ex vitro. 

Durante a fase de multiplicação 

das brotações in vitro, os estômatos 

apresentam-se com formas e estruturas 

anormais (Blanke & Belcher, 

1989) e a densidade pode ser diferente 

das folhas de plantas cultivadas 

ex vitro (Cappelades et al., 1990; 

Sciutti & Morini, 1993). Para diver- 

Figura 5.: Desenho esquemático da metodologia de aclimatização de plantas micropropagadas (Pedrotti, 1993). 

A e B: Indução ao enraizamento in vitro. 

C: Indução ao enraizamento ex vitro. 

D: Início do processo de aclimatização. 

E: Plantas sendo mantidas em sala com nebulização. 

F: Fotoperíodo sendo mantido em 16 horas de luz para evitar a entrada em dormência. 

G e H: Plantas transferidas à campo para completar o crescimento. 


Figura 6: Crescimento e desenvolvimento de mudas de macieira após aclimatização. 

sos autores, (Pospisilova et al., 1997), 

os estômatos in vitro não são funcionais, 

permanecem contentemente 

abertos ou fechados e são insensíveis 

aos estímulos habituais de escuro, 

alta concentração de CO 2 , ABA 

e potencial hídrico. Desta forma, a 

grande transpiração pode causar dificuldades 

durante o processo de 

aclimatização. 

A metodologia recomendada 

por Pedrotti (1993) (Figura 5) e 

utilizada no LMBV por Pedrotti & 

Voltolini (2001), possibilitou bons 

resultados para vários genótipos de 

macieira. Neste processo, as plantas 

são induzidas ao enraizamento 

ex vitro e transferidas para bandejas 

alveoladas. 

As bandejas são colocadas em 

caixas plásticas cobertas com uma 

placa de vidro transparente. Esta 

condição, permite a manutenção da 

umidade relativa em 100%. Com 

esta metodologia, a sobrevivência 

das plantas situa-se entre 70 e 95% 

(Tabela 5). No que concerne à matéria 

seca produzida pelas raízes e 

parte aérea das plantas, os maiores 

valores são obtidos quando as plantas 

receberam 1000 mg/L de AIB na 

fase de indução ao enraizamento. A 

aclimatização pode ser efetuada em 

câmaras de nebulização que mantém 

alta umidade relativa, o que 

diminuem as possibilidades de desidratação 

e morte das plantas. Neste 

sentido, Maciel et al. (2002) 

demostraram que é possível obter 

altos índices de sobrevivência de 

plantas do porta-enxerto M.7. Neste 

processo, as bandejas são transferidas 

para diretamente para a câmara 

de nebulização. Aos 30 dias 

após a transferência ex vitro, a percentagem 

de enraizamento é maior 

nas mudas que foram aclimatizadas 

no substrato composto por casca de 

arroz carbonizada, já que esta aumenta 

o espaço poroso como foi 

observado por Lê & Collet (1991) e 

por Avanzato & Cherubini (1993). 

As altas percentagens de enraizamento 

coincidem com as de sobrevivência, 

pois todas as plantas 

que enraizaram sobreviveram, e co- 


incidem com os de crescimento das 

mudas (Figura 6). Maciel et al. (2002) 

sugerem que a umidade relativa no 

ambiente utilizado garantiu as condições 

adequadas para a aclimatização 

das mudas. Esta hipótese é corroborada 

por Campostrini & Otoni 

(1996), pois plântulas produzidas in 

vitro não estão adaptadas ao novo 

ambiente, pois não possuem mecanismos 

de proteção contra a desidratação, 

já que seus estômatos geralmente 

se encontram abertos 

(Schackel et al., 1990). No entanto, 

segundo Pospíslová et al.(1997) e 

Bolar et al. (1998), durante a aclimatização 

as mudas ativam os mecanismos 

que permitem sua sobrevivência 

após a transferência para a casa 

de vegetação. Possivelmente as condições 

de aclimatização utilizadas 

neste trabalho possibilitaram a sobrevivência 

da planta até a entrada 

em funcionamento dos estômatos, o 

que permitiu um maior controle sobre 

as perdas de água, o que está de 

acordo com Sutter (1988). 

Considerações Finais 

Os resultados obtidos nesse laboratório 

corroboram com aqueles 

que foram publicados por vários 

grupos de pesquisa nacionais e estrangeiros. 

As metodologias desenvolvidas 

permitem a produção comercial 

de mudas de porta-enxertos 

e copa de macieira micropropagados. 

Em que pese as peculiaridades de 

cada genótipo a grande maioria dos 

clones utilizados atualmente podem 

ser produzidos seguindo protocolos 

semelhantes. A perspectiva do uso 

da indução ao enraizamento realizado 

simultaneamente à aclimatização 

das plantas ex vitro pode diminuir em 

até 50% o custo de produção de uma 

Tabela 

5. 

Sobrevivên 

cia, 

número 

e comprimento 

de 

raízes 

altura 

e número 

de 

folhas 

de 

miniestacas 

do 

porta-enxerto de 

macieira 

M. 

9 ( Malus pumila) 

, submetidas 

ao 

enraizamen 

to 

ex vitro, 

em 

diferentes 

concentraçõ 

es 

de 

AIB, 

45 

dias 

após 

a repicagem 

para 

substrato 

mineral. 

AIB 

Sobrevivênciadas 

Número 

de 

Comprimen 

to 

das 

Comprimen 

to 

das 

Número 

de 

( mg/ 

L) 

plantas 

( % ) 

raízes 

raízes 

( cm) 

brotações 

( cm) 

folhas 

0 85 b 10, 1 ns 

12, 0 ns 

5, 3 ns 

7, 

5 ns 

500 95 a 11, 5 

12, 5 

6, 3 

8, 

0 

1000 70 c 16, 0 

11, 6 

6, 9 

7, 

5 

1500 73 c 20, 0 

11, 3 

6, 9 

7, 

8 

* Médias 

seguid 

as 

de 

mesm 

as 

letra 

s nas 

coluna 

s não 

difere 

m signi 

ficati 

vament 

e pelo 

teste 

de 

Duncan 

a 5% 

. 

ns 

- não 

signi 

ficati 

vo

muda micropropagada, o que torna 

viável o uso comercial da micropropagação. 

A produção de mudas de alta 

qualidade genética e sanitária é um 

fator de extrema importância para a 

garantia da competitividade da 

pomicultura nacional. Neste sentido, 

a aplicação das técnicas aqui abordadas 

abrem perspectivas para a instalação 

de laboratórios comerciais para 

atender à demanda de mudas para a 

renovação de pomares pouco produtivos 

e a implantação de novos pomares 

com alta densidade. 


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Pesquisa 

Adriano Luiz Tonetti 

Mestre em Saneamento e Ambiente - UNICAMP 

atonetti@fec.unicamp.br 

Bruno Coraucci Filho, Dr 

Professor Associado da Faculdade de Engenharia 

Civil - UNICAMP 

Alexandre Patto Kanegae 

Mestre em Saneamento e Ambiente - UNICAMP 

Ronaldo Stefanutti, Dr 

Doutor pelo CENA-USP 


Método Alternativo de 

Tratamento de Esgotos 

Reator anaeróbio com recheio de bambu associado com filtros biológicos de areia 

Resumo 

ste artigo apresenta os resultados 

encontrados para 

o estudo de um sistema 

alternativo de tratamento 

de esgotos constituído por 

reator anaeróbio com recheio 

de bambu associado a um filtro 

biológico de areia. Tal combinaçaão 

possui baixo custo e busca minimizar 

o sério problema de saneamento pelo 

qual o Brasil passa. 

O reator anaeróbio foi alimentado 

com uma vazão de 2 l/min e seu 

efluente era aplicado em cinco cargas 

hidráulicas (20, 40, 60, 80 e 100 l/m 2 ) 

sobre a superfície de quatro filtros de 

areia com diferentes profundidades 

de leitos (25, 50, 75 e 100 cm). 

Devido à ação dos microrganismos 

anaeróbios e aeróbios, que aderem 

à superfície do bambu e da areia, 

obteve-se uma excelente remoção 

de matéria orgânica do esgoto que, 

caso fosse lançada em um corpo de 

água antes do processo de tratamento, 

levaria ao consumo de oxigênio e 

a uma mortandade da fauna e flora 

aquáticas. Quanto ao nitrogênio, ocorreu 

uma grande transformação da 

sua parte orgânica em nitrato, demonstrando 

a grande adaptação das 

bactérias responsáveis por esta reação 

bioquímica ao meio formado 

pela areia. Os organismos patogênicos 

foram em grande medida removidos, 

adequando o efluente a alguma 

prática de reuso. 

Palavras-chave: filtro de areia, 

pós-tratamento, efluente anaeróbio, 

baixo custo. 

Introdução 

O Brasil é um dos países que 

possuem o maior fluxo interno de 

água. Porém, há uma enorme 

disparidade na distribuição deste recurso 

entre suas diferentes regiões. 

Enquanto que no norte existe uma 

abundância hídrica, no sul e sudeste, 

industrializados e populosos, ocorre 

a escassez causada pelo elevado consumo 

e grande poluição dos rios, 

resultante da precária situação do 

saneamento básico. 

Este quadro alarmante acarreta 

sérios problemas à saúde pública e 

ao meio ambiente levando a mortandade 

de um grande número de espécies. 

Portanto, um dos desafios atuais 

para a melhoria desta situação é o 

desenvolvimento de sistemas de tratamento 

simples, eficientes e adaptáveis 

às condições econômicas e estruturais 

do nosso país. 

O Tratamento Anaeróbio 

O tratamento anaeróbio depende 

dos microrganismos que agem na 

ausência de oxigênio, transformando 

os dejetos gerados pela ação 

humana em produtos mais simples 

como metano, gás carbônico e água 

(METCALF e EDDY, 1991). Estes 

compostos mais simples podem 

retornar ao meio ambiente sem comprometer 

o planeta e seu ecossistema. 

Apesar da boa eficiência deste 

sistema, entre 10 e 30% da matéria 

orgânica não é degradada, o que 

impede que seu efluente atenda à 


Figura 1: Filtro anaeróbio de fluxo ascendente. 

legislação brasileira quanto a este 

parâmetro, havendo necessidade de 

um pós-tratamento. 

O reator anaeróbio é caracterizado 

pela presença de um material de 

recheio estacionário e inerte no interior 

de um tanque fechado. O esgoto 

penetra pela parte inferior e flui até a 

sua saída na área superior. No decorrer 

do escoamento, o esgoto entra em 

contato com este material. Sobre a 

superfície deste recheio ocorre a formação 

natural de um biofilme que 

degrada o substrato contido no fluxo 

de esgoto (Figura 1). 

O material de recheio no qual 

os microrganismos aderem deve 

ter as seguintes características: estrutura 

resistente, ser biológica e 

quimicamente inerte, leveza, porosidade 

elevada e preço reduzido. 

Tal sistema possui a vantagem 

de consumir pouca energia e produzir 

uma quantidade mínima de 

lodo, além de não depender da 

utilização de complexos equipamentos 

mecânicos. 

Pesquisadores da UNICAMP diagnosticaram 

que o uso de anéis de 

bambu poderia satisfazer a tais prérequisitos 

(CAMARGO, 2000). Este 

material apresenta a vantagem de 

possuir um baixo custo e ser facilmente 

encontrado no Brasil. Desta 

forma, construíram e operaram quatro 

reatores que possuíam o bambu 

como recheio e obtiveram uma remoção 

média de matéria orgânica 

(DBO) superior a 75%. Quanto ao 

nitrogênio orgânico, somente uma 

parcela de sua concentração foi transformada 

em amônia. 

Pode-se concluir ao final deste 

trabalho inicial que, apesar dos bons 

resultados, havia a necessidade de se 

realizar um pós-tratamento do 

efluente anaeróbio gerado pelo reator 

de bambu, pois ele não se adequava 

à legislação brasileira. Assim, 

buscando manter as características 

de um tratamento alternativo e barato 

decidiu-se aplicar o efluente gerado 

sobre a superfície de filtros biológicos 

de areia. 

A associação do reator anaeróbio 

com filtros biológicos de areia 

seria uma alternativa que preservaria 

o baixo custo total. Outro item 

importante seria a possibilidade de 

dispor o efluente gerado diretamente 

sobre os cursos d’água, ou 

reutilizá-lo na irrigação, ou no consumo 

não-humano, seguindo a orientação 

da Organização Mundial de 

Saúde (OMS, 1989). 

No Brasil, esta combinação seria 

aplicável nas pequenas cidades, em 

bairros isolados e condomínios fechados 

das metrópoles, onde a instalação 

de uma rede coletora de esgotos 

apresentaria custo elevado. 

Filtros Biológicos de Areia 

O filtro biológico de areia é um 

método de tratamento bastante antigo, 

inicialmente adotado na remoção 

de turbidez da água potável. A partir 

do século XIX, na Europa e nos 

Estados Unidos, passou a ser aproveitado 

na depuração de esgotos 

(MICHELS, 1996). 


O funcionamento deste sistema 

baseia-se na aplicação de afluente 

intermitentemente sobre a superfície 

de um leito de areia. Durante a infiltração 

do líquido ocorre a purificação 

por mecanismos físicos, químicos e 

biológicos. 

O tratamento físico é resultante 

do peneiramento e o químico 

ocorre pela adsorsão de determinados 

compostos. A purificação depende 

principalmente da oxidação 

bioquímica que ocorre no contato 

do afluente com a cultura biológica. 

Devido a esta característica, 

Jordão e Pessoa (1995) afirmam 

que este tipo de sistema é incorretamente 

chamado de filtro, pois seu 

funcionamento não possui como 

explicação primordial o peneiramento 

ou a filtragem. Neste mesmo 

sentido, KRISTIANSEN (1981) sustenta 

que o leito de areia, em conjunto 

com os microrganismos, forma 

um filtro vivo. 

Material e Métodos 

Este projeto de pesquisa está 

instalado em uma área experimental 

situada na Estação de Tratamento de 

Efluentes Graminha, na cidade de 

Limeira, Estado de São Paulo. O esgoto 

bruto é originário de um bairro 

residencial denominado Graminha. 

Inicialmente esta água residuária passa 

por um tratamento preliminar composto 

por grades de retenção e caixa 

de areia e em seguida, uma pequena 

Figura 2: Vistas externa (esquerda) e interna (direita) dos reatores anaeróbios.

Tabela 

1: 

Denominação 

dos 

filtros 

biológico 

s e profund 

idades 

do 

leito 

de 

areia. 

Profund 

idade 

do 

Leito 

Filtro 

( centímetros) 

F 5 

F 0 

F 5 

F 0 

025 

050 

075 

100 

porção do seu fluxo é direcionada até 

quatro reatores anaeróbios com recheio 

de bambu. 

Cada reator possui volume de 

500 l e foi construído em aço inox 

tendo formato cilíndrico e fundo 

cônico, que funcionou como um 

compartimento para a distribuição 

do esgoto (Figura 2). O meio suporte 

foi constituído de anéis de bambu 

da espécie Bambusa tuldoides. 

O caule do bambu foi cortado em 

pedaços de aproximadamente 5 cm 

(CAMARGO, 2000). 

Estes reatores anaeróbios foram 

operados com fluxo ascendente, tendo 

uma vazão de 2 l/min e tempo de 

detenção hidráulica de 3 horas, controlados 

diariamente. 

Filtros de Areia 

Na construção do leito dos filtros 

foram empregadas três camadas 

posicionadas a partir da base. A primeira 

foi constituída por brita e pos- 

Figura 3: Esquema dos filtros de areia. 

2 

5 

7 

10 

suía 20 cm de profundidade. Logo 

acima estava a camada formada por 

pedregulho, com 10 cm de profundidade, 

que objetivava sustentar a areia, 

impedindo que suas partículas fossem 

arrastadas para fora da estrutura 

do sistema. Quanto à camada de 

areia, buscando-se determinar qual 

era a espessura ideal para a realização 

do tratamento, empregou-se quatro 

filtros com diferentes profundidades 

de leito, conforme apresentado 

na Tabela 1. 

A areia empregada foi a popularmente 

denominada de grossa comercial, 

possuindo um diâmetro efetivo 

(D ) de 0,093 mm. Salienta-se 

10 

que estes materiais foram os mais 

comumente encontrados na região 

de desenvolvimento do projeto. 

Na construção dos filtros, foi 

utilizada uma caixa cilíndrica com 

estrutura de fibra de vidro e diâmetro 

de 100 cm. Na Figura 3 há um esquema 

da disposição das diferentes camadas 

que compõem os filtros. 

Para a distribuição uniforme 

do afluente sobre o leito dos filtros, 

empregou-se uma placa quadrada 

de 20 cm de comprimento, feita de 

madeira e posicionada no centro da 

camada superficial (Figura 4). Após 

o lançamento do afluente pela tubulação 

de distribuição, existe o 

choque do líquido com esta placa, 

distribuindo as gotículas sobre a 

superfície. 

Buscando-se determinar a capacidade 

de tratamento dos filtros 

biológicos de areia, foram aplicadas 

as cargas hidráulicas de 20, 40, 

60, 80 e 100 l/m 2 de efluente proveniente 

dos reatores anaeróbios sobre 

as superfícies. Cada carga hidráulica 

foi empregada pelo período 

de um mês entre as segundas e 

sextas-feiras. 

Na Figura 5 está apresentado de 

forma esquemática o fluxograma de 

funcionamento deste sistema de tratamento 

em estudo. 

As seguintes amostras foram obtidas 

semanalmente: esgoto bruto, 

efluente dos reatores anaeróbios com 

recheio de bambu e efluentes dos 

filtros de areia. Todas as análises 

foram baseadas no Standard Methods 

for the Examination of Water and 

Wastewater (AWWA/ANHA/WEF, 

1999). 

Os parâmetros físicos, químicos 

e biológicos analisados foram os 

seguintes: pH, demanda bioquímica 

de oxigênio (DBO), série do nitrogênio 

(nitrogênio orgânico e 

amoniacal, nitrito e nitrato) e 

coliformes totais. 

Resultados 

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 111 

pH 

O estudo deste parâmetro é de 

extrema importância em um sistema 

biológico. Isto porque os microrganismos 

responsáveis pelo tratamento 

dos esgotos necessitam de um pH 

que varie entre 4 e 8. Caso contrário 

existe o impedimento da formação 

do biofilme responsável pela depuração 

do efluente. 

De acordo com a Figura 6 podese 

fazer uma divisão dos valores de

pH encontrados para os filtros biológicos 

de areia em dois grupos básicos. 

O primeiro engloba os pHs encontrados 

nas cargas hidráulicas de 

20, 40 e 60 l/m 2 onde houve tendência 

para valores superiores a 7. No 

segundo grupo, constituído pelas 

cargas de 80 e 100 l/m 2 nota-se valores 

inferiores ao pH neutro. 

A característica encontrada para 

o primeiro grupo não se adequa aos 

Figura 4: Vista externa (esquerda) e superior 

(direita) de um filtro de areia, tendo ao centro 

a placa de distribuição de afluente. 

resultados esperados. De acordo com 

a análise dos compostos nitrogenados, 

esperava-se que a transformação 

dos nitrogênios orgânico e 

amoniacal em nitrato causasse a redução 

do pH. Tal fato ocorreria devido 

à redução de alcalinidade 

provocada pelas bactérias aeróbias 

no processo metabólico da degradação 

da matéria orgânica. Uma possível 

explicação para esta característi- 

Figura 5: Fluxograma do sistema de tratamento em estudo. 

Figura 6: Variação do pH durante as semanas de coleta. 


ca pode ser a formação de um sistema 

tampão químico pela areia. Assim, 

apesar do consumo de compostos 

alcalinos, haveria o impedimento 

da queda do pH do efluente dos 

filtros de areia. 

A formação do sistema tampão 

pelo leito de areia pode ser 

comprovada pelo fato do filtro 

F025, que possui o menor volume 

de areia, possuir tendência aos 

menores pHs e também por ter 

sido o primeiro a apresentar os 

valores mais baixos. O filtro de 100 

cm manteve valores altos de pH 

ate o final da aplicação da carga de 

100 l/m 2 . 

Vê-se também que o sistema, 

mesmo sob condições temporárias 

de aplicações de pHs bastante anormais, 

conforme encontrado na sexta 

semana, mostrou-se capaz de 

amortecê-los. Isso também pode 

ser notado nas duas últimas semanas 

de aplicação da carga de 100 l/ 

m 2 , quando houve a geração de um 

efluente ácido pelos reatores anaeróbios 

de bambu. Observa-se que 

nesta situação os efluentes dos quatro 

filtros não tiveram uma tendência 

a acompanhá-lo nesta queda 

brusca. 

Quando se comparam os valores 

encontrados para o pH com aqueles 

exigidos pela legislação brasileira 

(CONAMA 20/86), que permite a 

emissão de um efluente cujo pH 

varie entre 4 e 9, nota-se que o 

sistema propiciou valores bastante 

satisfatórios. 

Demanda Bioquímica de 

Oxigênio - DBO 

Caso seja lançado em um corpo 

de água uma grande quantidade 

de matéria orgânica, haverá o consumo 

parcial dela pelos microrganismos 

presentes no meio. Como 

conseqüência desta degradação, 

esta colônia formada consome grande 

quantidade de oxigênio, levando 

à morte diversas espécies da 

fauna e da flora. 

No que se refere a DBO, parâmetro 

que determina a quantidade 

de matéria orgânica, os reatores

Tabela 

2: 

Remoção 

média 

de 

DBO 

no 

sistema 

de 

tratamento 

nas 

cargas 

hidráulicas 

aplicadas. 

Ponto 

de 

Remoção 

média 

de 

DBO 

( % ) 

Coleta 

20 l/ 

m2 

40 l/ 

m2 

60 l/ 

m2 

80 l/ 

m2 

100 

l/ 

m2 

F025 95, 3 97, 3 93, 7 95, 8 91, 

3 

F050 98, 0 98, 9 98, 7 96, 5 94, 

9 

F075 97, 5 98, 9 98, 8 98, 3 97, 

0 

F100 97, 6 98, 8 99, 4 99, 3 98, 

7 

Figura 7: DBO média para cada uma das cargas hidráulicas aplicadas. 

Figura 8: Média para a concentração dos compostos nitrogenados no esgoto bruto 

e efluente dos reatores de bambu em cada carga hidráulica. 

anaeróbios propiciaram uma remoção 

média de aproximadamente 

48%. Este resultado está de acordo 

com as possibilidades dos microrganismos 

anaeróbios e com os dados 

encontrados para materiais de 

recheio normalmente empregados 

em estações de tratamento de grande 

porte. 

Quanto aos filtros de areia, vêse 

pela Figura 7 a excelente remoção 

de DBO. O maior valor encontrado 

foi de somente 29 mg/l, obtido no 

efluente do filtro com 25 cm de 

profundidade, durante a aplicação 

da maior carga hidráulica. Este resultado 

está muito abaixo do máximo 

permitido pela legislação brasileira, 

que é de 90 mg/l. 

Outra característica observada 

é que quanto mais profundo o leito 

de areia, melhores foram os resultados. 

Isto pode ser explicado pelo 

fato de que quanto maior a profundidade, 

maior a quantidade de areia 

revestida com biofilme. Assim existe 

uma ampla possibilidade de contato 

do material orgânico com os 

microrganismos. 

Quando se observa a Tabela 2, 

que apresenta os percentuais de 

remoção da DBO em todo o sistema, 

observa-se o valor mínimo de 

91,3%. O filtro com 100 cm de 

profundidade nunca removeu menos 

que 97,6%, independente da 

carga de aplicação. 

Nitrogênio 

A remoção dos compostos nitrogenados 

presentes no esgoto é de 

extrema importância. Caso isto não 

ocorra tem-se o lançamento de um 

efluente tóxico que pode levar à 

morte de micro e macrorganismos. 

Tal fato ocorre devido ao nitrogênio 

amoniacal ou devido à eutrofização, 

que acaba por criar um meio propício 

à floração de algas. 

Pela Figura 8 percebe-se que 

tanto o esgoto bruto como o 

efluente dos reatores de bambu 

eram constituídos de compostos 

nitrogenados pouco degradados 

(nitrogênio orgânico e amoniacal). 

Assim, desde a produção dos 


Figura 9: Média para a concentração dos compostos nitrogenados no filtro F025 e 

F050 em cada carga hidráulica. 

dejetos pelo ser humano até a chegada 

à estação de tratamento ocorreram 

poucas transformações em 

sua composição. Isto ocorre principalmente 

devido ao fato de os 

organismos responsáveis pela decomposição 

dos compostos nitrogenados 

agirem somente em presença 

de oxigênio. 

Ao comparar-se o esgoto bruto 

com o efluente dos reatores de bambu, 

nota-se que apesar da sua característica 

anaeróbia, a amônia na maioria 

das situações superava o valor 

de nitrogênio orgânico. Quanto às 

concentrações de nitrato e nitrito, 

observa-se que foram muito pequenas 

para estes dois pontos de coleta. 

Pelas Figuras 9 e 10, nota-se 

que o efluente dos reatores anaeróbios 

de recheio de bambu ao 

infiltrar-se através do leito de areia 

dos filtros biológicos sofreu grandes 

alterações no que se refere aos 

compostos nitrogenados. Ou seja, 

existiu uma grande transformação 

do nitrogênio orgânico e do 

amoniacal para nitrato, independente 

da carga que era empregada. 

Tal modificação é resultante das 

nitrobactérias, que em ambientes 

aerados levam tais compostos à sua 

forma mais oxidada. 

Para os filtros F025 e F050, a 

partir da carga de 60 l/m 2 passa a 

haver um aumento da concentração 

de nitrogênio amoniacal, que foi 

ampliada na de 80 l/m 2 . Este aumento 

pode ser explicado pelo 

acréscimo de carga, que acarretou 

na diminuição do tempo de contato 

entre o líquido que se infiltrava e a 

cultura biológica aderida à areia. 

Quanto maior era a profundidade 

do leito, maior era o processo de 

nitrificação, ou seja, de transformação 

do nitrogênio orgânico em nitrato. 

Assim, de acordo com a Figura 10, 

nota-se que o filtro com 100 cm de 

profundidade de leito propiciava uma 


completa nitrificação. Assim, a 

somatória das concentrações de todos 

os compostos nitrogenados era 

muito semelhante à de nitrato. 

Coliformes Totais 

Os coliformes totais são uma 

classe de organismos adotada pela 

engenharia sanitária como um indicador 

da presença de organismos 

patogênicos. Assim, caso esteja em 

pequenas quantidades, pode-se supor 

que a água também não conterá 

seres vivos que possam causar algum 

dano a saúde. 

Ao analisar-se as concentrações 

de coliformes totais pela Figuras 11, 

vê-se que o afluente sempre possuía 

valores superiores a 10 6 NMP/100 ml, 

chegando em alguns casos a superar 

10 9 NMP/100 ml. Desta forma, podese 

constatar que os reatores anaeróbios 

com recheio de bambu realmente 

não removem estes organismos, 

conforme afirma a literatura. 

Quanto aos filtros de areia, nas 

baixas cargas o F025 já apresentava 

valores mais altos que os outros três, 

e no decorrer do desenvolvimento do 

projeto, sempre possuía as maiores 

concentrações. Por outro lado, o filtro 

com 100 cm de profundidade chegava 

a gerar um efluente capaz de atender 

à legislação brasileira para a água 

potável quanto a coliformes totais. 

Ao observar-se a comparação 

entre o afluente e o efluente do filtro 

de areia apresentada na Tabela 3, 

percebe-se a grande remoção de 

coliformes totais que este sistema 

propiciou. O filtro com menor profundidade 

de leito, o F025, apresentou 

altos percentuais, sendo no mínimo 

igual a 84%. Os dois filtros mais 

profundos tiveram valores superiores 

a 99% em praticamente todas as 

situações em estudo. 

Conclusões 

A análise destes resultados demonstra 

a grande viabilidade deste 

sistema biológico para o tratamento 

de efluente de pequenas comunidades, 

utilizando materiais presentes 

nas próprias comunidades.

Figura 10: Concentração dos compostos nitrogenados nos filtros F075 e F100. 

Figura 11: Concentração de coliformes totais. 

Tabela 

3: 

Remoção 

média 

da 

concentração 

de 

Coliformes 

Totais 

nos 

filtros 

biológico 

s de 

areia 

em 

cada 

carga 

hidráulica. 

Ponto 

de 

Remoção 

dos 

Coliformes 

Totais 

( % ) 

Coleta 

20 l/ 

m2 

40 l/ 

m2 

60 l/ 

m2 

80 l/ 

m2 

100 

l/ 

m2 

F025 97, 5 89, 8 84, 8 84, 9 87, 

0 

F050 99, 9 99, 2 98, 0 87, 4 96, 

3 

F075 100, 0 99, 9 99, 4 99, 5 97, 

0 

F100 100, 0 100, 0 99, 9 99, 9 99, 

9 

O efluente gerado estava em conformidade 

com o exigido pela legislação 

brasileira para a emissão em um 

corpo receptor, sendo compatível com 

aqueles produzidos nas grandes estações 

de tratamento existentes nas grandes 

cidades brasileiras. Outro ponto é 

a possibilidade do reuso deste líquido 

em alguma atividade humana, resguardando 

os mananciais naturais para 

usos mais nobres. 


A FAPESP, CNPq, FINEP, Caixa 

Econômica Federal e PROSAB pelo 

apoio e financiamento na construção 

do projeto e em sua manutenção. 


AWWA/ANHA/WEF. Standard 

methods for the examination of 

water and wastewater. 19 a edição. 

Nova Iorque: American Public Health 

Association, 1999. 

CAMARGO, S. A. R. Filtro anaeróbio 

com enchimento de bambu 

para tratamento de esgotos sanitários: 

avaliação da partida e operação. 

Campinas: Faculdade de Engenharia 

Civil, UNICAMP, 2000. Dissertação 

de Mestrado. 

JORDÃO, E. P.; PESSOA, C. A. 

Tratamento de esgotos domésticos. 

3 a edição. Rio de Janeiro: ABES, 1995. 

KRISTIANSEN, R. Sand-filter 

trenches for purification of septic 

tank effluent: III. The micro flora, 

Journal of Environmental Quality, 

n. 10, p. 361–364, 1981c. 

METCALF e EDDY. Wastewater 

engineering, treatment, disposal 

and reuse. 3 a edição. Nova Iorque: 

McGraw - Hill, International Editions, 

1991. 

MICHELS, C. J. System suited 

for small communities. Water 

Environmental & Technology, n. 

8, v. 7, p. 45-48, 1996. 

OMS - ORGANIZAÇÃO MUN- 

DIAL DE SAÚDE. Directrices sanitárias 

sobre el uso de águas 

residuales en agricultura e 

aquicultura. Séries de reportagens 

técnicas. N 778. OMS, Genebra, 

1989. 


Pesquisa 

Soraya Cristina Leal-Bertioli - PhD 

Pesquisadora EMBRAPA Recursos 

Genéticos e Biotecnologia, 

soraya@cenargen.embrapa.br 

Patrícia Messenberg Guimarães - PhD 



messenbe@cenargen.embrapa.br 

Alessandra Pereira Fávero - MsC 



favero@cenargen.embrapa.br 

Márcio de Carvalho Moretzsohn - MsC 

Pesquisador EMBRAPA Recursos 


marciocm@cenargen.embrapa.br 

Karina Proite - MsC 

Estudante de doutorado da UnB, 

proite@cenargen.embrapa.br 

David John Bertioli - PhD 

Pesquisador Universidade Católica de Brasília 

david@pos.ucb.br 


Amendoim Selvagem 

amendoim cultivado, 

Arachis hypogaea, é 

uma das leguminosas 

produtoras de grãos 

mais plantada em todo 

o mundo, devido ao seu alto conteúdo 

de proteína e óleos insaturados. É 

cultivado extensivamente na China, 

Índia e Estados Unidos, além de diversos 

países da América Latina e 

África (Conab, 2002). Os principais 

problemas da cultura estão relacionados 

ao ataque de fungos da parte 

aérea e nematóides, necessitando periodicamente 

da utilização de defensivos 

agrícolas (Hagan, 1998 ; 

Subrahmanyam et al., 1983; Bailey, 

2002). Espécies silvestres de Arachis 

têm-se mostrado altamente promissoras 

como fonte de resistência a 

diversas pragas que atingem o amendoim 

e outras culturas, sendo que já 

foram identificadas algumas espécies 

com resistência a três fungos 

foliares (Cercospora arachidicola, 

Cercosporidium personatum e 

Puccinia arachidis) e ao nematóide 

das galhas (Meloidogyne spp.). Busca-se, 

agora, desenvolver ferramentas 

para a utilização destas espécies 

silvestres em programas de melhoramento 

genético, visando à obtenção 

de cultivares de amendoim com resistência 

mais duradoura (Fig.1). 

O projeto “Identificação de resistências 

a stress biótico em Arachis selvagem 

e desenvolvimento de ferramentas 

para o melhoramento genético 

através de mapeamento e genômica 

comparativa” combina esforços e habilidades 

de pesquisadores da Embrapa 

Recursos Genéticos e Biotecnologia, 

Universidade Católica de Brasília, IBONE 

(Instituto Botanico del Nordeste, Argentina), 

Universidade de Aarhus (Di- 


Uma fonte de resistência a pragas 

foto ilustrativa 

namarca) e Sainsbury’s Laboratories (Inglaterra) 

na busca de genes de resistência 

a fungos e nematóides patogênicos 

ao amendoim, e no desenvolvimento 

de um mapa genético para Arachis que 

possibilite a utilização destes genes. 

Produção de um mapa 

genético para facilitar a 

seleção assistida 

Espécies silvestres de Arachis possuem 

alta diversidade genética e constituem 

uma rica fonte de genes de 

resistência. Diversos trabalhos têm mostrado 

que as espécies silvestres são 

muito mais resistentes a doenças do 

que a espécie cultivada (Arachis 

hypogaea) (Holbrook et al., 2000). O 

amendoim cultivado é tetraplóide (tem 

quatro conjuntos de cromossomos, dois 

conjuntos do chamado genoma A e 

dois conjuntos do genoma B), enquan

to que a maioria das espécies silvestres 

é diplóide (apenas dois conjuntos de 

cromossomos). Esta diferença de 

ploidia dificulta a introgressão de genes 

dos parentes silvestres, uma vez que os 

híbridos obtidos de maneira tradicional 

são triplóides estéreis. Por isso, 

para obter híbridos férteis, necessita-se 

fazer cruzamentos entre espécies silvestres 

com genomas AA e BB. Os 

híbridos obtidos (AB) são então submetidos 

a tratamento com colchicina 

para duplicar o número de cromossomos, 

obtendo-se, assim, anfidiplóides 

sintéticos (AABB), que, em princípio, 

são compatíveis com o amendoim cultivado. 

Estes híbridos são então cruzados 

com A. hypogaea dando continuidade 

ao programa de pré-melhoramento 

de Arachis. 

Tradicionalmente, nos programas 

de melhoramento de plantas que envolvem 

hibridações seguidas de retrocruzamentos, 

grande parte do genoma 

da parental doadora é incorporada ao 

genoma da planta receptora e, por 

isso, são necessárias várias gerações 

para a eliminação gradual dos genes 

indesejáveis, enquanto o genótipo do 

Fig.1 - Sementes de diferentes espécies de Arachis 

parental recorrente é mantido para os 

demais locos. Em cada geração são 

selecionadas as plantas que apresentam 

a característica de interesse a ser 

introgredida, e as demais características 

do parental recorrente. Este processo 

de seleção, após a introgressão, 

pode ser otimizado através da construção 

de mapas genéticos e da identificação 

de marcadores moleculares 

fortemente associados aos genes de 

interesse. Desta forma, é possível, em 

cada fase de seleção, a escolha dos 

indivíduos que contenham o máximo 

de características do parental recorrente, 

diminuindo assim o tempo do 

processo de melhoramento. Isso é 

particularmente importante em programas 

que visam à introgressão de 

genes de resistência a pragas. Neste 

caso, a seleção indireta através de 

marcadores moleculares possibilita, 

além da redução de tempo, a identificação 

e seleção de genótipos resistentes 

na ausência do patógeno e a 

transferência e manutenção de mais 

de um gene de resistência principal 

durante a seleção (piramidização de 

genes de resistência). 

Para a implementação de um 

esquema efetivo de seleção assistida 

por marcadores em programas de 

melhoramento genético, três requerimentos 

são essenciais: (1) alguns 

marcadores devem estar fortemente 

ligados aos genes que controlam as 

características de interesse; (2) os 

marcadores devem estar facilmente 

disponíveis para a análise de grandes 

populações e (3) as técnicas utilizadas 

devem ser reproduzíveis entre 

laboratórios e com baixo custo. 

Mapeamento comparativo: 

Um atalho para um mapa 

genético 

Espécies de Arachis têm genomas 

muito grandes. O genoma 

haplóide de Arachis hypogaea tem 

aproximadamente 1,74 x 10 9 pares de 

bases. Isto dificulta a identificação e o 

mapeamento direto de genes de interesse. 

Uma outra espécie da família 

das leguminosas, Lotus japonicus, tem 

um genoma bem menor, tem um 

mapa genético de alta resolução já 

disponível e os projetos de seqüenci- 


Fig.2 - Exemplo de estudo de sintenia: Marcadores moleculares (M1 a M4) em posições 

colineares nos genomas de Lotus e Arachis. 

amento de ESTs (expressed sequenced 

tags) e do genoma estrutural estão 

quase completos (Asamizu et al., 2000; 

Sato et al., 2001). Por isso, L. japonicus 

tem sido considerada uma plantamodelo 

para todas as leguminosas, 

auxiliando no entendimento de outras 

espécies de genomas mais complexos. 

A comparação entre estes dois 

gêneros e a análise da ordem dos 

genes nos cromossomos possibilita a 

identificação de regiões correlatas 

entre os dois genomas (chamada 

sintenia), ou seja, o mapeamento comparativo. 

Neste processo, são identificados 

marcadores moleculares comuns 

aos diversos genomas, chamados marcadores-âncoras. 

Como exemplo de 

transferência de informação da planta 

modelo para leguminosas cultivadas 

pode-se citar o caso dos fenótipos 

mutantes: uma vez que o gene responsável 

por um fenótipo mutante 

seja clonado em Lotus, a análise 

fenotípica comparativa e a informação 

do mapa podem ser utilizadas 

como base para identificar genes candidatos 

para o gene correspondente 

em outras leguminosas. 

No caso específico de Arachis, a 

análise genômica comparativa poderá 

auxiliar no desenvolvimento de 

marcadores para o melhoramento genético 

da cultura, o que certamente 

facilitará a clonagem de genes de 

interesse. A exploração da colinearidade 

entre genes de Arachis e Lotus 

buscando a identificação entre as duas 

espécies e a identificação de regiões 

cromossômicas ortólogas (genes homólogos 

localizados em genomas de 

diferentes organismos) tem sido realizada 

através do desenvolvimento de 

um banco de ESTs de Arachis (Guimarães 

et al., 2003 ). Este banco de 

dados deverá acelerar o mapeamento 

do genoma de Arachis, a identificação 

de resistências e o desenvolvimento 

de marcadores a serem utilizados nos 

programas de melhoramento. Um benefício 

adicional do projeto é o desenvolvimento 

de um sistema genético 

unificado para a família das leguminosas, 

pois trabalhando com Lotus que é 

considerado um dos gêneros mais 

adaptados desta família e Arachis que 

é considerado um dos mais primitivos, 

qualquer região de similaridade 

encontrada provavelmente existirá em 

todas as leguminosas. Até o momento, 

já foram encontradas homologias 

entre Lotus e Arachis em vários genes 

que codificam para enzimas envolvidas 

em importantes cadeias metabólicas, 

além da homologia entre genes 

envolvidos na simbiose destas plantas 

com bactérias fixadoras de nitrogênio 

estarem sendo estudadas (Sandal, et 

al., 2003) (Fig. 2). A identificação de 

tais regiões pode facilitar o isolamento 

de genes envolvidos neste processo, 

possibilitando o desenvolvimento 

de variedades de Arachis com maior 

capacidade de fixação de nitrogênio, 

o que resultaria na redução da utilização 

de fertilizantes nitrogenados, contribuindo 

para uma produção de alimentos 

mais sustentável. 


Estudos de expressão gênica 

O estudo da expressão gênica tem 

demonstrado ser uma importante ferramenta 

no entendimento dos processos 

biológicos em nível molecular. Por exemplo, 

estes estudos podem ser utilizados 

na identificação de uma rede de genes 

expressos de fundamental importância 

no desenvolvimento de uma determinada 

estrutura, ou na resposta de um 

organismo a um estímulo externo. O 

estudo da expressão gênica diferencial 

pode contribuir para a caracterização de 

resistências, pois possibilita a identificação 

de genes–chave desta rede através 

da comparação da expressão gênica 

durante o desenvolvimento de uma estrutura 

sob condições normais e em 

organismos carregando uma mutação 

ou submetidos a algum tipo de stress. 

Através do acúmulo de dados da expressão 

diferencial de vários genes sob diferentes 

condições, pode-se reconstruir as 

vias reguladas por estes genes, predizer 

onde eles atuam e identificar novos 

genes associados ao processo. 

Para o entendimento da função de 

um gene, é fundamental o estudo de 

onde e quando ele é expresso. Recentemente, 

várias estratégias foram desenvolvidas 

para permitir o estudo da função 

de vários genes simultaneamente, 

entre elas: a genética reversa (geração de 

mutações específicas em genes de interesse), 

screens mutagênicos (geração de 

mutações randômicas e screening de um 

pool de mutantes para se identificar 

fenótipos de interesse) e bioinformática 

(a análise dos dados gerados por todas as 

estratégias acima). As estratégias acima, 

associadas aos projetos genoma, que 

têm como objetivo o sequenciamento do 

genoma inteiro de vários organismos, 

têm possibilitado o estudo sistemático da 

expressão diferencial de genes em nível 

de genoma como um todo. A análise da 

expressão diferencial de genes em resposta 

ao ataque de um patógeno constitui, 

portanto, uma ferramenta importante 

no isolamento de genes de resistência 

ou de fatores envolvidos com a interação 

patógeno-hospedeiro. 

Neste projeto, a identificação de 

genes expressos diferencialmente em 

germoplasma resistente de Arachis está 

sendo realizada através da análise de ESTs 

e de microarranjos. Para tal, várias bibliotecas 

de cDNA foram construídas a partir 

de Arachis stenosperma submetido a 

diferentes situações de stress (inoculado 

com nematóides e fungos) as quais estão

sendo seqüenciadas de forma massal 

visando à construção de um banco de 

dados de ESTs e dos chips de DNA. 

Uma vez isolados e confirmada 

sua função, estes genes podem ser 

introgredidos para o amendoim cultivado 

ou transferidos a outras plantas de 

interesse econômico, que sejam atingidas 

pelas mesmas pragas, como a soja 

e feijão, para as quais já existem disponíveis 

métodos de transformação. 

O impacto da utilização 

destas novas técnicas no 

cultivo do amendoim 

O Brasil produz atualmente aproximadamente 

170 mil toneladas de 

amendoim, sendo o maior produtor o 

estado de São Paulo, com aproximadamente 

60 mil ha plantados e 80-90% da 

produção do país (Conab, 2002). Um 

dos principais problemas dos produtores 

de amendoim deste estado é o 

ataque de doenças fúngicas de parte 

aérea, como a mancha barrenta 

(Didymella arachidicola), mancha castanha 

(Cercospora arachidicola), mancha 

preta (Cercosporidium personatum), 

ferrugem (Puccinia arachidis) e 

verrugose (Sphaceloma arachidis). A 

principal cultivar plantada no país é a 

cv. Tatu, com aproximadamente 80% 

da área plantada e é altamente susceptível 

às doenças acima citadas. A última 

cultivar de A. hypogaea lançada pelo 

Instituto Agronômico de Campinas 

(IAC), a IAC-Caiapó, é de ciclo longo 

(com 130 dias) e possui resistência 

moderada às cercosporioses, à mancha 

barrenta e a ferrugem (Conab, 2002). 

As espécies silvestres da secção 

Arachis têm sido utilizadas no melhoramento 

do amendoim na Índia, Argentina, 

Estados Unidos e Brasil. Várias das espécies, 

que, na maioria, são brasileiras, 

possuem níveis de resistência a pragas e 

doenças superiores aos encontrados em 

acessos de A. hypogaea (Stalker & Moss, 

1987; Fávero et al., 2000 e 2001). A falta de 

informações sobre o potencial destas 

espécies para o melhoramento de cultivares 

é a principal barreira para seu uso. As 

69 espécies silvestres de Arachis descritas 

e existentes são restritas ao Brasil, Bolívia, 

Paraguai, Argentina e Uruguai, sendo 57 

endêmicas ao Brasil. As expedições de 

coleta realizadas desde 1959 têm permitido 

a preservação de mais de 1600 acessos 

no banco de germoplasma, localizado na 

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 

através de seu curador e principal 

coletor, Dr. José Francisco M. Valls. Neste 

banco de germoplasma, há acessos que 

representam todas as espécies de Arachis, 

exceto uma, Arachis martii, considerada 

extinta. 

A identificação de espécies resistentes 

a doenças e pragas e a localização 

de marcadores associados aos genes de 

interesse auxiliarão sobremaneira a seleção 

de plantas com resistência, desde as 

primeiras fases do programa de melhoramento, 

até a obtenção de novas cultivares. 

Acredita-se que a possibilidade da 

piramidização de genes tornará as novas 

cultivares com resistências mais duradouras 

do que se fosse utilizada apenas 

a seleção baseada em avaliação agronômica 

e fitopatológica das plantas, pois 

será possível a identificação de marcadores 

moleculares ligados a genes de resistência 

localizados nos genomas A e B 

oriundos de espécies silvestres e incorporados 

ao amendoim cultivado. 

O projeto irá propiciar o diálogo 

mais intenso entre os parceiros na cooperação 

científica e tecnológica entre a 

União Européia e América Latina. Isto 

também beneficiará o treinamento de 

jovens pesquisadores em tecnologias de 

ponta em genômica e citogenética. Os 

mapas genéticos gerados e o mapeamento 

comparativo entre os genomas de 

Arachis e Lotus poderão facilitar o melhoramento 

de amendoim e, possivelmente, 

os programas de melhoramento de outras 

leguminosas. O desenvolvimento de variedades 

melhoradas de amendoim adaptadas 

à América Latina auxiliará na redução 

do uso de defensivos agrícolas e 

poluição associada, sem perdas na produtividade, 

contribuindo para o desenvolvimento 

sustentável da agricultura. 

Bibliografia Citada 

Asamizu, E., Nakamara, Y., Sato, S., e 

Tabata, S. (2000). Generation of 

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Conab (2002). Conjuntura Semanal. 

Especiais 16-2009. Ministério da 

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. Companhia Nacional de 

Abastecimento-Conab. 

Fávero, A. P.; Moraes, S. A.; Vello, N. 

A.; Valls, J. F. M. Caracterização de 

acessos de germoplasma de espécies 

silvestres de Arachis (Secção 

Arachis) resistentes à ferrugem 

(Puccinia arachidis). Anais do 46 o 

Congresso Nacional de Genética, 

19 a 23 de setembro de 2000 - 

Águas de Lindóia- SP, p.533-534 

Fávero, A. P.; Moraes, S. A.; Vello, N. A.; 

Valls, J. F. M. Caracterização de espécies 

silvestres de amendoim quanto à 

resistência à mancha castanha visando 

à introgressão de genes ao amendoim 

cultivado. Anais do I Congresso 

de Melhoramento de Plantas, 03 a 06 

de abril de 2001 - Goiânia, GO. 

Guimaraes, P.M., Leal-Bertioli, S., Seijo, 

G., Parniske, M., Stougaard, J., Bertioli, 

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Sandal, N., Madsen, L., Radutoiu, S., 

Krusell, L., Madsen, E., Kanamori, 

N., Sato, S., Tabata, S., James, E., 

Krause, K., Udvardi, M., Stougaard, 

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Molecular Biology, Barcelona, 2003. 

Sato, S., Kanerko, T., Nakamura, Y., 

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(1983). Components of resistance to 

Puccinia arachidis in peanuts. 

Phytopathology 73 (2) 253-256. 


Pesquisa 

Ana Paula Pacheco Clemente 

Bióloga, Especialista em Bioética, Direito e 

aplicações, coordenadora e professora dos cursos de 

pós-graduação lato sensu e extensão em Bioética da 

PUCMinas e UFLA, e do curso de extensão em 

Tanatologia e Bioética do IEC-PUC Minas, membro 

da diretoria do Capítulo de Bioética da SBCM, 

consultora da Comissão de Bioética e Biodireito da 

OAB-MG, membro fundador e da Diretoria 

Executiva da Sociedade Brasileira de Bioética 

Regional Minas Gerais. 

paulaclemente@bioconsulte.bio.br; 

paulaclemente@bol.com.br 

Bioética 

A área das ciências biológicas é 

a que mais privilegia o conceito de 

Bioética da forma como foi concebido 

inicialmente. Ela possui um campo 

muito vasto de atuação para o 

profissional que transita entre a área 

da saúde e a do meio ambiente. 

Segundo Potter, criador do termo, 

que era biólogo e oncologista, a atuação 

da Bioética seria buscar a boa 

qualidade de vida, pela interação do 

ser humano com o meio ambiente. 

Esse conceito foi adaptado pelo Instituto 

Rose e Kennedy de Reprodução 

Humana e Bioética, que tornou 

assim a Bioética voltada para a 

biomedicina e a biotecnologia. A 

Bioética tradicional, dos EUA, é baseada 

em quatro princípios fundamentais, 

que são: 

Autonomia: direito do paciente 

de participar ativamente de seu tratamento, 

refutando, concordando, discutindo 

e decidindo junto com o 

médico a melhor conduta a ser tomada. 

Esse conceito vem da filosofia, 

uma vez que o termo supramencionado 

significa autogoverno. Entretanto, 

para que tal aconteça, o sujeito 

(paciente) deve receber informações 

claras e precisas sobre seu quadro 

clínico, diagnóstico, tratamento e 

prognóstico. 

Beneficência e não-maleficência, 

as quais possuem origem hipocrática. 

A primeira pugna por sempre buscar 

o bem do paciente; já a segunda 

determina que, existindo dúvida 

quanto ao bem a ser ofertado ao 

paciente e sobre os seus efeitos 


Pluralidade e transdisciplinaridade 

colaterais, ou seja, se estes forem 

maiores que aqueles, o médico não 

deve atuar, uma vez que a atuação 

médica deve sempre buscar o bem 

do paciente. 

O princípio da justiça prega o 

livre acesso de todos a um tratamento 

médico de qualidade, e a livre 

distribuição dos progressos da medicina 

para todos os seres humanos. 

Deve-se ressaltar a existência, 

antes de Potter, dos movimentos 

pré-bioéticos, tais como o Código 

de Nuremberg, o qual estabeleceu 

regras mínimas para pesquisas clínicas 

em seres humanos, e a Declaração 

Universal dos Direitos Humanos, 

que estipula direitos e garantias 

mínimos de respeito à vida humana. 

Ambos buscaram impedir reincidências 

das atrocidades cometidas pela 

humanidade nas duas grandes guerras 

mundiais. 

Hodiernamente, bioética é a 

parte da ética que cuida das questões 

referentes à vida humana, à saúde, 

aos avanços da biotecnologia e aos 

efeitos destes sobre o homem. Busca 

sempre o bom e o melhor para o ser 

humano, possuindo, desta forma, um 

caráter antropocentrista bastante 

acentuado, que busca privilegiar a 

interação homem/meio ambiente. 

A atuação do biólogo no meio 

ambiente busca a proteção da biodiversidade, 

a manutenção de espécies 

em vias de extinção, a preservação 

do meio ambiente e da qualidade de 

vida. O licenciamento ambiental e o 

relatório de impacto ambiental de

esponsabilidade técnica do biólogo 

é de extrema importância para evitar 

acidentes ecológicos. O Brasil possui 

uma legislação ambiental que regulamenta 

as atividades dos profissionais 

que atuam na área. A Bioética 

influencia nas decisões à medida 

que analisa a interação do ser humano 

com o ambiente e os reflexos 

causados pelas ações propostas pelo 

homem. 

Mais recentemente temos tido 

discussões sobre transgênicos e 

OGMs, não só na área de meio 

ambiente, mas também na área médica, 

com a produção de animais 

transgênicos para transplante de 

órgãos, vacinas e medicamentos 

manipulados geneticamente. Temos 

também biotecnologia na formação 

de biomateriais, reprodução humana 

assistida, que gera grandes polêmicas 

por causa da doação de sêmen, 

óvulo, útero de substituição, 

que muda os pilares de filiação, 

trazendo gêmeos em idades diferentes, 

crianças com até cinco pais, 

crianças com material genético de 

três pais em resultado de exame de 

DNA com técnica de rejuvenescimento 

de óvulo; gestação após a 

morte dos pais biológicos, mudança 

de paradigma quanto à filiação, privilegiando 

a paternidade e maternidade 

sócio-afetivas. 

O Projeto Genoma Humana com 

a descoberta de todos os genes humanos 

, trará benefícios e proporcionará, 

daqui a alguns anos, a cura para 

várias doenças. Nesse âmbito haverá 

um avanço na medicina preditiva 

que, através da avaliação genética, 

pode fazer o diagnóstico de várias 

doenças que poderiam se manifestar 

ou não no futuro. Hoje já é possível 

fazer o diagnóstico de algumas doenças, 

porém não é possível curá-las, os 

benefícios são apresentados na 

melhoria da qualidade de vida e da 

adaptação do paciente. 

Já há algumas décadas, a medicina 

fetal proporciona, através do 

diagnóstico pré-natal, a possibilidade 

de diagnóstico de doenças cromossômicas, 

como a síndrome de 

Down. Hoje, contamos com a biotecnologia 

por meio do diagnóstico ge- 

nético pré-implantação; podemos 

fazer a análise genética retirando um 

blastômero do embrião, ou seja, uma 

célula totipotente, que poderá virar 

outro ser humano idêntico ao da 

célula de onde foi retirado. Dessa 

forma, o diagnóstico é realizado no 

embrião, não havendo necessidade 

de retirar nenhum material biológico 

após a implantação, para não correr 

o risco de um aborto. 

Com a descoberta de doenças 

genéticas pela micromanipulação de 

embriões, é possível descartar esses 

embriões “anormais” pondo em prática 

a chamada Eugenia doce, que 

seria o descarte de embriões e fetos 

com defeitos congênitos. Aí surge a 

discussão sobre o que é normal e o 

que é anormal. Caso do casal surdomudo 

que recorreu ao banco de sêmen 

para buscar um doador de sêmen 

surdo para ter seu bebê. 

A terapia gênica vai proporcionar 

através da utilização de vetores, 

como vírus e bactérias, a cura das 

doenças das quais forem localizados 

os genes que as causam, removendo 

ou acrescentando o gene saudável à 

pessoa. 

Outra questão discutida pela 

Bioética é o direito à identidade genética 

nos casos em que a criança foi 

adotada ou tenha nascido por intermédio 

de material genético doado, o 

que não desfaz o vínculo de paternidade; 

direito não para fins de herança 

nem tampouco para negatória de 

paternidade, mas, simplesmente, pelo 

direito de conhecer suas origens. O 

advento do exame de DNA trouxe a 

certeza biológica, mas muitos têm 

utilizado tal exame de forma errônea. 

Deve-se ter sempre o exame de DNA 

como mais uma prova judicial a ser 

juntada aos autos do processo, a fim 

de preservar a dignidade e a privacidade 

humanas. Ninguém é obrigado 

a fornecer prova contra si mesmo. 

A banalização do exame de DNA 

tem trazido conseqüências indesejáveis 

não só para o Direito de Família 

e de Sucessões, mas também para a 

Criminalística, porque ainda existem 

peritos despreparados para coletar o 

material biológico na cena do crime. 

É preciso seriedade e responsabilida- 

de para utilizar tal prova; deve-se 

evitar contaminação do material, 

armazená-lo de forma adequada, ter 

uma cadeia de custódia, solicitar autorização 

por escrito nos casos de 

investigação de paternidade ou de 

maternidade. 

Assim, as questões da bioética 

podem ser classificadas como emergentes, 

aquelas advindas do avanço 

da biotecnologia e da biociência, e 

persistentes as que possuem suas 

origens na má distribuição de recursos 

e em um sistema econômico 

excludente. Por esse motivo, a 

bioética deve recortar seu sujeito de 

trabalho por etnia, raça, sexo e condição 

econômica, uma vez que a 

busca do que é bom e melhor varia 

de acordo com essas características. 

Devido à complexidade dos valores 

envolvidos em sua atuação, 

esse campo de discussão revela-se 

como a ciência da composição, ou 

seja, todos os assuntos dentro do 

âmbito de atuação da bioética atingem 

toda a sociedade, logo, as decisões 

sobre eles devem ser tomadas 

com a participação de todas as partes 

envolvidas. 

A Bioética busca uma reflexão 

da biotecnologia apresentada pelas 

ciências biomédicas para que elas 

possam ser utilizadas em benefício 

da sociedade. Busca o melhor para a 

coletividade, fazendo interagir o homem 

com o meio ambiente, com 

vistas a propiciar a ele uma melhor 

qualidade de vida. O trabalho 

transdisciplinar faz-se necessário a 

fim de proporcionar um atendimento 

mais humanizado e justo na área 

das ciências da vida. Dessa forma, 

buscam-se soluções novas para conflitos 

novos. 

Destarte, a bioética representa a 

ciência do diálogo transdisciplinar, ou 

melhor, propõe a composição possível 

com os vários estranhos morais, 

pois um médico para atuar bioeticamente 

deve respeitar a individualidade 

de seu paciente e o advogado que 

abraçar causa tão apaixonante deve 

conhecer biomedicina e os avanços 

biotecnológicos. Assim como cada 

profissional, na sua área de atuação, 

deve buscar essa composição.

Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31

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