Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 1

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 1

EntrevistaBiotecnologia: modernas técnicas de engenharia genéticaunem setores em prol do desenvolvimento nacionalPlantas e animais transgênicos utilizados como biofábricas agregam valor a diversos produtos e integram vários setores de produçãoFernanda DinizJornalistaTeias de aranha produzidas em laboratório, vacas que produzem medicamentos no leite e plantas de sojausadas na luta contra a AIDS poderiam até parecer filme de ficção científica há alguns anos. Mas hojerepresentam uma realidade bem mais próxima do que se pode imaginar, pois estão sendo desenvolvidasdentro de laboratórios brasileiros. Mais especificamente na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia,uma das 41 unidades de pesquisa da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa, emBrasília, DF.Um dos responsáveis por tudo isso é o engenheiroagrônomo Elíbio Rech, que desde o inícioda década de 80, aposta nas técnicas deengenharia genética como soluções para problemasque afetam a agropecuária brasileira,como por exemplo, pragas, doenças e estressesambientais.Mas a biotecnologia é um caminho amplo epromissor e, com o tempo e o domínio dastécnicas de transformação genética de plantas,Rech e sua equipe foram descobrindo que épossível ainda ir muito além dessas expectativas,e com a participação de parceiros nacionaise internacionais, inúmeras bifurcações foramse abrindo nesse percurso.O domínio das técnicas em biotecnologia mostrou,então, que as soluções podem beneficiartambém os setores de saúde, indústria e alimentação,além de agregar valor aos produtosagropecuários, unindo o agronegócio ao setor farmacêutico e a indústria, por exemplo.E para aqueles que ainda se assustam com a palavra transgenia, é importante frisar que essa tecnologianada mais é do que uma ferramenta de melhoramento genético mais avançada, já que transpõe barreirase permite o cruzamento entre diferentes espécies vegetais, animais e de microrganismos.E mais: todas essas inovações tecnológicas não são capítulos de filmes de ficção ou de super heróis, massim produto dos avanços conquistados por pesquisadores genuinamente brasileiros.Para conhecer melhor as importantes pesquisas biotecnológicas que estão sendo desenvolvidas naEmbrapa-Genargen, e suas aplicações para os diversos setores da sociedade brasileira, a revista Biotecnologia,Ciência & Desenvolvimento entrevistou o pesquisador Elíbio Rech, que falou sobre osprincipais resultados que o Brasil vem alcançando nesse fascinante campo da ciência. Confiram:2 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

BC&D – Como o senhor avalia aposição do Brasil hoje em dia, naárea de biotecnologia vegetal, emrelação ao cenário mundial?Rech – Em termos de tecnologia ede nível de especialização dos cientistas,o Brasil não deixa nada a deveraos países de Primeiro Mundo. Infelizmentepor causa de questões ideológicase jurídicas, que durante algunsanos prejudicaram o andamento daspesquisas em biotecnologia, ainda nãotemos muitos produtos resultantesdessas técnicas no mercado hoje. Mas,agora, com a retomada das pesquisase com a maior confiança da sociedade,as pesquisas estão avançandomuito bem e os resultados são promissores.A Embrapa já têm váriasplantas transgênicas sendo testadas nocampo, dentro das condições exigidaspela Lei de Biossegurança e que, embreve, serão oferecidas aos produtorese consumidores brasileiros.BC&D – Quais são essas plantas eque benefícios podem trazer paraa sociedade?Rech – Primeiro, gostaria de destacaro feijão transgênico resistente ao vírusdo mosaico dourado, projeto coordenadopelos pesquisadores FranciscoAragão e Josias Faria, que é apior ameaça para essa cultura hoje noBrasil. As plantas já estão sendo testadascom bons resultados em outra unidadeda Embrapa, a Embrapa Arroz eFeijão, em Goiânia, e quando chegaremao mercado serão os primeirosprodutos transgênicos totalmente desenvolvidospor instituições públicasde pesquisa.O vírus do mosaico dourado é o piorinimigo do feijoeiro na América do Sul.No Brasil, a doença está presente emtodas as regiões e, se atingir a plantaçãoainda na fase inicial pode causarperdas de até 100% na produção.As plantas que estão sendo testadasno campo foram modificadas geneticamentepor uma nova estratégia detransformação de feijão, através da interferênciade RNA. A grande vantagemdessa nova técnica é que não háintrodução de proteínas nas plantas, oque exclue a necessidade de realizaçãode testes de alergenicidade e toxicologia.Além disso, a tecnologia deRNA pode causar resistência de múltiplosespectros, tornando a planta resistentea outros vírus que atacam ofeijão e a várias estirpes do mesmovírus.BC&D – E as outras plantas?Rech – Temos também plantas transgênicasde batata, coordenado pelospesquisadores Eduardo Romano, Damaresde Castro e André Dusi, e demamão, coordenado por Manoel Teixeira,sendo testadas no campo, tambémpara resistência a viroses. As variedadestransgênicas de batata são resistentesaos vírus “Y” (PVY) e PLRV,ou vírus do enrolamento das folhas,como são mais conhecidos. Elas foramdesenvolvidas em parceria entre a EmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia,Embrapa Hortaliças, UniversidadeFederal de Pelotas, o Institutode Ingeniería Genética Y Biotecnologia(INGEBI – Argentina), e o CentroBrasileiro-Argentino de Biotecnologia.Diferenças à parte, já que o primeirovírus causa o enrugamento das folhase mosaico e o segundo o enrolamento,como já diz o nome, ambos têmcomo sintomas a redução do porte daplanta e do tamanho das folhas e, quandoestão juntos, são capazes de causar100% de perdas na produção.As plantas foram transformadas pelaintrodução do gene da capa protéicado vírus “Y” nas variedades de batata,de modo a torná-las resistentes. Grossomodo, essa técnica pode ser comparadaa uma espécie de “vacina” genética.Essas plantas já estão sendo testadasno campo da Embrapa Hortaliças, unidadeda Embrapa, também localizadaaqui em Brasília.Já as plantas transgênicas de mamãoforam desenvolvidas em parceria entrea Embrapa Recursos Genéticos eBiotecnologia e a Embrapa Mandiocae Fruticultura para resistência ao vírusda mancha anelar. Esse vírus é o piorinimigo da cultura de mamão em nívelmundial. Além de reduzir o tamanhodas folhas, ele diminui também acapacidade de fotossíntese das plantas,levando à redução de seu crescimentoe, conseqüentemente, a perdassignificativas na produção. No Brasil,o vírus da mancha anelar vem comprometendoseriamente a produçãode mamão, especialmente das variedadesmais consumidas em nível mundial:papaya e formosa, já que atingeas duas principais regiões produtorasdo país: sul da Bahia e norte do EspíritoSanto, responsáveis por 80% daprodução nacional.As plantas foram transformadas pelaintrodução do gene da capa protéicado próprio vírus, como foi feito com abatata, e já estão sendo testadas nocampo da Embrapa Mandioca e Fruticultura,em Cruz das Almas, na Bahia.BC&D – Além de resistência a pragase doenças agrícolas, que outrosbenefícios as plantas transgênicaspodem trazer para a ciênciae a sociedade brasileira?Rech – Sem dúvida nenhuma, umadas principais aplicações para as plantastransgênicas é a sua utilização comobiofábricas para a produção de medicamentos.BC&D – E que pesquisas o senhordestacaria nessa área, hoje emdia, aqui no Brasil?Rech – Em primeiro lugar, gostaria dedestacar a pesquisa que visa desen-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 3

volver plantas e animais transgênicoscapazes de produzir o Fator IX, umaproteína responsável pela coagulaçãodo sangue. Os hemofílicos não produzemessa proteína e, por isso, quandose machucam, têm velocidade decoagulação muito mais lenta e são muitomais suscetíveis a hemorragias. Essapesquisa está sendo desenvolvida emparceria entre a Embrapa RecursosGenéticos e Biotecnologia, Universidadede Brasília – UnB, Escola Paulistade Medicina da Universidade Federalde São Paulo – Unifesp/EPM e oHospital de Apoio ao Hemofílico deBrasília e pode representar uma esperançade melhor qualidade de vidapara os portadores dessa doença.A pesquisa tem como objetivo utilizarplantas de soja e animais como biofábricaspara produção do Fator IX emlarga escala e custo mais reduzido.Atualmente, os hemofílicos controlama ausência do Fator IX com medicamentos,mas se a pesquisa da Embrapader certo, daqui a aproximadamente10 anos, eles poderão contar comprodutos muito mais baratos, já queserão produzidos diretamente no leitedos animais ou em plantas de soja.A pesquisa com animais é a que estáem fase mais avançada. Até o momentoestá sendo realizada com camundongos,como modelo para experimentoscientíficos, mas o objetivoé desenvolver vacas transgênicasque produzam o fator IX diretamenteno leite.É importante lembrar que esse produtonão será disponibilizado à sociedadecomo alimento e sim como medicamento,já que tem que ser tomadonas doses e quantidades corretas.Mesmo assim, será muito mais acessívele barato, pois o objetivo é produzi-loem sistemas que utilizam plantase animais. Existem evidências de quea utilização de plantas e animais transgênicoscomo biofábricas poderá reduziros custos de produção de proteínasrecombinantes em até 50 vezes.As plantas de soja contendo o fator IXjá foram transformadas geneticamente,mas ainda não foram testadas.O leite dos camundongos transgênicoscontendo fator IX já está sendoavaliado pela equipe da Dra. JussaraAlmeida, coordenadora do Centro deTratamento de Coagulopatia do Hospitalde Apoio de Brasília, com o mesmoequipamento utilizado para testaros medicamentos existentes no mercado,e os resultados têm sido positivos.O próximo passo é testar o leiteno sangue de pacientes portadores dehemofilia para avaliar o efeito de coagulaçãoe compara-lo aos produtoscomercializados hoje.BC&D – E quando o senhor acreditaque essa tecnologia chegaráao mercado?“Sem dúvidanenhuma, uma dasprincipais aplicaçõespara as plantastransgênicas é a suautilização comobiofábricas para aprodução demedicamentos”.Rech – Atualmente existe a expectativade que a geração de animais transgênicosde médio (cabras) ou grandeporte (bezerras) sejam desenvolvidasno país nos próximos anos. Mas o queé importante enfatizar é que o domíniodessa tecnologia representa umaesperança não apenas para os hemofílicos,mas para a sociedade de formageral. Já estão sendo desenvolvidastambém plantas de soja com anticorposanticâncer de mama, que vão auxiliarna prevenção e diagnóstico dessadoença; alface com gene para combatera diarréia infantil e soja comgene do hormônio de crescimento.E isso é apenas o começo, já que autilização de plantas e animais comobiofábricas é uma plataforma tecnológicaque vai permitir expressar muitasmoléculas de alto valor agregado.Além de se constituir em um importanteinstrumento para a produção defármacos que poderão ser usados naprevenção e cura de inúmeras doençasque afligem a humanidade, essatecnologia poderá ser muito importantetambém para o estudo de funçõesde moléculas oriundas da biodiversidadebrasileira.Aqui na Embrapa Recursos Genéticose Biotecnologia, é desenvolvido umtrabalho sistemático de coleta de genesda nossa fauna e flora e muitosdesses genes possuem bom potencialde utilização nas áreas de agriculturae saúde, por exemplo, por suas propriedadesmedicinais. A tecnologiapermitirá descobrir as funções dessesgenes com maior rapidez e eficiência.A tecnologia de utilização de biofábricaspara produção de fármacos valorizaainda mais o agronegócio brasileiro,já que permite a agregação de valora produtos agropecuários, comoplantas e animais. Além disso, favorecea integração entre o mercado agrícolae o setor farmacêutico e quemmais ganha com isso é a populaçãobrasileira, que vai poder contar comprodutos mais econômicos e saudáveis.BC&D - O senhor falou de outrosbenefícios para a área de saúde,como o câncer de mama, que é amaior causa de mortalidade atualda população feminina no Brasil.Poderia explicar melhor essa pesquisa?Rech – Essa pesquisa está sendo desenvolvidapela Embrapa RecursosGenéticos e Biotecnologia, em parceriacom a Universidade de Campinas(Unicamp); a Universidade de Brasília(UnB) e a Universidade de Montevidéu,no Uruguai, e tem como objetivodesenvolver variedades de sojatransgênica com anticorpos anticâncercontra o câncer de mama. Essas variedadesserão utilizadas para produçãode fármacos que atuarão na prevençãoe diagnóstico da doença e terãotambém potencial terapêutico, mesmocom o câncer em estágio avançado.È importante salientar mais umavez que elas não serão usadas na cadeiaalimentar, mas apenas como me-4 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

dicamentos.Os anticorpos monoclonais para usoclínico movimentam mais de US$ 1bilhão nos EUA. No Brasil, a utilizaçãodesses anticorpos na área médica aindaé pequena. O principal anticorpomonoclonal usado clinicamente é oanti-CD3, que atua na prevenção darejeição decorrente de transplantes deórgãos. O Instituto Butantã, de SãoPaulo, produz e distribui esse medicamentono Brasil.Os métodos e estratégias para produçãode novos anticorpos evoluíram,incorporando a manipulação genética,e a flexibilidade nessa manipulaçãofez desses anticorpos produtos dealto valor econômico e com grandesperspectivas de utilização, especialmentepara a prevenção e tratamentode algumas enfermidades.BC&D - Que outras doenças estãona mira das instituições brasileirasde pesquisa a partir de técnicasbiotecnológicas?Rech – Estamos obtendo resultadosinteressantíssimos com técnicas biotecnológicaspara combater uma dasdoenças que mais aflige a sociedadeatual, a AIDS. Essa é mais uma provade que a tecnologia dos transgênicosnão é usada apenas para aumentar aprodutividade das lavouras. Organismosgeneticamente modificados já sãoamplamente utilizados em vacinashumanas e, no momento, estamosavançando rapidamente no uso dessesorganismos para combater a AIDS.A pesquisa ainda está em fase de testese se baseia na introdução da cianovirina(proteína presente em algas)em plantas de soja, milho e tabacopara a sua produção em larga escala.Esta proteína é capaz de impedir amultiplicação do vírus no corpo humano.Os estudos estão sendo desenvolvidosem consórcio com a participaçãodo Instituto Nacional de Saúde dosEstados Unidos, Universidade de Londres(Inglaterra), Embrapa e um gruposul-africano. A intenção é produziro produto em gel (com propriedadesgermicidas) para que as mulheres apliquemna vagina antes do relacionamentosexual.É um método paliativo até que a vacinacontra essa doença esteja pronta.As estratégias adicionais são importantesaliadas no combate à AIDS. Entreessas, destaca-se o uso de preservativosque tem demonstrado grande eficáciana prevenção da transmissão doHIV. Entretanto, preservativos continuama ser controlados quase queexclusivamente pelo parceiro masculinoe em muitas sociedades a mulhernão pode negociar a utilização do preservativo.Por isso, um método de prevençãofeito exclusivamente para ouso feminino é altamente desejável.Também já sabemos que os sistemasde plantas transgênicas ofereceremmuitas vantagens para a produção decianovirina que pode ser largamenteescalonada até a quantidade adequada.Aliado a esse fato está o benefíciodo baixo custo do investimento requerido.Sementes de soja, milho e tabacosão candidatos potencialmente interessantescomo biorreatores, mas porenquanto ainda não sabemos qual dastrês espécies produz o maior teor deproteínas pelo menor custo. Somenteo desenvolvimento das pesquisas poderáindicar o melhor caminho.BC&D – Voltando a um ponto levantadopelo senhor, que é aquestão da coleta de genes na biodiversidadebrasileira: isso significaque muitas respostas paradesafios atuais podem estar no estudogenético das enormes potencialidadesda flora e da fauna brasileira.Para encerrar nossa entrevista,gostaria que nos falasse umpouco mais sobre esse assunto.Rech – Sem dúvida. A biotecnologiae a biodiversidade andam de mãosdadas em prol da ciência e do progressono Brasil. Um exemplo clarodisso é uma pesquisa que começoucom a coleta de aranhas da biodiversidadebrasileira e que hoje está emfase avançada e pode beneficiar diversossetores da indústria.A manipulação das proteínas encontradasnas teias de espécies de aranhasda biodiversidade brasileira – coletadasem três diferentes biomas:mata atlântica, Amazônia e cerrado -mostrou que a fibra da teia de aranhaé um dos fios mais resistentes e flexíveisda natureza, capaz de agüentar opeso da própria aranha a 80 quilômetrosde altura.De posse desse conhecimento, a EmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia,a Universidade de São Paulo (USP) e oInstituto Butantã se uniram para isolar osgenes dessas aranhas e investir em técnicasde engenharia genética que permitamaproveitar essas características emprol do desenvolvimento industrial .A pesquisa envolve várias etapas e a primeiraconsistiu no isolamento dos genesde interesse dessas aranhas para depois,em uma segunda fase, transferi-los paraplantas de algodão visando à produçãode fios mais resistentes. O objetivo é conseguirque a proteína da teia de aranhaseja incorporada à fibra do algodão, tornando-amais resistente. Os avanços daindústria têxtil levaram ao desenvolvimentode máquinas muito rápidas, eosfios do algodão não resistem a essa rapideze se quebram. Por isso, são necessáriosfios mais resistentes e, acima de tudo,mais flexíveis, e o que interessa de fatoà indústria é conseguir reunir resistênciae flexibilidade. O novo tecido, resultantedo desenvolvimento dessa pesquisa,pode ter aplicação direta para a confecçãode roupas esportivas e equipamentosde segurança, por exemplo. Por isso,despertou o interesse do Ministério daDefesa e hoje o Centro de Tecnologiado Exército brasileiro é um dos parceirosno desenvolvimento dos estudos,além da Universidade de Wyoming(EUA).Mas a transferência de genes para plantasde algodão é apenas uma das aplicaçõespara essa tecnologia. Pretendemostambém desenvolver plantas de sojatransgênicas com genes das aranhas eutilizar animais como biofábricas paraprodução do polímero no leite.Em 2007, conseguimos desenvolver asprimeiras proteínas das teias em laboratórionas folhas e sementes de soja. Estamostentando também produzi-las noleite de animais transgênicos, para avaliarqual sistema transgênico será mais eficientepara a produção em larga escalae custo mais reduzido dos biopolímeros.Além de resultar em inúmeras aplicaçõese benefícios para o desenvolvimento dediversos setores da economia brasileira,o fato de os estudos serem baseados emaranhas brasileiras permite agregar valorà nossa biodiversidade, o que é muitopositivo.Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 5

Colaboraram nesta edição:BIOTECNOLOGIACiência & DesenvolvimentoKL3 Publicações Ltda.FundadorHenrique da Silva CastroDireção Geral e EdiçãoAna Lúcia de AlmeidaE-mailbiotecnologia@biotecnologia.com.brPortalwww.biotecnologia.com.brDepartamento Comercial,Redação e Edição:SHIN CA 02 Bloco CEdifício Garden Place salas 225/226Lago-NorteBrasília - DFCEP: 71503-502Adelaide Maria de Souza AntunesAdriana Campos Moreira BritoAlexander Machado CardosoAline da Silva TurqueAntonio Amilton ChavesAntonio Basílio de MirandaBoutros Fouad SarrouhCynthia Barbosa da SilveiraElíbio RechFátima de CarvalhoGuilherme MuricyHélia Harumi SatoJuan Daniel RivaldiLuciana Francisco FleuriMarcos CatanhoMaria Rosa Machado PradoMaysa Mandeta ClementinoOrlando Bonifácio MartinsPaola Gomes PassagliaQueli Cruz BastosRicardo Pilz VieiraRoberta Márcia Marques dos SantosRodolfo FioriloRogério Saad VazSílvia Ligório FialhoSilvio Silvério da SilvaVadim R. VivianiOs artigos assinados são deinteira responsabilidadede seus autores.ISSN 1414-6347Nota: A Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento éindexada na AGROBASE (Base Nacional de Dados da AgriculturaBrasileira) BINAGRI - Biblioteca Nacional de Agricultura - MAPA -Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.), no AGRIS(International Information system for the Agricultural Sciencesand Technology) da FAO e atende a obrigatoriedade de DepósitoLegal na Biblioteca Nacional do Rio de janeiro- Fundação BibliotecaNacional.6 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

PesquisaLUCIFERASES DE VAGALUMESPesquisaESTRUTURA, FUNÇÃO E APLICAÇÃO EM BIOANÁLISE E BIOIMAGEAMENTOI. INTRODUÇÃObioluminescência é a emissãode luz fria e visível pororganismos vivos. Ela ocorreentre as bactérias, fungos,algas, celenterados,moluscos, artrópodes, anelídeos, equinodermase peixes; (Herring, 1987). Abioluminescência é um tipo especial dequimioluminescência, biologicamentefuncional, catalizada por enzimas, resultantede oxidações altamente exergônicasnas quais a energia é liberadapreferencialmente na forma de luz.Qualquer célula viva produz quimioluminescênciaultrafraca, como subprodutodo metabolismo oxidativo, aparentementesem função biológica (Lee,1989). Na bioluminescência a emissãode luz é visível, assumindo importantesfunções comunicativas intra- e inter-específicas,dentre as quais destacam-sea atração sexual, defesa, camuflagem eatração de presas. Basicamente umareação bioluminescente envolve a oxidaçãopor oxigênio de compostos genericamenteconhecidos por luciferinas.Estas reações são catalisadas por enzimasdenominadas de luciferases. O sistemabioluminescente de fungos é oúnico no qual a luminescência aparentementenão é catalisada por enzimas(Wilson and Hastings, 1998). Durante aoxigenação das luciferinas, são formadosintermediários peroxídicos altamenteinstáveis e ricos em energia, cuja clivagemtérmica gera produtos carbonílicos,um dos quais no estado excitado singleteque se desativa emitindo fluorescência(Wilson, 1995). Os rendimentosquânticos de bioluminescência (númerode fótons emitidos por molécula deluciferina oxidada) são em geral elevadosdevido aos sítios ativos das luciferasesque catalisam eficientemente a oxidaçãodas luciferinas e fornecem microambientesaltamente protetivos parao produto excitado, evitando que estese desative por outros processos nãoradiativosAs luciferases constituemportanto casos especiais de oxigenasesotimizadas para a emissão de luz.Vadim R. Viviani - Prof. Dr.Prof. Adjunto - BioquímicaLaboratório de Bioluminescência eBiotecnologia-UNISOUniversidade Federal de São CarlosCampus de Sorocaba, SP, Brasilviviani@ufscar.brbioluxgen@hotmail.comFigura 1. Besourosbioluminescentes da faunabrasileira: (A) vagalumelampirídeo; (B) larva trenzinho(Phengodidae) e (C) vagalumeelaterídeo (Fotos V.Viviani)Luciferina + O 2→ Intermediárioperoxídico →Oxiluciferina* s →Oxiluciferina+ hνBiodiversidade de insetosbioluminescentes.A bioluminescência ocorre predominantementeno ambiente marinho. No ambienteterrestre, a bioluminescência éencontrada pincipalmente na classe dosinsetos, que é a mais rica em espécies8 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

ioluminescentes. A bioluminescênciaé encontrada em ca de 2000 espéciesnas ordens Diptera, Collembola e principalmenteColeoptera (Lloyd, 1983). Naordem Collembola foram descritas espéciesluminescentes nos generos Lipurae Neanura, entretanto as funçõesbiológicas e a natureza química da bioluminescênciapermanecem completamenteobscuras (Harvey, 1952). Os fulgorídeos,da ordem Homoptera, tambémforam incluídos, entretanto a presençade luminescência própria neste grupoainda é incerta (Lloyd,1978). Recentementeespécies luminescentes form descritasem Blattodea (Zompro and Fritzsche,1999).Entre os coleópteros, a superfamília Elateroideainclue as principais famílias deinsetos luminescentes (Lawrence andNewton, 1995): Lampyridae, Phengodidae,Homalisidae, Telegeusidae, Elateridae.As famílias mais numerosas emespécies luminescentes são Lampyridae,Elateridae e Phengodidae (Lloyd, 1978)(Fig.1). Foram descobertas também espéciesbioluminescentes na família Staphylinidae(Costa et al., 1986).Lampyridae. A família Lampyridae inclueos vagalumes propriamente chamados,comca de 1800 espécies descritasno mundo e possivelmente omesmo número ainda para ser descritona região Neotropical (Lloyd, 1971). Oslampirídeos são coletivamente conhecidospor vagalumes e na fase adultaemitem luz pela região ventral dos últimossegmentos abdominais por meiode lampejos para finalidade de atraçãosexual (Lloyd, 1978). As larvas tambémsão luminescentes. A função da luminescênciana fase larval é ainda controvertida,possivelmente estando associadaa defesa (aposematismo, alarmee distração; Sivinsky, 1981).Elateridae. A família dos elaterídeos incluica de 9000 espécies descritas, dasquais apenas ca de 200, pertencentesas subfamílias Agrypinae e Campyloxeninaepossuem espécies luminescentes(Costa et al., 1988). Na fase adulta aslanternas estão localizadas na forma deduas vesículas ovaladas sobre o protóraxque emitem luz contínua na regiãodo verde, e uma lanterna abdominalque é ativada somente durante o vôo,que também emite luz contínua, masem geral de cromaticidade deslocadapara o vermelho em relação as lanternastorácicas (Bechara, 1988). A luminescêncianesta família também estáassociada com a atração sexual, entretantoo sistema de comunicação é aparentementemais simples do que noslampirídeos (Lloyd, 1971), mas permanecepouco estudado. As lanternas torácicastambem podem ter importantefunção defensiva.Figura 2. Luciferina e seus produtos de oxidaçãoPhengodidae. Os fengodídeos constituemuma família pequena, com ca de170 especies descritas, a maioria se nãotodas luminescente. No Brasil foramdescritas 50 espécies dentro da subfamíliaPhengodinae, a maioria dentro datribo Mastinocerini, mas um númeromaior de espécies ainda está para serdescrito. Anteriormente descobrimos 3espécies novas de fengodideos (Wittmer,1993, 1996) na região Central doBrasil. Nesta última tribo os machosadultos possuem luminescência na formade lanternas puntiformes laterais nossegmentos abdominais e torácicos, enquantoque as fêmeas e larvas possuempares de lanternas puntiformes lateraisao longo do corpo inteiro, e umaou duas lanternas cefálicas que emitemluz na faixa do verde-amarelado ao vermelho(Viviani and Bechara, 1993, 1997)(Fig. 1). A larva trenzinho de Phrixotrix,além de apresentar lanternas verde aolongo do corpo, são as únicas a apresentarembioluminescência vermelha.A Bioquímica dabioluminescência dos vagalumesO sistema luciferina-luciferase de coleópterosé um dos sistemas bioluminescentesmais conhecidos. A primeira luciferinae luciferase de insetos a serempurificadas foram as do lampirídeo norte-americanoPhotinus pyralis (Green &McElroy, 1956; Bitler & McElroy, 1957).O progresso alcançado na elucidaçãodas propriedades do sistema luciferinaluciferasede coleópteros se deve principalmenteao estudo do sistema destaespécie, abundante nos EUA. A luciferinade lampirídeos é um compostobenzotiazólico (Fig. 2) de peso molecular280 Da. Foi sintetizada pela primeiravez por White e colaboradores(1961, 1963), juntamente com a desidroluciferina(Fig. 2), seu produto de autooxidação.As luciferinas de outras espéciesde lampirídeos, bem como asdos elaterídeos (Colepicolo et al., 1986)e fengodídeos (Viviani and Bechara,1993) são essencialmente idênticas.A luciferase de vagalumes catalisa aoxidação da luciferina por oxigênio, ativadapor MgATP. São enzimas bifuncionais.Na primeira etapa da catálise enzimática,a luciferase atua como adenil-transferase,adenilando a luciferinaa partir de ATP e liberando pirofosfato(Fig.3). Esta etapa é essencialmente semelhantea reação de ativação de ácidosgraxos e outros ácidos carboxílicosaromáticos catalizado pelas acylCoA:sintetases (DeLuca and McElroy,1978), com as quais compartilham elevadograu de homologia (Wood, 1995).Em seguida a luciferase atua como oxigenase,removendo o próton do carbonoalfa a carbonila, tornando-o suscetívelao ataque por oxigênio molecular,com a produção do intermediário dioxetanônico(Fig.4; Wannalund, 1978),cuja clivagem produz dióxido de carbonoe oxiluciferina excitada. De acordocom DeLuca & McElroy (1974), aabstração do próton 4 do anel tiazínicoconstitui a etapa limitante da reaçãocatalisada pela luciferase.Origem dos sistemas bioluminescentesde insetos. Uma das questões maisintrigantes concernentes a bioluminescênciaé como este processo pode terse originado ao longo da evolução.Embora o mecanismo básico de toda abioluminescência envolva a oxigenaçãode uma luciferina gerando um intermediárioperoxídico, a natureza químicadas luciferinas, luciferases e cofatoresparticipantes difere consideravelmentede um grupo de seres vivos para outro,o que levou desde cedo à conclusãode que a bioluminescência possa ter seoriginado muitas vezes independentementeno decorrer da evolução (Seli-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 9

ger & McElroy, 1965; Hastings,1995). Em insetos, dados morfológicose bioquímicos sugeremque pelo menos três sistemasdiferentes (um em coleópterose dois em dípteros)são encontrados (Viviani,2002). Entretanto, a falta de estudossobre outros grupos,sugere a existência de novossistemas.A origem e possível função primitivada luciferina permanecemobscuras. Estudos de marcaçãoisotópica sugerem quea luciferina se origina da fusãodo amino­ácido cisteínacom benzoquinonas. Compostosbenzotiazólicos são comunsem pigmentos (Wood, 1995). Aluciferina de besouros foi encontradaunicamente em espéciesluminescentes, não havendoindícios em espécies nãoluminescentesde famílias filogeneticamentepróximas como Cantarídae (Viviani, tesede doutorado). Foi sugerido que a luciferinade coleópteros poderia originalmenteter papel antioxidante. Entretanto, aocorrência limitada a apenas espécies luminescentesargumenta contra esta possibilidade.É possível que a luciferina possaoriginalmente ter sido um intermediárioda biossíntese de pigmentos (Viviani,2008 no prelo).AS LUCIFERASES DECOLEÓPTEROSAs luciferases de vagalumes são monômeroscataliticamente ativos de ca 60 kDa(DeWet et al., 1985). A ca de 20 anos ocDNA para a luciferase do vagalume americanoPhotinus pyralis foi clonado, sequênciadoe a estrutura primaria da proteínafoi deduzida (DeWet et al., 1985). OcDNA da luciferase de Photinus pyralis éum fragmento de ca 1.6 kb que codificaum polipeptídeo de 550 resíduos de aminoácidos.A luciferase possui uma sequênciasinalizadora Ser-Lys-Leu que a dirigeapós a tradução para peroxissomas, asorganelas às quais está associada nos fotócitos(Gould et al., 1967). Desde então,os cDNAs que codificam uma variedadede luciferases, a maioria oriundos da famíliaLampyridae (Tatsumi et al., 1989;Kajiyama & Nakano, 1991; Devine et al.,1993; Sala-Newby et al., 1993; Ohmiya etal., 1995; Liu et al., 1996) foram clonadose sequênciados. As luciferases de lampirídeossão polipeptídeos de 546-550 resíduos,apresentam propriedades semelhantese preservam entre sí de 67 a 94% deidentidade a nível de estrutura primária(Wood, 1995). As luciferases de elaterídeossão polipeptídeos de 542-543 resíduose compartilham entre 82-99% identidadeFigura 3. Mecanismoenzimático dabioluminescênciacatalisado pelasluciferases devagalumesentre sí (Wood, et al., 1989; Viviani etal., 1999b). Nosso grupo clonou e determinouas sequências das luciferasesde 3 fengodideos (Viviani et al., 1999a;Ohmiya et al., 2000) (Fig.4, 5) e de umelaterídeo (Viviani et al., 1999b) queemitem na faixa do verde ao vermelho.As luciferases de fengodídeos são polipeptídeosde 543-546 resíduos, apresentam56-71% de identidade entre sí (Gruberet al., 1996; Viviani et al., 1999 a ;Ohmiya et al., 2000) e 46-50% de identidadecom as demais luciferases de lampirídeose elaterídeos.A analogia entre as reações de adenilaçãodas luciferases de coleópteros eaminoacyl-tRNA sintetases e acylCoAsintetases foi desde cedo reconhecida(DeLuca and McElroy, 1968). Com oadvento da biologia molecular descobriu-seque muitas as acyl CoA sintetasese outras ligases são homólogas àsluciferases.Estrutura tridimensional daluciferase de vagalumesA estrutura tridimensional da luciferasede Photinus pyralis foi originalmente resolvidapor cristalografia de raios X naausência dos substratos, mostrando umagrande domínio N-terminal e uma pequenodomínio C-terminal que provavelmentese aproximam para envolveros substratos durante a catálise (Fig. 6)(Conti et al., 1996). A determinação daestrutura tridimensional de outras AMPligasesmostrou que o domínio C-terminalpode assumir diferentes graus derotação em relação ao domínio N-terminaldependendo da enzima (May etal., 2002; Gulick et al., 2003). Evidênciassugerem que os dois domínios assumemuma conformação similar em diferentesenzimas durante aetapa de adenilação, ao passoque nas etapas subsequentesos dois domínios podemapresentar diferentesgraus de rotação dependendoda enzima (Gulick et al.,2003). Mais recentemente, aestrutura cristalográfica da luciferasedo lampirídeo japonês,Lucíola cruciata, foi resolvidana presença do análogoDLSA e dos produtosoxiluciferina e AMP, mostrandoalgumas diferenças comos modelos propostos(Nakatsu et al., 2006) (Fig.6).O sítio-ativo. O sítio ativo estálocalizado num bolsão no interiordo domínio N-terminal,que faz face para o domínioC-terminal, sendo que váriosresíduos conservados se encontramnas interfaces destes dois domínios.Estudos de comparação de sequencias,modelagem e mutagênese sítio-dirigidamostraram as regiões e resíduosdo sítio de ligação do ATP(Contiet al., 1997; Franks et al., 1998; Branchiniet al., 1998; Sandalova e Ugarova,1999). Os módulos I [(198SSGSTGL-PKG207), II (340YGLTE344) e III(418LHSGD422)] são particularmenteconservados nestas enzimas, sugerindoque estejam envolvidos com a funçãode ligação de ATP e de adenilação(Morozov and Ugarova, 1997). O moduloI, consiste em um loop altamenteflexível que separa o sítio de ligaçãodo ATP do sítio de ligação para o substratocarboxílico (May et al., 2002), queé variável, e está envolvido com a liberaçãode pirofosfato durante a adenilação.Em algumas ligases os resíduos quecorrespondem à Gly315 e à Arg437 nasluciferases de vagalumes podem estarenvolvidos com a adenilação. O resíduoconservado Lys 529 é importantepara o posicionamento e estabilizaçãodo grupo carboxila da luciferina e dosfosfatos do ATP nas luciferases (Branchiniet al., 2000).Foi especulada também a existência deum sítio de ligação para Coenzima A(CoA) na luciferase, visto que a muitotempo é sabido que o CoA afeta a cinéticada reação bioluminescente(Wood, 1995). Estudos recentes mostramque a CoA é importante para remoçãodos inibidores L-luciferina e desidroluciferina,e também no processo de epimerizaçãoda L-luciferina em D-luciferina,o substrato real da bioluminescência.Na estrutura tridimensional da acylCoA sintetase, a CoA aparece localizadana superfície da proteína entre osdomínios N e C-terminal, com a porção10 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

fosfopanteteina posicionada próximaao sítio de ligação do AMP(Gulick et al., 2003). Evidênciassugerem que a ligação da CoApromova a rotação do domínioC-terminal.Estudos de modelagem (Branchiniet al., 1998; Sandalova e Ugarova,1999), mutagênese sítio-dirigidae mais recentemente a resoluçãoda estrutura tridimensionalda luciferase na presença doanálogo DLSA revelou a identidadedos resíduos do sítio de ligaçãoda luciferina (Fig.6). A fotooxidaçãocom um análogo deluciferina e estudos de mutagênesemostraram que o peptídeo244HHFG245 está em proximidadeda luciferina (Branchini et al.,1997). Evidências indiretas tambémforam obtidas baseadas nasestruturas tridimensionais da fenilalaninasintetase com ATP e fenilalanina(Conti et al., 1997) e daluciferase de Photinus pyralis empresença do inibidor competitivoda luciferina, bromofórmio(Franks et al., 1998). Baseadosnestas informações dois modelosde sítio ativo foram propostos.Estes modelos em geral concordamentre sí, embora algumasdiferenças importantes sejam evidentes.De acordo com um dosmodelos, o resíduo Arg218 é aparentementeimportante para a estabilizaçãodo fenolato da luciferina(Branchini et al., 1998), enquantoque no outro modelo, oresíduo Arg337 está mais próximodo fenolato para fazer esta interação(Sandalova e Ugarova, 1999). A resoluçãoda estrutura tridimensional daluciferase de Lucíola cruciata na presençade DLSA e de oxilucifeina comAMP mostrou que a isoleucina 288 estápróxima do grupo fenolato do anel benzotiazólico,criando um microambientehidrofóbico e rígido, apropriado para aemissão de luz verde (Nakatsu et al.,2006).Determinantes estruturais dosespectros de bioluminescênciaA variedade de cores da bioluminescênciaencontrada nos besouros é atribuívelessencialmente às diferentes luciferases,desde que as luciferinas sãoidênticas nas três famílias. As luciferasesde coleópteros elateroides dividemseem dois grupos de acordo com asensibilidade espectral ao pH (Vivianiand Bechara, 1995): (I) as luciferasespH-sensitivas que incluem as luciferasesde lampirídeos, sofrem deslocamentobatocrômico mediante abaixamentoFigura 4. (Painel superior) Larva trenzinhoPhrixotrix hirtus, (Painel inferior) colônias debactérias E. Coli tornadas bioluminescentesapós transformação com plasmídeos contendoos cDNAs clonados das luciferases emissorasde luz verde e vermelha de Phrixotrix.de pH, aumento de temperatura e concentraçãode cátions (Seliger and McElroy,1964) e (II) luciferases pH-insensitivasque incluem as luciferases de fengodídeose elaterídeos, que não sofremdeslocamento batocrômico mediante diminuiçãodo pH, aumento da concentraçãode cátions de metais pesados divalentesou aumento de temperatura (Vivianiand Bechara, 1995).Mecanismos de modulação de coresde bioluminescência. Em princípio ascores da bioluminescência são governadasa nível de sítio ativo das luciferasespor tres fatores estruturais (Fig. 7):(1) efeitos não-específicos como polaridade(DeLuca, 1969) e polarização orientadado sítio ativo (Ugarova, 2000),determinada pela natureza dos resíduosque o compõem; (2) efeitos específicosde interação de resíduos ácidobásicosno sítio ativo das luciferasescom a oxiluciferina (White & Branchini,1975). O processo de tautomerizaçãoda oxiluciferina excitada na presençade resíduos básicos foi originalmenteproposto (a forma cetônica emite luzvermelha e a forma enólica emiteluz verde-amarela), entretanto, recentementeexperimentos com oadenilato do 5,5 dimetil-análogoda luciferina mostraram que a formacetônica pode emitir tanto luzverde-amarela como vermelha, tornandoa hipótese da tautomerizaçãoimprovável (Branchini etal., 2002); (3) a rotação dos anéistiazínicos da oxiluciferina em tornoda ligação C 2-C 2', que está emfunção da geometria do sítio ativo(McCapra et al.,1994) (Fig.6).Mais recentemente foi propostoque a delocalização de cargas naforma ceto-aniônica constitue fatordeterminante para os espectrosde bioluminescência (Branchiniet al., 2004). Estudos teóricosapoiam parcialmente esta últimahipótese, sugerindo que ocontrole exercido pelo microambienteda luciferase no grau depolarização dos grupos fenolatoe ceto-enol determina os espectrosde bioluminescência (Orlovaet al., 2004). Através de deconvoluçãoespectral, Ugarova e col.(2005) sugeriu a existência de trêsespécies emissoras que contribuiriamnos espectros de bioluminescênciadas luciferases de lampirídeos:(ceto-fenolato) que emitirialuz vermelha; (enol/fenolato)emissor de luz laranja e (enolato/fenolato)o emissor de luz verde.Estudos com a quimioluminescênciade adenilato de luciferinaem meio aquoso e na presençade soroalbumina bovina sugeremque a bioluminescência vermelha requerum microambiente menos estruturadoque a bioluminescência verde(Viviani e Ohmiya, 2006).As luciferases de lampirídeos. A maioriados estudos de estrutura e funçãotem utilizado principalmente as luciferasesde lampirídeos. A construção dequimeras entre as luciferases de lampirídeosrevelou que a região entre osresíduos 209-318 é determinante dascores nas luciferases de lampirídeos(Ohmiya et al., 1986). Entretanto, a mutaçãode vários resíduos isolados ao longoda estrutura primária das luciferasesde lampírideos afeta drasticamente a corda bioluminescência, em geral resultandoem mutantes vermelhos (Kajiyama& Nakano, 1991). A mutação de váriosresíduos conservados do sítio-ativo,entre os quais R218, H245, T343, tambémteve efeitos dramáticos nos espectrosde bioluminescência das luciferasesde lampirídeos (Branchini et al.,1998,2000, 2003).As luciferases pH-insensitivas. As lu-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 11

ciferases de elaterídeos e fengodídeossão muito menos propensas a mudançasde cor mediante mutações. Poucasmutações afetam os espectros de emissãodas luciferases emissoras de luzverde, e um número muito menor temum efeito dramático. A construção dequimeras com as isoenzimas do elaterídeoPyrophorus plagiophthalamus sugereque a região entre os resíduos 220-247 deve ter papel determinante para acor da bioluminescência nas luciferasesde elaterideos (Wood et al., 1990).Estudos de mutagênese sítio-dirigida daluciferase de Pyrearinus termitilluminansmostram que o espectro desta luciferaseé mais resistente a mudançasestruturais do que as luciferases de fengodídeos,embora ambas sejam pH-insensitivas(Viviani et al., 2001, 2002).As luciferases de fengodídeos. Nas luciferasesde fengodídeos emissoras deluz verde, poucas mutações tiveram efeitodramático no espectro. A construçãode quiméras com as luciferasesemissoras de luz verde e vermelha sugereque a conformação da região entreos residuos 220 e 344 tem importanteinfluência na cor da bioluminescênciaem fengodídeos (Viviani and Ohmiya,2000). Identificamos Arg215 comoum resíduo importante para a emissãode luz verde. Entretanto ainda não estáclaro se o papel deste resíduo está relacionadocom a estabilização do enolatoque emite luz verde, como sugeridopor Branchini e col (1998), ou com interaçõesimportantes para a manutençãoda estrutura do sítio ativo ou osdois processos (Viviani and Ohmiya,2000). Outro resíduo cuja substituiçãotem efeito dramático nos espectros daluciferases de fengodídeos emissoras deluz verde ou amarela é o resíduo T226.Foi proposto que Arg215 e Thr226 poderiaminteragir direta ou indiretamentepara manter uma conformação apropriadado sítio ativo para a emissão deluz verde (Viviani et. Al., 2002). Notavelmente,embora a substituição destesresíduos afete dramaticamente os espectrosdas luciferases verde e amarela, elasnão tem efeito na luciferase vermelhas,mostrando que R215 e T226 são funcionaisapenas para emissão de luz verde/amarela(Viviani et al., 2007). Estudosextensivos de mutagênese sítio-dirigidatambém mostraram que, com aexceção dos resíduos R215, Y224 eT226, a substituição de vários outrosresíduos ao longo da estrutura primáriada luciferase verde, inclusive de resíduosinvariáveis do sítio-ativo, não afetamou afetam apenas moderadamenteos espectros de bioluminescência destaluciferase, enquanto nenhuma substituiçãoaté agora afetou os espectrosda luciferase vermelha (Viviani et al.,Figura 5. Sequencias de amino-ácidos das luciferases emissoras de luzvermelha (PxRE) e verde (PxGR) clonadas a partir das larvas trenzinhoPhrixotrix spp (Viviani et al., 1999)2006, 2007). No conjunto estes resultadossugerem que a estrutura do sítioativo da luciferase verde seja mais estabilizadado que aquela da luciferase vermelha,e que a explicação para estasdiferenças de espectros de bioluminescênciaesteja mais relacionada a mudançasconformacionais durante a etapade emissão, do que na composiçãode resíduos do sítio-ativo.A sensibilidade ao pH.Após a clonagem de várias luciferasesde fengodídeos e de elaterídeos (Vivianiet al., 1999 a ,b; 2000), identificamosum conjunto de resíduos conservadosque diferem entre as luciferases pHdependentese as luciferase pH-independentes,que poderiam estar envolvidoscom o efeito pH (Fig. 5) (Vivianiet al., 1999b). Entre estes o resíduo 226(Thr em elaterídeos e fengodídeos e Asnnas luciferases de lampirídeos) constitueum resíduo-chave para emissão deluz verde-amarela (Viviani et al., 2001).O resíduo Gly247 em luciferases pHdependentese o respectivo Ala243 naspH-independentes afetam sensivelmentea sensibilidade ao pH, provavelmentepor interferirem com a flexibilidade desegmentos importantes no sítio ativo dasluciferases (Viviani et al., 2002). Entretanto,até pouco tempo, nenhum resíduotransformou uma luciferase pH-insensitivaem pH-sensitiva. Nossos resultadossugerem que o sítio ativo das luciferasespH-independentes é mais rígidograças a estabilização por forçashidrofóbicas gerando apenas uma espécieemissora. O sítio-ativo das luciferasesde lampirídeos é mais flexível ehidrofílico podendo originar duas espéciesemissoras dependendo de suaconformação (Viviani et. al., 2001).Mais recentemente, com a clonagemde duas luciferases pH-sensitivasde vagalumes brasileiros, inclusivea luciferase de Macrolampis que naturalmenteapresenta um espectro bimodal,identificamos que a substituiçãoE354N determina o aparecimento doombro no vermelho no espectro (Vivianiet al., 2005).A partir de estudos de modelagem e mutagênesesítio-dirigida, começamos aidentificar os resíduos que participamna determinação da sensibilidade aopH. Identificamos uma rede de resíduosque interagem entre sí por pontesde hidrogênio e pontes salinas que nasluciferases pH-sensitivas atuaria comouma comporta para o sítio-ativo (Vivianiet al., 2008) (Fig.9). Em especial, verificamosque vários resíduos que afetamos espectros de emissão estão localizadosno loop entre os resíduos 223-235 (Viviani et al., 2007) (Fig.8). Este loopatua como uma presilha que fixa partesdo sítio de ligação da luciferina, atravésdas ligações de hidrogênio dos re-12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

síduos Y227 e N229 (Fig.9). A rupturadas interações destes resíduos atravésde mutagênese, tem efeito dramáticonos espectros de ambos os grupos deluciferases, resultando em espectros quevariam temporalmente e que afetam asensibilidade ao pH (Viviani et al., 2007).Estes resultados indicam que a mobilidadedeste loop tem um papel crucialna determinação dos espectros de bioluminescênciae da sensibilidade ao pH(Viviani et al., 2007). Mudanças de pHpoderiam afetar a entrada de agua nosítio ativo, tornando-o mais polar e deslocandoo espectro de emissão para overmelho (Viviani et al., 2007, 2008).Figura 6. Estrutura tridimensional da luciferase de vagalumes, mostrando osítio de ligação da luciferinaOrigem e evolução molecularEmbora as luciferases sejam funcionalmenteclassificadas como oxigenases,estas enzimas não apresentam homologiaindicando que as luciferases nãose originaram a partir de oxigenases,como havia sido proposto originalmente(Rees et al., 1998). É mais provável quea função oxigenásica das luciferasestenha sido aperfeiçoada após a origemdo fenótipo luminescente, tendo sido abioluminescência que dirigiu a evoluçãode novas oxigenases e não o contrário(Rees, et al., 1998).No caso dos coleópteros, as luciferasesprovavelmente se originaram a partir deuma AMP-ligase (Schroeder, 1989; Suzukiet al., 1990; Toh, 1990; Scholten etal., 1991) com alguma função metabólicapor duplicação gênica (Fig.10). Enzimastipo-luciferases com a capacidadede emitir quimioluminescência fracana presença de luciferina e ATP foramencontradas em larvas de besourosnão-luminescentes de Tenebrio molitore outras larvas de coleópteros (Vivianiand Bechara, 1996). Estas ligasespodem ser enzimas parálogas às luciferasesmuito semelhantes às protoluciferasesque deram origem às luciferasesde coleópteros. Estas ligases poderiamcatalisar a formação do adenilatode luciferina, que é espontâneamentequimioluminescente em meio aquosoalcalino, embora com baixo rendimento(Seliger and McElroy, 1962). Emborao rendimento luminoso destas ligasesseja muito baixo para que a luminescênciatenha sido selecionada com basena sua visibilidade, é possível que aluminescência da protoluciferase originalfosse mais alta do que nas enzimastipo-luciferases encontradas em outrosbesouros. De fato, recentemente demonstramosque proteínas como BSA,que tem sítios hidrofóbicos para compostosaromáticos, aumentam consideravelmenteo rendimento de quimioluminescênciavermelha do adenilato deluciferina em sistema aquoso (Viviani eOhmiya, 2006). Alternativamente, a luminescênciaoriginal poderia desempenharalgum outro papel desconhecido.Em bactérias por exemplo, evidênciasrecentes suportam um papel importanteda luminescência no processo defotoreativação do DNA (Czys et al.,2003). Uma vez selecionada com basena luminescência, a estrutura da luciferaseevoluiu para a otimização da emissãode luz de diferentes cores para diferentesfinalidades.Aplicações biotecnológicas dasluciferases de coleópterosFigura 7. Mecanismos de determinação das cores de bioluminescência pelosítio-ativo das luciferases de besouros (de acordo com V.Viviani et al., 2008)Luciferina-luciferase como reagentesbioanalíticos. Após a purificação daprimeira luciferina e luciferase de vagalumesna década de 50, inúmeras aplicaçõesenvolvendo a quantificação deATP para fins analíticos e clínicos apareceram.Entre estas aplicações destacaram-sea monitoração de biomassa(Schram et al, 1989), avaliação da contaminaçãomicrobiológica de alimentos,bebidas, águas e fluídos biológicosBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 13

utilizados como marcadores sensíveisde células cancerígenas, auxiliando noestudo de metastatização e no desenvolvimentode novas terapias. A bioluminescênciaé o único método comsensibilidade suficiente para detectarmetástases em sua fase inicial. Entretanto,por ser uma técnica nova, seuuso permanece limitado a modelos animais.A derivação de genes terapêuticostambém tem sido feita com marcaçãobioluminescente (Contag et al., 1995;1996 and 1998).Figura 8. Multialinhamento da região dos loops entre os resíduos 223-235 e352-359 das luciferases de besouros, mostrando resíduos-chave para amodulação dos espectros de bioluminescência(Stanley, 1989; Lundin et al., 1989); avaliaçãoda viabilidade celular (Comhaireet al., 1989); ensaio de atividades enzimáticasenvolvendo o consumo ou formaçãode ATP; testes de citotoxicidade,entre outros. Hoje em dia existemkits específicos comercializados paraestas finalidades.DNA da luciferase como marcador deexpressão gênica. A clonagem dogene da luciferase de vagalumes tornoupossível toda uma nova gama de aplicaçõesenvolvendo o uso deste genecomo marcador altamente sensível daexpressão gênica em células e tecidos(Gould and Subramani, 1988; Naylor,2000). O gene das luciferases de vagalumestem sido utilizados como generepórter em bacérias, leveduras, vegetais,insetos e mamíferos, em análisesda função de promotores associadoscom desenvolvimento e controle circadiano.DNA da luciferase como marcadorpara bioimageamento de células e tecidos.Mais recentemente, com o desenvolvimentosde equipamentos de fotodetecçãoe imageamento mais sensíveis,os genes das luciferases estão sendoempregados para marcação e visualizaçãoin vivo em tempo real de célulase tecidos (Viviani and Ohmiya, 2006).São utilizados para marcação e estudosde disseminação de microrganismospatogênicos em plantas e animais, auxiliandona rápida seleção de drogasantimicrobicidas. Também estão sendoFigura 9. Rede de pontes de hidrogênio do loop entre os resíduos 223-235e o sensor de pH em luciferase de Phrixotrix spp (Viviani et al., 2005)Aplicação em biosensores. Os genesde luciferases estão sendo usados tambémem biosensores ambientais paradetecção de bioavaliabilidade de cátionsde metais pesados como mercúrioe arsênio ou agrotóxicos e outros disruptoresambientais em águas contaminadas(Tauriainen et al., 1999). Juntamentecom a GFP (green fluorescentprotein) e seus derivados, as luciferasesestão se tornando os genes repórteresmais utilizados para estas finalidades.Uma das mais recentes aplicaçõesna área de proteômica envolve o usode luciferase e GFPs em ensaios BRET(Bioluminescence Ressonance EnergyTransfer), onde interações proteína-proteínasão avaliadas pela alteração doespectro de emissão mediante transferênciade energia do emissor primário(luciferase-luciferina) para a GFP.Luciferases de espécies brasileirasampliando a gama de aplicações. Osgenes de luciferase de insetos utilisadosaté o recentemente codificavamsomente luciferases que emitem luz naregião verde-amarelada do espectro, limitandoconsideravelmente suas aplicações,desde que muitos tecidos biológicossão consideravelmente opacosnesta região. Com a clonagem da luciferaseemissora de luz vermelha dePhrixotrix e seus aliados produzidospor engenharia genética, a gama deaplicações foi ampliada, com o usodestas em células de mamíferos e emsistemas repórter múltiplos que utilizamsimultaneamente várias luciferases emissorasde diferentes comprimentos deonda para a análise simultânea de múltiploseventos celulares (Nakajima et al.,2004; Viviani and Ohmiya, 2006). A luciferasede Pyrearinus termitilluminans,devido a sua estabilidade e cinética deemissão, também vem sendo utilizadacomo importante marcador bioluminescentepara imageamento de células etecidos. A luciferase do vagalume Macrolampis,devido ao espectro bimodalsensível ao pH, pode ser utilizada embiosensores intracelulares de mudançasde pH e outros fatores. Recentementecomeçamos a desenvolver biosensores14 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

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PesquisaAnálise Comparativa de Genomas ProcarióticosPesquisaPOR QUE, COMO E O QUE COMPARAR?Ilustrações cedidas pelos autoresiniciativa pioneira do Departamentode Energia Norte-Americano (DOE) de obteruma seqüência genômicahumana de referência que pudesseatender melhor os seus propósitos decompreender os riscos potenciais paraa saúde e para o meio ambiente decorrentesda produção e do uso de novasfontes de energia e novas tecnologias,culminou no lançamento do ProjetoGenoma Humano, em 1990; mais tarde,os recursos tecnológicos gerados poreste projeto estimularam o desenvolvimentode muitos outros projetos genoma,tanto por setores públicos quanto porsetores privados (HGP 2001) (Figura 1).Desde a década de 1990, portanto, osesforços internacionais no sentido deobter seqüências genômicas completaslevaram à determinação de todo o códigogenético de mais de 700 organismos,entre estes, procariotos, leveduras,protozoários, plantas, invertebradose vertebrados, incluindo o próprio Homosapiens; atualmente, aproximadamente3.000 outros projetos genoma estão emandamento, representando interessesmédicos, comerciais, ambientais e industriais,ou contemplando organismosmodelosimportantes para o desenvol-Marcos Catanho, MScDoutorando em Biologia Celular e MolecularLaboratório de Genômica Funcional eBioinformáticaInstituto Oswaldo Cruz - FiocruzRio de Janeiro – RJmcatanho@fiocruz.brWim Degrave, PhDPesquisador TitularLaboratório de Genômica Funcional eBioinformáticaInstituto Oswaldo Cruz - FiocruzRio de Janeiro - RJwdegrave@fiocruz.brAntonio Basílio de Miranda, PhDPesquisador AssociadoLaboratório de Genômica Funcional eBioinformáticaInstituto Oswaldo Cruz - FiocruzRio de Janeiro – RJantonio@fiocruz.brhttp://www.dbbm.fiocruz.br/labwim/bioinfoteam/Figura 1. Evolução do número (cumulativo) de genomas eucarióticos e procarióticoscompletamente seqüenciados e depositados em bancos de dadospúblicos desde 1995 até 2007 (gráfico de barras) e a distribuição dos projetosgenoma segundo suas áreas de interesse (gráfico de pizza): biomedicina, evolução,meio ambiente, biotecnologia e agricultura. Observe que há uma nítidapreferência pelo seqüenciamento de genomas bacterianos (de menor tamanhoem relação aos genomas eucarióticos e, portanto, mais fáceis de seremanalisados) e genomas com importância biomédica (42%) ou biotecnológica(28%). Fonte: Genomes Online Database (GOLD 2008)20 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

vimento de pesquisas científicas (GOLD2008) (Figura 1).Ao mesmo tempo, a obtenção e análisede seqüências genômicas completas deinúmeros organismos (genômica)(Carraro & Kitajima 2002), juntamentecom dados de expressão gênica eprotéica de células, tecidos e órgãos inteiros,gerados por outras tecnologiasde alto desempenho como atranscriptômica (Passos et al 2000) ea proteômica (Sousa et al 1999; Ciero& Bellato 2002), aliados ao vertiginosoavanço da computação e desenvolvimentode algoritmos mais eficientes,por sua vez resultantes do surgimentoe consolidação de ciências como a Computação,a Bioinformática e a BiologiaComputacional nas últimas décadas(Binneck 2004; Prosdocimi et al2002), tem permitido à comunidade científicao uso de abordagens holísticase ao mesmo tempo inovadoras no estudoda estrutura, organização e evoluçãode genomas (Abby & Daubin 2007),no estudo da expressão diferencial degenes e proteínas (Patterson &Aebersold 2003), na análise da estruturatridimensional de proteínas (Ginalski2006), no processo de reconstruçãometabólica e na predição e classificaçãofuncional de genes (Galperin &Koonin 2000; Stein 2001; Gabaldon &Huynen 2004; Francke et al 2005; Lee etal 2007; Skrabanek et al 2008).Dentre estas abordagens destaca-se aanálise comparativa de genomas (tambémconhecida como genômica comparativaou comparação de genomas),que consiste na análise e comparaçãodo material genético de diferentes espéciesou cepas, com o propósito deestudar a estrutura, organização e evoluçãodos genomas (e das espécies correspondentes)e também as funções dosgenes e regiões não codificantes nestesgenomas.Nesta revisão, apresentamos um resumodas diferentes abordagens utilizadasna análise comparativa de genomas,ressaltando, através de exemplos, suaimportância e algumas contribuiçõespara o desenvolvimento da Biologia.Enfocamos nossa revisão em um grupoparticular de organismosunicelulares: os procariotos. Pertencentesaos reinos Archaea e Bacteria, estesseres representam quase a totalidadedos genomas seqüenciados até o momento(Figura 1) e dos projetos genomaem andamento (GOLD 2008); além disso,estas espécies reúnem característicasfascinantes, tais como uma enorme(e insuspeitada) diversidade genética(até mesmo entre espécies e populações),a capacidade de sobreviver eprosperar em virtualmente todos osecossistemas terrestres (refletida na incríveldiversidade morfológica, fisiológicae metabólica destes microrganismos),mantendo populações de tamanhomuito variado (desde muito pequenoaté incrivelmente grande), e a capacidadede adquirirem e usaremfreqüentemente material genético de organismosmuito distantes (Coenye et al2005; Binnewies et al 2006; Abby &Daubin 2007), oferecendo, por tudo isto,um campo fértil para o desenvolvimentode pesquisas em diferentes áreascomo a microbiologia, a genética, a bioquímica,a evolução e a taxonomiadestes microrganismos.Por que comparar?Figura 2. Representação esquemáticado processamento da informação genéticae epigenética (adaptado deStrohman 1997)Seqüências genômicas completas constituemuma fonte de dados singularporque, em princípio, elas representamtudo o que é necessário para criar umorganismo, juntamente com fatoresepigenéticos e sua interação com osmesmos (Figura 2). Mas o que fazer comtoda esta informação? Acredita-se queo genoma de um único organismo, vistoisoladamente, fora de seu contextoevolutivo, não é capaz de nos revelarmuito sobre si mesmo e que para tantoos genomas de diferentes espécies oucepas devem ser estudados comparativamente(Clark 1999). De fato, análisescomparativas entre as seqüênciasgenômicas de diferentes microrganismostêm contribuído enormemente para aelucidação de aspectos fundamentais dagenética, da bioquímica e da evoluçãode inúmeras espécies (Galperin &Koonin 1999; Kondrashov 1999; Fraseret al 2000; Galperin & Koonin 2000;Koonin et al 2000; Wei et al 2002; Huynenet al 2005; Abby & Daubin 2007).Por exemplo, desde o seqüenciamentodos primeiros genomas bacterianos em1995, análises comparativas de genomasprocarióticos têm nos revelado cada vezmais a natureza complexa da estruturae organização destes genomas e a enormediversidade genética entre estes organismos,muito acima daquela esperada,mesmo entre isolados de umamesma espécie, levando aquestionamentos importantes sobre osmecanismos pelos quais estes microrganismosevoluem e como devem serclassificados taxonomicamente (Coenyeet al 2005; Binnewies et al 2006; Abby &Daubin 2007). As forças que moldam aestrutura, composição e organizaçãodos genomas destes microrganismos –como, por exemplo, a eficiência nosprocessos de replicação, transcrição eregulação da expressão gênica - e aquelasresponsáveis pela geração de variabilidadee da capacidade de adaptaçãodestas espécies aos mais diversos nichosecológicos em nosso planeta – taiscomo eventos de duplicação gênica,transferência lateral de genes,desfuncionalização de genes (formaçãode pseudogenes), eliminação (deleção)de genes e rearranjos cromossômicos -, têm sido pouco a pouco desvendadase intensamente estudadas (Ochman &Davalos 2006; Abby & Daubin 2007).A reconstrução da história evolutiva dosseres vivos - baseada em métodos matemáticospara inferir o passado a partirde características presentes nas espéciescontemporâneas - também temse beneficiado com o seqüenciamentoe a análise comparativa de um númerocada vez maior de genomas, envolvendoos três domínios da vida - Archaea,Bacteria e Eukarya. Por exemplo, novasabordagens para análisesfilogenéticas, baseadas na comparaçãoe alinhamento de seqüências primáriasde múltiplos genes de inúmeras espéciesou, ainda, na comparação de característicasassociadas aos genomasinteiros de dezenas ou centenas de organismos,como o repertório completode genes ou a ordem (localização) dosmesmos nos genomas, têm sido desenvolvidas(Delsuc et al 2005; Dutilh et al2007), assim como novos métodos paracalcular a distância entre os genomasBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 21

de distintas espécies têm sido propostos(Otu & Sayood 2003; Henz et al 2005;Kunin et al 2005a e referências contidasneste trabalho; Kunin et al 2005b;Tekaia et al 2005), resultando emmelhorias na resolução da árvore davida e na superação de problemas antigose comuns aos métodos tradicionaisde análise filogenética, como porexemplo, a escolha de marcadoresevolutivos apropriados, a saturação dedeterminadas posições nos códons edesvios nas análises provocados porestes fatores (Delsuc et al 2005).Outro exemplo importante refere-se aoestudo da variabilidade metabólica e daconservação de funções enzimáticasnas diversas vias bioquímicas entre osorganismos. Comparações entre as viasbioquímicas preditas a partir da análisede genomas completamenteseqüenciados têm revelado a existênciade vias incompletas ou mesmo ausentesem várias espécies analisadas(Cordwell 1999; Galperin & Koonin 1999;Huynen et al 1999; Morett et al 2003;Peregrin-Alvarez et al 2003). Em algumassituações, isto poderia representaro resultado de adaptações a diferentesnichos ecológicos, como, por exemplo,em bactérias estritamente simbiontes,as quais codificam um número menorde enzimas e vias metabólicas em comparaçãocom seus parentes de vida livre,uma vez que o hospedeiro ofereceum ambiente constante e rico emmetabólitos (nutrientes e compostosquímicos intermediários) essenciais aodesenvolvimento destes microrganismos(Galperin & Koonin 1999; Huynen et al1999; Ochman & Moran 2001; Moran2002; Moya et al 2008). Em muitos casos,entretanto, as enzimas desaparecidasforam substituídas por proteínasfuncionalmente equivalentes, ou seja,capazes de catalisar as mesmas reações,mas exibindo virtualmente nenhumasimilaridade ao nível de suas seqüênciasprimárias (de aminoácidos) etampouco ao nível de suas estruturasterciárias (tridimensionais) (Galperin etal 1998; Huynen et al 1999; Morett et al2003). Estas formas alternativas, conhecidascomo proteínas análogas (Fitch1970, 2000) (Figura 3), originam-se apartir de processos evolutivos independentes,convergindo para uma mesmafunção biológica (neste caso para umamesma atividade enzimática), e podemestar associadas a diferentes linhagensfilogenéticas e/ou possuir distintos mecanismosde catálise (Galperin et al1998). Alguns trabalhos sugerem que afração de atividades enzimáticas nasquais ocorreram múltiplos eventos deorigem independente pode ser substancial(Morett et al 2003), somando-se aoutras evidências, também oriundas deanálises comparativas de genomas, queapontam a importância (muito maior doque se supunha) do papel desempenhadopelo que se pode chamar dehomologia funcional na evolução dosseres vivos; um bom exemplo é a indicaçãode que o número total de geneshomólogos compartilhados entre as espéciesatualmente conhecidas (genesFigura 3. Homologia versus analogia. O esquema representa os processos evolutivos que levam à formação de geneshomólogos (genes A1, A2, B1 e B2 nas espécies X1 e X2; genes C1 e C2 nas espécies Y1 e Y2) e análogos (B2 e C1),através da evolução independente de dois genes hipotéticos pertencentes a duas linhagens distintas (adaptado deJensen 2001). Na linhagem X a evolução do gene ancestral hipotético ocorreu através de dois eventos seqüenciais,resultando na formação de genes divergentes, porém relacionados a um ancestral evolutivo comum (homólogos):primeiro através de uma duplicação gênica (descendência horizontal), gerando os genes homólogos A e B na própriaespécie ancestral X0; em seguida, através de um evento de especiação (descendência vertical), que deu origem àsespécies X1 e X2 e aos pares de genes homólogos A1 e A2 (descendentes do gene A) e B1 e B2 (descendentes do geneB) nestas espécies. Na linhagem Y, o gene ancestral hipotético pertencente à espécie ancestral Y0 evoluiu através de umúnico evento de especiação, que originou as espécies Y1 e Y2 e o par de genes homólogos C1 e C2 (descendentesdiretos do gene ancestral desta linhagem) nestas espécies. Os pares de genes homólogos A e B (na espécie ancestralX0), assim como os pares A1 e B1 (na espécie X1) e A2 e B2 (na espécie X2) são denominados parálogos, uma vez queo evento responsável pela origem de todos eles, a partir do gene ancestral comum mais próximo entre os mesmos, foiuma duplicação gênica (Fitch 1970, 2000); já os pares de genes A1 e A2 (entre as espécies X1 e X2), A2 e B2 (tambémentre as espécies X1 e X2) e C1 e C2 (entre as espécies Y1 e Y2) são denominados ortólogos, uma vez que estes paresde genes homólogos foram originados, a partir de seus respectivos genes ancestrais comuns mais próximos, através deum evento de especiação (Fitch 1970, 2000). Os genes B2 e C1, pertencentes às espécies X2 e Y1, respectivamente, sãodenominados análogos, isto é, genes originados a partir de genes ancestrais não relacionados entre si (pertencentes alinhagens distintas) que, entretanto, convergiram para uma mesma função biológica (Fitch 1970, 2000)22 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

ubíquos) é inferior a 100, envolvendoprincipalmente os genes responsáveispelos processos de tradução (na grandemaioria), transcrição e replicação/reparo do DNA (Koonin 2003). Este númeroincrivelmente pequeno de genespresumidamente compartilhados entreos diversos organismos sugere que inúmerasfunções essenciais (e tambémnão-essenciais) - que obviamente variamde acordo com as condições nasquais uma dada espécie ou populaçãotem de sobreviver (estilo de vida e nichoecológico) - são desempenhadaspor genes que mantêm entre si relaçõesde parentesco distante (parálogos originadospor duplicações ancestrais ouque evoluíram muito rapidamente, muitasvezes divergindo ao ponto de nãopoderem mais ser reconhecidos comotais) ou que não dividem ancestralidadealguma (análogos) (Koonin et al 1996),ou ainda por genes taxonomicamenterestritos, isto é, exclusivos de uma espécie,família ou linhagem em particular(genes únicos).De um ponto de vista aplicado,tecnologias de alto desempenho(genômica, transcriptômica eproteômica) possibilitam que pesquisadores,através de análises e mineraçãocriteriosas de dados, aumentem nãosomente nosso conhecimento sobre abiologia dos seres vivos, mas tambémsejam capazes de desenvolver novosmétodos de diagnóstico, vacinas maiseficazes, novas drogas, novosmarcadores prognósticos e uma variedadede aplicações biotecnológicas. Noque se refere aos microrganismospatogênicos, por exemplo, e àsmicobactérias em especial, várias aplicaçõespotenciais da análise comparativade genomas têm sido reportadas,visando sobretudo à prevenção (atravésdo desenvolvimento de vacinas maiseficazes), o tratamento (pelo desenvolvimentode novas drogas) e o diagnóstico(através da criação de métodos maisrápidos, sensíveis e específicos) da tuberculosee outras doenças causadaspor micobactérias. Algumas dessas aplicaçõesincluem: a identificação degenes únicos de uma espécie em particular,a identificação de fatores de virulênciae a reconstrução metabólica(Gordon et al 2002); a caracterização depatógenos, a identificação de novosalvos para diagnóstico e para procedimentosterapêuticos (Fitzgerald & Musser2001); a investigação sobre a origemmolecular da patogênese, do espectrode hospedeiros e das diferençasfenotípicas entre isolados clínicos e populaçõesnaturais de patógenos (Behret al 1999; Brosch et al 2001; Cole 2002;Kato-Maeda et al 2001) e a investigaçãodos fundamentos genéticos da virulênciae da resistência a drogas demicobactérias causadoras de tuberculose(Randhawa & Bishai 2002).Como comparar?A análise comparativa de genomas consistena análise e comparação entre todoou grande parte do material genéticode diferentes espécies ou cepas. Portratar-se de uma abordagem holística,em larga escala, exige métodoscomputacionais para sua realização.Apesar de ser uma abordagem relativamenterecente, tendo início com oseqüenciamento dos primeiros genomasna década de 1990, suas ferramentasmais importantes têm origem nas técnicasclássicas de análise computacionalde seqüências: (i) algoritmos de alinhamentoglobal e local de pares ou demúltiplas seqüências, (ii) métodos deanálise filogenética e (iii) asimplementações destes métodos ealgoritmos (Needleman & Wunsch 1970;Smith & Waterman 1981; Felsenstein1981, 1989; Lipman & Pearson 1985;Pearson & Lipman 1988; Feng &Doolittle 1987; Altschul et al 1990, 1997;Thompson et al 1994). De fato, ela sebeneficia não somente de ferramentasdesenvolvidas no passado, mas tambémda criação de novas ferramentas e doaperfeiçoamento de ferramentas já existentes,ambos estimulados pela imensa,diversificada e complexa quantidadede dados produzida com os projetosde seqüenciamento em larga escala.Sendo os genomas basicamente longasseqüências de DNA, poder-se-ia analisálosalinhando-os como se fossem seqüênciascomuns, utilizando um dosalgoritmos de análise de seqüências citadosanteriormente. No entanto, isto sópode ser feito com genomas de espéciesou cepas muito próximas, uma vezque mudanças na organização dogenoma (inserções, deleções, inversões,rearranjos, trocas e duplicações) ocorremcom uma taxa muito elevada. Alémdisto, por tratar-se de seqüências de tamanhoextremo, torna-secomputacionalmente inviável a análisede mais de um par de genomas de umasó vez, mesmo com o uso de algoritmose programas eficazes, especialmente desenvolvidospara esta finalidade(Morgenstern et al 1998, 1999, 2002;Jareborg et al 1999; Delcher et al 1999,2002; Kent & Zahler 2000; Batzoglou etal 2000; Ma et al 2002; Bray et al 2003,2004; Schwartz et al 2003; Brudno et al2003a, 2003b; Kurtz et al 2004) (para umarevisão abrangente sobre este assunto,consulte Blanchette 2007). Portanto, namaioria das vezes as análises comparativasentre genomas são feitas em umnível de abordagem mais modular, tomando-seas partes que compõem taisseqüências, como por exemplo, oconjunto completo de genes codificadospelas espécies em estudo.Entre os métodos mais comumenteempregados nestas análises está abusca por similaridades entre seqüências.A etapa crucial deste tipo deanálise é determinar se as seqüênciascomparadas são ou nãohomólogas, ou seja, se descendemou não de uma seqüência ancestralcomum, estabelecendo-se equivalênciaentre as partes comparadas. Oresultado obtido permite, entre outrascoisas, a predição de função, jáque é presumido que seqüênciashomólogas tendem a ter funções similarese também determinar quaisos genes correspondentes (ortólogos)entre pares ou grupos de genomasanalisados (Rigden & Mello 2002; Leeet al 2007). Esta tarefa nada trivial éfeita comparando-se uma ou mais seqüênciasde entrada (querysequences), com outras inúmeras seqüênciasdepositadas em um bancode dados (subject sequences), atravésdo alinhamento consecutivo de cadaseqüência de entrada com cada seqüênciadepositada no banco, coma utilização de um algoritmo de alinhamentolocal (Smith & Waterman1981; Pearson & Lipman 1988;Altschul et al 1997). Para cada alinhamento,calcula-se o número de pontosobtidos (score), com base em umamatriz de substituição (PAM ouBLOSUM normalmente) e em valoresarbitrados de penalidade para a aberturae extensão de espaços nas seqüênciasalinhadas (gap opening/extension penalties), e o número dealinhamentos esperados ao acasocom pontuação igual ou superior aodo alinhamento em questão (Evalue),a partir da pontuação normalizada(bitscore) e do tamanho e composiçãodo banco de dados. Ahomologia é inferida com base nosvalores calculados dos diferentesparâmetros do alinhamento, algunsdeles já mencionados: pontuação,pontuação normalizada, número dealinhamentos esperados ao acasocom pontuação igual ou superior aodo alinhamento em questão,percentual de identidade, percentualda extensão de cada seqüência nopar alinhado que contribui para o alinhamento,diferença de tamanho entreas seqüências alinhadas etc. Aexistência de domínios - módulosque constituem unidades distintas doponto de vista evolutivo, funcional eBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 23

estrutural - em proteínas é um fatorcomplicador nestas análises, que deveser tratado com atenção.Atualmente, inúmeros bancos de dadose ferramentas computacionais para análisecomparativa de genomasprocarióticos estão disponíveis atravésda internet como serviços on-line e/ouprogramas independentes para uso local,abrangendo uma variedade de propósitose funcionalidades (Catanho etal 2007). A Tabela 1 apresenta um resumode tais recursos computacionais.O que comparar?Análises comparativas de genomas podemenvolver diferentes tipos de abordagem,oferecendo múltiplas perspectivasacerca dos organismos estudados(revisto por Wei et al 2002). Entre as análisescapazes de contribuir significativamentepara a compreensão de problemasbiológicos, ressaltando similaridadese diferenças importantes entre osgenomas e organismos comparados, destacam-se:(i) comparações envolvendo aestrutura genômica global, (ii) comparaçõesentre regiões codificantesidentificadas em diversos genomas e (iii)comparações envolvendo regiões nãocodificantes de diferentes genomas (Figura4).Comparações envolvendo aestrutura genômica globalPesquisas envolvendo a organizaçãoTabela 1. Bancos de dados e ferramentas computacionais para análise comparativa de genomas procarióticosFonte: Catanho et al 2007.24 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

(tais como genes, operons, grupos[clusters] gênicos, elementos de inserção,repetições etc.), determinando, porexemplo, a distribuição assimétrica dosgenes entre as fitas de DNA (chamadasleading e lagging) e em relação aospontos de origem e término dareplicação, a diferença de composiçãode bases entre as fitas leading e lagginge a formação de gradientes ao longoda cadeia de DNA, representados pordesvios na composição de bases e nastaxas mutacionais nas proximidades doponto de término da replicação (revistopor Rocha 2004a).Comparações entreregiões codificantesFigura 4. Análise comparativa de genomas. O esquema representa genericamenteos três níveis de abordagem da genômica comparativa de procariotos(e também de eucariotos) e algumas análises comumente realizadas.Uma vez que seqüências genômicas completas são obtidas atravésdo seqüenciamento em larga escala dos genomas de diferentes espécies,análises comparativas envolvendo (i) a estrutura genômica, (ii) as regiõescodificantes e (iii) as regiões não codificantes entre estes genomas podemser realizadas, oferecendo múltiplas perspectivas acerca dos organismosestudados. Neste painel, segmentos genômicos sintênicos entre os genomashipotéticos A, B e C são representados por barras horizontais decores idênticas (Estrutura genômica). De maneira similar, regiões codificantesortólogas (entre diferentes genomas) e parálogas (dentro de ummesmo genoma) são representadas por círculos de cores idênticas (Regiõescodificantes). A presença de elementos regulatórios ou de pseudogenes,dentro de regiões não codificantes, conservados entre os genomashipotéticos A, B e C são representadas por círculos pontilhados (Regiõesnão codificantes)cromossômica de procariotos receberampouca atenção no passado em relaçãoa estudos similares em eucariotos.Este quadro vem se modificando, graçasaos resultados obtidos com oseqüenciamento em larga escala dosgenomas de inúmeros representantesdestes seres vivos (Rocha 2004a). Comparaçõesenvolvendo a estrutura globalde genomas procarióticos completamenteseqüenciados possibilitam a obtençãode informações sobre a organizaçãoe evolução destes genomas e tambéma identificação de característicasúnicas nos mesmos, permitindo revelare compreender as forças atuantes nestesprocessos, muitas vezes relacionadasa atividades celulares fundamentaiscomo a expressão gênica coordenada,a replicação cromossômica e adivisão celular (Rocha 2004b). Estas pesquisasincluem tipicamente (i) a descriçãode características estruturais doDNA (como por exemplo, tamanho dogenoma, conteúdo GC[guanina+citosina] global, variações doconteúdo GC ao longo do genoma, freqüênciasde mono- e oligonucleotídeos,desvios na utilização decódons e de aminoácidos, entre outros)(ii) a análise do conteúdo e distribuiçãode repetições e outras regiões debaixa complexidade, (iii) a identificaçãode regiões sintênicas conservadase de eventos de rearranjo genômicoe (iv) a análise de regiões limítrofes entreregiões sintênicas vizinhas (breakpoints).Através de análises como estas foi possível,por exemplo, demonstrar que oprocesso de replicação cromossômicaé um dos principais responsáveis pelaorganização e pela inter-relação entremuitos dos elementos que constituema organização genômica em procariotosOutra abordagem comumente empregadapara comparar os genomas de diferentesorganismos procarióticos consideraestes seres (de forma alegórica)como sendo sacos de genes, orientandoas análises somente para o conteúdocodificante de seus genomas: genes eseus produtos (proteínas especificamente).As possibilidades oferecidas poreste tipo de abordagem são inúmeras,incluindo a aquisição de informaçõessobre a organização e evolução destesgenomas, a identificação de característicasúnicas nos mesmos, aplicação diretaem processos de reconstrução metabólicae em processos de predição eclassificação funcional de genes(Galperin & Koonin 2000; Stein 2001;Gabaldon & Huynen 2004; Francke etal 2005; Lee et al 2007; Abby & Daubin2007; Skrabanek et al 2008). Tais estudosabrangem normalmente (i) a identificaçãode regiões codificantes, (ii) acomparação dos conteúdos gênico eprotéico, (iii) a identificação/análise daconservação de famílias de genesortólogos e parálogos entre os genomascomparados, (iv) a análise da conservaçãode grupos gênicos e da conservaçãoda ordem (localização) dos genesentre as diferentes espécies estudadas,(v) a identificação/análise de eventosde fusão/fissão gênica e da ocorrênciade ligação funcional entre genes nasespécies analisadas. Recentemente, análisesdeste tipo levaram a uma das maisimportantes descobertas da eragenômica. Através de comparações entreo repertório de genes codificadospelos genomas de múltiplos isoladospatogênicos de bactérias da espécieStreptococcus agalactiae (principal causade infecção neonatal em humanos),Tettelin e colaboradores (2005) demonstraramque esta espécie pode ser descritapor um pan-genoma, constituídopor um conjunto de genes compartilhadospor todos os isolados (genomacentral) e por um segundo conjunto deBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 25

genes formado por genes parcialmentecompartilhados e genes cepa-específicos(genoma dispensável), ou seja, constituídopela soma dos genes que representama essência (centrais) e a diversidade(dispensáveis) desta espécie. Resultadossimilares foram obtidos analisando-seisolados provenientes de outrasespécies (Streptococcus pyogenes,Bacillus anthracis, Escherichia coli eHaloquadratum walsbyi) e modelosmatemáticos baseados nos dados obtidospara os diferentes grupos analisadosmostraram que, enquanto para algumasespécies (Bacillus anthracis) opan-genoma pode ser completamentedescrito com o seqüenciamento dosgenomas de apenas alguns poucos representantes,em outras espécies(Streptococcus pyogenes, Escherichia colie Haloquadratum walsbyi), genes novoscontinuarão a emergir mesmo apóso seqüenciamento dos genomas de centenasou milhares de cepas, sugerindoque o pool de genes disponíveis no universomicrobiano é muito maior do quese imaginava (Tettelin et al 2005; Mediniet al 2005; Chen et al 2006; Legault et al2006). Embora o significado do pangenomaainda não seja bem compreendido(uma possibilidade seria a deque ele estaria envolvido na adaptaçãoa diferentes nichos ecológicos), estesestudos demonstram claramente a necessidadede se analisar genomas demúltiplos isolados, e não apenas um oudois representantes de cada espécie,para que se tenha uma compreensãoglobal da complexidade das espéciesbacterianas.Comparações envolvendoregiões não codificantesO processo de regulação transcricionalé um importante mecanismo de adaptaçãoem procariotos, no qual proteínasregulatórias e sinais regulatórioslocalizados nas regiões extra-gênicassão elementos-chaves envolvidos. Nestesentido, comparações entre regiõesnão codificantes de genomas de diferentesespécies procarióticas têm auxiliadograndemente a identificação e caracterizaçãode segmentos genômicoscom papéis regulatórios (Pareja et al2006), contribuindo para a elucidaçãodos circuitos genéticos de regulaçãotranscricional nestes organismos. Estasabordagens baseiam-se na suposição deque regiões funcionalmente importantesencontram-se sob pressão seletivae, portanto, tendem a evoluir com umataxa menor do que regiões sem nenhumpapel funcional (Wei et al 2002).Por outro lado, comparações entre proteínasjá caracterizadas e regiões nãocodificantes em inúmeras espécies deprocariotos têm sido usadas na identificaçãoe caracterização de cópias obsoletasde genes ou, em outras palavras,fósseis moleculares chamadospseudogenes (Liu et al 2004; Lerat &Ochman 2005). Tais seqüências podemser reconhecidas por apresentarem rupturasem seus marcos de leituraprovocadas por mudanças de fase e porcódons de parada prematuros (Lerat &Ochman 2005). Por possuírem umgenoma muito compacto, rico em genese contendo muito pouco DNA nãocodificante, acreditava-se que a formaçãode pseudogenes em microrganismosprocarióticos era mínima (com algumasraras exceções bem conhecidas).Entretanto, atualmente, pseudogenes sãoreconhecidos como um atributo normalde genomas procarióticos, encontradosem virtualmente todos os genomasprocarióticos já analisados, particularmenteem bactérias patogênicas quesurgiram recentemente, nas quais a presençadestes fósseis moleculares ocorreem grande número (Lerat & Ochman2005; Ochman & Davalos 2006). Estudosenvolvendo a identificação e a caracterizaçãoda origem e função primitivade genes extintos são muito importantespara a compreensão da evoluçãodo proteoma e da natureza e dinâmicados genomas procarióticos(Ochman & Davalos 2006).Conclusões e perspectivaspara o futuroA análise comparativa de genomas possuivariadas aplicações em diferentescampos do conhecimento, desde a análiseda estrutura, organização e evoluçãodos genomas até o desenvolvimentode métodos mais eficientes de prevenção,tratamento e diagnóstico de doençasparasitárias, por exemplo. Além disso,por envolver análises em larga escala,exigindo, portanto, métodoscomputacionais para sua realização, osdesafios impostos pela necessidade dese comparar grandes, diversificados ecomplexos volumes de dados, oriundosdos inúmeros projetos genoma, têmestimulado o desenvolvimento de novosmétodos, algoritmos e ferramentascomputacionais e também o aprimoramentode técnicas já existentes.Sem dúvida, a análise comparativa degenomas constitui um campo fértil parapesquisas envolvendo diversos aspectosda biologia dos organismosprocarióticos (e também eucarióticos),como a genética, a bioquímica, a evoluçãoe, ainda, os mecanismosmoleculares da patogênese, do espectrode hospedeiros e das diferençasfenotípicas entre alguns de seus representantes.Neste sentido, diferentes abordagenstêm sido desenvolvidas e empregadas nacomparação de seqüências genômicas, oferecendoassim múltiplas perspectivas acercados organismos estudados.Com o constante aprimoramento dos métodosde seqüenciamento em larga escalaocorrido nos últimos anos, aumentandosubstancialmente a rapidez e a eficiênciacom que genomas inteiros são seqüenciados(Shendure et al 2008), e a recente possibilidadede se obter seqüências genômicas(completas ou parciais) de comunidades inteirasde microrganismos diretamente deamostras ambientais (metagenômica), novase importantes descobertas científicas eavanços tecnológicos podem ser antecipadospara o futuro.Referências bibliográficasAbby S, Daubin V. 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GLOSSÁRIOAlgoritmo. Procedimento organizado (passos e instruções)para executar um determinado tipo de cálculoou solucionar um determinado tipo de problema.Alinhamento de seqüências. Processo de alinhar (colocarlado a lado) duas ou mais seqüências do mesmotipo (nucleotídicas ou protéicas) de forma a obter omáximo de identidade entre elas com o propósito dedeterminar o grau de similaridade.Alinhamento global. Alinhamento de pares de seqüênciasnucleotídicas ou protéicas ao longo de todaa extensão das mesmas.Alinhamento local. Alinhamento de uma ou maispartes de duas seqüências nucleotídicas ou protéicas.Análise filogenética. Análise filogenética ou filogeniaconsiste no estudo das relações evolutivas (ouseja, na reconstrução da história evolutiva) entre gruposde organismos ou outras entidades que se acreditapossuírem um ancestral comum, como por exemplo,espécies, populações e genes.Analogia. Relação entre dois caracteres quaisquer quedescendem, por convergência, de caracteres ancestraisnão relacionados entre si (Fitch 1970, 2000).Bioinformática e Biologia Computacional. Em 17 dejulho de 2000, o National Institutes of Health (NIH),uma das agências do departamento de saúde norteamericanocom reconhecimento internacional na áreade pesquisa biomédica, divulgou sua definição detrabalho para Bioinformática e para Biologia Computacional,elaborada pelo Biomedical Information Scienceand Technology Initiative Consortium (BISTIC)Definition Committee. De acordo com este documento“A bioinformática e a biologia computacional têmsuas raízes nas ciências da vida bem como nasciências da computação e informação e na tecnologia.Ambas estas abordagens interdisciplinaresse beneficiam de disciplinas específicas, tais comoa matemática, a física, as ciências da computaçãoe a engenharia, a biologia e as ciências docomportamento. Cada uma delas mantém interaçõesmuito estreitas com as ciências da vida paraconcretizar todo o seu potencial. A bioinformáticaaplica princípios das ciências da informação e datecnologia para tornar os vastos, diversificados ecomplexos dados produzidos pelas ciências da vidamais compreensíveis e úteis. A biologia computacionalusa abordagens matemáticas e computacionaispara resolver questões teóricas e experimentaisna biologia. Embora a bioinformática e a biologiacomputacional sejam distintas, há significativasobreposição e atividade em suas interfaces.(...) Bioinformática: pesquisa, desenvolvimento ouaplicação de ferramentas e abordagens computacionaispara ampliar o uso de dados de origembiológica, médica, comportamental ou de saúde,incluindo adquirir, armazenar, organizar, arquivar,analisar ou visualizar tais dados. BiologiaComputacional: desenvolvimento e aplicação demétodos analíticos e teóricos de dados e técnicasde modelagem matemática e simulação computacionalpara o estudo de sistemas biológicos, comportamentaise sociais.” (BISTIC Definition Committee,2000). [Tradução livre do autor].DNA. Sigla em inglês para deoxyribonucleic acid, ouácido desoxirribonucléico. Ácido nucléico constituídopor desoxirribose, fosfato e pelas bases nitrogenadasadenina, guanina, citosina e timina. Contém asinstruções genéticas usadas no desenvolvimento e funcionamentode todos os seres vivos.Fatores epigenéticos. Fatores (não genéticos) responsáveispelo controle temporal e espacial da atividadede todos os genes necessários para o desenvolvimentode um organismo complexo desde o zigoto até a faseadulta (citado por Strohman 1997).Fusão/Fissão gênica. Foi observado que determinadospares de proteínas funcionalmente relacionadasentre si, presentes em certos organismos, têm homólogosem outros organismos fundidos em uma únicacadeia protéica (Marcotte et al 1999; Enright et al 1999).O processo de formação destas proteínas é chamadode fusão gênica (quando há a adição de genes ouseqüências funcionais em uma cadeia de DNA) oufissão gênica (quando há a perda de genes ou seqüênciasfuncionais em uma cadeia de DNA). Eventos defusão/fissão gênica são fenômenos naturais reconhecidoscomo uma das principais forças evolutivasna criação de proteínas de múltiplos domínios.Genes. Genes são as unidades hereditárias emtodos os organismos vivos, formando componentesessenciais do genoma (o conjunto completode informação genética) destes organismos,sendo responsáveis pelo desenvolvimento físico,pelo metabolismo e também, até certo ponto,seu comportamento. Alguns genes produzemmoléculas de RNA enquanto outros desempenhamimportantes papéis regulatórios ou estruturais.A maioria dos genes codifica proteínas,grandes moléculas compostas de longas cadeiasde aminoácidos, que respondem pela maioriadas reações químicas desempenhadas pela célula.Genoma. Termo criado, em 1920, por Hans Winkler,professor de Botânica na Universidade deHamburgo. Designa toda a informação hereditáriade um organismo que está codificada no seuDNA (ou, em alguns vírus, no RNA). Isto incluitanto os genes como as seqüências não codificadoras(conhecidas como DNA-lixo).Genômica. Análise (em larga escala) do genomacompleto de um organismo.Homologia. Relação entre dois caracteres (traçosgenéticos, estruturais ou funcionais de umorganismo) quaisquer que descendem de um caractereancestral comum, normalmente com divergência(Fitch 1970, 2000).Matriz de substituição. Matriz que representatodas as possíveis trocas entre aminoácidos, nasquais um valor é atribuído a cada uma destastrocas. Estes valores são proporcionais à probabilidadede ocorrência de cada troca, tomandosecomo base um determinado modelo evolutivo.PAM – Percent Accepted Mutation (Dayhoffet al 1978). BLOSUM - BLOcks SUbstitution Matrix(Henikoff & Henikoff 1992).Metagenômica. Também conhecida como genômicaambiental, ecogenômica, ou ainda genômicade comunidades, consiste na análise domaterial genético obtido diretamente de amostrasambientais, permitindo o estudo de organismosque não podem ser facilmente cultivadosem laboratório, bem como o estudo de organismosem seus ambientes naturais (Metagenomics2008).Micobactérias. O gênero Mycobacterium (familiaMycobacteriaceae, ordem Actinomycetales),um dos mais antigos e bem conhecidos gênerosde bactéria, foi introduzido por Lehmann e Neumannem 1896, para incluir os agentes causadoresda hanseníase e da tuberculose, bactérias quehaviam sido anteriormente classificadas comoBacterium leprae e Bacterium tuberculosis, respectivamente(Goodfellow & Minnikin, 1984).Os organismos pertencentes a este gênero sãoaeróbios, imóveis e não formam endósporos ouesporos; têm forma de bastonetes delgados, retosou ligeiramente encurvados, com raras formasramificadas. Seu DNA é rico em guanina (G) ecitosina (C) (de 62 a 70% G+C, com exceção deMycobacterium leprae que tem 57.8% de GC). Asmicobactérias possuem ainda características peculiarescomo álcool-ácido resistência (uma vezcoradas por corantes básicos, resistem à descoloraçãopor soluções álcool-ácidas sendo, portanto,denominadas bacilos álcool-ácido resistentes)e resistência incomum à dessecação e a agentesquímicos.Ortólogos. Genes homólogos em espécies diferentesoriginados de um gene ancestral comum,durante a especiação (Fitch 1970, 2000).Óperon. Grupo de genes funcionalmente relacionadosentre si, regulados (em conjunto) por ummesmo operador.Parálogos. Genes homólogos em uma espécieem particular originados por duplicação (Fitch1970, 2000).Proteínas. Moléculas compostas por aminoácidosligados entre si em uma ordem particular,especificada pelas seqüências de DNA dos genesque as codificam. São componentes essenciais dos organismos,participando de todos os processos celulares(catálise enzimática, sinalização celular, resposta imune,adesão celular, ciclo celular etc.) e também comocomponentes estruturais e mecânicos.Proteômica. Análise (em larga escala) do conjunto completode proteínas expressas por uma célula, tecido ouorganismo, em um dado momento e sob certas circunstânciasambientais.Regiões sintênicas. Sintenia foi um termo originalmentecunhado para designar a presença de dois ou maisloci gênicos (próximos ou não) no mesmo cromossomo.Atualmente, refere-se também a duas regiões degenomas distintos que mostram considerável grau desimilaridade de seqüência entre si e algum grau de conservaçãoda ordem dos genes nestas regiões e que, portanto,têm probabilidade de descender de um ancestralcomum.Regiões de baixa complexidade. Regiões em ácidosnucléicos ou proteínas com desvios na composição deseus resíduos (nucleotídeos ou aminoácidos), incluindotratos homopoliméricos (longas seqüências formadaspelo mesmo resíduo), repetições com curtos espaçosentre si e sobre-representações mais sutis de algunsresíduos.Seqüência genômica. Toda ou parte da cadeia de DNAque compõe um genoma.Simbiontes. Organismos que vivem em simbiose, isto é,dois organismos distintos que mantêm íntima e longaassociação entre si, na qual um ou ambos se beneficiamdesta relação. Esta associação inclui relações nas quaisuma das partes vive sobre (ectobiose) ou dentro (endobiose)da outra, podendo ser obrigatória, ou seja, necessáriaà sobrevivência de pelo menos um dos organismosenvolvidos, ou facultativa, na qual a associação ébenéfica, porém não é essencial à sobrevivência dosorganismos. As categorias de simbiose incluem o mutualismo(quando ambos se beneficiam), o comensalismo(quando apenas um se beneficia e o outro não é significativamentelesado ou beneficiado) e o parasitismo(quando apenas um se beneficia e o outro é lesado pelarelação) (Symbiosis 2008).Transcriptômica. Análise (em larga escala) do conjuntode todos os RNA mensageiros (transcritos) de umacélula, tecido ou organismo, em um dado momento esob certas circunstâncias ambientais.Referências bibliográficasBISTIC Definition Committee. NIH working definition ofbioinformatics and computational biology. 2000. Disponívelem: Acesso em: 26 mar. 2008.Dayhoff MO, Schwartz RM, Orcutt BC. 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PesquisaSEXAGEM DE EMBRIÕES BOVINOSAtualidades sobre a aplicação da técnica de Sexagem aliada ao PCR (Polymerase Chain Reaction), desde o campo até a comercialização de embriões sexados.Fotografias e ilustrações cedidas pelos autoressexagem de embriões poranálise de DNA, agregada àprodução in vitro, constituemferramentas importantes que permitemintensificar e acelerar o melhoramentogenético de animais de alto valorzootécnico. Através destas tecnologiaso criador pode escolher o sexodesejado ainda na fase embrionária,estudadas há mais de 25 anos e areação em cadeia da polimerase(PCR) reproduz artificialmente a formacomo o DNA é replicado na natureza(HASLER et al, 2002). Apresentadaà comunidade científica em1984, a PCR foi adotada como umaferramenta de pesquisa essencialdado à potencialidade de utilizaçãona área de biologia molecular (OLI-VEIRA; HENKES, 2002).A sexagem de Embriões Bovinospela técnica de PCR (do inglês PolymeraseChain Reaction) é uma biotecnologiarelacionada à transferênciade embriões (REICHENBACH etal., 2001), que contribui diretamentena otimização da eficiência reprodutivapara a melhora da performanceprodutiva e da lucratividade dosrebanhos bovinos (SCARCELLI et al,2004).COLHEITA DE OÓCITOSPAOLA GOMES PASSAGLIA – BIÓLOGA– CENTRO DE ENSINO SUPERIOR DEUBERABA – paolapassaglia@hotmail.comANTONIO HAMILTON CHAVES –DOUTOR EM ZOOTECNIA – PROFESSORDO CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃOTECNOLÓGICA DE UBERABAahchaves@terra.com.brFigura 1: Colheita de oócitosFonte: Gonçalves, 2001diminuindo custos com receptoras, tratamentoshormonais para sincronização,manejo e locação de espaço napropriedade. O Brasil tem se destacadocomo um dos países que mais aplicacomercialmente e em larga escalaas diversas biotecnologias utilizadas nareprodução animal.As técnicas para a determinação dosexo em embriões bovinos têm sidoO primeiro passo é a colheita in vitrode oócitos, geralmente é efetuadapor punção folicular, utilizandoagulha acoplada a uma seringa oubomba a vácuo, guiada por ultrasonografiatransvaginal (GONÇAL-VES et al., 2002), este método decolheita por ser não-cirúrgico temmostrado praticidade na utilização repetidada mesma doadora (HAFEZ,1995).A punção folicular transvaginal contribuipara reduzir o intervalo entregerações, para acelerar o melhoramentogenético, bem como podeser repetida em várias oportunidadesnum mesmo animal sem prejuízode sua capacidade reprodutiva30 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

oócito e melhora o posterior desenvolvimentoembrionário.Além do meio, outros fatores relacionadoscom o ambiente de cultivo celulardevem ser considerados comofundamentais. Geralmente, a maturaçãode oócitos bovino é realizada a37,8 o C por 24 horas em atmosfera de5% de CO2 em ar e umidade saturada(GONÇALVES; 2002).FECUNDAÇÃO IN VITROFigura 2: oócito maturadoFonte: Folheto de divulgação do CongressoBrasileiro de Reprodução Animal, 2006(PIETERSE et al., 1991).Com o desenvolvimento de técnicasde reprodução assistida em animais,ocorreu um grande avanço naotimização e multiplicação de fêmeasde interesse para a produçãoanimal.A aspiração de ovócitos imaturospor punção folicular, associada à maturaçãoe fecundação “in vitro” dosmesmos, e ao cultivo “in vitro” dosembriões, permite que sejam produzidas,em média, 36 crias/anode uma única fêmea. (RUMPF,2006).a maturação (GONÇALVES et al,2002).Também é usual a utilização do LH,ou do hormônio folículo estimulante(FSH) ou ainda a combinação dessasgonadotrofinas. A maioria dos resultadospublicados demonstra que a adiçãode gonadotrofinas ao meio dematuração de oócitos bovinos, aumentaa capacidade de fecundação doA FIV também é uma técnica fundamentalpara o uso de todas as novasbiotécnicas da reprodução animal, poisatravés dela é possível produzir embriõespró-sexados e embriões ou zigotosem vários estágios de desenvolvimento,para os estudos de transgênesee clonagem. Recentemente,também tem sido sugerido o uso daFIV para avaliar o potencial reprodutivode touros, avaliando com maisprecisão a fertilidade de um reprodutor(DODE, 2000).As técnicas mais utilizadas para separaçãode espermatozóides vivos dosdemais componentes do sêmen e doscrioprotetores são o swim up, o gradientede percoll e o lavado espermático.A técnica ideal para separaçãoespermática deve ser rápida, simples,de baixo custo, capaz de recuperara maioria dos espermatozóidesmóveis, não resultar em alterações espermáticas,remover espermatozóidesmortos e outras células, incluindo mi-MATURAÇÃO IN VITROA maturação dos oócitos (Figura 2),envolve as transformações nucleare citoplasmática, e está ligada a umasérie de mudanças estruturais e bioquímicasque tornam o gameta femininoapto a ser fecundado e terdesenvolvimento embrionário subseqüente..O oócito presente nofolículo primordial, uma vez ativado,deve crescer e sofrer várias modificaçõesde ordem ultra-estrutural,citoplasmática e bioquímicacom a finalidade de se tornar competentepara reiniciar e completarFigura 3: Células (em estágiode clivagem) de embriõesbovinos cultivados .in vitro. -Foto de divulgação do cursode Fecundação in vitro daUniversidade Federal dePelotas, 2006Figura 4: Sistema de micromanipulaçãocompostopor microscópio invertido,2 microseringas para a aspiraçãoe 2 micromanipuladoresmecânicos (GAR-CIA; UVO, 2002)Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 31

crorganismos, remover substânciastóxicas e bioativas, permitir o processamentode grandes volumes de sêmen,além de permitir o controle daconcentração e volume final da suspensãoespermática (GONÇALVES etal., 2002).A composição química dos meios parao cultivo in vitro de embriões foi determinadapela avaliação de suas necessidadesmetabólicas. A maioria dosmeios consiste de soluções salinasacrescidas de um componente macromolecular,podendo ser preparadasem laboratórios próprios, ou adquiridascomercialmente (MATTOS et al,1991).CULTIVOO cultivo de células in vitro (Figura3) requer o uso de substâncias compropriedades especiais como, presençade proteínas, propriedades sulfarctantese ausência de toxinas, para umbom desenvolvimento celular (SOLA-NO & PILAR, 1984).A composição química dos meios parao cultivo in vitro de embriões foi determinadapela avaliação de suas necessidadesmetabólicas. A maioria dosmeios consiste de soluções salinasacrescidas de um componente macromolecular,podendo ser preparadasem laboratórios próprios, ou adquiridascomercialmente (MATTOS etal, 1991).Figura 5: Etapas do processo demicromanipulação para a retirada de biópsiaembrionária por aspiração (GARCIA; UVO,2002)Para facilitar a liberação dos embriõesbiopsiados do fundo da placa de petri,é adicionado a cada microgota contendoembrião biopsiados, 50µl de Sur-factant Fluramic a 0,4% ou 50µl deálcool polivinil a 1% (HASLER et al,2002). Segundo Ardais et al (2005);os embriões geralmente são biopsia-MICROASPIRAÇÃO DO DNA(BIÓPSIA)Para realizar a biópsia de embriõesutiliza-se um micromanipuladorLeitz (Figura 4). Uma placa é acopladae montada em um dos ladosdo micromanipulador. Antes da biopsia,os embriões são individualmentelavados através de três microgotas(100 µl) de proteínalivrePBS em uma placa de petri de 100mm 2 . Os embriões são aderidos aofundo da placa de petri e são visualizadosa uma amplificação de 100vezes e alinhados ao centro. Umapequena porção ideal de 6 a 10 célulasdo blastocisto é removida pelomovimento direto da lâmina (Figura5), geralmente na borda do embrião.Depois que cada embrião ébiopsiado, a lâmina é descartada.Figura 6. Diagrama ilustrando as diferentes etapas durante aamplificação de DNA utilizando a técnica de PCR (OLIVEIRA;HENKES, 2002)32 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

Figura 7: Ilustração de resultado da PCR em biópsia de embriões bovinos com eletroforese em gel de agarosecorado com Brometo de Etídio (ALONSO, 2006)Embriões analisados como machosEmbriões “ presumíveis fêmeas”Total de embriões biopsiadosNº de EmbriõesTestados7931110ResultadosConfirmadosPorUS ou Nascimento742599Taxa de Acerto93.7%80.5%90.0%Tabela 1: Resultados gerais de sexagem por PCR obtidos entre abril de 1999 e março de 2001, para embriões játransferidos e com resultado de sexagem por ultra-sonografia (GARCIA e UVO, 2002).Nos últimos anos, o Brasilapresentou uma demanda crescente do uso desta tecnologia em animais de genética superior, utilizando a aspiração,a amplificação da região repetitiva Y específica do cromossomo, seguida da eletroforese, protocolos estesrecentemente mais utilizados comercialmente (GARCIA e UVO, 2002)dos no 6º dia de cultivo, mediante microaspiraçãoutilizando um micromanipuladormecânico.POLIMERASE CHAINREACTION (PCR)Esta técnica é utilizada para amplificare detectar DNA específico do cromossomoY (Fig. 6), presente somentenas células dos embriões do sexomasculino. As células biopsiadas sãosubmetidas à lise com proteinase K,segundo Luz et al (2000); Almodimet al (2005) e Ardais (2005).O DNA é sintetizado em um ciclo iniciale passa a ser o molde para a sínteseposterior de DNA dos ciclos subseqüentes.Após aproximadamente 30ciclos de síntese os produtos de PCRdeverão incluir, além do DNA original,aproximadamente 105 cópias daseqüência alvo. A reação envolve ciclosseqüenciais completos compreendendotrês etapas básicas: desnaturação,anelamento e síntese do DNA(OLIVEIRA e HENKES, 2002) e extensãodos .primers. (PEREIRA, 1996).a) Desnaturação: Compreende a dissociaçãodas ligações que mantêm unidaa dupla fita de DNA. Isso é obtidotipicamente pela utilização de temperaturasentre 93-95°C;b) Anelamento: Ligação das seqüênciasiniciadoras com a seqüência alvo.Esse passo normalmente utiliza temperaturasentre 50 e 70°C dependendoda Tm ou temperatura de dissociação(do inglês temperature of milting)calculada. Temperaturas de anelamentomais elevadas aumentam aespecificidade da reação.c) Síntese do DNA: A partir dos iniciadoresjá ligados à seqüência alvo,começa a síntese de uma nova seqüênciacomplementar. As temperaturasque conferem maior eficiêncianessa etapa estão entre 70-75°C(OLIVEIRA e HENKES, 2002).d) Extensão dos primers: Estaetapa é feita a 72°C, que é a temperaturaótima para a enzima TaqDNA polimerase, que duranteesta fase utiliza-se dos nucleotídeosincluídos entre os reagentespara a reação de PCR e completaa fita sintetizada, de acordocom a fita original, a partir dos .primers.. Ao final desta etapa, repetem-senovamente os ciclos por aproximadamente30 vezes, o que faz comque a seqüência alvo seja amplificada1 bilhão de vezes (PEREIRA, 1996).Segundo Oliveira e Henkes(2002), Essa quantidade de materialpode ser facilmente visualizadacomo bandas de tamanhoespecífico quando submetida àBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 33

eletroforese em gel de agarose(Figura 7). Ardais (2005), Almodim(2005) e Alonso (2006), ressaltamque, duas bandas representammachos, podendo ser visualizadosos cromossomos X eY, e nas fêmeas apenas a visualizaçãodo cromossomo X.A separação de moléculas de ácidosnucléicos em laboratórios debiologia molecular é realizadacom o auxílio da técnica de eletroforeseem gel de agarose. Osgéis de agarose são, geralmente,corados com soluções de brometode etídio (EtBr), uma substânciaintercalante de alta toxicidadee mutagenicidade, que revelaos ácidos nucléicos ao fluorescersob luz ultravioleta (AZEVE-DO et al., 2003).O USO COMERCIAL DASEXAGEM DE EMBRIÕESTodos os setores da indústria dogado derivam do benefício econômicoda habilidade de determinaro sexo de embriões antesque a prenhez esteja estabelecida.Os benefícios maximizadospela sexagem de embriões durantea transferência rotineira esuperovulação das doadoras, estãosendo realizados agora emuma variedade de aplicações comerciais.Os embriões sexados podem sercongelados com sucesso, contudorealçando a utilidade comercialdo procedimento da biopsiacomo uma ferramenta rotineira daprodução (HEER; REED, 1991).A atual situação econômica dapecuária mundial exige dos produtoresmáxima eficiência paragarantia de retorno econômico.Desta forma, elevados índices deprodução, associados à alta eficiênciareprodutiva devem seconstituir em metas para técnicose os criadores alcançares melhorprodutividade e satisfatórioretorno econômico (SCARCELLIet al, 2004).Segundo Bredbacka; Kankaanpää;Peippo (1995) e Shea(1999) a sexagem de embriõesbovinos baseada na metodologiade PCR têm se tornado mais comumpara fins comerciais, onde se observauma eficiência (proporção de amostrasdiagnosticadas) de 90-95% e acuráciade 93-98%, conforme dados coletadospor Garcia e Uvo (2002) publicadono jornal o Embrião, da SociedadeBrasileira de Tecnologia de Embriões(Tabela 1).Nos últimos anos, o Brasil apresentouuma demanda crescente do uso destatecnologia em animais de genética superior,utilizando a aspiração, a amplificaçãoda região repetitiva Y específicado cromossomo, seguida da eletroforese,protocolos estes recentementemais utilizados comercialmente(GARCIA e UVO, 2002).CONSIDERAÇÕES FINAISA sexagem de embriões bovinos pelatécnica de PCR é uma biotécnica, bastanteutilizada atualmente; todavia,complexa que requer equipamentos,experiência e habilidade profissionalpara a sua execução, além disso, éuma técnica que é indicada somentepara a produção de crias geneticamenteprivilegiadas e com alto valor deMercado.No Brasil, a sexagem já tem relevânciacomercial, visto que vários profissionaise empresas de biotecnologiada reprodução oferecem serviços paraa realização da sexagem de embriõesa nível comercial.A estreita relação da sexagem e transferênciade embriões com a produçãoanimal têm alterado o comérciotradicional de reprodutores, elevandosubstancialmente o valor das fêmeasgeneticamente superiores.BIBLIOGRAFIA1. ALMODIN, C. G. A bovine protocolfor training professionals in preimplantationgenetic diagnosis using polimerasechain reaction. Fertility and Sterility,V.84, no 4, p. 895 .900, 2005.2. ALONSO, R.V.; WEPPERT, M.; GAR-CIA, J.F.; REICHENBACH, H.D. Effectof biopsy by peizo-micromanipulationon development capacity of in vitroproduced bovine morulae and blastocysts.Acta Scientiae Veterinariae,v. 31, p. 214-15, 2003.3. ALONSO, R.V.; HELLÚ, J. A. A.;ARDAIS, D. B.; VISINTIN, J. A.;GARCIA, J.F. Aplicação comercialem larga escala da sexagem deembriões produzidos in vitro poranálise de DNA. In: anais....XXReunião Anual da Sociedade Brasileirade Tecnologia de Embriões.Araxá, M.G. 2006, 26 p.4. ARDAIS, D. B. et al. Sexagemde embriões produzidos in vitropor análise de DNA. In: anais...6o Congresso Brasileiro das RaçasZebuínas. Uberaba, M.G.: ABCZ,2005, 352p.5. AZEVEDO, M. O., FELIPE, M.M. S., BRÍGIDO, M. M., MARA-NHÃO, A. Q., DE SOUZA, M. T.Técnicas Básicas em BiologiaMolecular. Brasília, DF. EditoraUNB, 2003, 211p.6. BREDBACKA, P., KANKA-ANPÄÄ, A., PEIPPO, J. PCR . Sexingof bovine embryos: Asimplified protocol. Theriogenology,v. 44, p. 167-76, 1995.7. BRUM, D. S., et al. Cultivo individualde blastocistos bovinos produzidosin vitro. Brazilian JounalVeterinary Research AnimalScience. São Paulo, v. 39, n.2, 2002.8. CAMARGO, L. S. A.; SÁ,W. F. ;VIANA, J. H. M.; FERREIRA, A. M.; SERAPIÃO, R. V.; RAMOS, A. A.;MACHADO, M. A.; VALE FILHO,V. R.; ANDRADE, V. J. Sexagemde embriões bovinos fecundadosin vitro e cultivados com célulasdo cumulus na presença de soro.Revista Brasileira de ReproduçãoAnimal, v. 27, n. 3, p. 407 .409. 2003.9. CARVALHO, R.V.; DEL CAMPO,M.R.; PALASZ, A. T.; PLANTE, Y.;MAPLETOFT, R.J. Survival ratesand sex ratio of bovine embryosfrozen at different developmentalstages on days 7. Theriogenology.Vol. 45, pág. 489 . 498,1996.34 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

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PesquisaBIOTECNOLOGIA NA INDÚSTRIAFARMACÊUTICARevisão dos principais processosRogério Saad Vaz, BMD, Ph.D.,Coordenador do curso de Biomedicina daFaculdade Pequeno PríncipePesquisador do Instituto Pelé PequenoPrínciperogeriovaz@fpp.edu.brMaria Rosa Machado Prado, M.Sc. ,Professora Adjunta do curso de Farmáciada Universidade Positivomaria.rosamachado@up.edu.brFátima de Carvalho, M.Sc., ProfessoraAdjunta do curso de Farmácia daUniversidade Positivofatimadecarvalho@up.edu.brindústria farmacêutica necessitade processos biotecnológicos paraobtenção de vários produtos importantespara a saúde humana e animal.A história da biotecnologia modernacomeça inclusive com o desenvolvimento deum medicamento, a penicilina, na primeirametade do século XX. A partir de então, processosbiotecnológicos são utilizados na produçãode vitaminas, hormônios, antibióticos,vacinas e enzimas. Este trabalho apresentaas características gerais desses processos.Na biotecnologia industrial o reator é o elementocentral, pois é nele que se desenvolvemas transformações de interesse;embora fundamental, não é o mais importantedo processo. Dois conjuntos de operaçõesdevem ser considerados:1) Os tratamentos iniciais (“Upstream processes”)-antecedem a operação.2) Os tratamentos finais (“downstream processes”)-englobam a separação e a purificaçãodos produtos e tratamentos dos residuos(Borzani et al,2001)O sucesso de um dado processo fermentativodepende muito de uma correta definiçãode 4 pontos básicos: microrganismo,meio de cultura, a forma de condução doprocesso fermentativo e as etapas de recuperaçãodo produto (Schmidell et al., 2001).Os três primeiros itens fazem parte dos “upstreamprocesses” enquanto o último do “downstreamprocesses”.Na verdade, esses quatro pilares de umprocesso fermentativo interagem enormemente,sendo necessário buscar definí-losde forma conjunta, levando em consideraçãoaspectos biológicos e econômicos. Odesempenho de um dado microrganismodepende muito da composição do meio decultura em que este é colocado. A seguir,serão abordados cada um destes pilares.1- TIPOS DE MICRORGANISMOSSão divididos em vírus, procariontes (bactériase cianofíceas) e eucariontes (fungos,protozoários, algas, cultura de tecidos animaise vegetais). Os vírus patogênicos apresentaminteresse para vacinas, enquanto quevírus bacteriófagos são importantes paraestudos genéticos ( para mapeamento daposição dos genes e para construção denovas cepas por transdução ou recombinação.Na recombinação, fagos são usadoscomo vetores para introduzir DNA estranhona célula (Moo-Young).Bactérias e fungos são os microrganismosresponsáveis pela maioria dos processosbiotecnológicos farmacêuticos. As categoriasde produtos da fermentação bacterianasão:- “single cell protein” ou biomassa- produtos finais (ex: solventes e ácidos)- metabólitos primários (ex: aa., enzimas enucleótideos)- metabolitos secundários (ex: anticorpos,pigmentos e polisacarídeos)A composição do meio pode influenciar ometabolismo das células diretamente atravésda nutrição ou indiretamente e pelaalteração da forma do crescimento como aeficiência da aeração- particular e importantequando há crescimento de organismosfilamentosos (Moo-Young).A cultura de tecidos de células animais (répteis,peixes, aves, anfíbios, insetos) e vegetais– cultivadas em larga escala para produçãode vacinas, para acúmulo de metabólitoscelulares e para bioconversão desubstratos como esteróides e alcalóides. Acultura de tecidos de células vegetais paraprodução de agentes farmacologicamenteativos é uma área promissora.A obtenção desses microrganismos pode serfeita de várias maneiras: isolamento a partirde recursos naturais; compra em coleçõesde culturas; obtenção de mutantes naturais;obtenção de mutantes induzidos por métodosconvencionais; obtenção de microrganismosrecombinantes por técnicas de engenhariagenética.Para uma aplicação industrial, espera-se queos microrganismos apresentem as seguintescaracterísticas gerais:- apresentar elevada eficiência na conversãodo substrato em produto;- permitir o acúmulo do produto no meio,de forma a se ter elevada concentração doproduto no caldo fermentado;- não produzir substâncias incompatíveis como produto;- apresentar constância quanto ao comportamentofisiológico;- não ser patogênico;- não exigir condições de processo muitocomplexas;- não exigir meios de cultura dispendiosos;36 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

- permitir a rápida liberação do produtopara o meio.2. MEIOS DE CULTURAA formulação de um meio de cultivo develevar em conta as características nutricionaisdo microrganismo a ser cultivado, deforma que não existe uma formulação únicapara o desenvolvimento de microrganismosem condições artificiais. No caso decultivo de células vegetais e animais in vitro,monocamadas de culturas celulares animaissão indispensáveis para o cultivo decélulas o isolamento e identificação de viroses.A produção de vacinas virais e deinterferon são os principais processos comerciaisusando células animais (MOO-YONG).As linhagens celulares são extremamenteúteis na pesquisa celular, como fonte degrandes quantidades de células de um tipouniforme, especialmente por poderem serestocadas em nitrogênio líquido a –196º C,por um período de tempo indefinido (AL-BERT, 1997). Essas linhagens celulares imortalizadaspodem se desenvolver ancoradasem uma superfície plástica como monocamadas,ou prescindir da necessidade decontato e crescer em suspensão dentro defrascos nos quais o meio de cultivo é levementeagitado (MOO-YOUNG).Os meios de cultivo para células animaissão complexos, contendo soluções tamponantesde sais minerais, glucose, vitaminas,aminoácidos, fatores de crescimento, extratosfetais e soro. Antibióticos são usualmenteincorporados nesses meios para evitarcontaminação bacteriana., embora muitasvezes interfiram no isolamento e purificaçãodo produto metabólico. Independentedo fato das linhagens celulares serem derivadasde diferentes mamíferos ou de diferentesórgãos ou do mesmo hospedeiro,elas se desenvolveram todas no mesmo tipobásico de meio de cultivo.O cultivo celular de células vegetais podeser feito em meios sólidos ou em suspensão.As técnicas e o meio usado para crescimentode plantas são similares aquelespara células animais, exceto que a luz éessencial e extratos fetais e soro devem serde origem vegetal. Carboidratos devem seradicionados ao meio desde que o processode fotossíntese realizado por células emcultura é pouco eficiente. Os reatores paracrescimento de plantas não requerem altastaxas de oxigenação, embora a agitação sejaimportante para prevenir sedimentação celular(MOO-YOUNG).Os fatores que influem nesses cultivos sãoa temperatura, o pH, teor de oxigênio, agitação,teor de umidade3. BIORREATORESA engenharia da fermentação é um ramoda tecnologia que estuda o desenho, desenvolvimento,construção e operação daplanta e equipamentos utilizados nos processosbiológicos em escala industrial.Nos processo de fermentação, o biorreatorfornece o ambiente para o crescimento epara a atividade microbiana. Durante o período,previne a liberação da biomassa internapara o ambiente, assim como, impedea entrada de substâncias estranhas paradentro do meio de reações.O meio ambiente do biorreator leva emconsideração os aspectos biológicos, químicose físicos (WINKLER, 1986).a) meio biológico: é favorável quando somenteo organismo que contribui ao processoestá presente, sendo denominado umsistema “asséptico”. Isto se consegue pelaesterilização do ambiente e posterior introduçãodo microrganismo desejado (inoculação);b) meio químico: está relacionado com omeio de crescimento microbiano, com asconcentrações adequadas de substratos ounutrientes microbiológicos, assim como precursoressintéticos, livres de substâncias inibidorase mantidas ao pH adequado. Enquantoos nutrientes solúveis são adicionadosao meio, a manutenção da oxigenaçãoé feita continuamente. Nos processos anaeróbicos,deve-se em alguns casos, disporde dispositivos para eliminar o oxigêniocontinuamente. Outros parâmetros devemser observados, e dizem respeito à baixaatividade do meio aquoso (baixa concentraçãodo soluto) assim como à força iônica(substâncias iônicas em solução precedentede sais);c) meio físico: se refere principalmente àtemperatura do sistema, que para seu controleleva em conta o desenho do fermentador.Este controle, bem como a necessidadeem manter-se a uniformidade das condiçõesdurante o processo, está relacionadocom uma boa agitação, o que por suavez, provoca a ruptura de estruturas doorganismo (cisalhamento).3.1 Tipos de biorreatoresVários tipos de biorreatores podem ser utilizadose o grau de sofisticação (desenho,construção e funcionamento) dependem dasensibilidade do processo ao ambiente mantidono recipiente (WINKLER, 1986). Omaterial utilizado na construção dos biorreatoresdeve ser atóxico, resistente à pressãoe à corrosão química.Os biorreatores em processos farmacêuticospodem ser Químicos ou Biológicos:-Biorreatores Químicos nos quais as reaçõesocorrem na ausência de células vivas,ou seja, são tipicamente os “reatores enzimáticos”.-Biorreatores Biológicos nos quais as reaçõesse processam na presença de células.Os biorreatores biológicos são amplamenteconhecidos e mais utilizados, sendo empregadosdesde a década de 40 paraprodução industrial. Possuem uma grandediversidade de aplicação, como produçãode enzimas, antibióticos, vitaminas, ácidosorgânicos, solventes, bebidas e tratamentode resíduos orgânicos industriais ou domésticos.Na classificação dos biorreatores, ainda sãolevados em consideração:• tipo de biocatalisador: células ouenzimas;• a configuração do biocatalisador:células ou enzimas livres ou imobilizadas;• forma de se agitar o líquido no reator.Assim sendo, os biorreatores classificam-seem dois grupos: sistema de cultivo dispersoe sistema de cultivo imobilizado.3.2. Modo de operaçãoA classificação Mista de Kleinstreuer é amais utilizada:1. Reatores em fase aquosa (fermentaçãosubmersa)a. Células e enzimas livres:a.1) Reatores agitados mecanicamente (STR- stirred tank reactor)a.2) Reatores agitados pneumaticamente- Coluna de bolhas (“bubble column”)- Reatores “air-lift”a.3) Reatores de fluxo pistonado (“plugflow”)2. Reatores em fase não-aquosa (fermentaçãosemi-sólida)b) Células/enzimas imobilizadas em suportes:b.1) Reatores em leito fixob.2) Reatores com leito fluidizadoc) Células/enzimas confinadas entre membranas:c.1) Reatores com membranas planasc.2) Reatores de fibra oca (hollow-fiber)3. Reatores estáticos (reatores com bandejas)4. Reatores com agitação (tambor rotativo)5. Reatores com leito fixo6. Reatores com leito fluidizado gás-sólidoOs biorreatores mais amplamente empregadossão os Reatores Agitados Mecanicamente(STR), constituindo cerca de 90% dototal de reatores utilizados industrialmente.3.3 Tamanho da unidadede produçãoA capacidade total da planta de fermentaçãoserá obtida utilizando-se pequenas unidadesou um número pequeno de unidadesmaiores. O tamanho da unidade podeser influenciado por:- facilidade para transporte;- espaço disponível;- custo de produção: unidade grandes acarretammenores custos que as pequenas,principalmente se forem com instrumentaçãosofisticada;- recipientes pequenos são adequados quandose necessita uma variedade de produtose quando existe perigo de rompimentos.Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 37

A capacidade dos biorreatores em fase aquosavaria conforme a necessidade. Assim, emescala de produção industrial:- Até 1-2 m 3 : cultivo de microrganismospatogênicos, células animais ou vegetais, emgeral produtos ligados à saúde;- Intermediária – até 100-200 m 3 : paraprodução de enzimas, antibióticos e vitaminas;- Milhares de m 3 : fermentação alcoólica outratamento biológico de resíduos, sem assepsia.3.4 Fornecimento de oxigênionos biorreatoresO suprimento adequado de oxigênio é indispensávelpara microrganismos aeróbios,e o efeito levará a um maior ou menorrendimento da cultura. Para alguns microrganismosfacultativos, que podem desenvolver-sesem oxigênio, o aporte deficiente,além de influenciar no rendimento, provocadiferenças na velocidade do crescimentoe nos produtos sintetizados a partirda atividade do microrganismo (STURZA,1995).O principal problema no fornecimento deoxigênio diz respeito ao fato de ser ligeiramentesolúvel, o que faz com que deva serfornecido de forma contínua, inclusive emfermentações do tipo interrompido ou embatelada (por cargas, batch). Assim, devesecolocar o gás em contato com o líquido,dissolve-lo no meio, e transferir o gás dissolvidona fase gás-líquido aos organismos.A administração rápida de oxigênio necessita,portanto, de grandes superfícies de contactoentre o gás e o líquido, para facilitar adissolução. Isto faz com que a administraçãode oxigênio e a agitação sejam práticasinseparáveis em um sistema aerado (WINK-LER, 1986).3.4.1. Aeração e agitação dos biorreatorespara fermentação líquidaAlém de proporcionar oxigênio, a aeraçãotambém é importante para limpar o cultivode produtos metabólicos voláteis e indesejáveis.A agitação, direta ou como efeitosecundário da aeração, é necessária pelasseguintes razões:- aumentar a velocidade de transferênciade oxigênio das borbulhas de ar ao meiolíquido, uma vez que os microrganismosnecessitam de oxigênio dissolvido;- aumentar a velocidade de transferênciade oxigênio e nutrientes do meio para ascélulas, evitando-se que surjam áreas combaixo nível de oxigênio e nutrientes;- impedir a formação de grupos de célulasou agregados de micélio;- aumentar a velocidade de transferênciade produtos metabólicos de células ao meio;- aumentar a taxa ou eficiência de transferênciade calor entre o meio e as superfíciesde refrigeração do fermentador.Por outro lado, a turbulência da agitaçãopromove:- dispersão de ar em pequenas bolhas;- impedir a coalescência das bolhas;- diminuir a extensão limitante da películade líquido na interfase gás/líquido;- retardar a perda de gás durante o cultivo,fazendo com que as bolhas demorem maispara chegar à superfície.Alguns aspectos são extremamente importantes,uma vez que afetam o fornecimentode oxigênio para o cultivo, como a geometriado sistema, sua velocidade, a alturatotal do líquido no fermentador, tipo de difusore vazão de ar.Em fermentação, necessita-se das duasações, o bombeamento e o cisalhamento.Estes efeitos são conseguidos utilizando-seturbinas e hélices. Existem modelos comoa turbina com pás inclinadas, que proporcionamas duas ações ao mesmo tempo.O cisalhamento está diretamente relacionadoà velocidade do agitador. Assim, determinadosorganismos são sensíveis a esteefeito, e se adaptam melhor a reatores queutilizam sistema sem agitador. Durante oprocesso fermentativo é possível ocorreremalterações significativas no caldo, quepode passar à condição de líquido nãonewtoniano,como no caso de processosenvolvendo o cultivo de fungos filamentosos.A tensão de cisalhamento varia em funçãodo gradiente de velocidade (dv/dr). A constantede proporcionalidade entre a tensãode cisalhamento e o gradiente de velocidadeé definida como a viscosidade do líquido.Assim sendo, esta viscosidade influenciao processo, e pode mudar durante afermentação.3.4.2 Aeração dos biorreatores parafermentação no estado sólidoQuando se trabalha com fermentação emestado sólido, a agitação é comanda pelotipo de processo, tipo de reator e o produtodesejado. Existe a fermentação com agitaçãoocasional ou com agitação contínua.Alguns produtos, como aflatoxina e ocratoxinas,são produzidos em sistemas agitados,e a esporulação pode ser reprimida com aagitação. Também a agitação pode ter efeitosadversos sobre a porosidade do substrato,provocando a compactação das partículas,impedindo a fixação do microrganismoao sólido e ocasionando o rompimento domicélio, por exemplo.A aeração do substrato é facilitada em funçãodos espaços vazios existentes entre aspartículas sólidas.3.5 INSTRUMENTAÇÃO ECONTROLE EM BIOPROCESSSOSO sucesso de um processo fermentativodepende da existência de condições adequadaspara a produção de biomassa e formaçãoda produto. A temperatura, pH, graude agitação, concentração de oxigênio nomeio de cultivo e outros fatores devem sermantidos constante durante todo o processo.A manutenção dessas condições necessitaum monitoramento cuidadoso da fermentaçãoatravés de um sistema de controlepelo qual as condições ótimas podemser mantidas.O monitoramento do processo fornece importantesinformações quanto ao progresso dafermentação, essas indicam casos de contaminação,morte celular ou fermentações queocorrem de maneira fora do esperado.O avançodos processos fermentativos totalmenteautomatizados depende da existência de sensoresque produzam sinais significativos decontrole.3.5.1 CONTROLE DE PROCESSOExistem três possíveis objetivos para o controledo processo:1) Manter uma variável constante ao longo detempo2) Forçar uma variável a seguir o caminhopré-determinado ao longo do tempo3) Otimizar algumas funções das variáveis dosistemaO primeiro se consegue pela regulação, osegundo por mecanismos auxiliares, o terceiropor controladores ótimos.Todos os aparelhos de instrumentação sãogeralmente conhecidos como controladoresautomáticos. Em um sistema de controle setem quatro classes de variáveis:1) Variáveis controladas: é a variável de saídaque desejamos controlar.2) Variável manipulada: é a variável de entradacom a que se controla .3) Variável de distúrbio: variável de entradaque afeta a variável controlada.4) Variáveis de referência: é o valor desejadoda variável controlada.Os parâmetros que podem ser medidos emprocessos fermentativos:1) PARÂMETROS FÍSICOS:- Temperatura- Pressão- Consumo de potência- Viscosidade- Fluxo de aeração e de meio- Turbidez- Peso do fermentador2) PARÂMETROS QUÍMICOS:- pH- Oxigênio dissolvido- Oxigênio e gás carbônico nos gases de saída- Potencial de redox- Concentração de substrato- Concentração de produto- Força iônica3) PARÂMETROS BIOLÓGICOS:- Produtos biologicamente ativos- Atividade enzimática- Conteúdo de DNA e RNA- Conteúdo de NADH 2e ATP- Conteúdo em proteína1) Parâmetros Físicos:A – TEMPERATURAA taxa do crescimento microbiano , como todasas outras reações químicas, é uma funçãoda temperatura. Normalmente, os microrganismoscrescem em temperaturas que variamde 25 a 30ºC. Existem, quanto à temperatura38 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

de crescimento, quatro grupos de microrganismos:· Psicrófilos: 14-20º C· Mesófilos: 30-36º C· Termófilos: 50-60º C· Extremo termófilos: 60-80º CA temperatura também afeta a eficiência daconversão do substrato (fonte de carbono –energia) em massa celular. O rendimentomáximo de conversão ocorre a temperaturamenor que a temperatura ótima de crescimento.Este ponto é particularmente importantena otimização do processo quando se esperaum máximo rendimento, mas não taxa de crescimento.As reações simultâneas que ocorrem no interiordas células, influenciam no crescimento eformação de proteínas enzimáticas, que apresentamrápidas variações de acordo com a faixade temperatura.Para cada microrganismo, existe um temperaturaótima de crescimento e de formação deproduto, em um substrato adequado; para umaotimização eficiente é necessário um controlede temperatura de 0,5º C.Os sensores de temperatura mais utilizadossão:- Termômetro: Utilizado somente em pequenosfermentadores devido a sua fragilidade.Em fermentadores maiores há a necessidadede inserir o termômetro dentro de um localpróprio dentro de fermentador; é apenas indicativoe não automatizado.- Termístor: São semicondutores feitos demisturas de óxidos de ferro, níquel e outrosmetais; a principal característica é a grandevariação da resistência em função de umapequena variação de temperatura.- Termômetro bimetálico: Consiste de umabobina bimetálica helicoidal protegida por umtubo, pode ser colocado na extremidade umacaneta para o registro de variações de temperatura.São menos suscetíveis a quebras porémcustam mais caro.- Termômetro de bulbo de pressão: É ummedidor de pressão conectado a um pequenotubo, preenchido com gás ou líquido apropriadosob pressão. Uma caneta é conectada naextremidade livre para o registro de sinaiselétricos ou pneumáticos.- Termopares: São dois filamentos de doismetais diferentes que são mantidos em diferentestemperaturas, ligados em um circuitoelétrico. A corrente produzida pode ser medidano ponto comum da temperatura dos doismetais.- Termômetros de resistência elétrica: Baseia-senas diferenças de resistência elétricados metais com a variação de temperatura.B – PressãoO monitoramento da pressão é importantedurante a esterilização e a manutenção de umapressão positiva no reator (aproximadamente1,2 absoluto) pode auxiliar a manutenção daassepsia; mas a razão mais importante é a segurança.Equipamentos industriais e de laboratóriosão projetados para suportar uma pressãoespecífica para a fermentação e mais umfator de segurança.Em fermentadores, medidores de diafragmasão utilizados para o monitoramento dapressão. Esses medidores produzem um sinalpneumático que pode ser transformado,se necessário, em um sinal elétrico. Éimportante que o sensor indique, registree controle a pressão.Para minimizar o risco de contaminaçãoutiliza-se uma sobre pressão de 0,2-0,5 bar.A pressão hidrostática também deve serconsiderada nos grandes fermentadores umavez que influencia na solubilidade do oxigênioe gás carbônico no meio de cultura.C – PotênciaDiferentes tipos de medições podem serfeitas para monitorar a potência necessáriapara fermentadores com agitação mecânica,normalmente mede-se a energia totalconsumida pelo agitador. A desvantagemdeste método porém, é que ele consideratambém as perdas observadas quando seaumenta a velocidade de agitação (ocorreaproximadamente 30% de perda de energia,utilizada pelo motor).Medidas diretas da energia dentro do meiode cultivo podem ser conseguidas utilizandomedidores dentro do reator.D – ViscosidadeA viscosidade e outras propriedades reológicasdo meio de cultivo podem ser medidas,através da energia consumida em diferentesvelocidades de agitação. Outro métodoutilizado, é o monitoramento da potênciadurante e após um rápido desligamentoda agitação (menos de 30 segundos).Fluídos Newtonianos e não Newtonianostambém respondem diferentemente aagitação.E – Velocidade de fluxo (Ar/Líquido)A aeração também pode ser controlada dediferentes maneiras, tanto o ar de entradacomo o ar de saída. O aparelho mais simples,rotâmetro, fornece leitura visual oupulsos elétricos. O monitoramento da taxade aeração é muito importante para os cálculosde balanço de material nos processosfermentativos.Para o controle da velocidade de fluxo delíquido, em escala laboratorial, são utilizadasbombas de fluxo bem calibradas, queabastecem o fermentador com quantidadesconhecidas do líquido. Controles de processosmais longos, podem ser feitos porpesagens contínuas. Um sensor de nível demeio pode ser utilizado já que detecta tambémo nível de espuma.2) Parâmetros Químicos:A – Sondas de pHO pH externo apresenta pouca influênciasobre o pH interno das células microbianas,mas o rompimento dos substratos , seutransporte pela parede celular e a secreçãodos produtos celulares, são todos afetadospelo valor do pH do ambiente. O pH domeio tem um efeito sobre a estrutura epermeabilidade da membrana externa.O pH é uma medida da atividade dos íons hidrogênioe sua determinação se da dependendoda temperatura. Porém, o sinal da sonda mudarácom a temperatura; é importante compensar oefeito da temperatura no circuito . Com a exigênciade esterilidade , as sondas esterilizáveisestão ganhando aceitação.B – O 2e CO 2:Um procedimento normal é determinar no arque entra e sai o O 2e o CO 2separadamentepelas propriedades paramagnéticas do O 2e oespectro de absorção de infravermelho do CO 2.Os sensores para medir esses gases estão bemdesenvolvidos e funcionam com poucas interrupções.O N 2, NH 3, metanol e etanol, podem ser medidospelo espectrômetro de massas e também podemedir informação qualitativa e quantitativa sobreo intercâmbio de O 2e CO 2. Mediante o usode membranas permeáveis aos gases, é possívelmedir os gases dissolvidos no meio nutritivo.Existem instrumentos que podem analisar até 8gases simultaneamente na fermentação.C – Oxigênio dissolvido (OD):O papel crítico que joga o oxigênio dissolvido(OD) num processo de fermentação é muitoimportante; as sondas de OD consistem em umacamisa de aço inox ou cristal que contém eletrodose um eletrólito adequado.Existem interessantes novidades no campo deeletrodos enzimáticos, denominados biosensores.4. Recuperação do Produto FinalÉ a etapa mais difícil, e um processo difícil ecaro, chegando a representar de 80% - 90% docusto total do processo.Os procedimentos utilizados podem ser : físicos/químicos e biológicos (graus de variação).. Filtração , centrifugação e flotação ( separaçãode células do líquido). Rompimento de células (caso produto seja intracelular).. Extração com solvente específico. Cromatografia. Filtração por membranas. Adsorção.Cristalização.SecagemOs autores dedicam este artigo à memória do ProfessorWalter BorzaniREFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASBORZANI,et al,2001.Biotecnologia Industrial-fundamentosv.1, 1º Ed. Edgard Blucher ltda-SP.SCHMIDELL,et al.2001. Biotecnologia Industrial-EngenhariaBioquímica v.2, 1º Ed. Edgard Blucherltda-SPREHM,et al,.Biotechnology – Biological Fundamentals,v.1, 2º Ed. VCH – WeinheimMOO-YOUNG,M.Comprehensive Biotechnology.The Principles of Biotechnology: ScientificFundamentals.V.1, Ed. Pergamon Press-Oxford.Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 39

Pesquisaβ-1,3 GLUCANASEPRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE β-1,3 GLUCANASEIlustrações cedidas pelas autorasLuciana Francisco FleuriDra. em Ciência de Alimentos pelaUniversidade Estadual de Campinas eProfa. da Universidade Metodista dePiracicabaluciana@fea.unicamp.brHélia Harumi SatoProfa. Titular da Faculdade deEngenharia de Alimentos daUniversidade Estadual de CampinasRESUMOO presente trabalho visou o estudo da produçãoe purificação da β-1,3 glucanase dalinhagem Cellulosimicrobium cellulans 191.Em fermentador de 5 L, a maior produçãode β-1,3 glucanase utilizando 1,5 vvm e 3vvm, foi respectivamente 0,32 U/mL e 0,72U/mL, após 24 h de fermentação a 30 o C;enquanto que em frascos aletados agitadosa produção de β-1,3 glucanase foi de 1,12U/mL após 24 h a 30 o C. A β-1,3 glucanase(45 KDa) foi purificada 11,92 vezes com rendimentode 25% em resina de troca iônicaDEAE-Sephadex A50.Palavras-chave: β-1,3 glucanase, Cellulosimicrobiumcellulans 191, produção, purificação.SUMMARYThe aim of this work was to study the productionand purification of β-1,3 glucanasesfrom Cellulosimicrobium cellulans 191strain. In a 5 L fermenter, the highest productionof β-1,3 glucanase with 1.5 vvm and3.0 vvm were 0.32 U/mL and 0.72 U/mLrespectively, after 24 h of fermentation at30 o C; while in shaken flasks was produced1.12 U/mL after 24 h at 30 o C. The β-1,3Figura 1. Estudo da produção de β-1,3 glucanase em fermentador de 5 L, emmeio de cultivo contendo 1% de parede celular de levedura em tampão fosfato0,2 M, pH 7,5 a 30 o C, 200 rpm e 1,5 vvmglucanase (45 KDa) was purified 11.92 times witha yield of 25% using a DEAE-Sephadex A50 ionexchangeresin.Key-words: β-1,3 glucanase, Cellulosimicrobium cellulans191, production, purification.INTRODUÇÃOA β-1,3 glucana é o componente encontrado emmaior quantidade na parede celular de leveduras(Kim, et al. 2004), correspondendo juntamentecom a β-1,6 glucana, 48 a 60% da estrutura (Klis,1994).A camada de β-glucana corresponde à camada internada parede celular de leveduras e pode serhidrolisada por β-1,3 glucanases para diferentesfinalidades. Uma grande quantidade de produtospodem ser isolados e purificados da célula microbianacom o auxílio da lise enzimática como, porexemplo: peptídeos, polissacarídeos, proteínas recombinantes,ácidos nucléicos, pigmentos, enzimas,lipídeos, entre outros. Além do potencial deaplicação na preparação de protoplastos, fusãocelular e transformação de leveduras, ressalta-sesua aplicação na preparação do polissacarídeo glucana,pré-tratamento para lise mecânica de célulasem Dyno-Mill, produção de extrato de levedurae lise de microrganismos (Fleuri e Sato, 2005).As β-1,3 glucanases, podem ser produzidas pordiferentes microrganismos. Rowley e Bull (1977)estudaram a produção do complexo enzimáticoextracelular contento β-1,3 glucanase produzidopelo microrganismo Arthrobacter sp. Ferro(2002) estudou a produção de β-1,3 glucanase pelalinhagem Cellulosimicrobium cellulans 191, assimcomo Soares (2002) e Fleuri (2003 e 2006).Beshai et al. (2003) descreveram a produção deβ-1,3 glucanase de Bacillus sp. utilizando uma linhagemde Escherichia coli recombinante em fermentador.As preparações enzimáticas de β-1,3 glucanasesobtidas por microrganismos são encontradas naforma bruta e na forma parcialmente purificada.Enzimas em estado impuro podem ser aplicadaspara finalidades específicas e em muitos casossão requeridas por serem de fácil obtenção e debaixo custo. As enzimas purificadas apresentam avantagem de estarem livres de outras enzimas esubstâncias que interferem nos substratos desviandoas reações específicas. Além disso, comercialmentesão muito mais valorizadas.Muitas β-1,3 glucanases, obtidas por fermentaçãode microrganismos, têm sido purificadas, entreelas: a β-1,3 glucanase (27,19 KDa) de Oer-40 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

skovia xanthineolytica LL-G109 (Andrews eAsenjo, 1987); β-1,3 glucanase (12 KDa) de Oerskoviaxanthineolytica LL-G109 (Ventom eAsenjo, 1990); β-1,3 glucanase (82 KDa) líticade Rarobacter faecitabidus (Shimoi et al., 1991);β-1,3 glucanase (40 KDa) de Oerskovia xanthineolyticaTK-1 (Saeki et al., 1994); β-1,3 glucanasede Oerskovia xanthineolytica LL-G109 (Parradoet al.,1996; Ferrer et al., 1996); endo-1,3-β glucanase (17 KDa) de Trichoderma harzanium(Thrane et al., 1997); β-1,3 glucanase (29KDa) de Trichoderma harzianum (Noronha eUlhoa, 2000); β-1,3 glucanases (17,1 KDa e 57KDa) da linhagem Cellulosimicrobium cellulans191 (Ferro, 2002; Soares, 2002); β-1,3 glucanasealcalina (71 KDa) de Bacillus clausii NM1(Miyanishi et al., 2003); β-1,3 glucanase (83,1KDa) de Thichoderma asperellum (Bara et al.,2003).O presente estudo visou a produção da β-1,3 glucanasepela bactéria Cellulosimicrobium cellulans191 em frascos agitados e em fermentadore a purificação em coluna de troca iônica.Figura 2. Estudo da produção de β-1,3 glucanase em fermentador de 5 L,em meio de cultivo contendo 1% de parede celular de levedura em tampãofosfato 0,2 M, pH 7,5 a 30 o C, 200 rpm e 3,0 vvmMATERIAL E MÉTODOSProdução de β-1,3 glucanase em frascos agitadosA β-1,3 glucanase foi produzida, em frascos agitados,em meio de cultivo composto por 2,0 g/Lde (NH 4) 2SO 4;0,2 g/L de MgSO 4.7H 2O e 10 g/Lde parede celular de levedura em tampão fosfato0,2 M, pH 7,5. Os frascos foram incubados a30 o C, 200 rpm durante 24 h.Para a preparação do pré-inóculo, uma alçada dacultura de 24 h do microrganismo em tubo inclinadode meio TYM foi inoculada separadamenteem frascos Erlenmeyers aletados de 500 mLcontendo 100 mL do meio de cultivo. Alíquotasde 10 mL de pré-inóculo foram transferidas assepticamentepara frascos Erlenmeyers de 500mL contendo 90 mL do mesmo meio de cultivo.Os frascos foram incubados a 30 o C, a 200 rpmdurante 24 h. Após incubação, o meio de cultivofoi centrifugado a 7.840 g durante 10 min a 5 o Ce os sobrenadantes utilizados como preparaçãoenzimática bruta.Produção de β-1,3 glucanase emfermentador de 5 LA produção de β-1,3 glucanases pela linhagem C.cellulans 191 foi estudada em fermentador de 5L no meio de cultivo descrito anteriormente;com 1,5 e 3 vvm de aeração. As condições depH, temperatura e agitação para a produção deβ-1,3 glucanase foram respectivamente, 7,5; 30 o Ce 200 rpm.As amostras foram coletadas em diferentes temposde fermentação. A alteração do pH do meiode cultivo foi determinada com o auxílio de potenciômetro.O crescimento celular foi estimadoindiretamente através da medida de absorbânciaa 660 nm.A atividade de β-1,3 glucanase foi determinadacomo descrito por Saeki et al. (1994) e Santos(2000). A mistura de 250 µL de solução enzimáticae 250 µL de solução 1,0% de laminarinaem tampão acetato de sódio 0,1 M, pH 5,5foi incubada a 55 o C por 30 min. A reação foiinterrompida por aquecimento a 100 o C por 5min. Os açúcares redutores foram determinadospelo método de Somogyi (1952) utilizandoglicose como açúcar padrão. Para controleforam determinados os açúcares redutorespresentes na solução enzimática utilizandoágua destilada no lugar da solução de laminarina.Para ajuste do espectrofotômetro foipreparado um tubo branco utilizando-se águadestilada no lugar da solução de laminarina.Uma unidade de atividade foi definida como aliberação de um µmoL de glicose por minutopor mL de solução enzimática.Purificação parcial da β-1,3 glucanaseA preparação bruta (20 mL) de β-1,3 glucanase(1,12 U/mL) foi aplicada em coluna deDEAE-Sephadex A50 de 2,5 cm de diâmetroe 40 cm de comprimento, equilibrada em tampãofosfato de sódio 0,01 M, pH 6,5. As proteínasadsorvidas foram eluídas pela aplicaçãode 250 mL do mesmo tampão usandogradiente de sal (de 0 a 1 M de NaCl). Asfrações de 5 mL foram coletadas a cada 12,5min.O curso de eluição das proteínas foi acompanhadopela medida da absorbância a 280 nm.As frações contendo atividade de β-1,3 glucanaseforam reunidas, dialisadas contra águaDeterminação da atividade deβ-1,3 glucanaseFigura 3. Purificação da β-1,3 glucanase através de cromatografia de troca iônica emcoluna de DEAE-Sephadex A50Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 41

Padrões β-1,3 glucanasePadrões: a- fosforilase b (94,0 KDa); b- albumina bovina (67,0KDa); c- ovoalbumina (43,0 KDa); d- anidrase carbônica (30,0KDa); e- inibidor de tripsina de soja (20,1 KDa); f- α-lactoalbumina (14,0 KDa)Figura 4. Eletroforese da β-1,3 glucanase purificada em gel SDS-poliacrilamidadestilada e liofilizadas. A concentração de proteínadas soluções enzimáticas foi determinada comodescrito por Lowry et al. (1951), usando ovoalbuminacomo padrão. A atividade de β-1,3 glucanasefoi determinada como descrito anteriormente.Eletroforese da β-1,3 glucanase em gelSDS-poliacrilamidaAs frações com atividade de β-1,3 glucanase foramconcentradas por liofilização, ressuspendidas e aplicadasem gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamidaa 12% (SDS-PAGE), como descrito por Laemmli(1970). A eletroforese foi desenvolvida emduas etapas: a 80 V por aproximadamente 30 mine a 120 V por aproximadamente 2 h.Após a corrida eletroforética, os géis foram lavadostrês vezes por 20 min com uma solução fixadorade etanol (30%) e ácido acético (10%) emágua destilada. Em seguida, o gel foi corado comCoomassie Blue R250.A mistura padrão de proteínas, utilizada como parâmetropara determinar a massa molecular da β-1,3 glucanase, continha fosforilase b (94,0 KDa),albumina bovina (67 KDa), ovoalbumina (43,0KDa), anidrase carbônica (30,0 KDa), inibidor detripsina de soja (20,1 KDa) e α-lactoalbumina (14,0KDa).RESULTADOS E DISCUSSÃOProdução de β-1,3 glucanaseem frascos agitadosFoi obtido 1,12 U/mL de β-1,3 glucanase atravésda fermentação da linhagem C. cellulans 191, emfrascos agitados aletados, em meio de cultivoem tampão fosfato 0,2 M, pH 7,5, a 30 o C e200 rpm, após 24 h de incubação.Produção de β-1,3 glucanase em fermentador de 5L, em diferentes condições de aeraçãoA produção de β-1,3 glucanase pela linhagemC. cellulans 191 em meio de cultivo contendo1% de parede celular de levedura em tampãofosfato 0,2 M, pH 7,5, em fermentadorde 5 L, foi estudada em diferentes tempos defermentação; a 30 o C, 200 rpm e 1,5 e 3 vvmde aeração.Na fermentação da linhagem C. cellulans 191em fermentador de 5 L com 1,5 vvm deaeração, foi obtido máxima produção de β-1,3 glucanase após 24 h de fermentação (0,34U/mL). O pH do meio de cultivo praticamentenão apresentou variação durante afermentação.No cultivo do microrganismo em fermentadorde 5 L com 3 vvm de aeração, a β-1,3 glucanasefoi produzida no final da fase exponencial decrescimento atingindo atividade máxima de0,72 U/mL de β-1,3 glucanase após 24 h defermentação. O pH do meio de cultivotambém não apresentou variação significativadurante a fermentação.O presente estudo demonstra que maioresaerações são favoráveis para a produção daenzima. O aumento da aeração de 1,5 vvmpara 3 vvm na produção de β-1,3 glucanasepela linhagem C. cellulans 191 provocou umaumento de aproximadamente 2,12 vezes naatividade enzimática. No estudo com aeração de1,5 vvm foi obtido 0,34 U/mL de β-1,3 glucanaseapós 24 h de fermentação do microrganismo C.cellulans 191, indicando uma produçãoaproximadamente 3,1 vezes maior que a obtidanos estudos descritos por Ferro (2002); enquantoque no estudo de produção com aeração de 3vvm, foi obtida uma produção 5 vezes maior quea obtida por Ferro (2002).Nota-se também que a produção de β-1,3glucanase em frascos aletados foi superior 1,5vezes quando comparada à produção emfermentador. O tipo de agitação em frascosaletados e em fermentador são diferentes eparecem interferir diretamente na produção daenzima pela bactéria C. cellulans 191.Resultados similares foram relatados por Beshayet al. (2003) que estudou a produção de β-1,3glucanase por Bacillus sp. utilizando umalinhagem de E. coli recombinante. Foi obtidouma produção enzimática 1,03 vezes menor emfermentador de 3 L, quando comparado com oestudo de produção da enzima em frascosagitados.Purificação parcial de β-1,3 glucanaseEm estudo preliminar foi testado ofracionamento enzimático por precipitação comsulfato de amônio (40, 60 e 80% de saturação)da preparação bruta de β-1,3 glucanase obtidaatravés do cultivo de C. cellulans 191 em frascosagitados aletados. Nesta etapa a atividadeespecífica da preparação enzimática final foiinferior à atividade específica da preparaçãoenzimática inicial. Dessa forma, para apurificação da β-1,3 glucanase o extratoenzimático bruto foi aplicado diretamente nacoluna de troca iônica sem concentração préviacom sal.A purificação da β-1,3 glucanase da linhagem C.cellulans 191 foi conduzida em coluna de DEAE-Sephadex A50 equilibrada em tampão fosfato0,01 M, pH 6,5. A enzima foi eluída da resinautilizando tampão contendo 0,6 M de NaCl. Foiobtido um pico de β-1,3 glucanase (Figura 3), aqual foi purificada 11,92 vezes com umrendimento de 25% (Tabela 1).Diferentes métodos de purificação de β-1,3glucanases têm sido relatados. A β-1,3 glucanasede Oerskovia xanthineolytica TK-1 foi purificadaem coluna de DEAE-Sephacel, DEAE-Toyopearl650M e Bio-Gel P-2. A enzima foi purificada 21vezes e apresentou massa molecular estimadaem 40 KDa (Saeki et al., 1994).A β-1,3 glucanase de Oerskovia xanthineolyticaLL-G109 foi purificada em coluna HR 16/10 Q-Sepharose FF. Em eletroforese em gel SDS, aenzima apresentou massa molecular deaproximadamente 27,19 KDa (Parrado et al.,1996). Ferrer et al. (1996) prosseguiram osprocedimentos de purificação desta enzimaatravés de ultrafiltração e duas colunasconsecutivas de HR 16/10 Q-Sepharose FF emdiferentes valores de pH (pH 8,5 e 5,0).Thrane et al. (1997) purificou uma endo-β-1,3glucanase do filtrado de uma cultura deTrichoderma harzanium através de filtração emgel utilizando coluna Sephacryl S-300R e42 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

Tabela 1. Purificação da β-1,3 glucanase em coluna de DEAE-Sephadex A50ExtratosBrutoPurificadoVolume(mL)2050U/mL1,120,112U total22,45,6Proteínas(mg/mL)9,180,078ProteínasTotais (mg)183,63,9Atividade Específica(U/mg)0,121,43Rendimento(%)10025Fator dePurificação111,92focalização isoelétrica, sendo obtido fator depurificação de 12,5 vezes e rendimento de 13%.Em eletroforese em gel SDS, a enzima apresentoumassa molecular em torno de 17 KDa.Noronha e Ulhoa (2000) purificaram uma β-1,3glucanase de Trichoderma harzianum através devárias etapas cromatográficas utilizando colunaSephacryl S-200, coluna Fenil-Sepharose ecoluna CM-Sepharose. A enzima foi purificada65 vezes e foi obtido 0,32% de rendimento.Através de SDS-PAGE a massa molecular foiestimada em aproximadamente 29 KDa.Uma β-1,3 glucanase da linhagemCellulosimicrobium cellulans de 17,1 KDa foipurificada e caracterizada. A β-1,3 glucanase foipurificada do sobrenadante do meio de cultivoatravés de ultrafiltração e cromatografia emcoluna de CM-Sepharose CL6B (purificação de78,2 vezes e rendimento de 5,53%) (Ferro, 2002).Outra β-1,3 glucanase de massa molecular de 57KDa da linhagem Cellulosimicrobium cellulans191 foi purificada do sobrenadante do meio decultivo através de ultrafiltração (membrana deexclusão de 10 KDa) e cromatografia de trocaiônica em coluna de DEAE-Sepharose equilibradaem pH 5,5. A enzima foi purificada 1,18 vezesquanto à atividade de β-1,3 glucanase e 5,1 vezesquanto à atividade de liticase (Soares, 2002).A β-1,3 glucanase alcalina produzida por Bacillusclausii NM1 foi purificada 124 vezes porprecipitação com sulfato de amônio,cromatografia de troca iônica com DEAE-Sepharose FF e filtração em gel com SephacrylS-200HR com rendimento de 41,8%. A massamolecular da enzima purificada foi estimada em71 KDa por eletroforese em gel de SDS-PAGE(Miyanishi et al., 2003).Thichoderma asperellum produz pelo menos duasβ-1,3 glucanases extracelulares na presença deparede celular de Rhizoctonia solani como indutor.A β-1,3 glucanase foi purificada por filtração emgel em coluna Sephacryl S-100 e cromatografiade troca iônica em coluna de Q-Sepharose FastFlow, sendo obtido fator de purificação de 35,7vezes e rendimento de 9,5%. A massa molecularda exo-β-1,3 glucanase purificada foi estimadaem 83,1 KDa utilizando eletroforese SDS-PAGE(Bara et al., 2003).No presente estudo a β-1,3 glucanase (45 KDaem SDS-PAGE) da linhagem C. cellulans 191 pôdeser purificada através de uma única etapacromatográfica, utilizando a coluna de troca iônicaDEAE-Sephadex A50.CONCLUSÕESA maior produção de β-1,3 glucanase (1,12 U/mL) foi obtida através do cultivo da bactéria C.cellulans 191 em frascos agitados aletados, emcomparação com a produção em fermentador.Em fermentador a maior produção da enzimafoi obtida com 3 vvm de aeração, emcomparação com a produção utilizando 1,5vvm. A β-1,3 glucanase foi purificada 11,92vezes em coluna de DEAE-Sephadex A50 comrendimento de 25% e apresentou massamolecular de 45 KDa em SDS-PAGE.REFERÊNCIASAndrews, B. A.; Asenjo, J. A. Continuousculturestudies of synthesis and regulation ofextracellular β-1,3 glucanase and proteaseenzymes from Oerskovia xanthineolytica.Biotechnol. 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PesquisaGlicerol de biodieselEstratégias biotecnológicas para o aproveitamento do glicerol gerado da produção de biodieselIlustrações cedidas pelos autoresJuan Daniel Rivaldi*Engenheiro Químico, Mestre emBiotecnologia IndustrialEscola de Engenharia de Lorena(EEL), Universidade de SãoPaulo(USP)*Autor para correspondência:danielrivaldi@gmail.comBoutros Fouad SarrouhLicenciado em Química;Mestre em Análise de Processos naIndústria Química;Doutor em BiotecnologiaIndustrialEscola de Engenharia de Lorena(EEL), Universidade de São Paulo(USP)Rodolfo FioriloEngenheiro QuímicoGerente Industrial – DAFFERQuímica Ltda.Silvio Silvério da SilvaEngenheiro de Alimentos;Mestre em Ciência e Tecnologia deAlimentos;Doutor em TecnologiaBioquímico- FarmacêuticoEscola de Engenharia de Lorena(EEL), Universidade de São Paulo(USP)RESUMOA intensiva busca por fontes alternativas de energiae processos sustentáveis visando a reduçãoda poluição ambiental e o aquecimento globaldo planeta tem estimulado o mercado mundialde combustíveis limpos. Os biocombustíveis,como o biodiesel, representam uma alternativarenovável e ambientalmente segura aos combustíveisfósseis. Sua produção encontra-se emcrescimento acelerado, e como conseqüência,a quantidade de subprodutos gerados de suaprodução, principalmente o glicerol bruto. Como objetivo reduzir os futuros problemas ambientaispor acumulação de glicerol e tornar aprodução de biodiesel mais rentável, a implementaçãode estratégias biotecnológicas que utilizamo glicerol como única fonte de carbonopara obtenção de produtos de maior valor agregado,vem sendo estudado como uma promissoraalternativa e solução. Este trabalho descreveestudos bem documentados sobre o mecanismometabólico de glicerol por microrganismose pertinentes com a proposta de utilizaçãodo glicerol em processos microbianos. Damesma forma são apresentadas novas estratégiasque podem ser exploradas visando o aproveitamentodeste material e sua bioconversãoem bioprodutos de alto valor agregado.Palavras-chave: glicerol, fermentação,bioproduto.Biotechnological strategies for glycerolutilization derived from biodiesel productionABSTRACTThe claim for reducing environment pollutionstimulates the world market of clean fuels. Biofuelsas biodiesel, represents a renewable andenvironmentally safety alternative to fossil fuel.Nonetheless, its production is increasing considerably,and as a consequence, the amount ofraw glycerol (byproduct) generated is growingexponentially. With the aim to reduce environmentproblems due to accumulation of glycerol,biotechnological strategies for its bioconversionin value-added products are being implementing.This work presents detailed argumentson the metabolic mechanisms of glycerolassimilation by microorganisms, as well as,a description of the most recent biotechnologicalprocesses applied to obtain bioproducts fromglycerol.Keywords: glycerol; fermentation; bioproduct.INTRODUÇÃOA utilização de fontes alternativas de energiaé umas das grandes prioridades atuais, quevem contribuir significativamente para contornaros graves problemas ocasionados pelodesenvolvimento tecnológico. A preocupaçãoatual pela redução da poluição e a crise energéticatêm estimulado o mercado mundial debiocombustíveis. A economia global mantémseem crescimento e a demanda por energialimpa e recursos renováveis encontra-se emcontínuo aumento (BILGEN et al., 2006).Neste sentido, a busca intensiva por combustíveisalternativos ao petróleo, como o biodiesel,apresenta grande importância principalmentepara os países emergentes, uma vezque sua produção auxilia à conservação domeio ambiente, mediante a redução dos gasesresponsáveis pelo aquecimento global, econtribui para o desenvolvimento social mediantea geração de empregos (OLIVEIRA etal., 2006). No Brasil, a produção e comercializaçãode biodiesel possui importantes vantagensdevido à grande disponibilidade dematéria-prima para sua produção e ao crescimentocontínuo da indústria de óleos vegetaise etanol (OLIVEIRA et al. 2006, OISTI,2006).A produção de biodiesel está significativamenteacelerada, uma vez que o governo brasileiroestabeleceu a obrigatoriedade da adição debiodiesel ao combustível de petróleo mediantea lei 11097/2005. No ano 2013, a quantidadede biodiesel a ser adicionado deveráalcançar 5 % do volume total de diesel utilizado(ANP, 2007). O glicerol é o principalsubproduto gerado na produção de biodiesel,sendo que aproximadamente 10 % dovolume total de biodiesel produzido correspondema glicerol (DASARI et al., 2005). Estima-seque com o incremento do volume debiodiesel, o glicerol co-produzido aumentaráde 83 para 330 milhões L/ano até o ano 2010(MME, 2007). Com o intuito de evitar futurosproblemas derivados da acumulação de glicerole para tornar a produção de biodieselmais competitiva, torna-se necessário a buscade alternativas para o uso do glicerol brutogerado nesta produção. Este subproduto, naforma pura, possui inúmeras aplicações industriais(aditivos para a indústria de alimentos,química e farmacêutica). O glicerol obtido resultanteda transesterificação de triglicerídioscom álcool apresenta impurezas como água,sais, ésteres, álcool e óleo residual, que lheconferem um baixo custo (OOI et al.,2004).A rentabilidade de vários processos químicos44 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

depende em parte, da venda dos subprodutos,permitindo a redução dos custos deprodução e conseqüentemente, do preçofinal do produto. Dessa forma, existe umgrande interesse na purificação do glicerolou no seu reaproveitamento direto, semtratamento, o que proporcionará à viabilizaçãodo processo de produção de biodiesel,permitindo que este se torne competitivono crescente mercado de biocombustíveis.Os processos para sua purificaçãoincluem filtração, destilação a vácuo, descoloraçãoe troca de íons para a remoçãoprincipalmente de K + e Na + utilizados comocatalisadores (YONG et al. 2001). No entanto,os tratamentos de purificação são decusto excessivamente elevados para pequenose médios produtores nacionais de biodiesel.Devido a este fato, uma maior quantidadede efluentes contendo glicerol poderáser descartada no meio ambiente semnenhum tratamento, aumentando conseqüentementeos problemas e riscos ambientais.A conversão microbiana de glicerol por processosbiotecnológicos em produtos demaior valor agregado como biomassa e biomoléculas,é uma alternativa relevante paraa maior valorização da produção de biodiesel(ITO et al., 2005). Neste sentido, abiotecnologia moderna, com todo seu avançotrará grandes contribuições e permitiráa obtenção de biomoléculas e produtos comimportantes propriedades.NATUREZA E CARACTERÍSTICASDO GLICEROLGlicerol é o nome comum do compostoorgânico 1,2,3-propanotriol, descoberto porCarl W. Scheele em 1779 durante a separaçãode uma mistura aquecida de PbO preparadacom óleo de oliva. Os seus sinônimossão glicerina, trihidroxipropano, glicilálcool, gliceril e 1,2,3-trihidroxipropano.Na natureza, o glicerol existe em vegetais(soja, mamona, babaçu, girassol, palma, algodão,coco, dendê, pinhão manso) e animaisem formas combinadas de glicerinacom ácidos graxos. O glicerol é tambémum composto considerado fundamental dentrodo sistema metabólico de microrganismos;onde atua como precursor de numerososcompostos; e como regulador de váriosmecanismos bioquímicos intracelulares(LAGES, SILVA-GRAÇA, LUCAS, 1999).Em microrganismos eucarióticos, o glicerolconstitui o principal composto formado pararegular as variações de atividade de águaem ambientes altamente osmofílicos(WANG et al., 2001).Em humanos, o glicerol participa na termo-regulaçãodo corpo, resistência a altastemperaturas, na resistência dos músculosem atividades físicas e na resposta neuralda variação da glicemia (YANG et al., 1999).O glicerol na sua forma pura apresenta-secomo um líquido viscoso, incolor, inodoroe higroscópico, com sabor doce, solúvelem água e álcool, insolúvel em éter e emclorofórmio.Devido às suas características físicas e químicase ao fato de ser inócuo, o glicerolpuro apresenta diferentes aplicações na indústriade cosméticos, farmacêutica, detergentes,na fabricação de resinas e aditivose na indústria de alimentos. Apesar de oglicerol apresentar estas aplicações na formapura, poucos estudos estão sendo direcionadospara a utilização de glicerol brutona forma direta.OBTENÇÃO E TRATAMENTODO GLICEROL BRUTOSubproduto natural do processamento deóleos e gorduras, o glicerol pode ser obtidomediante reação de saponificação de ácidosgraxos (óleos, azeites ou sebo) comhidróxido de sódio ou hidróxido de potássio,como co-produto da fabricação de biodiesele em menor proporção, mediantesíntese microbiana. A produção sintética deglicerina a partir de cloreto de alil via epicloridrinaencontra-se em declínio devidoao excesso no mercado de glicerol do processode biodiesel. Dentro deste contexto,o glicerol constitui o maior subproduto geradono processo de produção do biodieselvia esterificação de ácidos graxos vegetaisou gordura animal com álcool (metanol ouetanol) para produzir ésteres e glicerol napresença de catalisador (KOH ou NaOH)(DIECKELMANN e HEINZ, 1988)A equação global de transesterificação éapresentada na Figura 1a, onde são necessáriostrês moles de álcool por cada mol detriglicerídeo utilizado. Esta reação global éconseqüência de um número de reaçõesreversíveis e consecutivas mostradas na Figura1b. A primeira consiste na conversãode triglicerídeos em diglicerídeos, seguidada conversão destes diglicerídeos em monoglicerídeos,e finalmente de glicerídeosa glicerol, rendendo uma molécula de ésterde álcool por cada glicerídeo em cadaetapa da reação.No final da etapa de transesterificação, oglicerol e ésteres formam uma massa líquidade duas fases, que são facilmente separáveispor decantação ou centrifugação. Afase superior, a mais leve ou menos densa,contém os ésteres metílicos ou etílicos constituintesdo biodiesel. A fase inferior oupesada encontra-se composta de glicerolbruto e impurezas.O valor do glicerol bruto obtido da produçãode biodiesel encontra-se entre 0,2 a0,4 R$/kg. Este baixo valor é atribuído aoconteúdo de aproximadamente 30 % (p/p)de impurezas e ao grande volume desteco-produto gerado pelas indústrias. O glicerolbruto apresenta-se na forma de líquidoviscoso pardo escuro, que contém quantidadesvariáveis de sabão, álcool (metanolou etanol), monoacilglicerol, diacilglicerol,oligômeros de glicerol, polímeros e água(OOI et al., 2004). A porcentagem de glicerolna mistura varia entre 65 a 70 % (p/p), sendo a maior parte das impurezas sabãoformado pela reação dos ácidos graxoslivres com excesso de catalisador (saponificação).Dessa forma, o aspecto do glicerolbruto encontra-se estreitamente relacionadoao conteúdo de sabão, que proporcionaaparência de viscoso e escuro. Parareduzir o sabão gerado, recomenda-se conduzira reação de transesterificação commatérias primas (triglicerídeos) com baixoconteúdo em ácidos graxos livres e água,ao mesmo tempo de reduzir a quantidadede catalisador (OOI et al., 2004).A mistura residual resultante é submetidoao processo de acidulação com ácido concentrado(HCl, H 2SO 4, ou H 3PO 4) para a separaçãode glicerol e ácidos graxos do sabão(Figura 2a). No entanto, a maior partedos processos de tratamento de glicerol éconduzida utilizando HCl ou H 2SO 4, sendoFigura 1. (a) Reação global e (b) Reações consecutivas detransesterificação de triglicerídeos. R 1, R 2, R 3e R representam grupos alquilasBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 45

o H 3PO 4restrito pelo alto custo. Durante aacidulação, forma-se certa quantidade desal (reação do ácido inorgânico com íon dosabão) que se deposita na fase inferior deum líquido de três fases, estando a fase superiorconstituída pelos ácidos graxos livres,e a fase intermédia composta principalmentepor glicerol e álcool (Figura 2b).O glicerol recuperado alcança concentraçõessuperiores a 80 % (p/p), com quantidadesvariáveis de água, corantes e álcool.Posteriormente, o glicerol com excesso deácido é neutralizado com solução de NaOHe submetido a tratamento térmico (70 o C)para eliminar os componentes voláteis (recuperaçãode álcool)(OOI et al., 2004;FUKUDA, KONDO, NODA, 2001). Nestaforma, parcialmente livre de impurezas, oglicerol pode ser utilizado como substratode fermentação por várias espécies de microrganismos.As características físicas, químicas e nutricionaisdo glicerol bruto dependem do tipode ácido graxo (gordura animal ou óleovegetal) e do tipo de catálise empregadana produção de biodiesel. No entanto, aprocura pela glicerina purificada é muitomaior, devida ao seu valor econômico. Aaplicação do glicerol na indústria está condicionadaao grau de pureza, que deve serigual ou superior a 95%. Para obter graude pureza superior a 95% (p/p)(grau alimentícioou farmacêutico), o glicerol deveser submetido a destilação, mas sob custoelevado .Por outro lado, de acordo com a Tabela 2,o glicerol bruto contém elementos nutricionais,como, fósforo, enxofre, magnésio,cálcio, nitrogênio e sódio, e que são factíveisde serem utilizados por microrganismospara o seu crescimento durante processosfermentativos (THOMPSON, HE,2006).ASSIMILAÇÃO, METABOLISMO ECONVERSÃO MICROBIOLÓGICA DOGLICEROL.O glicerol é considerado uma fonte de carbonoaltamente reduzida e assimilável porbactérias e leveduras sob condições aeróbicase anaeróbicas 19 para a obtenção deenergia metabólica, como regulador do potencialredox e para a reciclagem de fosfatoinorgânico dentro da célula (DILLIS etal., 1980).Vários estudos foram desenvolvidos visandoa utilização de glicerol como fonte decarbono por microrganismos, especialmentepor bactérias. Muitos deles apontam principalmentea mecanismos de assimilação deglicerol por estes microrganismos para aprodução de compostos intermediários depolímeros, resinas e aditivos para combustíveis(PAPANIKOLAOU et al., 2002; ITOet al., 2005; CHENG et al 2007).O transporte do glicerol através da membranacelular constitui a primeira etapa parao seu metabolismo. De uma forma geral, aassimilação de glicerol por parte dos microrganismosenvolve o transporte passivo(GANCEDO, GANCEDO, 1968) e transporteativo (LAGES, SILVA-GRAÇA, LUCAS, 1999)através da membrana plasmática.O transporte passivo inclui a difusão simples(permeação não específica) e a difusãofacilitada mediada por proteínas localizadasnas camadas mais internas da membranaplasmática (MIP), as permeases. Adifusão simples, sendo ATP não dependente,requer um gradiente de concentraçãopara o transporte do substrato através damembrana. Conseqüentemente, a concentraçãodo substrato no interior da célula nãoFigura 2.(b)- Separação do glicerol apóstratamento com ácido concentrado,a fase superior corresponde aácidos graxos, fase intermédia:glicerol, fase inferior: glicerol + saisFigura 2.(a) - Fluxograma de produção de biodiesel e tratamento de purificação do glicerolsupera aquela encontrada no meio decultura(MOAT, FOSTER, SPECTOR, 2002).Na levedura Saccharomyces cerevisiae, estudosdesenvolvidos por Luyten et al.(1995), assinalaram a existência de permeasesFPS1, específicas para transporte deglicerol (Figura 3).O glicerol é um dos poucos substratos queatravessa a membrana celular por difusãofacilitada nas células procarióticas. Em bactériascomo Escherichia coli, a proteína do46 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

tipo poro-canal-G1pF atua por sensibilidademecânica sem gasto energético na presençade glicerol. Este facilitador permite aassimilação, além de glicerol, de pequenasmoléculas de polihidroxi álcoois, uréia eglicina, mas exclui moléculas carregadascomo gliceraldeído-3-fosfato e dihidroxiacetonafosfato(HOLST et al., 2000). Emquanto aos mecanismos genéticos, foramdescritos três genes responsáveis pela assimilaçãoe regulação do conteúdo intercelularde glicerol em Saccharomyces cerevisiae,o GUP1 e GUP2 (HOLST et al., 2000)e FPS1(LUYTEN et al.,1995) associados diretamentecom o transporte facilitado e quesão expressas conforme estímulos provocadosnas células, como o estresse osmótico.Por outro lado, mecanismos de transporteativo simporte glicerol/H + e simporte glicerol/Na+ (dependentes de ATP) foram descritosem numerosas espécies de leveduras,entre elas Debaryomyces hansenii, Pichiasorbitophila, Saccharomyces cerevisiae,Zygosaccharomyces rouxii (LAGES, SIL-VA-GRAÇA, LUCAS, 1999). Tanto as acumulaçõesde glicerol por estresse, como aexistência de mecanismos ativos, são comunsem grande variedade de leveduras(LAGES, LUCAS, 1997).Após a passagem do glicerol através damembrana plasmática pelos possíveis mecanismos,o glicerol pode ser catabolisadopor várias rotas metabólicas independentes,apresentado na Figura 4.Uma das rotas, provavelmente a principalpara a oxidação de glicerol por leveduras,consiste na fosforilação do glicerol pela enzimaglicerol-quinase para formar glicerol-3-fosfato, que é reduzido a dihidroxiacetonafosfato pela enzima mitocondrial glicerolfosfo-ubiquinona oxidoreductase (FADdependente)(GANCEDO, SERRANO, 1989).Figura 3. Tipos de transporte para aassimilação de glicerol pela leveduraSaccharomyces cerevisiae. FPS1 eYFLO54c são proteínas de transporte,GUT1 e GUT2 são genes para expressãode enzimas de assimilação de glicerol.(Baseado em: NEVES, LAGES, LUCAS,2004)Estudos demonstraram que, os genes quecontrolam a síntese das enzimas glicerolquinasee fosfo-ubiquinona oxidoreductasesão GUT1 e GUT2, respectivamente (GRAU-SLUND, LOPES, RONNOW, 1999). A expressãodessas enzimas é reprimida duranteo crescimento celular em substratos fermentescíveiscomo glicose, mas desreguladoquando glicerol ou etanol é utilizadocomo a principal fonte de carbono (GRAU-SLUND, RONNOW, 2000).Outra possível via catabólica do glicerol correspondeà oxidação de glicerol e conseqüenteformação de dihidroxiacetona pela enzimaglicerol desidrogenase. Após, a dihidroxiacetonaé fosforilada a dihidroxiacetona fosfatopela enzima dihidroxiacetona quinase dependentede Adenosina Trifosfato (ATP). Gancedoe Gancedo (1968) reportaram que levedurasda espécie Schizosaccharomyces pombe,por exemplo, oxida glicerol mediante essavia sob condições de “stress” osmótico.A dihidroxiacetona fosfato é considerada umaimportante molécula intermediária para a gliconeogênese(síntese de hexoses), assim comopara a obtenção de numerosos compostos atravésdas vias oxidativas, incluindo, ácido cítrico,ácido succínico, ácido acético, ácido fórmico,ácido lático, etanol e outros compostosde interesse comercial (MOAT, FOSTER, SPEC-TOR, 2002). O crescimento de microrganismosem fontes de carbono alternativas aoscarboidratos, como L-malato, acetato, ou glicerol,requer a capacidade de sintetizar hexosesnecessárias para a produção de mucopeptideosda parede celular, armazenagem deglicogênio, e outros compostos derivados dehexoses, como as pentoses, envolvidos na biosíntesede ácidos nucléicos (MOAT, FOSTER,SPECTOR, 2002).Também, Hauge, King e Cheldelin (1955),fazem referência sobre a capacidade de algumasbactérias, entre elas Acetobacter suboxydans,de oxidar a molécula de dihidroxiacetonafosfato pela via pentose-fosfato, incrementandoo número de bioprodutos possíveisde serem obtidos por via biotecnológica a partirde glicerol.Em espécies de leveduras do gênero Yarrowiasp., e em bactérias como Klebsiella pneumoniae,Clostridium pasteurianum, Citrobacterfreundii, Klebsiella pneumoniae, Clostridiumpasteurianum, Clostridium butyricum,Enterobacter agglomerans, Lactobacillus brevis,Lactobacillus buchneri and Bacillus welchii(ZHAO, CHEN, YAO, 2006; GONZÁLEZ– PAJUELO et al., 2006; CHENG et al., 2007),observa-se que sob condições de anaerobiose,o glicerol sofre desidratação pela enzimaglicerol desidratase para produzir 3-dihidroxipropionaldeído.Posteriormente, este intermediário é transformadopela enzima NADH dependente 1,3-propanodiol oxido-reductase para gerar 1,3-propanodiol, principal intermediário para produçãode polímeros, resinas e aditivos de importantesaplicações industriais (GONZÁLEZ– PAJUELO et al., 2006; CHENG et al., 2007).Uma vez que o glicerol é assimilado no interiorda célula, numerosos compostos são produzidoscomo conseqüência do seu metabolismo.BIOPRODUTOS OBTIDOS PORFERMENTAÇÃO MICROBIANADO GLICEROLTabela 1. Composição do glicerol bruto obtido durante a produção de biodieselem função de diferentes matérias prima. (Adaptado de: THOMPSON, HE ,2006)A extraordinária expansão da indústria de biodieselno Brasil e no mundo vem originandograndes volumes do principal co-produto,o glicerol. A superprodução de glicerol afetanegativamente o preço do biodiesel no mercado,tornando imperiosa a busca de novasBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 47

Figura 4. Vias metabólicas de assimilação de glicerol pormicrorganismos e seus possíveis produtos. (Adaptado de: GANCEDO,GANCEDO, 1968; HAUGE, KING, CHELDELIN, 1955; XIU et al., 2007)aplicações para este co-produto. Neste contexto,o glicerol vem sendo investigadocomo a futura fonte de carbono em processosmicrobianos para a obtenção de bioprodutosde alto valor agregado.A continuação, detalham-se os recentes processosfermentativos aplicados nos laboratóriosde pesquisa científica para a obtençãode bioprodutos a partir do glicerol, independentedo seu origem.1,3-PropanodiolO propanodiol é um composto intermediáriopara a síntese de compostos cíclicos emonômeros para poliésteres, poliuretanose polipropileno tereftalato. É conhecido queos processos químicos tradicionais de produçãosão altamente nocivos devido ao compostostóxicos formados. As pesquisas maisimportantes na utilização biotecnológica doglicerol bruto apontam principalmente àprodução do composto intermediário 1,3-propanodiol (GONZALEZ-PAJUELO et al.,2006; XIU et al., 2007). Atualmente, estescompostos são produzidos quase exclusivamentea partir de um derivado do petróleo,o óxido de propileno, mediante processosquímicos convencionais (SULLIVAN,2003).O campo de aplicação do composto 1,3-propanodiol é considerado amplamenteabrangente, diferentes setores comerciais, desdea produção de polimeros, tintas, resinas de poliéster,lubrificantes, anti-cogelante, até produçãode cosméticos. Mediante fermentação de glicerolbruto por Klebsiella pneumoniae foram obtidosconcentrações de até 56 g/L em escala de laboratório.No entanto, a produção de 1,3-propanodiola escala industrial encontra-se limitado devido aque os a maioria dos microrganismos produtores,Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Clostridium,Propionibacterium and Anaerobiospirillum, sãoconsiderados patogênicos e requerem de condiçõesestritas de anaerobiose e nutrientes específicospara seu desenvolvimento (BARBIRATO et al.,1997). Uma solução futura para o scale-up consistiriana utilização de ferramentas da engenhariagenética para inserir genes que expressem enzimasgeradoras de 1,3-propanodiol em microrganismosmais adaptados a condições industriais, comopor exemplo, a bactéria Escherichia coli (DHAR-MADI, MURARKA, GONZÁLEZ, 2006).Notoriamente, muitas espécies apresentam a capacidadede fermentar o glicerol produzindo 1,3-propandiol, entre elas podem ser citadas Citrobacterfreundii, Klebsiella pneumoniae, Clostridiumpasteurianum, Clostridium butyricum, Enterobacteragglomerans, Lactobacillus brevis, Lactobacillusbuchneri and Bacillus welchii (BARBIRATO etal., 1997; GONZALEZ-PAJUELO et al., 2006; XIUet al., 2007) . Atualmente, as bacterias Clostridiumbutyricum e Klebsiella pneumoniae são consideradasas de maior utilização e provavelmentesejam as melhores produtoras deste composto (XIUet al., 2007). Recentemente, González-Pajuelo etal. (2005) comparando uma espécie natural deClostridium butyricum VPI 3266 com outra geneticamentemodificada Clostridium acetobutylicumDG1(pSPD5) (contendo genes para produção de1,3-propanodiol), observaram que no tempo de47 h de fermentação em batelada alimentada, acepa modificada alcançou maior produtividade(0,65 mol/mol de glicerol, 1,7 g/L h) que a cepanatural (0,69 mol/mol, 1,21 g/L.h). Em fermentaçãocontínua de glicerol bruto e comercial (pureza:80-90% ) em uma taxa de diluição (D) de 0,05h -1 (pH 6,5; 35 o C) com a mesma cepa modificada,foram obtidos valores de rendimento e produtividadesimilares aos observados em batelada alimentada(0,61-0,64 mol/mol glicerol, 1,49-1,56g/L.h). Os mesmos autores reportaram alta produtividadeem 1,3-propanodiol (10,3 g/L.h) em cultivocontínuo da bactéria Clostridium butyricum(GONZÁLEZ-PAJUELO, ANDRADE, VASCONCE-LOS, 2005).Outro aspecto considerado de importância é aimobilização de células em diferentes polímerospara sua re-utilização em fermentações consecutivas.O encapsulamento de células de Klebsiellapneumoniae em celulose-sulfato de sódio e policloretode metil dialil amônia desenvolvido porZhao, Chen e Yao (2006), permitiu executar fermentaçõesem batelada repetida, batelada alimentadae processo contínuo para a obtenção de 1,3-propanodiol sob concentrações de glicerol tão elevadasquanto 120 g/L. A quantidade de produtoobtido foi de 63,1 g/L (5,7 g/L.h), 51,86 g/L(1,08g/L.h) e 13,6 g/L (4,5 g/L h) para fermentação embatelada simples, batelada alimentada e fermentaçãocontínua, respectivamente. Apesar dos valoresde produtividade na fermentação por bateladaalimentada serem menores que na batelada simples,os resultados sugerem a potencialidade da48 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

eutilização de células imobilizadas, principalmentepor fornecer um ambiente estável paraa célula frente a altas concentrações de substrato.A co-fermentação de glicerol e glicosefoi avaliada por Xiu et al. (2007) para a produçãode 1,3-propanodiol por Klebsiella pneumoniaeDSM2026. Na relação glicose-gliceroligual a 0,2 e sob condições de microaeraçãoforam alcançados valores de produtividadeigual a 1,95 g/L.h.Os primeiros estudos tecnológicos para o aumentode escala foram desenvolvidos porCheng et al. (2007), utilizando reator em processopor batelada alimentada de 5000 L devolume total. Sob condições de baixo potencialde oxidação, alcançado mediante fluxode nitrogênio gás (0,15 vvm), foram fermentados4000 L de meio contendo 40 g/L deglicerol a pH 6,8 ; 90 rpm e 37 o C. Aconcentração máxima de produto foi de 58,8g/L, mas com uma produtividade ainda baixade 0,92 g/L.h. Estes resultados iniciais demonstrama factibilidade da produção de 1,3-propanodiol a escala piloto, mas novas tentativasdeverão ser conduzidas para a sua otimizaçãovisando a projeção industrial.EtanolEtanol, butanol, e outros compostos são coproduzidosdurante a fermentação de glicerol(DABROCK, BAHL, GOTTSCHALK, 1992). Itoet al. (2005) demonstraram a possibilidadede produzir etanol e hidrogênio por Enterobacteraerogenes HU-101 utilizando efluentesda indústria de biodiesel contendo ate 41%(p/p) de glicerol. Convenientemente diluído(7,3 g/L), o efluente foi fermentado em formadescontínua em frascos anaeróbicos e em formacontínua utilizando reator de coluna empacotada.Na fermentação descontínua, os rendimentosem hidrogênio e etanol foram de0,89 mol/mol de glicerol e 1 mol/mol glicerol,respectivamente. Rendimentos acima de10 g/L foram obtidos em processo contínuoempregando cerâmica porosa como suportede microrganismos. Neste processo, comparandomeios contendo efluente de biodiesele glicerol comercial, os mesmos autores observaramque produção de hidrogênio foimaior naquele meio com glicerol parcialmentepurificado (60 mmol/L.h) que utilizando efluente(30 mmol/L h). Aparentemente, as impurezasque acompanham o efluente aumentarama fragilidade dos flocos de microrganismos,facilitando o wash- out das células doreator na mesma taxa de diluição.Em outros trabalhos, etanol e ácido fórmicoforam os principais produtos da fermentaçãode glicerol pela bactéria Klebsiella planticola,em concentrações equimolar acima de 2g/L (JARVIS, MOORE, THIELE, 1997). Estesresultados estimulam a procura de novos microrganismospara a fermentação de glicerolvisando a produção de etanol e hidrogênio.Ácidos orgânicosTambém, existem numerosos trabalhos direcionadospara a produção de ácido cítrico eácido succínico por fermentação de glicerol.Estes compostos são de ampla aplicação naindústria de alimentos e constituem importantesintermediários para a indústria de polímerose produção de compostos químicoscomo o 1,2-butanodiol e 2,4-butanodiol.Papanikolaou et al. (2002) obtiveram considerávelquantidade de ácido cítrico, deordem de 35 g/L, mediante fermentaçãode glicerol por Yarrowia lypolitica. Por suaparte, Rymowicz et al. (2006) publicaramestudos de assimilação de glicerol desenvolvidoscom três cepas mutantes de Yarrowialypolitica, obtendo concentrações deaté 124,5 g/L de ácido cítrico. A produçãode ácido succínico e ácido acético a partirde glicerol por Anaerobiospirillum succiniciproducensresultou em concentrações6,5 vezes superiores a aquelas obtidas utilizandoglicose como única fonte de carbono(LEE et al., 2001).A síntese de ácido propiônico por célulasde Propionibacteria acidipropionici e Propionibacteriafreudenreichii ssp. shermaniiimobilizadas em alginato de cálcio foi reportadopor Bories et al. (2004). Sob condiçõesde alta concentração de glicerol obtiveram-seconcentrações de ácido propionicode até 42 g/L.PolihidroxialcanoatosA preocupação pela redução dos contaminantesambientais vem acelerando novaspesquisas para a produção de polímerosbiodegradáveis. Espécies de Pseudomonasproduzem naturalmente polihidroxialcanoatos(PHA), poliésteres lineares de compatívelcom uma ampla faixa de potenciaisaplicações devido a suas propriedades físicase biodegradabilidade (ASHBY, SOLAI-MAN, FOGLIA, 2005).Muitos microrganismos acumulam PHA sobcondições de estresse, principalmente quandosubmetidos à falta de nitrogênio, fósforoou oxigênio, e utilizam esse polímeroquando a fonte externa de carbono é limitada.Historicamente, os ácidos graxos foramutilizados extensivamente para a síntesede PHA (ASHBY, SOLAIMAN, FO-GLIA, 2005). Glicerol proveniente da produçãode biodiesel apresenta-se como umaopção de substrato econômico para a produçãodeste tipo de biopolímeros. Bormane Roth (1999) utilizaram Methylobacteriumrhodesianum para produzir polihidroxibutirato(PHB) na concentração de 10,5 g/Lem fermentação por batelada com meio contendo5 g/L de glicerol e caseína peptona.Koller et al. (2005) obtiveram polihidroxialcanoatosnuma concentração máxima de16,2 g/L, mediante fermentação em bateladaalimentada de soro de queijo e glicerolbruto por uma cepa selvagem de levedura.Para estressar as células, o cultivo foi conduzidosob tensão de oxigênio (taxa de 10mL/min) e sem outra fonte de fósforo alémdaquela fornecida pelos 2,5 g/L de extratode levedura. Um ponto interessante nestapesquisa foi a capacidade da cepa selvagemde produzir simultaneamente 3-hidroxivalerato(8-10 % do total de PHA) semnecessidade dos precursores ácido propiónicoou ácido valérico.Ashby, Solaiman e Foglia (2005) utilizaramduas cepas, Pseudomonas oleovorans B-14682e Pseudomonas corrugata 388 para a produçãode PHA. Partindo de concentrações máximasde 50 g/L glicerol, as cepas P. oleovoranse P.corrugata produziram 0,97 g/L dePoli 3-hidroxibutirato (P3HB) e 0,67 g/L deacido hidroxidodecenóico, respectivamente.De igual forma, foi observada a capacidadede produção de blend de P3HB and PHA emdiferentes proporções por cultura mista dosmicrorganismos estudados.Ácido graxo poliinsaturado ômega-3De conhecidas propriedades terapêuticas contranumerosas enfermidades cardiovasculares,câncer e Alzheimer, os ácidos graxos poliinsaturadosômega-3 (AGPI ù-3) são geralmenteobtido a partir de fontes naturais como óleosvegetais ou de peixes.Recentemente foram desenvolvidos trabalhospara a produção de AGPIù-3 a partir da microalgaheterotrófica Schizochytrium limacinumque possui capacidade produzir altos níveisde ácido docosahexaenóico (DHA). Pylee Wen (2007) observaram que após 5 dias decrescimento em frascos Erlenmeyer (pH 8,20 o C, 170 rpm), aproximadamente 18 g/L decélulas da microalga se formavam em meiosindependentes contendo glicose, glicerol puroe glicerol bruto na concentração de 90 g/L.Foram analisados alguns parâmetros cinéticoscomo a velocidade específica de crescimentoµ, 0,685/ h; rendimento em biomassa, 0,284g/g glicerol bruto; rendimento de DHA, 171,27mg/g glicerol bruto e rendimento volumétricode 3,08 g/L. Também, foi estudado o efeitode diferentes concentrações de glicerolbruto contendo sabão sobre o crescimento damicroalga. Concentrações superiores a 40 g/Ldeste glicerol, influenciaram negativamenteno crescimento da microalga, sendo que naconcentração de 90 g/L observou-se a mortedas células após 2 dias de cultivo. Estes resultadospodem ser considerados ótimos, desdeque não se necessitaria de uma etapa de prétratamentodo glicerol para a separação dosabão, etapa geralmente longa e de custo elevado.O trabalho demonstra que um leque deoportunidades pode ser aberto com pesquisasutilizando exclusivamente algas heterotróficase glicerol como fonte de carbono.Avanços tecnológicos noaproveitamento do glicerol no BrasilRecentemente, no XVI Simpósio Nacional deBioprocessos (SINAFERM 2007) foram apresentadosnumerosos trabalhos na busca desoluções biotecnológicas para a utilização deglicerol originado da produção de biodiesel.Por exemplo, Meinicke, Vendruscolo e Ninow(2007) compararam diferentes meioscontendo concentrações variáveis de glicerole glicose como fonte de carbono para a produçãode corantes naturais pelo fungo filmamentosoMonascus ruber. A máxima produçãode pigmentos vermelhos em frascos Erlenmeyerfoi de 5,2 UDO 480 nm(1 unidade UDO(Abs) corresponde a 15 mg/L de pigmento) eprodutividade de (0,0596 UDO 480nm./h) utili-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 49

zando fonte de carbono mista (5 g/L deglicose e 15 g/L de glicerol). Os autoresobservaram que variações no valor de pHpodem regular a proporção do tipo de pigmentosencontrado no meio. Valores de pHinferiores a 5,5 encontram-se associados àformação de pigmentos amarelos, sendo queos valores superiores favorecem a produçãode pigmentos vermelhos.Também, o glicerol resultante da transesterificaçãode óleo de mamona demonstrouser uma fonte de carbono apropriadapara produção de biosurfactante ramnolipídeo(uma ou duas moléculas de ramnose eácido graxo de cadeia longa) por Pseudomonaaeruginosa 59 . A concentração da fontede nitrogênio (NaCO 3) representou serum fator preponderante na produção do biosurfactante,comprovado pela redução datensão superficial da água maior a 45,7 % eíndice emulsificação às 24 h superior a 56,1% para os diferentes hidrocarbonetos testados(querosene, hexadecano e isso-octano).Prieto et al 2007 obtiveram resultadossimilares na produção de ramnolipídeos,comprovando a maior influência do NaNO 3na produção de biosurfactante pela mesmaespécie de microrganismo, seguido porNH 4NO 3, uréia e NH 4SO 4.Recentemente, em trabalhos de pesquisavisando a seleção de leveduras aptas paraa assimilação e crescimento em glicerol comercial,verificamos que algumas espécies,incluindo Kluyveromyces marxianus eCandida batistae, apresentaram elevada capacidadede crescimento neste substrato.Dentre as leveduras estudadas, Hansenulaanomala e Candida tropicalis mostraramcapacidade de produzir etanol em concentraçõesde 3,5 e 6,1 g/L, respectivamente61 . Estes resultados, ainda preliminares, sãopromissores para produção de etanol a partirde glicerol por esses microrganismos.Por outro lado, Volpato et al (2007) isolaramde ambientes amazônicos diferentescepas de Bacillus com capacidade de produzirlípases utilizando glicerol como fontede carbono. A máxima atividade lipolíticaem glicerol (24,3 U/L) foi obtida com oisolado BL74.Destaca-se também a possibilidade da fermentaçãode glicerol de biodiesel por Streptomycesclavuligerus para a produção deácido clavulânico, potente inibidor de betalactamases,que junto com a penicilina ecefalosporina são utilizados contra infeccionesbacterianas. O trabalho desenvolvidopor Gutierrez e Costa Araújo (2007) comparoua suplementação continua de meiosde cultura contendo concentrações variáveisde fonte de aminoácidos e glicerol paraa produção de ácido clavulânico. Após 120h de fermentação, a máxima concentraçãode ácido clavulânico obtido foi de 60 mg/L.Na busca de novas cepas fermentadoras deglicerol, Silva e Contiero (2007) isolaram abactéria GLC29 produtora de 10,8 g/L de1,3-propanodiol a partir de 20 g/L de glicerol.Este estudo soma-se às numerosaspesquisas desenvolvidas em outros paísespara a produção deste glicol com importantesaplicações industriais (GONZALEZ-PAJUELO et al., 2006; XIU et al., 2007).Estes e outros estudos demonstraram a potencialidadeda utilização do glicerol, provenienteda produção de biodiesel, comofonte de carbono para a produção de compostosquímicos de interesse comercial.Embora, em etapas iniciais, novas linhas depesquisas estão sendo definidas para obtercompostos de maior valor agregado, queincluam principalmente moléculas bioativas,como proteínas e ribonucleotídeos, paraa indústria alimentícia e farmacêutica.A utilização de biorefinarias para conversãode glicerol bruto apresenta-se como umaestratégia promissora para evitar futuros problemasde acumulação deste subproduto,ao tempo de aumentar a rentabilidade daprodução de biodiesel.Aspectos econômicosO excesso de glicerol proveniente da produçãode biodiesel associado à baixa demandamundial (0,5 bilhões ton/ano) e baixocusto, projetam um desequilíbrio econômiconas indústrias oleoquímicas e de refinode glicerol, ao tempo de pôr em risco asustentabilidade econômica de usinas de biodieselno mundo (HGCA, 2007). No Brasil,a maioria das plantas industriais de biodieselnão valoriza efetivamente o glicerol.A projeção do volume de glicerol nopaís para o ano 2013 é de 488 milhões eas perspectivas, nesse sentido, não são auspiciosas,devido a que poucas apresentamplanos futuros para sua conversão em produtosde maior valor agregado.O uso intensivo deste co-produto é essencialpara a sustentabilidade econômica daindústria de biodiesel no país. A queda bruscado preço do glicerol no cenário internacionalnos últimos 5 anos tem obrigado àparalisação da produção da glicerina sintéticaa partir de propileno. O excesso devolume de glicerol, o alto preço do propilenoe as vantagens de produzir compostosderivados da indústria petroquímica demaior valor, conspiraram para o severodeclínio das indústrias de glicerina sintética(HGCA, 2007). Nos Estados Unidos, ovalor do glicerol diminuiu de 1048 R$/tem 2004 para aproximadamente 125 R$/tno ano 2006 (YAZDANI, GONZALEZ,2007). No Brasil, atualmente o preço FOB(Free on Board) do glicerol bruto varia de200 a 400 R$/t, sendo o valor do glicerolloiro (parcialmente tratado para remoçãode impurezas) de 600 a 800 R$/t. Estimaseque na próxima década, sempre que semantenha a tendência favorável para o biodiesel,o preço do glicerol co-produzidopoderia diminuir ainda mais.Considerando a situação e a projeçãopara os próximos anos, a utilização doglicerol como substrato para fermentaçãopoderia torna-se vantajoso em relação aopreço de outros resíduos tradicionalmenteutilizados como fonte de carbono para aobtenção de bioprodutos. Por exemplo, opreço do melaço de cana de açúcar no mercadointernacional varia entre os 120 e 170R$/t, outro exemplo corresponde ao valordo bagaço de cana que oscila entre9,5 e 24 R$/t. Neste último caso, o bagaçodeve ser submetido a tratamentos físicos,químicos ou enzimáticos para disponibilizara glicose, o que elevaria o preçofinal do substrato. A produção industrialde biomoléculas por fermentação de gliceroleconomizaria custos de processos tradicionaisque requerem etapas de elevadoconsumo energético para extração eacondicionamento do substrato (sacarosede cana de açúcar ou glicose de amido demilho).O grande desafio no Brasil seráincentivar as pesquisas biotecnológicas que,timidamente, vem sendo desenvolvidas nopaís. Alem disso, facilitar a imediata transferênciatecnológica dessas descobertas naprópria usina de biodiesel, permitindo reduzircustos de transporte para convertero biodiesel em um biocombustível de altarentabilidade econômica.CONCLUSÃODesde que alguns governos estipularamnormativas que obriga a adição de biodieselao combustível de petróleo, grandequantidade de glicerol vem sendo gerada,tornando-se necessária a busca de alternativaspara sua utilização. Numerosaspesquisas estão sendo desenvolvidas nessesentido, no entanto, os esforços aindaconstituem uma solução em longo prazopara a acumulação de glicerol. A biotecnologiaapresenta alternativas para a obtençãode produtos de alto valor agregadocomo bio-pesticidas, pigmentos, aromas,polímeros, antibióticos e proteínas recombinantes.No entanto, é preciso estudarcom maior detalhe aspectos de engenhariabioquímica como agitação, aeração,cinética de crescimento e obtenção de produtos,e transferência de massa e energia.Estes parâmetros são considerados essenciaispara entender os mecanismos de utilizaçãode microrganismos assim como paraa otimização de processos, objetivando afutura ampliação de escala. Estratégias maisdetalhadas para a utilização biotecnológicado glicerol são esperadas em poucosanos, de forma a reduzir os impactos ambientaise tornar o biodiesel um produtoaltamente competitivo no mercado mundialde biocombustíveis.AGRADECIMENTOSOs autores agradecem o apoio financeiroda CAPES e o CNPq para o desenvolvimentode projetos de pesquisas.REFERÊNCIAAHN, W.S.; PARK, S.J.; LEE, S.Y.; Appl. 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PesquisaNANOPARTÍCULASUma alternativa para a administração de biofármacosIlustrações cedidas pelas autorasRoberta Márcia Marques dos SantosDoutora em Bioquímica e Imunologiapela Universidade Federal de MinasGerais. Serviço de DesenvolvimentoBiotecnológico, Divisão deDesenvolvimento Farmacotécnico eBiotecnológico, Fundação Ezequiel Dias,Belo Horizonte, MG, Brasil.roberta@funed.mg.gov.br* Sílvia Ligório FialhoDoutora em Ciências Farmacêuticas pelaUniversidade Federal de Minas Gerais.Divisão de DesenvolvimentoFarmacotécnico e Biotecnológico,Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte,MG, Brasil.silvia.fialho@funed.mg.gov.brPalavras-chave: nanopartículas,biofármacos, liberação controlada.1. BIOFÁRMACOSDurante os anos de 1980 o termo “biofármacos”tornou-se sinônimo de proteínasterapêuticas produzidas pela tecnologiade DNA recombinante, incluindotambém os anticorpos monoclonais,obtidos pela tecnologia de hibridoma.Mais tarde, os medicamentos a base deácidos nucléicos usados para a propostade terapia gênica e tecnologia de antisenso,foram adicionados ao grupo(WALSH, 2002). No entanto, os produtosbaseados em proteínas recombinantespodem ser considerados, atualmente,os principais representantes dessegrupo.O desenvolvimento da tecnologia doDNA recombinante, na década de 1970,marcou o início da era da biotecnologiamoderna. Alguns anos depois, em1982, a insulina humana, desenvolvidapela empresa Genentech (EUA) chegouao mercado, marcando de vez a aplicaçãoindustrial dessa tecnologia (BU-CKEL, 1996). Desde então, centenas decentros de pesquisa e empresas no mundointeiro têm se empenhado na pesquisa,no desenvolvimento e na produçãodos biofármacos (DEMAIN, 2004).Nos Estados Unidos, dos novos medicamentosaprovados entre os anos de2003 a 2006, 24% eram biofármacos. Oresultado desses trabalhos é que há maisde 165 produtos aprovados em todo omundo, com um mercado estimado, em2004, em torno de 33 bilhões de dólarese projetado para cerca de 70 bilhõesde dólares para o ano de 2010 (WAL-SH, 2006).Diferentes fatores contribuíram para queas proteínas recombinantes se tornassemsubstâncias de grande interesse dasindústrias farmacêuticas. Primeiramente,destaca-se que a tecnologia de produçãodos biofármacos permitia uma provisãode medicamentos que não poderiamser produzidos pelas tecnologias convencionais,como por exemplo, a eritropoetinae o GCSF (fator estimulador decolônias de granulócitos). Esta tecnologiapossibilitava, também, a produção de umamaior quantidade dos medicamentos queaté então estavam disponíveis apenas emquantidades limitadas, como por exemplo,o hormônio do crescimento. A técnicade desenvolvimento de proteínas recombinantespermitia ainda, a produçãode medicamentos mais seguros, livres devírus patogênicos humanos (BUCKEL,1996). Uma substância que exemplificaessa situação é o hormônio do crescimentohumano (hGH). Diferente da insulina,que era extraída de pâncreas bovino esuíno, o hormônio do crescimento é espécie-específico.Pacientes que sofrem dehipopituitarismo necessitam de tratamentode reposição desse hormônio. De 1960a meados de 1980 o hormônio para essespacientes era obtido da glândula pituitáriade cadáveres. Tal tratamento era consideradosatisfatório até que alguns pacientes,em decorrência de uma infecçãocausada pelo tratamento, apresentaram asíndrome de Creutzfeld-Jacob (CAREY,1987). Outro ponto positivo dessa tecnologiafoi a possibilidade de utilização demais uma rota para encontrar tratamentosnovos, mais seguros e eficazes para asdoenças.Nos 25 anos de existência dos biofármacosno mercado, várias doenças foram econtinuam sendo o foco das atenções tantono desenvolvimento quanto na produçãodos medicamentos, sendo as principaiso câncer, a hepatite, o diabetes, osdistúrbios do crescimento e a hemofilia(WALSH, 2006).Entre as proteínas, os hormônios e as citocinasrepresentam a maior categoria deprodutos (ex. insulinas e gonadotrofinas).As citocinas aprovadas incluem uma variedadede fatores hematopoiéticos recom-52 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

inantes, incluindo eritropoetinas, fatoresestimuladores de colônia e produtosbaseados nos interferons. Proteínasterapêuticas aprovadas relacionadas aosangue incluem uma variedade de fatoresda coagulação sanguínea, trombolíticose anticoagulantes recombinantes.A tabela 1 apresenta uma visão geraldas principais classes das proteínasrecombinantes terapêuticas. Além dessas,há ainda uma variedade de vacinasde subunidades e de produtos baseadosnos anticorpos monoclonais,indicados para o tratamento ou detecçãode vários cânceres e para prevençãode rejeição de transplante de órgão.Os biofármacos podem ser produzidosem um dos vários sistemas de expressãodisponíveis para a produção de proteínasterapêuticas, incluindo bactérias,leveduras, células de insetos e mamíferos.A escolha do melhor sistema envolvevárias questões, sendo que asprincipais são as intrínsecas à estruturada proteína e aquelas relacionadas aocusto da produção.As bactérias como a Escherichia coliapresentam vantagens como uma produçãorápida, com bons rendimentos eeconômica. No entanto, dentre as desvantagens,estão a incapacidade de modificaçõespós-traducionais, como a glicosilação,e a possibilidade de formaçãode corpos de inclusão (JANA ANDDEB, 2005). As leveduras e fungos têma sua utilização para a produção de proteínasterapêuticas para uso humano limitadadevido ao perfil de glicosilaçãodiferente daquele das células humanas.Ainda assim, há alguns produtos nomercado, como o anticoagulante Hirudina(Refludan/Hoechst e Revasc /Canyon Pharmaceuticals) e algunsanálogos de insulina como, por exemplo,a insulina Aspart (Novolog/NovoNordisk), ambos produzidos em Saccharomycescerevisiae (GERNGROSS,2004; WALSH, 2006).As células de mamíferos, apesar deserem sistemas de produção industrialtecnicamente complexos, lentos, debaixa produtividade e de alto custo,continuam a ser os de escolha devidoa sua similaridade com as célulashumanas em relação às modificaçõespós-traducionais e padrões de glicosilação.Cerca de 60 a 70% das proteínasrecombinantes terapêuticas sãoproduzidas em células de mamíferos,principalmente nas células de ováriode hamster chinês (CHO). Avançostêm sido alcançados para aumentar aFigura 1 – Representação esquemática de nanoesferas e nanocápsulasprodutividade desse tipo de cultura.Atualmente, são obtidos rendimentos100 vezes maiores do que a 20 anosatrás, quando da primeira utilizaçãode cultura de células de mamíferospara produção industrial de proteínasrecombinantes (WURM, 2004; BROW-NE AND AL-RUBEAI, 2007).As proteínas terapêuticas, inicialmenteaprovadas para uso na medicinageral, eram simples proteínas de reposição(ex. insulina recombinante efatores sanguíneos). Nos últimos anos,tem-se observado um aumento proporcionaldos biofármacos desenvolvidoscomo proteínas modificadas ouanálogos. O objetivo dessas modificaçõesé alterar as características funcionaiscomercialmente importantespara as proteínas. Alguns autores consideramessas proteínas modificadas comoa segunda geração dos biofármacos, sendode primeira geração, as proteínas recombinantesidênticas às que ocorrem emhumanos (BUCKEL, 1996; WASH, 2004).As modificações controladas de propriedadesbiofísicas específicas de proteínaspodem impactar potencialmente em umavariedade de características terapêuticas.Para modulação das propriedades das proteínas,tais como a eficácia, a estabilidade,a especificidade, a imunogenicidade ea farmacocinética, uma variedade de estratégiastêm surgido, dentre elas, a manipulaçãoda estrutura primária, a incorporaçãode modificações químicas e pós-traducionaise a utilização de “auxiliares” defusão (MARSHALL et al., 2003).A rota mais comum para otimização é amutagênese sítio-específica. O desenvolvimentode um análogo de insulina é umexcelente exemplo da abordagem das proteínasmodificadas. Devido às suas característicasintrínsecas, quando estocadas nasconcentrações da dose terapêutica, as moléculasindividuais de insulina interagemumas com as outras formando oligômeros(principalmente hexâmeros). Após aadministração subcutânea ou intramuscular,a sua ação na circulação sangüínea éretardada pela necessidade de deoligomerizaçãoinicial. Através da mutação sítioespecíficados aminoácidos envolvidos naauto-associação, tornou-se possível alteraressa propriedade. Análogos de insulinamonoméricas com um perfil de tempode ação mais rápido do que a insulinahumana estão no mercado, como porexemplo a Insulina Lispro (Eli Lilly), a InsulinaAspart (NovoRapid/Novo Nordisk)e a Glulisina (Apidra/Sanofi-Aventis). Comoconseqüência prática, essa insulina modificadapode ser administrada minutos antesdas refeições, trazendo mais flexibilidadenos horários de alimentação dos pacientes(FROKJAER AND OTZEN, 2005;COELHO, 1997; VAJO AND DUCKWOR-TH, 2000; WANNMACHER, 2005).Outra forma de insulina modificada é ainsulina glargina (Lantus ® e Opsulin ® ) aprovadacomo um análogo que apresenta umaumento significativo na duração da atividade.A mudança feita na seqüência deaminoácidos aumentou o ponto isoelétricoda molécula de 5,4 para aproximadamente7,0. Dessa forma, quando a insulinaé formulada, no pH ácido, ela se encontrasolúvel e, após a administração, nopH fisiológico, ocorre a formação de microprecipitadosde insulina no local dainjeção e as moléculas individuais de insulinaentram na circulação sangüíneamuito lentamente, com duração de 24 ho-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 53

Tabela 1 – Classes de biofármacos e seus principais representantesBaseada em WALSH, 2003 e 2006ras, permitindo uma única injeçãoao dia (WALSH, 2003; VAJO ANDDUCKWORTH, 2000).Alterações nas moléculas tambémpermitem melhorar a sua estabilidade.A utilização de métodos de otimizaçãoracional permite que as proteínaspossam ser modificadas de formaque a sua estrutura e a sua atividadesejam mais robustas quando expostasà protease, ao estresse oxidativo e àsmudanças na temperatura, no pH e nascondições da solução. Mutações dosaminoácidos cisteína por serina foramintroduzidas com sucesso em várias54 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

proteínas terapêuticas como, por exemplo,com o interferon beta 1b (MARK etal., 1984; MARSHALL et al., 2003).Uma ferramenta que tem sido utilizadapara alterar a farmacocinética de algunsbiofármacos é a peguilação, um processoem que cadeias de polietilenoglicolsão ligadas aos peptídeos e proteínas.Em geral, a peguilação reduz avelocidade de clearance plasmático porreduzir a degradação metabólica e acaptação mediada pelo receptor da proteínada circulação sistêmica. Esta técnicatambém melhora o perfil de segurançadas proteínas por conferir umaproteção antigênica e imunogênica aosseus epitopos. Vários biofármacos estãono mercado na forma peguiladacomo o interferon alfa (PEGasys ® ePEG-Intron ® ), o hormônio do crescimento(Somavert ® ) e a asparaginase (Oncaspar® ) (MARSHALL et al., 2003;FROKJAER AND OTZEN, 2005; HARRISAND CHESS, 2003).2. DIFICULDADES NAADMINISTRAÇÃODE BIOFÁRMACOSAs proteínas e peptídeos têm proporcionadoum crescente interesse devidoao seu papel na fisiopatologia e ao seuprogresso nas áreas de biotecnologia ebioquímica. O uso dessas moléculas emmedicina, no entanto, tem sido limitadodevido a sua baixa biodisponibilidade,a qual resulta da sua baixa estabilidadefrente às enzimas proteolíticase à degradação hidrolítica, da baixa permeabilidade,e da curta meia-vida nacirculação sistêmica (REIS et al., 2006).Desde 1987, Carey já enfatizava queuma das principais limitações na utilizaçãodas proteínas recombinantes naclínica era a questão da impossibilidadede administração por via oral. Vinteanos depois, esse continua a ser, semdúvida, um ponto a ser totalmente solucionado.A via oral é a rota de administração demedicamentos preferida e mais amplamenteutilizada. No entanto, ela geralmentenão está disponível para a liberaçãode macromoléculas tais como proteínas.A instabilidade inerente das proteínasao trato gastrintestinal, assimcomo a baixa permeabilidade atravésdas membranas biológicas devido à altamassa molecular e à superfície polar características,implicam no tratamentopela via parenteral (FROKJAER ANDOTZEN, 2005; JORGENSEN et al., 2006).No entanto, essa via apresenta algunsinconvenientes ao paciente, especialmentenos casos crônicos, o que diminuia adesão ao tratamento, comprometendo,assim, o resultado esperado.Muitos esforços de pesquisa estão sendofeitos para melhorar a adesão dopaciente, seja através do emprego devias alternativas de administração oupor redução da freqüência de injeções.A maioria dos medicamentos a base deproteínas é formulada como suspensõesou soluções aquosas prontas para o usoou como pó liofilizado para reconstituiçãodo produto. A formulação de proteínasdepende do conhecimento dassuas características físico-quimicas e biológicas,incluindo estabilidade químicae física, imunogenicidade e propriedadesfarmacocinéticas. A atividade terapêuticade proteínas é altamente dependenteda sua estrutura conformacional.No entanto, a estrutura da proteínaé flexível e sensível a condições externas,o que significa que a sua produção,formulação e manipulação necessitemde atenção especial na otimizaçãoda eficácia e da segurança, incluindoa minimização da resposta imune(FROKJAER AND OTZEN, 2005).De uma perspectiva de formulação, asproteínas são moléculas complexas edesafiadoras para o desenvolvimento desistemas de liberação de fármacos. Osucesso de uma formulação dependeda capacidade da proteína em mantersua estrutura nativa e atividade durantea preparação e a liberação no organismo,assim como durante o período deestocagem. Algumas proteínas precisamde liberação sustentada, enquanto outrasrequerem uma liberação controlada,imediata ou pulsada. A liberaçãopode ser alcançada utilizando diferentessistemas particulados de liberaçãode fármacos, tais como as micro e nanopartículaspoliméricas, os hidrogéis,os lipossomas e as emulsões (JORGEN-SEN et al., 2006 ).A demanda por melhores formas paraa administração de proteínas tem resultadona pesquisa pelo desenvolvimentode tecnologias farmacêuticas,e empresasfocadas nos métodos de liberaçãode fármacos têm crescido a cadaano. A maioria das proteínas que estãono mercado podem ser consideradascomo candidatas para os novos métodosde liberação, uma vez que são facilmenteliberadas pelas vias tradicionaiscomo na forma de injeções subcutâneas(SC), intramusculares (IM) ouintravenosas (IV) e têm a sua farmacologiabem caracterizada. Devem ser consideradosfatores como a competiçãode mercado, a conveniência, a adesãodo paciente, a necessidade de liberaçãotópica ou local, a toxicidade sistêmica eas questões de segurança. Alguns métodosestão sendo desenvolvidos e estãodirecionados para a competição de mercadopara os biofármacos aprovados,como a insulina, o hormônio do crescimentohumano, os interferons e a eritropoietina.Esses sistemas objetivam umamelhoria na adesão do paciente ao tratamento.Em muitos casos, a administraçãotópica de proteínas constitui uma viapreferencial à sistêmica, pois esta últimanão promove níveis significativos no localda doença. Em determinadas situaçõessão necessários elevados níveis sistêmicospara alcançar efeito local nos tecidosalvo, o que muitas vezes causa efeitostóxicos indesejáveis. Devem ser aindaconsideradas questões como o impactodos processos de produção do sistemade liberação na integridade da proteína,e também a integridade da proteínaapós sua liberação no local de administração.A administração de proteínas degradadaspode representar além dos efeitoscolaterais, a perda da potência. Paraa administração sistêmica de proteínas, aquantidade liberada na circulação é dependenteda eficiência do sistema de liberaçãoe da biologia intrínseca da viade administração (CLELAND et al., 2001).Quando são consideradas as novas opçõespara administração de proteínas, avia mais comumente abordada é a parenteral,devido ao maior número de estudosem animais e aos testes clínicos quegarantem uma maior segurança e eficácia.Os pulmões têm sido extensivamenteestudados como uma via de administraçãode proteínas pela a sua grande áreade superfície e por permitir uma rápidaabsorção devido ao contato próximo entreos alvéolos e a circulação (GONDA,2000; CLELAND et al., 2001). A insulinaé, sem dúvida, o protótipo biofarmacêutico,tendo sido o Exubera ® (Pfizer) a primeiraformulação inalatória aprovadapelo FDA (Food and Drug Administration),e que permite administrar uma formade insulina em pó seco. Cerca de 40%da proteína chega ao pulmão profundoe 10% é biodisponível. O início de açãoda insulina inalada é mais rápido do quea injetável de ação rápida, o que permitea sua utilização pré-prandial (MCMAHONAND ARKY, 2007). Estudos clínicos demonstraramuma equivalência significativacomparativamente a várias formas deinsulina convencional. A insulina inaladaapresentou-se efetiva, bem tolerada emelhor aceita em pacientes com diabetestipo 1 e tipo 2 (HOLLANDER et al., 2004;WANNMACHER, 2005).Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 55

O aumento do uso das proteínas terapêuticasna indústria farmacêutica temsalientado questões como a sua estabilidadedurante o período de estocageme a liberação eficaz de forma a evitar aocorrência de efeitos adversos. Modificaçõesquímicas controladas tais comosubstituições, acilação e peguilação têmcumprido algumas, mas não todas assuas promessas, enquanto sistemas poliméricosde liberação prolongada podemdesempenhar um papel importante(FROKJAER AND OTZEN, 2005).Devido a suas propriedades de liberaçãosustentada e prolongada, ao pequenotamanho e a biocompatibilidadecom tecidos e células, as nanopartículaspodem ser sistemas promissores paraa administração de proteínas e peptídeos(RIEUX et al., 2006.).3. NANOPARTÍCULASA aplicação de materiais poliméricoscom finalidades terapêuticas está crescendomuito rápido e tem sido evidenciadaem diversos campos como engenhariade tecidos, implante de dispositivosmédicos e órgãos artificiais, próteses,oftalmologia, odontologia, reparoósseo e outros (NAIR AND LAURENCIN,2007).Os sistemas poliméricos estão sendoamplamente estudados e utilizados, enão só permitem uma liberação lenta egradual do fármaco, como tambémpodem possibilitar o direcionamento aalvos específicos do organismo, comosítios de inflamação ou tumor.Embora o conceito de sistemas de liberaçãode fármacos não seja novo, umgrande progresso tem ocorrido no tratamentode uma variedade de doenças.O transporte de fármacos para o localde ação é considerado o aspecto maisimportante, e para que este consiga liberaruma dose eficaz do fármaco nolocal de ação são necessários veículosadequados. As nanopartículas apresentamaplicações potenciais na administraçãode substâncias terapêuticas como objetivo de aumentar a eficiência dotransporte de fármacos e melhorar osperfis de liberação (KUMAR, 2000).A nanotecnologia pode ser definidacomo um campo científico multidisciplinarbaseado no desenvolvimento, nacaracterização, na produção e na aplicaçãode estruturas, dispositivos e sistemascom forma e tamanho na escalananométrica. Atualmente há um investimentoglobal na nanotecnologia emtorno de U$ 7 bilhões e estima-se para2011-2015 um investimento de cerca deU$ 1,5 trilhão (STYLIOS et al., 2005).56 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37Na nanomedicina, ou seja, no desenvolvimentode tratamentos efetivos baseadosna nanotecnologia, ocorre a interseçãode diferentes áreas, entre elasa biologia, a química, a física, as engenhariasquímica e mecânica, a ciênciade materiais e a medicina clínica(FAROKHZAD AND LANGER, 2006).Os primeiros esforços na nanomedicinaforam focados no aumento daspropriedades das modalidades terapêuticase de diagnóstico já disponíveis.Recentemente, houve uma alocaçãode $144 milhões pelo InstitutoNacional do Câncer e $54 milhões peloInstituto Nacional do Coração, Pulmãoe Sangue nos Estados Unidos para apesquisa em nanotecnologia nos anosde 2004 e 2005, respectivamente. Essesinvestimentos, juntamente como ogrande aumento do número de patentesna área nos últimos cinco anos,ampliou significativamente o interessedos pesquisadores pela nanomedicina(FAROKHZAD AND LANGER,2006).A nanomedicina ainda se encontra nosestágios iniciais e este assunto aindaprecisa ser amadurecido. O que se esperaé uma entrada contínua de novasplataformas de nanotecnologia queapresentarão um grande impacto positivoem diferentes níveis, incluindo:a detecção de alterações molecularescausadoras de doenças, diagnóstico eimagem de doenças, transporte de fármacos,sistemas multifuncionais paraaplicações terapêuticas e de diagnóstico,veículos que aumentem a eficáciain vivo de agentes terapêuticos etecnologias nanométricas que acelerema pesquisa científica (FAROKHZADAND LANGER, 2006).No campo da nanotecnologia os sistemasde liberação controlada de fármacosse destacam e têm apresentadoum crescente avanço (EMERICHAND THANOS, 2006). Entre eles, as nanopartículasforam inicialmente desenvolvidasem meados dos anos 70 como objetivo de transportar substânciasnos organismos, tecidos ou até mesmocélulas, para melhorar a eficáciaterapêutica e diminuir o efeito tóxicodas substâncias nelas carreadas (MON-TASSER et al., 2000; FATTAL et al., 2002).Elas foram inicialmente desenvolvidascomo sistemas de transporte para vacinase fármacos antineoplásicos. Visandoaumentar a captação pelo tumor,a estratégia de transporte do fármacopara o local específico foi empregadae o primeiro passo importanteda pesquisa objetivou o desenvolvimentode métodos para redução dacaptação das nanopartículas pelas célulasdo sistema reticular endotelial. Simultaneamente,a utilização das nanopartículaspara diferentes vias de administraçãotambém foi estudada (KUMAR, 2000).Nas últimas quatro décadas, a tecnologiapolimérica de liberação controlada apresentouum impacto nas diferentes áreasda medicina, sendo elas, principalmente,a oftalmologia, a pneumologia, a relacionadaà dor, a endocrinologia, a cardiologia,a ortopedia, a imunologia e a neurologia,com diferentes produtos já presentesna prática clínica (FAROKHZADAND LANGER, 2006). O mercado anualno mundo de sistemas poliméricos deliberação controlada, incluindo os sistemasde liberação de fármacos, é estimadoem 60 bilhões de dólares e estes sistemasestão sendo utilizados por mais de100 milhões de pessoas a cada ano.As nanopartículas são sistemas coloidaispoliméricos com tamanho entre 10 e 1000nm (RIEUX et al., 2006), nos quais o fármacopode se encontrar dissolvido, recoberto,encapsulado ou disperso. Elassão classificadas em duas categorias, asnanoesferas e as nanocápsulas, as quaisdiferem entre si segundo a composiçãoe a organização estrutural. As nanocápsulassão sistemas vesiculares em que ofármaco encontra-se no interior de umacavidade aquosa ou oleosa circundadapor uma membrana polimérica, ou podendotambém ser encontrado adsorvidona membrana polimérica. As nanoesferassão formadas por uma matriz polimérica,onde o fármaco encontra-se dispersoou adsorvido (Figura 1) (ABDE-LWAHED et al., 2006). Estes sistemas podempromover um aumento da solubilidadedo fármaco neles incorporado, protegeras substâncias de degradação e modificarsua distribuição (LACOEUILLE etal., 2007; RIEUX et al., 2006; SCHAFFAZI-CK et al., 2003).Diferentes aplicações terapêuticas dasnanopartículas têm sido estudadas, principalmentepara administração pelas viasparenteral e oral. Por meio da administraçãoparenteral, objetiva-se uma distribuiçãomais seletiva do fármaco, aumentando,assim, seu índice terapêutico. Comrelação à administração oral, as pesquisastêm sido direcionadas principalmenteà diminuição dos efeitos adversos e àproteção de fármacos passíveis de degradaçãono trato gastrointestinal, taiscomo peptídeos e proteínas, aumentandoa biodisponibilidade dos mesmos(KUMAR, 2000; RIEUX et al., 2006; REISet al., 2007).As vantagens da utilização de nanopartículasincluem a liberação controlada e/ou prolongada da substância nelas en-

capsuladas, a redução de efeitos adversosassociados à substância, a proteçãode compostos da inativação antes de atingiremo local de ação, o aumento da penetraçãointracelular e o aumento da atividadefarmacológica (TEIXEIRA et al.,2005).Diferentes métodos são encontrados parao preparo de nanopartículas, os quais permitema modulação da sua estrutura, dasua composição e das suas propriedadesfisiológicas (RIEUX et al., 2006). A escolhado método de preparo depende dopolímero e da solubilidade do fármaco aser encapsulado. Estes métodos podemser classificados em duas categorias principais,sendo elas a polimerização de monômerose a utilização de polímeros préformados(REIS et al., 2006). Com exceçãodos alquilcianoacrilatos e do malonatode poli-dialquilmetilideno, grandeparte dos monômeros adequados para oprocesso de polimerização micelar promovemuma formação de polímeros nãobiodegradáveis ou que se degradam muitolentamente. Além disso, as moléculas residuaisno meio de polimerização podemser mais ou menos tóxicas, o que requera purificação do material. Para contornaras limitações dos métodos de polimerizaçãode monômeros, têm sido empregadosos métodos de preparo utilizandopolímeros pré-formados.Entre os métodos que utilizam polímerospré-formados, a técnica de dispersão depolímeros pré-formados tem sido a maisempregada. Nela, o polímero é dispersoem um solvente orgânico imiscível comágua como o diclorometano, o clorofórmioe o acetato de etila. A dispersão formadaé emulsificada com uma fase aquosacontendo um emulsionante e a faseorgânica é então evaporada. Após evaporaçãocompleta do solvente orgânicoas nanopartículas são separadas por meiode centrifugação (RIEUX et al., 2006) epodem ser armazenadas como suspensãoou serem liofilizadas.4. POLÍMEROSPara que um polímero seja caracterizadocomo biomaterial ele não deve ser causadorde resposta inflamatória ou reaçõestóxicas no local de aplicação, deve apresentaruma meia-vida adequada, o seutempo de degradação deve ser compatívelcomo o processo de cicatrização ouregeneração, deve apresentar propriedadesmecânicas adequadas à aplicação desejada,seus produtos de degradação nãodevem ser tóxicos, devem ser capazes deserem metabolizados e eliminados do organismo,e devem apresentar permeabilidadeapropriada à aplicação desejada.Os sistemas de liberação de peptídeose proteínas são preparados, geralmente,a partir de polímeros biodegradáveis.No entanto, o desenvolvimentode sistemas biodegradáveis requer ocontrole de um maior número de variáveisjá que a cinética de degradaçãodo polímero, in vivo, deve permanecerconstante para que seja obtidauma liberação controlada da substância.Portanto, fatores como o pH ea temperatura, que podem promoverum aumento ou uma redução na velocidadede degradação do sistema,devem ser avaliados durante o desenvolvimento(DASH AND CUDWORTHII, 1998).Tanto os polímeros sintéticos quantoos naturais têm sido amplamente estudadoscomo biomateriais. O processode biodegradação envolve a clivagemhidrolítica ou enzimática das ligaçõeslevando a erosão do materialpolimérico (NAIR AND LAURENCIN,2007).Os polímeros naturais podem ser consideradoscomo os primeiros biomateriaisutilizados clinicamente. No entanto,apesar de apresentarem algumasvantagens, eles podem promover umaatividade antigênica, a qual está associadaao seu processo de purificação,e também podem transmitir doenças.Como exemplos de polímeros naturais,destacam-se aqueles à base de proteínascomo as albuminas bovina e humana,o colágeno e a gelatina.Os polímeros sintéticos, geralmente,são biologicamente inertes, apresentampropriedades mais previsíveis,maior uniformidade lote a lote, alémde outros fatores. Eles são representadospelas poliamidas, pelos poliaminoácidos,pelos polialquilcianacrilatos,pelos poliésteres, pelos poli (ortoésteres),pelos poliuretanos e pelas poliacrilamidas.A natureza dos polímeros empregadosem sistemas de liberação de fármacosinfluencia significativamente no tamanhoe no perfil de liberação do sistema.Os polímeros biodegradáveis sintéticostêm apresentado crescente interessena aplicação como sistemas deliberação, já que os naturais apresentam,geralmente, uma rápida liberaçãodo fármaco. Os principais critérios naseleção de um polímero são, principalmente,a biodisponibilidade, a biocompatibilidadee a sua velocidade dedegradação (RIEUX et al., 2006).O perfil e o mecanismo de liberaçãodo fármaco dependem da natureza dopolímero e também das propriedadesfísico-químicas da substância nele incorporada.Alguns polímeros são menossensíveis às condições empregadas nosprocessos de preparação, o que pode serdevido à sua composição química, à suamassa molar e à sua cristalinidade (RIEUXet al., 2006).Os polímeros biodegradáveis mais utilizadosatualmente são os poliésteres, taiscomo a poli(ε-caprolactona), o poli(D,Llático)(PLA) e os copolímeros derivadosdos ácidos lático e glicólico (PLGA) (DASHAND CUDWORTH II, 1998). São polímerostermoplásticos e constituem a classemais antiga e a mais estudada dos polímerosbiodegradáveis (NAIR AND LAU-RENCIN, 2007). Eles podem ser preparadosa partir de uma variedade de monômerospela abertura do anel e por vias depolimerização dependendo da unidademonomérica. Os derivados dos ácidos láticoe glicólico foram empregados comomaterial de fios de sutura na década de1960 e, desde então, outros poli-ésteresalifáticos foram desenvolvidos como polímerosbiodegradáveis e têm despertadobastante atenção devido a biocompatibilidadee aos perfis de degradação controláveisque apresentam.5. ESTUDOS E PATENTES DAAPLICAÇÃO DE NANOPARTÍCULASPARA A ADMINISTRAÇÃO DEBIOFÁRMACOSAlguns estudos têm demonstrado que asnanopartículas podem prolongar a liberaçãoe também aumentar a biodisponibilidadede peptídeos e proteínas.Sánchez e colaboradores (2003) desenvolverammicro e nanopartículas para administraçãoparenteral de interferon. Nesteestudo, foi realizada uma comparaçãoda taxa de encapsulamento e da liberaçãodo peptídeo a partir de micro e nanopartículaspreparadas por diferentestécnicas de encapsulamento, utilizando ocopolímero dos ácidos lático e glicólico(PLGA) como matriz e contendo poloxamercomo agente estabilizante. Os resultadosmostraram que o interferon podeser eficientemente encapsulado em microe nanopartículas. Os sistemas exibiramum perfil de liberação similar e a integridadee a bioatividade da substânciaforam mantidas. A atividade antiproliferativado interferon variou dependendoda formulação desenvolvida.Nanopartículas de polietilenoglicol e ácidopoli-lático contendo um peptídeo neuroprotetor(peptídeo intestinal vasoativo)para administração intranasal tambémforam estudadas (GAO et al., 2007). A biodistribuição,a liberação no cérebro e oefeito neuroprotetor da formulação foramavaliados. Os resultados mostraram queBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 57

a formulação de nanopartículas promoveuuma maior concentração do peptídeono cérebro de camundongos quandocomparado à formulação na formade solução. De acordo com os pesquisadores,as nanopartículas desenvolvidaspodem ser carreadores promissorespara peptídeos e proteínas.Reis e colaboradores (2007) avaliaramnanoesferas de alginato-dextrano contendoinsulina. As nanoesferas foramcaracterizadas quanto ao tamanho e suadistribuição e quanto à forma. A eficiênciade encapsulamento e a liberaçãoin vitro da insulina também foram determinadas.A bioatividade da proteínafoi avaliada in vitro e em ratos diabéticos.Os resultados mostraram que as nanoesferasdesenvolvidas, de 267 nm a2760 nm, apresentaram uma eficiênciade encapsulamento de 82,5 %. As nanopartículasimpediram a liberação dainsulina no meio ácido e permitiramuma liberação sustentada do peptídeoem meio neutro. A insulina encapsuladafoi bioativa, como demonstrado pelosestudos in vitro e in vivo.Algumas patentes também descrevem autilização de nanopartículas para administraçãode peptídeos e proteínas:- patente US 5,500,224 intitulada “Composiçõesfarmacêuticas de nanocápsulas”descreve uma composição farmacêuticana forma de suspensão coloidalde nanocápsulas preparadas com opolímero polialquilcianoacrilato (VRAN-CKX et al., 1996). Esta formulação éadequada para a administração oral depolipeptídeos e polissacarídeos.- patente US 5,641,745 intitulada “Liberaçãocontrolada de micro e nanoesferasbiodegradáveis contendo ciclosporina”descreve uma formulação farmacêuticade liberação controlada contendociclosporina encapsulada em microesferasou nanoesferas biodegradáveis(RAMTOOLA, 1997). A formulação apresentapropriedades de liberação lentada ciclosporina e é adequada para otransporte do peptídeo para o intestinoquando administrada pela via oral.- patente US 20060033224 intitulada “Microesferas/nanoesferaspoliméricas eencapsulamento de proteínas” descreveum processo de formulação de microesferase nanoesferas e o encapsulamentode proteínas com atividade terapêuticae outras substâncias (CASTOR,2006). Os sistemas formados foram capazesde encapsular as proteínas e promoveruma liberação controlada destassubstâncias.- patente US 7,291,598, intitulada “Nanopartículaspara o transporte de proteínas”,descreve nanopartículas compostasde quitosano, ácido poli-glutâmicoe pelo menos uma substância ativa eque apresentam uma superfície carregadapositivamente (SUNG et al 2007).As nanopartículas desenvolvidas sãocapazes de aumentar a permeabilidadeda proteína encapsulada por meio dotransporte pela via paracelular.- patente US 20070009605 intitulada “Encapsulamentode peptídeos hidrossolúveis”descreve um processo de preparode microesferas ou nanoesferas biodegradáveispor meio da técnica de emulsificaçãoóleo em água (IGNATIOUS,2007). Estas formulações são adequadaspara a liberação controlada de peptídeosbioativos.6. CONSIDERAÇÕES FINAISOs gastos com pesquisa e desenvolvimentona área biofarmacêutica estão emtorno de 19 a 20 bilhões de dólares nosúltimos três ou quatro anos. Estima-seque aproximadamente 2.500 fármacosde base biotecnológica estejam em fasede descoberta, 900 em triagem pré-clinicae 1.600 em testes clínicos (WALSH,2006). Do ponto de vista técnico, avançosna engenharia de proteínas e nossistemas de liberação irão garantir aaprovação de um número ainda maiorde produtos modificados e de liberaçãocontrolada.A eficiência e a segurança da administraçãode proteínas terapêuticas são achave do sucesso comercial e, em algunscasos, a demonstração da eficácianos atuais e futuros produtos biotecnológicos.Várias empresas têm se dedicadoà busca por diferentes e maiseficientes métodos de liberação de proteínas.Para avaliar criticamente as opções,cada método deve ser consideradoem termos de quão fácil ele podeser para a produção, para o impacto naqualidade da proteína, para a biodisponibilidadee para a toxicidade. Emgeral, os sistemas de liberação de proteínasevoluíram muito nos últimosanos, mas, um grande esforço em pesquisae desenvolvimento ainda é necessáriopara tornar a maioria desses sistemasviáveis para a comercialização. Ossistemas nanoparticulados são umaoportunidade para melhorar a adesãodo paciente ao tratamento e sua qualidadede vida por meio da redução donúmero de injeções.7. REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICASAbdelwahed W, Degobert G, Fessi H. Apilot study of freeze drying ofpoly(epsilon-caprolactone) nanocapsulesstabilized by poly(vinyl alcohol): formulationand process aotimization. InternationalJournal of Pharmaceutics, v. 309,p. 178-188, 2006.Browne SM, Al-Rubeai M. Selection methodsfor high-producing mammalian celllines. Trends in Biotechnology, v. 25, p.425-32, 2007.Buckel, P. Recombinant proteins for therapy.Trends in Pharmacological Sciences,v. 17, p. 450-6, 1996.Carey NH. Production and use of therapeuticagents. 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PesquisaPATENTES DE COMPOSTOSOSQUÍMICO-F-FARMACÊUTICOSIlustrações cedidas pelas autorasA proteção de compostos químicos-farmacêuticos com fórmulas MarkushQueli Cruz BastosAluna de Doutorado do curso de Pós-Graduação em Tecnologia de ProcessosQuímicos e Bioquímicos da UniversidadeFederal do Rio de Janeiro e Pesquisadoraem Propriedade Industrial do InstitutoNacional de Propriedade Industrial/INPIqueli@inpi.gov.brA matéria abordada neste artigo é parteintegrante da tese de doutorado da autora.Portanto, as argumentações e questionamentosexpressos não refletem, necessariamente,o entendimento institucional doINPI sobre a questão.Adriana Campos Moreira BrittoD.Sc., Especialista em Patentes da Coordenaçãode Gestão Tecnológica da FundaçãoOswaldo Cruz/GESTECadriana@fiocruz.brAdelaide Maria de Souza AntunesD.Sc., Professora Titular do Departamentode Processos Orgânicos da Escola deQuímica da Universidade Federal do Rio deJaneiroadelaide@eq.ufrj.brINTRODUÇÃOA proteção de um composto químicofarmacêutico por patentes édada por meio de reivindicações,e pode ser caracterizada por suaestrutura química (fórmula geral);por sua nomenclatura oficial daIUPAC; por suas propriedades físicas;ou por suas propriedades físico-químicas.Quando um compostoquímico é caracterizado por suafórmula estrutural, surgem as chamadas“fórmulas Markush”. As “fórmulasMarkush” são estruturas químicasque apresentam diferentesradicais substituintes pertencentesa diferentes grupos químicos. Assim,o termo “fórmula Markush”tem sido empregado para designarqualquer estrutura química quecontenha uma subestrutura requeridae um (ou mais) grupo(s) químicosvariáveis ou opcionais (Simmons,2003).A Figura 1 apresenta um exemplotípico de uma estrutura “Markush”que, de acordo com Milne(1991), pode representar cerca de1 967 324 000 estruturas distintas.Onde: A= NH ou CH;B = O, S, NR ou C=X;X = O ou S;n = 0 ou 1, onde n = 0 quando A= N;R = selecionado de H, halo, alquil,haloalquil,, nitro, amino, alquilamino,OH arilalcóxi e alcóxi.R 1, R 2, R 3= H, alquil, aralquil ou fenil(substituído por um ou mais substituintes)R 3e R 4formam uma ligação duplae R 5= H ou alquil quando A = NR 4e R 5formam uma ligação duplae R 3forma uma dupla ligação comA quando A = C com a condição deque ao menos um dos R 1e R 2é Hou alquilEste tipo de estrutura permite aeleição de um grande número desubstituintes, os quais podem se ligarà molécula em posições diversas,assim como através de diferentesarranjos dos mesmos. Como conseqüência,uma multiplicidade decompostos pode ser protegida apartir de uma única estrutura de representação.Contudo, embora estescompostos sejam estatisticamentepossíveis, nem todos poderão,necessariamente, ser concretizados.O termo “Markush” surgiu em 1923,quando o Dr. Eugene A. Markushdepositou um pedido de patentenos Estados Unidos, o qual estavaassociado a um método de prepararcorantes de pirazolina. Porém, otipo de reivindicação, depositadopor Eugene Markush, foi consideradoinespecífico pelo examinadorde patente norte-americano. Todavia,depois de apelar à Comissão dePatentes nos Estados Unidos, a patentefoi concedida em 1924 comoUS 1,506,316.60 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

FIGURA 1. Estrutura “Markush”Markush não foi o primeiro inventora tentar abranger mais de umcomposto em um único pedido depatente. Quando comparada a reivindicaçõesanteriores, suareivindicação foi relativamentesimples, possuindouma linguagem genérica euma listagem curta decompostos específicos.Mas, os examinadores insistiamque uma reivindicaçãonão poderia abrangercompostos alternativos.Entretanto, após a decisãona Comissão de Patentesnos Estados Unidos, as reivindicações“Markush” foramcitadas por outros pedidosde patentes, e o nome “grupoMarkush” foi vinculado a reivindicaçõescontendo fragmentos químicos“selecionados de grupos consistindode” uma lista de alternativas.Com o passar do tempo, o formatoconhecido como uma reivindicação“Markush” tornou-se padrão,significando uma estrutura químicacom substituintes variáveis (Simmons,1991).Uma das maiores preocupações -não somente por parte da indústriafarmacêutica, como também das universidadese Instituições de pesquisaque realizam pesquisas nessa áreae investem no desenvolvimento denovos compostos farmacêuticos - éjustamente a proteção por patentesem virtude dos grandes gastos emP&D, pois o processo de invençãoe desenvolvimento de um novo medicamentoé longo e complexo, sendoque de 5 mil a 10 mil moléculasanalisadas, apenas uma se transformaem um medicamento aprovado.Um medicamento pode levarmais de 15 anos para ser produzido(Sá, 2007).No entanto, surgem dúvidas com relaçãoao escopo de proteção dessespedidos de patentes com “fórmulasMarkush”. E, neste sentido, é prudentelembrar que as reivindicaçõessão as especificidades da invençãopara as quais a proteção é requerida,ou melhor, os aspectos particularesque os inventores consideramcomo novidade em relação ao estadoda técnica existente até aquelemomento. Desta maneira, elas delimitame estabelecem os direitosdo titular da patente sobre a matériaobjeto de proteção. Enfim, as reivindicaçõessão, de fato, a invenção(Muller et al, 2001). Portanto,a preocupação em estabelecer critériose limites de forma a satisfazertanto o detentor da patentequanto ao usuário é objeto de grandediscussão, tendo em vista o forteimpacto dessas patentes de medicamentosna saúde pública. Os críticosdas patentes amplas frisam queas mesmas tendem a desencorajara inovação subseqüente por outrospesquisadores na área geral da patente.Em contraste, os defensoresde pedidos limitados destacam queestes incentivam outros a “contornar”a patente, proporcionandomenos restrições à pesquisa afimconduzida por outrem. Estes tambémressaltam que tais pedidos tendema estabelecer direitos menoscontestáveis, ou seja, menos vulneráveisa ações judiciais.Uma vez que, o Acordo TRIPS(Acordo sobre Aspectos dos Direitosde Propriedade Intelectual) permiteque os países membros doWTO (World Trade Organization)adotem suas próprias definições depadrões de patenteabilidade, ouseja, as invenções devem apresentarnovidade, atividade inventiva eaplicação industrial, mas em nenhummomento determina qualquer especificaçãocom relação ao critérioutilizado para definir a patenteabilidade,esta flexibilidade permite quediferentes critérios sejam adotadosem cada país. Dessa forma, umaampla reivindicação, como a deuma estrutura “Markush” pode seranalisada de diferentes maneiras, deacordo com os critérios adotadosem cada país membroda WTO.Portanto, dado os efeitossubstanciais que uma patentepode ter na competiçãoe, então, sobre preçosde medicamentos, os critériosque são aplicados parao exame e concessão dapatente farmacêutica sãoextremamente relevantespara a política da saúde pública.Para tal, o presente trabalhotem por objetivomostrar características das reivindicaçõesde compostos químico-farmacêuticoscom “fórmulas Markush”,os problemas associados aelas e as soluções propostas.PROBLEMAS ASSOCIADOS AREIVINDICAÇÕES MARKUSHOs problemas relacionados às reivindicações“Markush” são decorrentesdo fato destas serem caracterizadaspor definições genéricas, ouseja, um composto químico é definidopor uma fórmula estrutural quepode dar origem a milhões de compostos.Um dos primeiros problemas relacionadosàs reivindicações “Markush”amplas é a busca por anterioridadespara se estabelecer o critériode novidade; pois, em virtudedos milhões de compostos que podemser pesquisados, esta se tornadesestimulante. Esse fato ocorre devidoaos programas utilizados parabusca de compostos “Markush” seremlaboriosos e, conseqüentemente,consumirem considerável tempopara a preparação do banco dedados, o que torna a ocorrência deerros freqüente durante o processamento.Além disso, pesquisasmuito abrangentes podem levar aum grande número de falsos resultados,tornando o banco de dadosmuito caro e ineficaz (Ustinova &Chelisheva, 1996).Outro fator problemático é a avali-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 61

ação da suficiência descritiva, poisem reivindicações “Markush” muitoamplas, parte da reivindicação nãoé suportada no relatório descritivopelo modo de executar a invenção.A insuficiência de exemplos experimentaiscom relação ao processode preparação desses compostos,ou dados experimentais que comprovemsuas atividades biológicas,é uma característica desse tipo depatente. Sendo assim, é um fatorproblemático, uma vez que é inviávelfornecer esses dados experimentaispara “Markushs” que originammilhões de compostos, ou seja, osexemplos não cobrem todas as classesde compostos descritas na reivindicação.O manual de procedimentode exame de patentes do escritóriojaponês é bem enfático comrelação à falta de suficiência descritiva,e descreve que as reivindicações“Markush” violam a Lei de Patentesdo Japão quando o relatóriodescritivo da patente não possui suficiênciadescritiva. Tal manual descreveo seguinte exemplo:“Exemplo1: Quando uma reivindicaçãodescreve um processo de preparaçãode para-nitro benzeno substituídopor nitração, onde o gruposubstituinte do benzeno (X) é CH3,OH ou COOH. No relatório descritivoo material inicial usado é tolueno,onde X é CH3. Em nenhum momentoencontra-se descrito no relatóriodescritivo exemplos onde omaterial é ácido benzóico (paraX=COOH). Portanto, tendo em vistaa grande diferença entre CH3 eCOOH, os exemplos não cobremtodas as classes de compostos descritasna reivindicação.” (ExaminationGuideline for Patent and UtilityModel in Japan, Part. I, Cap. 1, p.24, 2001).FIGURA 2: “Fórmula Markush”, onde R = H ou alquila C 1-4; R1 = OH ou alcóxi C 1-4Devido à falta de suficiência descritiva,uma patente com uma “Markush”muito ampla pode dar origema novas patentes, ou seja, patentesde seleção, as quais selecionam compostospertencentes a uma “Markush”principal, os quais não foramexemplificados quanto ao seu processode preparação e à demonstraçãoda sua atividade biológica.Como exemplo, pode ser citada apatente EP 1 002 792, a qual deuorigem a patente de seleção EP 0627 406. A patente de seleção é umtipo de proteção amplamente utilizadopor detentores de patentes quequerem estender seu prazo de proteçãoalém da expiração da patenteoriginal. Dessa forma, tem-se o chamadoevergreening, através do qualas indústrias farmacêuticas tentamaumentar o prazo de proteção patentária(onde uma mesma moléculapode gerar dezenas de patentes)e construir, dessa forma, uma barreiraformada com relação ao monopóliodaquele produto. Entretanto,uma patente de seleção não necessariamenteé obtida pelo mesmoinventor da “Markush” principal, oque acaba dando margem a processosjudiciais.Além da suficiência descritiva, a unidadede invenção de uma patentetambém é um requisito de patenteabilidadeadotado não só pelo escritóriojaponês, como também pelosescritórios United States Patent Office(USPTO) e European Patent Office(EPO), para examinar reivindicações“Markush”. A unidade de invençãodo pedido de patente deinvenção se refere a uma únicainvenção, ou a um único grupo deinvenções inter-relacionadas demaneira a compreenderem umúnico conceito inventivo, ou seja,a resolução de um único problematécnico. Portanto, a unidade deinvenção de uma reivindicação“Markush” torna-se questionável, àmedida que, quando se tem umnúmero desproporcional de possíveiscompostos alternativos, nãose pode predizer que todos estespertencem ao mesmo grupo deinvenções e possuem o mesmoobjetivo proposto.A partir do dos problemas expostosacima se torna necessário estabelecercritérios para avaliar oescopo de proteção de uma reivindicação“Markush”.SOLUÇÕES PROPOSTASTendo em vista os manuais de examedos escritórios de patentes dosEstados Unidos (2001), Japão(2001) e EPO (2007), e com basenos requisitos de patenteabilidadedas Leis de Patente, foram traçadasalgumas propostas para soluçãodas dificuldades encontradasquanto ao escopo de proteção deuma reivindicação “Markush”.Primeiramente, deve ser estabelecidoo critério da unidade de invençãoque, de acordo com o presentetrabalho, descreve reivindicações“Markush” de compostosquímico-farmacêuticos. Esse conceitopode ser visto da seguinteforma:a. Todos os compostos originadosda fórmula principal devem possuirpropriedades em comum,além de terem que ser utilizadospara o mesmo fim, ou seja, conformeo exemplo de “Markush” naFigura 2, todos os compostos devempossuir o mesmo centro ativocom atividade analgésica.b. Todos os possíveis compostosoriginados de uma “Markush” terãoque apresentar uma estruturaprincipal comum a todos eles, ouseja, conforme demonstrado na62 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

Figura 2, todos os compostos originadosdaquela “Markush” terão quepossuir o centro ativo analgésicocomo estrutura principal.Quando uma reivindicação “Markush”não apresenta unidade deinvenção, as buscas por anterioridadesse tornam muito amplas e,consequentemente, devem ser realizadascom base nos compostosexemplificados no relatório descritivo.Antes de dar prosseguimentoao exame, a requerente deve serinformada da falta de unidade deinvenção e, dessa forma, determinarquais grupos de compostos deverãoser examinados.Com relação à falta de suficiênciadescritiva, esta pode ser uma razãopara negar ou invalidar uma patente,principalmente na área farmacêutica,pois tal área tem interesseparticular nesse requerimento (nocaso da necessidade de uma licençacompulsória ou após a patenteexpirar para a reprodução de medicamentosgenéricos).Portanto, os exemplos experimentaissão requisitos essenciais paraavaliar a suficiência descritiva deuma patente com reivindicação“Markush”. Os exemplos experimentaisde processo de preparaçãoou de atividade biológica dos compostosdevem se estender a todasas classes de compostos alternativosda ‘Markush”, pois não se podepredizer ou extrapolar que diferentesclasses de compostos, dos possíveissubstituintes, possam ser obtidaspor uma mesma maneira depreparo, visto que a natureza dasreações é diferente (vide exemplo1). Seguindo a mesma linha de pensamento,não é evidente para umtécnico no assunto que os compostoscujas classes de possíveis substituintes- que não foram exemplificadassegundo sua ação - tenhama mesma atividade dos compostosexemplificados. Assim, devem estarexemplificados substituintes dasdiferentes classes, para que elesestejam revelados de forma clara eprecisa.De forma análoga, não é evidentepara um técnico no assunto que oscompostos, cujas classes de substituintesnão foram exemplificadas,tenham as mesmas características físico-químicasdos compostos exemplificados(equivalentes óbvios). Istoé, não se pode afirmar que a atividadefarmacológica dos compostos,com substituintes pertencentes aclasses distintas daquelas exemplificadas,seja uma decorrência óbviaa partir da observação da atividadefarmacológica dos compostosexemplificados.Ustinova e Chelisheva (1996) descrevemque não é possível obter ocontrole total nesse tipo de reivindicação,mas os dados experimentaisseriam requerimentos necessáriospara suportar as reivindicaçõese controlar a complexidade de estruturas“Markush”. Correa (2006),em seu artigo, também descreveque os escritórios de patente deveriamexigir dos requerentes informaçõestais como testes e experimentosque tornassem possível a reproduçãodestes.De acordo com os problemas apresentadoscom relação a uma amplaproteção tal como de uma reivindicação“Markush”, e as soluções propostas,a melhor opção seria estabelecercritérios mais consistentescom relação à patenteabilidade dessescompostos, exigindo que essasreivindicações sejam menos amplase devidamente suportadas porexemplos experimentais. Um outrofator relevante, para que uma reivindicação“Markush” esteja de formaclara e precisa, seria evitar termosque acarretam indefinição, taiscomo: aril, alquil, alquileno, etc, semespecificar o número de átomos decarbono.CONCLUSÕESDiante do exposto, vale ressaltarque, a partir de reivindicações devidamentesuportadas pelo relatóriodescritivo, não somente o pesquisador- como também os examinadoresde pedidos de patentes eprogramadores para busca por anterioridades–teriam melhor clarezae precisão para a avaliação dessasreivindicações. Estas característicastêm que ser levadas em consideraçãoquando do exame dos pedidos depatente de medicamentos, as quaisafetam grandemente a saúde públicacom relação ao acesso aos mesmos.Portanto, quando de tal exame, torna-senecessária a existência de regrasbaseadas, tanto nos conceitos fundamentaisda química e da farmacêutica,como nas respectivas Leis de Patentes.REFERÊNCIAS· Correa C. M. 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PesquisaMicrorganismosAssociados a PoríferosPotencial Biotecnológico da Microbiota Associada às Esponjas MarinhasFotos e ilustrações cedidas pelos autoresAline da Silva TurqueBacharel em Ciências BiológicasUniversidade do Grande RioMestranda em Química Biológicapelo Instituto de Bioquímica Médica-UFRJturque@bioqmed.ufrj.brCynthia Barbosa da SilveiraGraduanda em Biologia Marinhapela Universidade FederalFluminense-UFFcynthiabs@bioqmed.ufrj.brRicardo Pilz VieiraDoutor em BiofísicaProfessor Visitante do Instituto deBioquímica Médica-UFRJrpvieira7@hotmail.comGuilherme MuricyDoutor em BioquímicaProfessor Adjunto do Departamentode Invertebrados - Museu Nacional-UFRJmuricy@acd.ufrj.brAlexander Machado CardosoDoutor em Química BiológicaProfessor Adjunto do CentroUniversitário Estadual da Zona Oesteamcardoso@bioqmed.ufrj.brMaysa Mandeta ClementinoDoutora em Química BiológicaPesquisadora do Instituto Nacionalde Controle da Qualidade em Saúde-INCQSmaysa@incqs.fiocruz.br1. IntroduçãoOs Poríferos, também conhecidos comoesponjas, são invertebrados que filtramgrandes quantidades de água e adquiremseus nutrientes por fagocitose dosmicróbios capturados durante a filtração(Fig.1). Habitam os oceanos tropicais,temperados e polares, com algumasespécies encontradas em águadoce (Taylor et al., 2007). As esponjasformam uma das mais antigas radiaçõesdos metazoários, cuja origem data doPeríodo Pré-Cambriano há cerca de 500milhões de anos (Hentschel, 2004). Sãoorganismos sésseis (fixos no substrato)que apresentam uma alta biodiversidade,com uma estimativa de aproximadamente15.000 espécies representadasem três classes: Demospongiae, Calcareae Hexactinellida (Fig.2), sendo a maioriapertencente ao primeiro grupo (Hoopere Van Soest, 2002).As esponjas são geralmente sustentadaspor um esqueleto constituído por espículassilicosas ou calcárias, que podemser complementadas ou substituídas porcalcário maciço (esponjas coralinas) oupor fibras de espongina, uma proteínado tipo do colágeno (esponjas córneas).De uma forma simples elas podem serdefinidas como: “Animais filtradores esésseis, que se utilizam de uma únicacamada de células flageladas (coanócitos)para bombear água através de seucorpo” (Bergquist, 1980) (Fig.3). Apesarde serem animais capazes de alcançargrande porte, com mais de 1 metro dealtura, ou recobrir largas áreas de substrato,alguns dos seus processos orgânicossão mais semelhantes aos encontradosnos Protozoa (animais unicelulares)do que nos Metazoa (animais multicelulares).Apresentam uma morfologiasimples e um baixo grau de organização,sem a formação de tecidos verdadeiros,e uma enorme diversidade deformas e cores.As esponjas possuem capacidade deOrlando Bonifácio MartinsDoutor em BiofísicaProfessor Adjunto do Instituto deBioquímica Médica-UFRJomartins@bioqmed.ufrj.brFigura 1. Microscopia eletrônica de transmissão mostrando uma célulade esponja. Arqueócito de Hymeniacidon heliophila fagocitando um procarioto(←) no mesohilo da esponja64 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

Figura 2. O filo Porifera é dividido em três classes: Demospongiae (A) Oscarella sp. (D) Haliclona sp; Calcarea (B)Clathrina aurea (E) Paraleucilla magna e Hexactinellida (C) Esqueleto de Dactylocaulis pumiceus, (F) Hyalonema sp.hospedar grandes comunidades de organismos,como archaeas, bactérias,fungos e algas, que podem compor até50% do seu volume tecidual (Osinga,2003). Alguns microrganismos são passadosdo óvulo ao embrião e deste aoindividuo adulto através da transmissãovertical, como aqueles encontrados emassociação com embriões do primeiroao último estágio de desenvolvimentona esponja Corticium candelabrum(Koty et al., 2007). Microrganismos nointerior das esponjas foram inicialmentedescritos em estudos de microscopiaeletrônica por Lévi e Lévi (1965) e Vacelete Donadey (1977). Esses estudosmostram que células procarióticas encontram-seem íntima interação com amatriz do mesohilo desses invertebrados(Fig.4) (Turque et al., 2008).Atualmente vários artigos descrevem oisolamento e a caracterização de micróbiosassociados com as esponjas (Webstere Hill, 2001). Com a disponibilidadede ferramentas moleculares, trabalhosmais recentes vêm utilizando técnicascomo construção de bibliotecasdo gene ribossomal 16S rRNA, hibridizaçãoin situ de sondas com fluorescência(FISH) e eletroforese em gel comgradiente desnaturante (DGGE). Estastécnicas são freqüentemente utilizadasno estudo das comunidades microbianas.A aplicação desses métodos temrevelado comunidades com alguns gruposcomuns entre esponjas filogeneticamentediferentes (Hentschel etal., 2006). Um novo filo de bactérias temsido proposto através da utilização dealgumas dessas técnicas, como a amplificaçãodo gene 16S rRNA e a microscopiaeletrônica. O candidato a filoPoribacteria, encontrado em associaçãocom diferentes espécies de esponjas ede diferentes regiões geográficas, demonstrouser bastante específico e exclusivodas esponjas marinhas, não sendoencontrado em outros organismos,água ou sedimento (Lars et al., 2004). Oestudo dos grupos bacterianos associadoscom Hymeniacidon heliophila ePolymastia janeirensis demonstraram apresença de um novo grupo aqui denominadocandidato a filo Spongebacter(Fig. 5), distinto do Poribacter descritorecentemente.Com exceção da archaea Cenarchaeumsymbiosum que, em estudos recentes utilizandotécnicas de genômica, foi demonstradamantendo uma associaçãosimbiótica bem estabelecida com a esponjaAxinella mexicana (Hallam et al.,2006), a simbiose e o papel fisiológicodos microrganismos associados às esponjasainda não têm sido conclusivamentedemonstrados. A natureza dessasrelações, se mutualísticas ou comensais,precisa ser melhor esclarecida. Poressa razão a simbiose nos poríferos édefinida como uma associação consistenteentre o micróbio e sua esponjahospedeira, independente da atribuiçãodo benefício (Enticknap et al., 2006). Especula-seque funções como aquisiçãode nutrientes, regulação metabólica,mecanismos de defesa e fixação de nitrogêniopodem ser atribuídas às interaçõesentre esponjas e microrganismos(Hentschel et al., 2003).Um grande número de compostos deinteresse biotecnológico, como porexemplo, citotoxinas, agentes antifúngicos,antibióticos, antivirais, e principalmenteanticancerígenos tem sido isoladosde esponjas marinhas e microrganismosassociados (Sipkema et al.,2005), e mais de 200 novos metabólitossão descritos a cada ano (Blunt et al.,2006). Essa breve revisão tem comoobjetivo principal divulgar essa novaárea do conhecimento e ressaltar aenorme carência de pesquisas científicasvoltadas para biotecnologia da microbiotade esponjas marinhas.2. Produção de MetabólitosSecundários2.1 BactériasAs esponjas permitem a formação deum microambiente dentro de seus tecidos,abrigando uma ampla diversidadebacteriana produtora de metabólitos secundáriosnão caracterizados, representandoum potencial científico ainda nãoexplorado na busca por novos compostosde interesse biotecnológico. Recentementedemonstrou-se que algunsmetabólitos descritos como origináriosde invertebrados marinhos são, na verdade,sintetizados por bactérias (Mohapatraet al., 2002). Foi observado quebactérias em associação com poríferosproduzem compostos similares aos isoladosanteriormente da esponja, comopor exemplo, salicilihalamida A isola-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 65

Compostos biologicamente ativos foramisolados das esponjas em diferentes ambientes,incluindo tropicais, subtropicaise temperados, com o interesse por novosprodutos naturais (Holler et al., 1999). Ocomposto qualificado para utilização emterapia humana sorbicillactona A, um tipode alcalóide, foi isolado da esponja Irciniafasciculata, mas é na verdade sintetizadopelo fungo associado Penicilliumchrysogenium. Communisina B e derivadosforam isolados do fungo Penicilliumsp. associado à esponja Axinella verrucosa(Jadulco et al., 2003).2.3 ArchaeasFigura 3. Reprodução esquemática de uma esponja. (A) Mesohilo,camada intermediária e gelatinosa entre as paredes interna e externa daesponja, Poro, orifício de entrada de água e ósculo principal canal de saídade água. (B) Detalhe ampliado de um poro inalante. Coanócito, célulaflagelada que com o batimento do seu flagelo cria uma corrente de águatrazendo nutrientes e gases e espículas que formam o esqueleto da esponjado de Haliclona sp., idêntico ao aspicularenA, produzido por bactérias associadas(Crews e Bescansa, 1986).O composto 2-metiltio, 1,4-naphtoquinonafoi isolado de bactérias associadasà esponja Dysidea avara e demonstrouforte propriedade antiangiogênicae antimicrobiana (Bringmann et al.,2003). Antibióticos incluindo lipopeptideos,originários do gênero Bacillus,demonstraram forte atividade contra microrganismoscom resistência clínica,como por exemplo, Staphylococcusaureus e S. epidermidis (Muscholl et al.,2008). Um glicoglicerolipideo sintetizadopela bactéria Microbacterium sp. encontradaem associação com a esponjaHalichondria panicea exibiu propriedadesantitumorais muito interessantes(Wicke et al., 2000). Metabólitos comatividade citotóxica e antimicrobianosproduzidos por Pseudomonas sp. tambémforam isolados da esponja Homophymiasp. (Bultel-Ponce et al., 1999).Atividade antimicrobiana foi vista tambémem 27 isolados de bactérias associadascom as esponjas Aplysina aerophobae Aplysina cavernícola (Thomset al., 2004).Christian e colaboradores (2005) mostraramque um composto natural halogenadoé sintetizado por uma cianobactériaassociada com quatro espéciesde esponjas da ordem Dictyoceratida.A cianobactéria Oscillatoria spongeliae,que compõe grande parte dovolume tecidual da esponja Dysideaherbacea, é produtora do antimicrobianoéter bifenil polibrominato conferindoproteção contra outros microrganismosinvasores (Unson et al., 1993). BactériasGram positivas como Actinomycetessão também conhecidas por produziremmetábolitos secundários com atividadeantibiótica em esponjas (Chelossiet al., 2006).Aproximadamente a metade das bactériasencontradas em associação com asesponjas marinhas Hymeniacidon heliophilae Polymastia janeirensis pertenceà classe Proteobactéria (Turque et al.,2008). Na esponja Theonella swinhoeias Proteobactérias são responsáveis pelaprodução do composto theopalauamida(Webster et al., 2001).2.2 FungosA maioria dos compostos bioativos derivadosde fungos marinhos descritosaté hoje provém daqueles associadoscom esponjas. Os fungos do gênero Penicilliumsão os maiores produtores dosmetabólitos secundários estudados. Háum crescente interesse na determinaçãoda verdadeira diversidade de fungos presentesnas esponjas marinhas e de possíveissubstâncias biologicamente ativas.Ao contrário da pesquisa de metabólitossecundários com fungos terrestres,esses estudos em ambientes marinhossão relativamente novos. As esponjasexibem inúmeras associações com fungos,mas o entendimento da produçãode compostos com atividade biológicaem esponjas tem sido mais focado embactérias, com menos ênfase nos eucariotos(Taylor et al., 2004).Archaeas são microrganismos distintos debactérias e eucariotos (Woese e Fox, 1977),sendo divididas em dois principais filos:Crenarchaeota e Euryarchaeota (Woese etal., 1990). Alguns grupos de archaeas sãoconhecidos por possuírem adaptações àvida em ambientes extremos e apresentaremcaracterísticas hipertermofílicas (crescemem temperaturas mais altas que 70ºCaté o limite máximo de 121ºC), metanogênicas(anaeróbicas que sintetizam metano)e halofílicas (que crescem em altasconcentrações de sal) (Schiraldi et al.,2002). As propriedades incomuns das archaeasas tornam alvo para o desenvolvimentode processos biotecnológicos eaplicações industriais (Alqueres et al.,2007). Nenhuma archaea foi descrita comopatogênica apesar de estarem presentesem humanos, animais e plantas (Cardosoet al., 2003). Muitos microrganismos do domínioArchaea têm sido isolados para finsindustriais, como por exemplo, a utilizaçãode esterases e lipases, enzimas quepossuem grande termoestabilidade e aplicaçãona biossíntese orgânica (Alquereset al., 2007).Em trabalhos mais recentes, archaeas foramencontradas em associação com esponjas.A archaea Cenarchaeum symbiosumfoi descrita como um organismo simbionteda esponja Axinella mexicana, possuindoalta especificidade (Preston et al.,1996). Esta archaea apresenta um metabolismoquimiolitoautotrófico, que é complementarao da esponja, usando comoúnica fonte de carbono o CO 2e consumindoamônia para seu suprimento deenergia (Hallam et al., 2006). Neste caso,a archaea atua detoxificando os produtosde excreção da esponja o que torna clarasas relações simbióticas. Archaeas metanogênicasforam descritas em Rhopaloeidesodorabile através de observação dogene 16S rRNA, parecendo formar um micronichoanaeróbico dentro da esponja.Membros das archaeas Crenarchaeota eEuryarchaeota estão presentes no coanossomae no mesohilo de Tentorium semisuberites(Thomas et al., 2006).Apesar de inúmeros artigos demonstrarem66 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

Figura 4. Microscopia eletrônica de transmissão mostrando microrganismos associados a esponjas marinhas.Hymeniacidon heliophila (A,B,C e D), Polymastia janeirensis (E,F,G e H)a ocorrência de archaeas nas esponjas,seu potencial biotecnológico não temsido explorado. Nenhum estudo revelouaté hoje compostos com aplicaçãobiotecnológica produzidos por archaeasassociadas com esponjas marinhas.Isso sugere a necessidade de maioresesforços na pesquisa para futuras aplicaçõesindustriais e farmacológicas.3. CultivoA produção de drogas a partir de microrganismosassociados às esponjasmarinhas tem sido limitada pela dificuldadede cultivo desses organismos commeios definidos em laboratório. Para odesenvolvimento de uma droga comercialé necessária a produção desta emgrande quantidade para estudos clínicos.Técnicas dependentes de cultivotêm sido empregadas com pouco sucesso(Webster et al., 2001), uma vezque apenas uma quantidade proporcionalmentemenor da comunidade totalde bactérias associadas às esponjas écultivada com sucesso. Somente 0,15%da população de bactérias da esponjado Caribe Ceratoporella nicholsoni foicultivada (Santavy et al., 2001), enquantoproporções maiores de cultivo, chegandoa 11% da comunidade bacteriana,foram possíveis em Aplyisina aerophoba,esponja do Mediterrâneo (Friedrichet al., 2001).Muitas espécies de esponjas têm sidocultivadas com a utilização de técnicasde maricultura, que permite o cultivodesses organismos no mar, sendo degrande interesse para utilização sustentáveldas esponjas. Para a aplicaçãodessa técnica, fatores como profundidade,corrente e luminosidade são importantespara o crescimento das esponjase dos microrganismos associados(Sipkema et al., 2005). A mariculturatem sido empregada com muito sucessoem algumas espécies de esponjasmarinhas, proporcionando aumentode biomassa desses organismos ea obtenção de compostos químicosem quantidades comerciais.4. MetagenômicaO interesse em microrganismos associadosàs esponjas como produtoresde compostos biologicamente ativosvem crescendo, mas a vasta maioriadessa comunidade microbiana aindanão foi isolada em cultura pura.Metagenomas de micróbios associadosàs esponjas marinhas têm sido utilizadoscom sucesso na identificaçãode genes alvos envolvidos na síntesede produtos naturais (Hallam et al.,2006). Esse método envolve construçãode bibliotecas genômicas atravésde extração e clonagem de DNA dealto peso molecular (Handelsman,2004). O gene 16S rRNA é um dos principaisgenes utilizados como marcadormolecular para construção de bibliotecas,sendo de fácil amplificaçãopela técnica de PCR (Reação em Cadeiada Polimerase) (Vieira et al.,2008).Essa nova abordagem revelou novosgenes de microrganismos não cultivadosassociados às esponjas Theonellaswinhoei e Discodermia dissoluta(Piel et al., 2004). A análise de metagenomatambém identificou enzimas,como as que são capazes dehidrolisar agar provenientes de algumasbactérias do gênero Cytophagaassociadas a esponja Halichondriapanicea (Imhoff e Stöhr, 2003). Genesque codificam amilases e acetilcolinesterasesforam identificados na bactéria Artrobacterilicis e no fungo Mucor sp., associadosà esponja Spirastrella sp. (Mohapatraet al., 1997).A construção de bibliotecas gênicas é ummétodo promissor na elucidação do potencialgenético de microrganismos ainda nãocultivados. Recentemente foi seqüenciadoo genoma de archaea Cenarchaeum symbiosumisolada da esponja Axinella mexicanadisponibilizando mais de 2000 novosgenes para a investigação cientifica das funçõesbiológicas e possíveis aplicações tecnológicas(Hallam et al., 2006).A identificação de genes responsáveis pelasíntese de metabólitos secundários por meiodessa técnica torna-se uma fonte alternativapara exploração da diversidade químicapresente na comunidade microbiana das esponjasdisponibilizando inúmeros genespara clonagem e expressão heteróloga deproteínas com interesse biotecnológico.5. ConclusãoEsponjas marinhas são hospedeiras demuitos microrganismos. A aplicação debactérias, fungos e principalmente archaeasna biotecnologia permanece limitada. Aprodução em larga escala dos metabólitossecundários originados de microrganismosassociados a esponjas, continua restritadevido à dificuldade do cultivo em laboratórioda maioria destes micróbios. Estratégiasalternativas têm sido propostas para aobtenção desses compostos, como culturade esponjas no ambiente marinho (maricultura)e técnicas de metagenômica.Estudos recentes chamam a atenção paraum sistema bioquímico de comunicaçãocelular chamado “Quorum Sensing”. Estesistema sofisticado de comunicação permiteque as bactérias enviem e recebam men-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 67

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PesquisaAVALIAÇÃO DE MORTEPROGRAMADA DE CÉLULASFotos e ilustrações cedidas pelos autoresApoio: CNPqComparação do Índice Apoptótico Progressivo em cultura de CondrócitosGabrielle Reinoldes Bizarria GUILHERMEMestranda do Programa de Pós Graduação emBiotecnologia Médica – gabrielle_rbg@yahoo.com.brAparecida Vitória de Gonçalves SOUZAMestranda do Programa de Pós Graduação emBiotecnologia Médica – FMB-UNESPvitoriagsouza@yahoo.com.brAndrei MOROZMestrando do Programa de Pós Graduação emBiotecnologia Médica - FMB-UNESPandreimoroz@terra.com.brPriscila MURADOR - MsPesquisadora do Hemocentro de Botucatu – Faculdadede Medicina – UNESPpmurador@fmb.unesp.brRenata Aparecida de Camargo BITTENCOURT - MsDoutoranda do Programa de Pós Graduação emOrtopedia – FMB –UNESPRentcourt2000@yahoo.com.brMarjorie de Assis GOLIM – DraPesquisadora do Hemocentro de Botucatu – Faculdadede Medicina – UNESPcitometria@fmb.unesp.brRosana ROSSI-FERREIRA – Profa. Dra.Docente do Departamento de Ciências Biológicas – FC-UNESP – Baururossi@fc.unesp.brElenice DEFFUNE – Profa. Dra.Docente do Departamento de Urologia –FMB-UNESP –Botucatued12@fmb.unesp.brINTRODUÇÃOEm todo mundo são gastos milhares dedólares todos os anos em tratamentos parareduzir sintomas de doenças sem cura efetiva.Os problemas ortopédicos que atingemem sua maioria idosos, são de grande importânciaeconômica para a sociedade, poisrequerem muitas intervenções cirúrgicas.Essas intervenções muitas vezes não obtêmos resultados bons esperados em longo prazo.Uma das formas para reduzir os gastose melhorar a qualidade de vida do paciente,quanto a possíveis rejeições e incômodoscom próteses, são os auto-transplantes,que se caracterizam pela retirada de materialautólogo e, após a realização de culturacelular em laboratório, o re-implante 1 .Estas considerações se aplicam, entre outras,a transplantes de cartilagem em pacientesque apresentam doenças como a osteoartritee a artrite reumatóide. Estas sãodoenças degenerativas, sem cura efetiva,apenas com tratamento sintomático e paliativo.Os tratamentos que vêm sendo desenvolvidos,mais recentemente, envolvem a terapiacelular. Esta terapia consiste em produzir acartilagem articular “in vitro” para realizaçãode transplantes autólogos, com a finalidadede regenerar o tecido lesado. A produçãode tecido “in vitro” se faz a partir decélulas do próprio paciente e, como não háincompatibilidade imunológica, as chancesde rejeição são extremamente reduzidas 2 .Uma das formas de se realizar um transplanteautólogo é utilizar condrócitos retiradosda cartilagem do paciente. Os condrócitosdevem ser cultivados em matriz tridimensional(scaffolds) para não perderem seufenótipo, durante três a quatro semanas, edepois, transplantado para a área lesada 3 .Estudos anteriores demonstraram que o fenótipodessa cartilagem teve alta variação,obtendo-se cartilagem do tipo hialina, fibrocartilageme os dois tipos juntos 4 . Emborase verifique uma variação de fenótipo, amaioria dos transplantes feita em outrasdemonstrações aponta sucesso em cerca de80% 5 . Esta taxa poderia ser melhorada seestudos induzissem não só a produção dematriz extracelular para formação do tecido,mas também a proliferação celular doscondrócitos, até porque, essas células estãosendo cultivadas em ambiente estranho, epodem apresentar morte celular precoce.Ilustração 01: Pérola de alginato desódio com células (aumento 20X)Ainda assim, este tipo de transplante écontra-indicado em paciente com lesõesprovocadas por osteonecrose, condrocalcinose,osteoartrite, artrite reumatóidee meniscectomia total 6 .Nos últimos três anos, com o avanço natecnologia de células-tronco, um segundotipo de cultivo celular vem sido testado.Ele consiste em cultivar célulastroncomesenquimais e diferenciá-las emcondrócitos. Essas células mesenquimais(ou células do estroma medular – CTMs)estão presentes na medula óssea emIlustração 02: Formação de gruposisógenos pelos condrócitos cultivadosdentro da pérola de alginato de sódiobaixíssima quantidade (0,01% a 0,001%do total de mononucleares) e são capazesde serem diferenciadas (dependendodo ambiente local e estímulos tróficos)em condrócitos, osteoblastos, adi-70 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

viabilidade celular (1) a técnica maisamplamente utilizada para observaçãode viabilidade celular que consiste emusar o corante de viabilidade celular azulde Tripan junto com a Câmara de Neubauer;(2) e a técnica por marcação comanexina V (conjugada com FITC - isoticianato)e iodeto de propídeo com posterioranálise por Citometria de Fluxo.MATERIAL E MÉTODOSA pesquisa foi aprovada pelo Comitê deÉtica em Pesquisa e os animais utilizadosestavam sob cuidados no Biotérioda Faculdade de Medicina de Botucatu– UNESP.Gráfico 01: Média das viabilidades celulares de cultura de condrócitos em pérolade alginato (tridimensional) durante 3 semanas de cultivo. Linha azul: viabilidadecelular feita por citometria de fluxo e marcação com anexina V e iodeto depropídeo. Linha rosa: viabilidade celular feita por corante de viabilidade (azul detripan) e Câmara de Neubauerpriedades muito intrigantes, é deixadade lado. A maioria trata sobre as possíveisdiferenciações e transplantes.O estudo da apoptose (morte celular programada)é importante pois, esse fenômenopode ser desencadeado por estímulosdiversos, presentes ou ausentesna cultura celular, como: hormônios oufatores tróficos, toxinas, competição negativaentre as células, etc. Assim, aoanalisarmos a extensão da progressãoda apoptose, podemos corrigir a culturacom o que estiver faltando ou sobrandopara as células.Para o cultivo de condrócitos, neste trabalho,foi utilizada a matriz tridimensionalde alginato de sódio. Essas célulasforam cultivadas em laboratório semestímulo de proliferação como é descritona literatura. Assim, observando a viabilidadecelular em cultura tridimensionale a progressão de morte celular porapoptose podemos avaliar se essas célulastem condições de serem re-implantadasem lesões de tecido cartilaginosoColeta da cartilagem e processamento:foram coletadas raspas de tecido cartilaginosode coelhos machos. As amostraspassaram por processamento emlaboratório para destruição da matrizextracelular e liberação dos condrócitos.A digestão do tecido foi feita comincubação a 37 o C por 45 minutos comtripsina a 0,25%, após a retirada da tripsina,foi feito nova incubação com hialuronidasena mesma condição anteriore por último, após a remoção da hialuronidase,o tecido foi incubado comcolagenase tipo I em estufa a 37 o C por18 horas.Inclusão dos condrócitos em pérolade alginato: fez-se necessário o uso dematriz tridimensional para o cultivo decondrócitos, para esses não perderemseu fenótipo. Optou-se pelo hidrogel dealginato de sódio para realização dematriz tridimensional pois é um materialreabsorvível, podendo ser re-implantadodiretamente nos organismos. Para istofoi preparado uma solução de alginatode sódio 1,2% em cloreto de cálcio a155mM. O pellet celular de condrócitosfoi ressuspenso na solução de alginatode sódio e colocado em uma seringa deTabela 01: Análise das médias de expressão de anexina V e iodeto de propídeonas culturas durante 3 semanas de cultivopócitos e miócitos 7 .A dificuldade existente nesta técnica éexpandir as CTMs em laboratório paraobtenção de cultura homogênea e facilitara sua diferenciação em outros tipocelulares. Infelizmente, na literatura, édifícil de achar trabalhos básicos sobreisolamento, expansão e caracterizaçãodas CTMs, e a base do conhecimentosobre essas células que possuem pro-para regenerá-lo. E, também, contribuimoscom dados básicos, que faltam naliteratura.Para o cultivo de CTMs em monocamada,avaliamos dados básicos que, também,faltam na literatura como viabilidadecelular ao longo da cultura, progressãodo crescimento das CTMs durantea cultura de células mononucleadasdo sangue de medula óssea, e aprogressão da morte celular por apoptose.Além de avaliar os índices de apoptosenas culturas celulares, ainda foi possível,ainda, comparar, duas técnicas deIlustração 03: Viabilidade celular porazul de tripan em Câmara de Neubauer.Células não viáveis estão coradasem azulBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 71

a temperatura ambiente. Após a remoçãoda saponina por centrifugação, foicolocado o anticorpo monoclonal antivimentinae depois um anticorpo secundárioconjugado com FITC. A leitura foifeita por citometria de fluxo FACSCALI-BUR BD® e a análise em software PA-INT-A-GATE da BD®.RESULTADOSCultivo de condrócitos em pérolas dealginato: Na cultura em pérola de alginatode sódio (ilustração 01), os condrócitosnão perderam seu fenótipo,continuando como células ovaladas queformam grupos isógenos (ilustração 02).Ilustração 04: Condrócitos marcados com anexina V (FL1) e iodeto de propídeo(FL3). Em azul e ciano temos expressão de anexina V; em verde e ciano temosexpressão de iodeto de propídeo, e somente o ciano representa a coexpressão deanexina V e iodeto de propídeo. A maior parte da cultura em cinza são as célulasque não expressaram os marcadores, sendo consideradas células viáveis. Ao lado,temos a legenda que mostra a porcentagem de cada cor (isto é cada expressão)1mL. Foi feito o gotejamento da soluçãoda seringa em cloreto de sódio a 55mMpara a formação das pérolas de alginato.Essas foram cultivadas em meioDMEM Dulbecco’s Modified Eagle MediaMeio - GIBCO ® suplementado comF-12 Nutrient Mixture (Ham) - GIBCO ® ,com troca a cada dois dias.Dissolução da pérola de alginato paraliberação de condrócitos: as pérolas dealginato foram incubadas a temperaturaambiente com citrato de sódio a 165mMpor uma hora. Após contrifugação, opellet celular formando foi ressuspensoem meio de cultura.Ilustração 05: Aumento 20X. Trêssemanas de cultivo (após segunda passagem)das células mononucleadas damedula óssea. Na microscopia de luzcontrastadada observa-se o aumento daformação de colônias celulares (noscírculos).Coleta de medula óssea e processamento:foi retirado 5 mL de medula ósseada crista ilíaca de coelhos machos(com heparina para não coagular). Osangue foi processado em laboratóriotendo suas células mononucleadas separadaspor Ficoll-hypaque ® densidade1.077g/mL como descrito no protocolode ZAGO e COVAS, 2006. As célulasmononucleadas foram cultivadas em fracosde 25cm 2 com meio Knockout-DMEM- GIBCO ® .Tripsinização das culturas: para “soltar”as CTMs que aderiram a placa, foifeito digestão enzimática com tripsina a0,25% durante 2 minutos.Viabilidade celular por azul de tripan:foram coletadas amostras de células emisturado (v:v) com azul de tripan 0,2%.A mistura foi colocada na Câmara deNeubauer para contagem celular.Viabilidade celular por marcação comanexina-V e iodeto de propídeo: foiutilizado o KIT “ANNEXIN V-FITC APOP-TOSIS DETECTION KIT I” - BD Pharmingene a marcação das células foifeita de acordo com as especificaçõesdo fabricante. A leitura foi feita em citômetrode fluxo FACSCALIBUR BD® e aanálise em software PAINT-A-GATE daBD®.Marcação das CTM com anti-vimentina:A vimentina é um componente intracelularde caracterização das CTM,portanto sua marcação é de extrema significância.A permeabilização celular foifeita com saponina a 1% por 15 minutosViabilidade Celular e Progressão daApoptose em Cultura Tridimensionalde Condrócitos: A viabilidade celular foianalisada por dois métodos (1) por marcaçãocom anexina V e iodeto de propídeoanalisadas por Citometria de Fluxo;e (2) usando-se o corante de viabilidadecelular azul de Tripan com análisepela Câmara de Neubauer.Em ambas as análises, podemos perceberdiminuição da taxa de viabilidadecelular (gráfico 01).Para confrontar as duas metodologiasde avaliação da viabilidade celular utilizou-seo teste não paramétrico de Mann-Whitney. Não houve diferença significativados testes para p

Gráfico 02: Média das viabilidades celulares de cultura de célulasmononucleadas da medula óssea durante 4 semanas de cultivo. Linha azul: viabilidadecelular feita por citometria de fluxo e marcação com anexina V e iodeto depropídeo. Linha rosa: viabilidade celular feita por corante de viabilidade (azul detripan) e Câmara de NeubauerTabela 02: Análise das médias de expressão de anexina V e iodeto de propídeonas culturas durante 2 semanas de cultivoIlustração 06 Células mononucleadas marcados com anexina V (FL1) e iodeto depropídeo (FL3). Em azul e ciano temos expressão de anexina V; em verde e cianotemos expressão de iodeto de propídeo, e somente o ciano representa a coexpressãode anexina V e iodeto de propídeo. A maior parte da cultura em cinza são as célulasque não expressaram os marcadores, sendo consideradas células viáveis. Ao lado,temos a legenda que mostra a porcentagem de cada cor (isto é cada expressão)de cultivo, é impossível realizar qualquertipo de teste a respeito de viabilidadecelular, progressão de apoptose ou quantidadede CTM presente na amostra.Mesmo assim, conseguimos observar aprogressão da cultura por microscopiade luz contrastada (ilustração 05: trêssemanas de cultura).A viabilidade celular das células mononucleadastambém foi analisada pelosdois métodos descritos. Em ambas asanálises, pode-se perceber diminuiçãoda taxa de viabilidade celular (gráfico02).Para confrontar as duas metodologiasde avaliação da viabilidade celular utilizou-seo teste não paramétrico de Mann-Whitney. Não houve diferença significativados testes para p

Tabela 03: Análise das médias de expressão positiva de anti-vimentina nas culturasdurante 2 semanas de cultivo:DISCUSSÃOA cultura em gel de alginato de sódio,embora não tenha proporcionado a proliferaçãocelular, possibilitou a formaçãode matriz pericelular com colágeno tipoII (resultado não mostrado). Por não sero ambiente próprio dos condrócitos,essas células apresentaram ao longo dacultura diminuição de suas viabilidadescelulares, tanto pelo método de marcaçãocom anexina V e iodeto de propídeoquando analisados tanto por citometriade fluxo, quanto com o coranteIlustração 07: Média da viabilidade celulare de cultura de CTM duas últimassemanas de cultivo. Linha azul: viabilidade celular feita por citometria de fluxoe marcação com anexina V e iodeto de propídeode viabilidade (azul de Tripan) na Câmarade Neubauer. A diminuição da viabilidadecoincidiu com a alta incidênciade morte celular, tanto por apoptosequanto por necrose, pois no final dacultura observamos mais de 60% deapoptose precoce, 73% de necrose e 35%de apoptose tardia ou necrose secundária.Quanto a progressão da apoptose,embora tenha diminuído pouco duranteo cultivo, ainda se apresentou altaao final deste, nos fazendo consideraro meio (hidrogel) ao qual essas célulasestão sendo expostas. Os mais prováveisfatores de interferência são: dificuldadedo meio de cultura e nutrientesem chegar as células dentro do alginatode sódio, dificuldade das toxinas celularesliberadas saírem do gel, falta deestímulo de crescimento, como o TGF âou problemas de manipulação durantea coleta e processamento da cartilagem.Para essa cultura, o índice apoptóticocomprova que as células, se re-implantadascom a finalidade de corrigir defeitosno tecido cartilaginoso, não atingiriamseus objetivos, uma vez que com aviabilidade baixa e grau de morte celularalto elas seriam incapazes de regenerarlesões. A avaliação dos parâmetrosanalisados neste trabalho deve serrefeita durante a realização de novocultivo celular em outros materiais hidrogeis,ou num alginato de sódio demenor concentração, assim como colocarjunto ao meio, fatores de crescimentoextras.O método pelo azul de tripan, emboraneste estudo tenha se mostrado tão eficazquanto os marcadores de morte celularpor citometria de fluxo, não permite identificaraquelas células que estão entrando emprocesso apoptótico.Pelos resultados aqui apresentados, sugerimosque os testes de viabilidade celular devemser feitos sempre durante o cultivo decondrócitos em matriz tridimensional. E sempreque a viabilidade celular diminuir, sugere-sefazer a curva de morte celular, principalmentepor apoptose, para tentar corrigiros erros do cultivo.Já a cultura em monocamada de célulasmononucleadas da medula óssea proporcionoua proliferação celular, e o aumento dasCTMs no cultivo.A diminuição da viabilidade total das célulasem cultura, e o aumento da apoptose (confirmadapelo aumento da marcação com anexinaV) se mostram compatíveis. A partir domomento em que o meio de cultura usadoserve para estimular o crescimento das CTM,é compreensível que vejamos diminuição dacompetição negativa proporcionada pelascélulas mononucleadas através da diminuiçãoda viabilidade total das células. Ao mesmotempo, a progressão do aumento daapoptose confirma tal resultado.A proliferação máxima das CTM ocorreudurante a terceira semana de cultivo, apósterceira passagem. Essa proliferação celularestá de acordo com a diminuição da mortecelular, tanto por apoptose quanto por necrose,observadas atráves da diminuição progressivada marcação com anexina V e iodetode propídeo. Na quarta semana observouseuma menor expressão de vimentina pelascélulas em cultura. Essa expressão diminuídapode estar relacionada com perda de fenótipopelas células (o que ocorre devidoao número de passagens) e não com a mortedas células, pois não há indício de aumentodos marcadores de morte celular naquarta semana. A partir da observação dograu de apoptose celular dessa cultura, sugere-seque a diferenciação celular ocorrana terceira semana, ponto em que as CTMssão em sua maioria homogêneas e o índicede apoptose/morte celular está diminuindoconsideravelmente.Tal perda de fenótipo das CTMs vem sidoamplamente estudada e discutida na literaturacomo nos relatos de Javazon, E. (2004).Por um lado as passagens (repiques) comtripsina estimulam o crescimento, e por outro,ao estimular a taxa de proliferação, estimulatambém mutações no DNA celular oque pode levar a perda do fenótipo pelacélula e diminuição da atividade das telomerases– enzimas responsáveis por manter ostelômeros celulares com tamanho suficientepara a célula não entrar em senescência.A pesquisa de CTMs elevou-se, somente, nosúltimos quatro anos, e ainda é difícil achartrabalhos coerentes, principalmente, em relaçãoa caracterização e expansão dessascélulas. Por falta de informação base (o queestá começando a ser produzido e divulga-74 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

Tabela 04: Análise das médias de expressão de anexina V e iodeto de propídeo nasculturas durante 2 semanas de cultivo.Shahdadfar, A. (2006).Pelos resultados aqui apresentados, sugerimosque os testes de viabilidade celulardevem ser feitos sempre duranteo cultivo de CTMs para verificar o augeda homogeneidade do cultivo e a baixamorte celular.BIBLIOGRAFIAdo por necessidade de entenderem asCTMs antes de diferenciá-las) é difícilcorrelacionar os resultados deste trabalhocom a literatura. Os principais trabalhoscom CTM na literatura indicam quefizeram a contagem celular (pelos maisvariados métodos) mas raramente expõeos resultados em seus artigos, e muitosdeles não diferenciam as CTMs das outrascélulas mononucleadas durante acontagem celular, levando em consideraçãosomente a confluência de célulasna placa de cultura vistas por microscopiade luz – Bonab, M.M. et al. (2006),Ilustração 08: Cultura de células mononucleadas da medula óssea, e as CTMs estãomarcadas com anti-vimentina (FL1). Ao lado, temos a legenda que mostra a porcentagemda expressão de anti-vimentina (29,50%)Ilustração 09 CTMs marcadas com anexina V (FL1) e iodeto de propídeo (FL3). Naesquerda temos somente as CTMs que foram marcadas com anti-vimentina, neste quadrodistribuídas por tamanha x granulosidade. Ao meio encontra-se a marcação dasCTMs do “gate’ R2 com anexina V e iodeto de propídeo. Do lado esquerdo temos alegenda do quadrante do meio (UL = up left, UR = up right, LL = low left, LR = lowright) onde se lê que 58,11% das células estão viáveis, 6,94% expressão somenteanexina V, 4,37% expressão somente iodeto de propídeo e 3,68% coexpressa anexinaV e iodeto de propídeo01. CARVALHO, A.C.C. Células-Tronco:a medicina do futuro. Ciênc. Hoje. SãoPaulo, v.29, p. 27-31, 200102. GOLDSBY, R.A.; KINDT, T.J.; OS-BORNE, B.A. Kuby Imunologia. Quartaed. Rio de Janeiro: Livraria e EditoraREVINTER Ltda., 2002. p 517-526.03. BENTLEY, G.; MINAS, T. Revisãoclínica:tratar a lesão articular em jovens.Br. Med. J., London, v.10, 2001. Disponívelem http://www.bmj-pt.com04. ROBERTS, S.; McCALL, I.W.; DAR-BY, A.J.; MENAGE, J.; EVANS, H.; HAR-RISON, P. E.; RICHARDSON, J.B. Autologouschondrocyte implantation forcartilage repair: monitoring its successby magnetic resonance imaging and histology.Arthritis Res. Ther. v. 5, p. 60-72, 200305. WROBE, R. R. Articular cartilage injuryand autologous chondrocyte implantation.Phys. Sportsmed., Minneapolis,v. 28, 2000. Disponível em: http//www.physsportsmed.com.issues06. KLINIKUM LEVERKUSEN TRAUMA-TOLOGY & ORTHOPEDIC SURGERY.Autologous chondrocyte implantation.Levekusen, 2000. Disponível em:. Acesso em: 28 abr. 200307. MARTIN, I.; PADERA, R. F.; VUN-JAK-NOVAKOVIC, G.; FREED, L.E. Invitro differentiation of chick embryobone marrow stroma cells into cartilaginousand bone-like tissues. J. BoneJoint Surg., Boston, v. 16, p. 181-189,199808. ZAGO,M.A; COVAS,D.T. Células-Tronco: A nova froteira da medicina.Primeira ed. São Paulo: Editora Atheneu,2006. p.35-4809. JAVAZON, E.; BEGGS, K.; FLAKE,A. Mesenchymal stem cells: Paradoxesof passaging Experimental Hematologyv.32, p. 414–425,200410. BONAB, M. et al. Aging of mesenchymalstem cell in vitro. BMC Cell Biology,v.7:14 doi:10.1186/1471-2121-7-14, 200611. SHAHDADFAR, A. et al. In Vitro Expansionof Human Mesenchymal StemCells:Choice of Serum Is a Determinantof Cell Proliferation, Differentiation,Gene Expression, and TranscriptomeStability Stem Cells v. 23, p.1357–1366,2005.Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 75

PesquisaCaracterização morfológica e fisiológicaem acessos de Agaricus blazei e A. sylvaticusEstudos baseados em critérios morfológicos e fisiológicosFotos e ilustrações cedidas pelos autoresFotos e ilustrações cedidas pela autoraArailde Fontes Urben, Ph.DBióloga, Fitopatologista, MicologistaEmbrapa Recursos Genéticos eBiotecnologiaarailde@cenargen.embrapa.brHISTÓRICOO cogumelo Agaricus blazei Murril foi encontradopela primeira vez em 1965 na regiãode Piedade – São Paulo, pelo imigrantejaponês Takatoshi Furomoto. Em 1972,Fig. 01 – Agaricus sylvaticus cultivado em céuaberto em São Pauloele enviou amostras deste fungo para a Universidadeda Província de Mie no Japão paraser analisado. O material foi também enviadopara a Bélgica, Argentina e Estados Unidos,onde posteriormente o fungo foi classificadocomo Agaricus blazei Murril (Mizuno,1997).Seus efeitos terapêuticos foram inicialmenteestudados pela Faculdade de Medicina daUniversidade de Mie e pela Universidadede Shizuoka no Japão, onde descobriram suaspropriedades anticancerigenas e seu potencialde ativar o sistema imunológico. Os cientistasjaponeses revelaram que o polissacarídeoß-glucan atuava no organismo, aumentandoas funções imunológicas, elevandoos macrófagos, “Natural Killer Cell”(NKC), células T, células B e célulascomplementares,evitando a regeneração ea metástase do câncer (Mizuno, 1990,1997).INTRODUÇÃOOs cogumelos têm sido considerados umgrupo especial de fungos pelo seu tamanhomacroscópico, distinto corpo de frutificaçãoe produção de bilhões de esporos. Suas frutificaçõespodem ser de cores vivas (amarelo,laranja, vermelho, violeta ou verde) escuras(marrom ou preto) ou sem coloração(branco ou hialino), de consistência carnosafrágil a coriácea, morfologia bastante variávele formas curiosas.Apesar dos cogumelos serem consideradoscomo um alimento especial, eles tambémpodem ser tóxicos e alucinógenos.Existem relatos de intoxicação e morte naAmérica e Inglaterra devido ao consumo decogumelos silvestres.No México, os fungos alucinógenos eramusados pelos índios em rituais religiosos etambém como medicamentos. O gênero PSI-LOCYBE, comum naquele país, era consideradoum produto divino.Esses macrofungos são conhecidos pela humanidade,particularmente pelos povos asiáticos,desde os primórdios da história, sejapela sua toxidez ou pelas suas propriedadesnutricionais e medicinais. O homem primitivojá se alimentava desses cogumelos noperíodo entre 5.000 a 4.000 anos a.C. elogo aprendeu a valorizá-los como alimento.O Brasil foi o primeiro país a cultivar o Aga-Fig. 02 – Agaricus blazei cultivado emestufas no Distrito Federal (A e B)acessos nº 01 e (C) acesso nº 276 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

icus blazei. Atualmente é também cultivadoem outros países como o Japão, China eCoréia.Inicialmente o cultivo era realizado usandoas mesmas técnicas para o Champignon deParis (Agaricus bisporus). Hoje, sabe-se quea metodologia de cultivo vem se aprimorandocada vez mais direcionada para a produçãode Agaricus blazei, cuja demanda vemcrescendo consideravelmente nestes últimosanos.O cultivo pode ser realizado no campo (emcéu aberto) ou em estufas (cultivo protegido).Diversas são as vantagens de cultivarem estufas, entre elas: melhor controle datemperatura e umidade, proteção contra chuvas,ventos, granizo e controle de pragas(Abe, 2002).O seu mercado destina-se principalmente àexportação para o Japão e Estados Unidos.Embora o mercado interno ainda não tenhaa expressão econômica desejável, o consumoa nível nacional vem crescendo a cadaano, apesar dos altos preços que vem sendopraticados. Em geral, este produto vem sendoutilizado como nutricêutico, por seus atributosde aumentar as defesas imunológicasdo organismo.Agaricus blazeiAgaricus blazei, sinonímia A. sylvaticus é umfungo saprófito, comestível e medicinal, quese desenvolve em clima tropical e úmidocom temperatura variando entre 25 - 28°C.É rico em proteínas, vitaminas e sais minerais.É usado como nutricêutico na prevençãoe tratamento de diversas enfermidades,como o câncer, Aids, artrites reumáticas, lupus,hepatite B e C, entre outras doenças.No Japão, é conhecido vulgarmente comoHimematsutake. No Brasil, recebeu diversosnomes, como por exemplos: CogumeloPiedade, Cogumelo da Vida, Cogumelo Medicinal,Cogumelo Princesa, Cogumelo deDeus, Cogumelo do Sol, etc.Classificação fúngica de Agaricus blazei:REINO: FungiFILO: BasidiomycotaCLASSE: Basidiomycetes/HymenomycetesORDEM: Agaricales/HymenomycetalesFAMÍLIA: AgaricaceaeGÊNERO: AgaricusESPÉCIE: Agaricus blazei MurrilFig. 03 - Aspectos culturais de 01 acesso de Agaricus sylvaticus (A) e 02 de Agaricusblazei (B e C), desenvolvidos a 28 °C em meio de cultura BDA, com dez dias deincubaçãoSob condições naturais e artificiais, este fungopode apresentar diversas linhagens. Estaslinhagens ou grupo de isolados são observadosa partir de características morfológicasdas colônias fúngicas desenvolvidas emdiferentes meios de cultivos artificiais de laboratório,temperaturas e luminosidade.Em condições de campo ou estufas, a presençade uma nova linhagem, pode ser observadanos corpos de frutificação. Fatoresabióticos ou mesmo bióticos, podem favorecerou contribuir com o surgimento deuma nova linhagem ou variedade.OBJETIVO:O objetivo deste trabalho foi caracterizarmorfo- fisiologicamente diferentes acessosde Agaricus blazei e Agaricus sylvaticus paraverificar se havia similaridades ou diferençasentre eles.MATERIAL E MÉTODOSAcessos de Agaricus blazei e Agaricus sylvaticusprocedentes do Distrito Federal ede São Paulo, foram submetidos a testes morfológicose fisiológicos no Laboratório deQuarentena Vegetal da Embrapa RecursosGenéticos e Biotecnologia, Setor de Micologia.Através do exame direto, avaliou-se o tamanho,cor, disposição das lamelas e texturado corpo frutífero. Em microscópio ópticode luz, observou-se a organização das lamelas,a forma e tamanho dos esporos. Testou-setrês meios de cultura: batata-dextro-Fig. 04 - Aspectos culturais de 01 acesso de Agaricus sylvaticus (A) e 02 de Agaricusblazei (B e C), desenvolvidos a 28 °C em meio de cultura MB, com dez diasde incubaçãoA identificação e a classificação das espéciesde Agaricus têm sido baseadas em característicasmorfológicas e fisiológicas pela maioriados especialistas em taxonomia, e maisrecentemente, métodos genéticos, molecularese bioquímicos.As espécies de Agaricus são diferenciadasprincipalmente pela coloração, forma e dimensãodos corpos frutíferos e estruturasmicroscópicas (esporos, lamelas, cistídios, etc).Fig. 05 - Aspectos culturais de 01 acesso de Agaricus sylvaticus (A) e 01 de Agaricusblazei (B), desenvolvidos a 28 °C em meio de cultura suco de tomate, com dez dias deincubaçãoBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 77

Fig. 06 - Esquemas de corte transversal delamelas mostrando a trama: A. trama demediostrato: regular e filamentosa; hm -himênio, hp - himenópede, sh - subhimêmio,m - mediostrato; B. mediostratoregular “en boyaux”; C. mediostrato regularceluloso; D. mediostrato filamentosoemaranhado;E. mediostrato enteriforme;F. mediostrato bilateral; G. mediostratoinverso (bilateral-inverso); H. sub-himênio:H1 - filamentoso; H2 - celuloso; H3 -ramosose-ágar (BDA), suco de tomate e meio básico(MB). As placas foram incubadas a 28°C sob luz fluorescente contínuaRESULTADOS E DISCUSSÃOOs resultados mostraram pequenas diferençasentre o acesso de São Paulo com os deBrasília, evidenciados pela observação diretae características culturais. As amostras deA. sylvaticus analisadas apresentaram coloraçãomais clara nos bordos e mais escurano centro do píleo, dimensões maiores docorpo frutífero e dos esporos quando comparadoscom os acessos de A. blazei.Os esporos de A. sylvaticus apresentam coloraçãosub-hialina a marrom claro, sub-esféricosa ovóides com uma única membrana,dimensões: 7,2 - 14,4 x 7,2 - 9,6µ. Tramabilateral do tipo mediostrato, regular celuloso.Os esporos de A. blazei (acesso 01)apresentaram coloração hialina à sub-hialina,sub-esféricos a ovóides, com uma única membrana,dimensões: 6,0 - 10,8 x 5,5 - 8,4µ.Trama bilateral do tipo mediostrato regularceluloso (Fig. 6).Os esporos de A. blazei (acesso 02) apresentaramas mesmas características do acesso01 com diferenças nas dimensões dos esporos:4,8 - 9,6 x 4,3 -7,2µ. Em meio decultivo, o micélio de A. sylvaticus e de umdos acessos de A. blazei, apresentaram texturadelicada, paredes estreitas, denso, filamentosoe cotonoso. Já no segundo acesso,o micélio foi escasso, pouco denso e filamentoso(Figs. 3 a 5).A espessura do píleo e o vigor dos isoladossão um dos principais determinantes do graude qualidade do cogumelo.Estas pequenas diferenças entre os cogumelosestudados, são provavelmente devidoa fatores climáticos, utilizados no cultivo,como temperatura, luminosidade, umidade;o plantio em céu aberto, e a linhagem utilizada.Dentro de uma mesma espécie pode ocorrervariações na forma, coloração e tamanho dasestruturas macroscópicas e microscópicas, emdecorrência de fatores abióticos ou genéticos.Como conseqüência dessas variações pode, surgirnovas linhagens ou variedades dentro de umamesma espécie (Figs. 7 a 10).DefiniçãoFig. 08 - Pleurotus ostreatus var. chinesacultivado pela técnica “Jun Cao”adaptada pela Embrapa Recursos Genéticose Biotecnologia- Forma especial (f.sp): grupo de indivíduosdentro de uma variedade ou espécie,distinto dos outros, por umas tantas reaçõesfisiológicas. Designa uma qualidade diferenciada,distinta de outras espécies.- Linhagem: série sucessiva de gerações deum fungo.- Variedade: subdivisão das espécies quese fundamenta em pequenas diferenças noscaracteres distintivos dos indivíduos da mesmaespécie.Outros exemplos:- Pleurotus columbinus e Pleurotus sapidus,são sinônimos de P. ostreatus. P. columbinus,o píleo tem coloração azulada eP. sapidus, cor cremosa a bege ou marromclaro.- Singer propôs, que P. columbinus é umavariedade de P. ostreatus: P. ostreatus var.columbinus.- Literatura consultada: “Growing GourmetMedicinal Mushrooms” – Paul Stamets, 1993,pág. 314CONCLUSÃOFig. 07 - Pleurotus ostreatus (Cogumelo Ostra) cultivado pela técnica “Jun Cao”adaptada pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia1. Existe uma grande variabilidade genéticade cogumelos do gênero Agaricus nativos ecultivados em todo o mundo.2. As linhagens produzidas por esses cogumelossão resultados do tipo de substrato oudo composto utilizado, das condições climáticas,do local de cultivo e de mutação genéticaque pode ocorrer naturalmente ou78 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

5. Agaricus sylvaticus é sinônimo deAgaricus blazei. Os acessos analisadosde São Paulo é uma variedadede Agaricus blazei, podendo, portantoser denominado, Agaricus blazeivar. sylvaticus (Urben, 2005).6. Normalmente pequenas diferençasmorfológicas não justificam o enquadramentode uma nova espécie,dessa forma, Agaricus sylvaticus eAgaricus brasiliensis, são sinônimosde Agaricus blazei.REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICASFig. 09 - Pleurotus ostreatus var. H1 cultivado pela técnica “Jun Cao” adaptadapela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologiaartificialmente.3. Linhagens de alta qualidade, precisam satisfazeros seguintes critérios: micélio branco,denso, filamentoso, cotonoso, com fragrânciasuave e livre de contaminantes.4. Estudos químicos têm revelado que a concentraçãoelevada de nutrientes e de princípiosativos nos cogumelos está diretamenterelacionada com o tipo da linhagem utilizada,a qual exige condições especificas oudiversos fatores, como por exemplos:A)Fatores nutricionais (substâncias essenciaispara o desenvolvimento: carbono, nitrogênio,vitaminas e minerais).B)Fatores abióticos (umidade do compostoe da cobertura, temperatura, luminosidade,oxigênio, produtos químicos no ar, concentraçãode Co 2).C)Fatores bióticos (vírus, bactérias, actinomicetos,fungos, nematóides, insetos, ácarose genéticos).D) Fatores genéticos (natural ou artificial)E) Fatores inerentes ao processamento (colheita,secagem/ desidratação e estocagem).URBEN, A.F.;AMAZONAS, A.;, URI-ARTT, A.; CORREIA, M.; VIEIRA, W.Curso cultivo de cogumelos comestíveise medicinais. Brasília:Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia,1999. p. 105-122.AURORA, D. Mushroom demystified.2. ed. Berkeley: Ten SpeedPress, 1986. 959 p.BADO, L. C. Produccion de hongoscomestibles. In: VALOR nutritivoy toxicologia de los hongos. SanCristóbal de las Casas, México: [s.n.],1994. 108 p.CHANG, S. T.; HILES, P. G. The nutritionalattributes and medical valueof edible mushroom. In: EDIBLEmushrooms and their cultivation.[Boca Raton]: CRC Press, 1989. p. 27-40.HAYES, W. A.; WRIGTH, S. H. Ediblemushrooms. In: Rose, A. H. (Ed.).Economic microbiology: microbialbiomass. London: Academic Press,1979. p. 31-176.HOBBS, C. Medicinal mushrooms:an exploration of tradition, healing,& culture. Santa Cruz, Ca.: BotanicaPress, 1995. 252 p.MILES, P. G.; CHANG, S. T.Mushroom biology: concise basicsand current developments. Singapore:World Scientific, 1997. 194 p.URBEN, A. F.; OLIVEIRA, C. Cogumeloscomestíveis: utilização e fontesgenéticas. Revisão Anual de Patologiade Plantas, v. 6. p. 173-196, 1998.Fig. 10 - Pleurotus sapidus cultivado pela técnica “Jun Cao” adaptada pela EmbrapaRecursos Genéticos e BiotecnologiaZHANXI, L.; ZHANZHUA, L. Fungicultivation with Jun-Cao. Fuzhou:Asia-Pacific Cultivation Training Center,1995. 110 p.Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 79