Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 1

Padrões β-1,3 glucanasePadrões: a- fosforilase b (94,0 KDa); b- albumina bovina (67,0KDa); c- ovoalbumina (43,0 KDa); d- anidrase carbônica (30,0KDa); e- inibidor de tripsina de soja (20,1 KDa); f- α-lactoalbumina (14,0 KDa)Figura 4. Eletroforese da β-1,3 glucanase purificada em gel SDS-poliacrilamidadestilada e liofilizadas. A concentração de proteínadas soluções enzimáticas foi determinada comodescrito por Lowry et al. (1951), usando ovoalbuminacomo padrão. A atividade de β-1,3 glucanasefoi determinada como descrito anteriormente.Eletroforese da β-1,3 glucanase em gelSDS-poliacrilamidaAs frações com atividade de β-1,3 glucanase foramconcentradas por liofilização, ressuspendidas e aplicadasem gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamidaa 12% (SDS-PAGE), como descrito por Laemmli(1970). A eletroforese foi desenvolvida emduas etapas: a 80 V por aproximadamente 30 mine a 120 V por aproximadamente 2 h.Após a corrida eletroforética, os géis foram lavadostrês vezes por 20 min com uma solução fixadorade etanol (30%) e ácido acético (10%) emágua destilada. Em seguida, o gel foi corado comCoomassie Blue R250.A mistura padrão de proteínas, utilizada como parâmetropara determinar a massa molecular da β-1,3 glucanase, continha fosforilase b (94,0 KDa),albumina bovina (67 KDa), ovoalbumina (43,0KDa), anidrase carbônica (30,0 KDa), inibidor detripsina de soja (20,1 KDa) e α-lactoalbumina (14,0KDa).RESULTADOS E DISCUSSÃOProdução de β-1,3 glucanaseem frascos agitadosFoi obtido 1,12 U/mL de β-1,3 glucanase atravésda fermentação da linhagem C. cellulans 191, emfrascos agitados aletados, em meio de cultivoem tampão fosfato 0,2 M, pH 7,5, a 30 o C e200 rpm, após 24 h de incubação.Produção de β-1,3 glucanase em fermentador de 5L, em diferentes condições de aeraçãoA produção de β-1,3 glucanase pela linhagemC. cellulans 191 em meio de cultivo contendo1% de parede celular de levedura em tampãofosfato 0,2 M, pH 7,5, em fermentadorde 5 L, foi estudada em diferentes tempos defermentação; a 30 o C, 200 rpm e 1,5 e 3 vvmde aeração.Na fermentação da linhagem C. cellulans 191em fermentador de 5 L com 1,5 vvm deaeração, foi obtido máxima produção de β-1,3 glucanase após 24 h de fermentação (0,34U/mL). O pH do meio de cultivo praticamentenão apresentou variação durante afermentação.No cultivo do microrganismo em fermentadorde 5 L com 3 vvm de aeração, a β-1,3 glucanasefoi produzida no final da fase exponencial decrescimento atingindo atividade máxima de0,72 U/mL de β-1,3 glucanase após 24 h defermentação. O pH do meio de cultivotambém não apresentou variação significativadurante a fermentação.O presente estudo demonstra que maioresaerações são favoráveis para a produção daenzima. O aumento da aeração de 1,5 vvmpara 3 vvm na produção de β-1,3 glucanasepela linhagem C. cellulans 191 provocou umaumento de aproximadamente 2,12 vezes naatividade enzimática. No estudo com aeração de1,5 vvm foi obtido 0,34 U/mL de β-1,3 glucanaseapós 24 h de fermentação do microrganismo C.cellulans 191, indicando uma produçãoaproximadamente 3,1 vezes maior que a obtidanos estudos descritos por Ferro (2002); enquantoque no estudo de produção com aeração de 3vvm, foi obtida uma produção 5 vezes maior quea obtida por Ferro (2002).Nota-se também que a produção de β-1,3glucanase em frascos aletados foi superior 1,5vezes quando comparada à produção emfermentador. O tipo de agitação em frascosaletados e em fermentador são diferentes eparecem interferir diretamente na produção daenzima pela bactéria C. cellulans 191.Resultados similares foram relatados por Beshayet al. (2003) que estudou a produção de β-1,3glucanase por Bacillus sp. utilizando umalinhagem de E. coli recombinante. Foi obtidouma produção enzimática 1,03 vezes menor emfermentador de 3 L, quando comparado com oestudo de produção da enzima em frascosagitados.Purificação parcial de β-1,3 glucanaseEm estudo preliminar foi testado ofracionamento enzimático por precipitação comsulfato de amônio (40, 60 e 80% de saturação)da preparação bruta de β-1,3 glucanase obtidaatravés do cultivo de C. cellulans 191 em frascosagitados aletados. Nesta etapa a atividadeespecífica da preparação enzimática final foiinferior à atividade específica da preparaçãoenzimática inicial. Dessa forma, para apurificação da β-1,3 glucanase o extratoenzimático bruto foi aplicado diretamente nacoluna de troca iônica sem concentração préviacom sal.A purificação da β-1,3 glucanase da linhagem C.cellulans 191 foi conduzida em coluna de DEAE-Sephadex A50 equilibrada em tampão fosfato0,01 M, pH 6,5. A enzima foi eluída da resinautilizando tampão contendo 0,6 M de NaCl. Foiobtido um pico de β-1,3 glucanase (Figura 3), aqual foi purificada 11,92 vezes com umrendimento de 25% (Tabela 1).Diferentes métodos de purificação de β-1,3glucanases têm sido relatados. A β-1,3 glucanasede Oerskovia xanthineolytica TK-1 foi purificadaem coluna de DEAE-Sephacel, DEAE-Toyopearl650M e Bio-Gel P-2. A enzima foi purificada 21vezes e apresentou massa molecular estimadaem 40 KDa (Saeki et al., 1994).A β-1,3 glucanase de Oerskovia xanthineolyticaLL-G109 foi purificada em coluna HR 16/10 Q-Sepharose FF. Em eletroforese em gel SDS, aenzima apresentou massa molecular deaproximadamente 27,19 KDa (Parrado et al.,1996). Ferrer et al. (1996) prosseguiram osprocedimentos de purificação desta enzimaatravés de ultrafiltração e duas colunasconsecutivas de HR 16/10 Q-Sepharose FF emdiferentes valores de pH (pH 8,5 e 5,0).Thrane et al. (1997) purificou uma endo-β-1,3glucanase do filtrado de uma cultura deTrichoderma harzanium através de filtração emgel utilizando coluna Sephacryl S-300R e42 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37