Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 1

ciferases de elaterídeos e fengodídeossão muito menos propensas a mudançasde cor mediante mutações. Poucasmutações afetam os espectros de emissãodas luciferases emissoras de luzverde, e um número muito menor temum efeito dramático. A construção dequimeras com as isoenzimas do elaterídeoPyrophorus plagiophthalamus sugereque a região entre os resíduos 220-247 deve ter papel determinante para acor da bioluminescência nas luciferasesde elaterideos (Wood et al., 1990).Estudos de mutagênese sítio-dirigida daluciferase de Pyrearinus termitilluminansmostram que o espectro desta luciferaseé mais resistente a mudançasestruturais do que as luciferases de fengodídeos,embora ambas sejam pH-insensitivas(Viviani et al., 2001, 2002).As luciferases de fengodídeos. Nas luciferasesde fengodídeos emissoras deluz verde, poucas mutações tiveram efeitodramático no espectro. A construçãode quiméras com as luciferasesemissoras de luz verde e vermelha sugereque a conformação da região entreos residuos 220 e 344 tem importanteinfluência na cor da bioluminescênciaem fengodídeos (Viviani and Ohmiya,2000). Identificamos Arg215 comoum resíduo importante para a emissãode luz verde. Entretanto ainda não estáclaro se o papel deste resíduo está relacionadocom a estabilização do enolatoque emite luz verde, como sugeridopor Branchini e col (1998), ou com interaçõesimportantes para a manutençãoda estrutura do sítio ativo ou osdois processos (Viviani and Ohmiya,2000). Outro resíduo cuja substituiçãotem efeito dramático nos espectros daluciferases de fengodídeos emissoras deluz verde ou amarela é o resíduo T226.Foi proposto que Arg215 e Thr226 poderiaminteragir direta ou indiretamentepara manter uma conformação apropriadado sítio ativo para a emissão deluz verde (Viviani et. Al., 2002). Notavelmente,embora a substituição destesresíduos afete dramaticamente os espectrosdas luciferases verde e amarela, elasnão tem efeito na luciferase vermelhas,mostrando que R215 e T226 são funcionaisapenas para emissão de luz verde/amarela(Viviani et al., 2007). Estudosextensivos de mutagênese sítio-dirigidatambém mostraram que, com aexceção dos resíduos R215, Y224 eT226, a substituição de vários outrosresíduos ao longo da estrutura primáriada luciferase verde, inclusive de resíduosinvariáveis do sítio-ativo, não afetamou afetam apenas moderadamenteos espectros de bioluminescência destaluciferase, enquanto nenhuma substituiçãoaté agora afetou os espectrosda luciferase vermelha (Viviani et al.,Figura 5. Sequencias de amino-ácidos das luciferases emissoras de luzvermelha (PxRE) e verde (PxGR) clonadas a partir das larvas trenzinhoPhrixotrix spp (Viviani et al., 1999)2006, 2007). No conjunto estes resultadossugerem que a estrutura do sítioativo da luciferase verde seja mais estabilizadado que aquela da luciferase vermelha,e que a explicação para estasdiferenças de espectros de bioluminescênciaesteja mais relacionada a mudançasconformacionais durante a etapade emissão, do que na composiçãode resíduos do sítio-ativo.A sensibilidade ao pH.Após a clonagem de várias luciferasesde fengodídeos e de elaterídeos (Vivianiet al., 1999 a ,b; 2000), identificamosum conjunto de resíduos conservadosque diferem entre as luciferases pHdependentese as luciferase pH-independentes,que poderiam estar envolvidoscom o efeito pH (Fig. 5) (Vivianiet al., 1999b). Entre estes o resíduo 226(Thr em elaterídeos e fengodídeos e Asnnas luciferases de lampirídeos) constitueum resíduo-chave para emissão deluz verde-amarela (Viviani et al., 2001).O resíduo Gly247 em luciferases pHdependentese o respectivo Ala243 naspH-independentes afetam sensivelmentea sensibilidade ao pH, provavelmentepor interferirem com a flexibilidade desegmentos importantes no sítio ativo dasluciferases (Viviani et al., 2002). Entretanto,até pouco tempo, nenhum resíduotransformou uma luciferase pH-insensitivaem pH-sensitiva. Nossos resultadossugerem que o sítio ativo das luciferasespH-independentes é mais rígidograças a estabilização por forçashidrofóbicas gerando apenas uma espécieemissora. O sítio-ativo das luciferasesde lampirídeos é mais flexível ehidrofílico podendo originar duas espéciesemissoras dependendo de suaconformação (Viviani et. al., 2001).Mais recentemente, com a clonagemde duas luciferases pH-sensitivasde vagalumes brasileiros, inclusivea luciferase de Macrolampis que naturalmenteapresenta um espectro bimodal,identificamos que a substituiçãoE354N determina o aparecimento doombro no vermelho no espectro (Vivianiet al., 2005).A partir de estudos de modelagem e mutagênesesítio-dirigida, começamos aidentificar os resíduos que participamna determinação da sensibilidade aopH. Identificamos uma rede de resíduosque interagem entre sí por pontesde hidrogênio e pontes salinas que nasluciferases pH-sensitivas atuaria comouma comporta para o sítio-ativo (Vivianiet al., 2008) (Fig.9). Em especial, verificamosque vários resíduos que afetamos espectros de emissão estão localizadosno loop entre os resíduos 223-235 (Viviani et al., 2007) (Fig.8). Este loopatua como uma presilha que fixa partesdo sítio de ligação da luciferina, atravésdas ligações de hidrogênio dos re-12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37