Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 1

fosfopanteteina posicionada próximaao sítio de ligação do AMP(Gulick et al., 2003). Evidênciassugerem que a ligação da CoApromova a rotação do domínioC-terminal.Estudos de modelagem (Branchiniet al., 1998; Sandalova e Ugarova,1999), mutagênese sítio-dirigidae mais recentemente a resoluçãoda estrutura tridimensionalda luciferase na presença doanálogo DLSA revelou a identidadedos resíduos do sítio de ligaçãoda luciferina (Fig.6). A fotooxidaçãocom um análogo deluciferina e estudos de mutagênesemostraram que o peptídeo244HHFG245 está em proximidadeda luciferina (Branchini et al.,1997). Evidências indiretas tambémforam obtidas baseadas nasestruturas tridimensionais da fenilalaninasintetase com ATP e fenilalanina(Conti et al., 1997) e daluciferase de Photinus pyralis empresença do inibidor competitivoda luciferina, bromofórmio(Franks et al., 1998). Baseadosnestas informações dois modelosde sítio ativo foram propostos.Estes modelos em geral concordamentre sí, embora algumasdiferenças importantes sejam evidentes.De acordo com um dosmodelos, o resíduo Arg218 é aparentementeimportante para a estabilizaçãodo fenolato da luciferina(Branchini et al., 1998), enquantoque no outro modelo, oresíduo Arg337 está mais próximodo fenolato para fazer esta interação(Sandalova e Ugarova, 1999). A resoluçãoda estrutura tridimensional daluciferase de Lucíola cruciata na presençade DLSA e de oxilucifeina comAMP mostrou que a isoleucina 288 estápróxima do grupo fenolato do anel benzotiazólico,criando um microambientehidrofóbico e rígido, apropriado para aemissão de luz verde (Nakatsu et al.,2006).Determinantes estruturais dosespectros de bioluminescênciaA variedade de cores da bioluminescênciaencontrada nos besouros é atribuívelessencialmente às diferentes luciferases,desde que as luciferinas sãoidênticas nas três famílias. As luciferasesde coleópteros elateroides dividemseem dois grupos de acordo com asensibilidade espectral ao pH (Vivianiand Bechara, 1995): (I) as luciferasespH-sensitivas que incluem as luciferasesde lampirídeos, sofrem deslocamentobatocrômico mediante abaixamentoFigura 4. (Painel superior) Larva trenzinhoPhrixotrix hirtus, (Painel inferior) colônias debactérias E. Coli tornadas bioluminescentesapós transformação com plasmídeos contendoos cDNAs clonados das luciferases emissorasde luz verde e vermelha de Phrixotrix.de pH, aumento de temperatura e concentraçãode cátions (Seliger and McElroy,1964) e (II) luciferases pH-insensitivasque incluem as luciferases de fengodídeose elaterídeos, que não sofremdeslocamento batocrômico mediante diminuiçãodo pH, aumento da concentraçãode cátions de metais pesados divalentesou aumento de temperatura (Vivianiand Bechara, 1995).Mecanismos de modulação de coresde bioluminescência. Em princípio ascores da bioluminescência são governadasa nível de sítio ativo das luciferasespor tres fatores estruturais (Fig. 7):(1) efeitos não-específicos como polaridade(DeLuca, 1969) e polarização orientadado sítio ativo (Ugarova, 2000),determinada pela natureza dos resíduosque o compõem; (2) efeitos específicosde interação de resíduos ácidobásicosno sítio ativo das luciferasescom a oxiluciferina (White & Branchini,1975). O processo de tautomerizaçãoda oxiluciferina excitada na presençade resíduos básicos foi originalmenteproposto (a forma cetônica emite luzvermelha e a forma enólica emiteluz verde-amarela), entretanto, recentementeexperimentos com oadenilato do 5,5 dimetil-análogoda luciferina mostraram que a formacetônica pode emitir tanto luzverde-amarela como vermelha, tornandoa hipótese da tautomerizaçãoimprovável (Branchini etal., 2002); (3) a rotação dos anéistiazínicos da oxiluciferina em tornoda ligação C 2-C 2', que está emfunção da geometria do sítio ativo(McCapra et al.,1994) (Fig.6).Mais recentemente foi propostoque a delocalização de cargas naforma ceto-aniônica constitue fatordeterminante para os espectrosde bioluminescência (Branchiniet al., 2004). Estudos teóricosapoiam parcialmente esta últimahipótese, sugerindo que ocontrole exercido pelo microambienteda luciferase no grau depolarização dos grupos fenolatoe ceto-enol determina os espectrosde bioluminescência (Orlovaet al., 2004). Através de deconvoluçãoespectral, Ugarova e col.(2005) sugeriu a existência de trêsespécies emissoras que contribuiriamnos espectros de bioluminescênciadas luciferases de lampirídeos:(ceto-fenolato) que emitirialuz vermelha; (enol/fenolato)emissor de luz laranja e (enolato/fenolato)o emissor de luz verde.Estudos com a quimioluminescênciade adenilato de luciferinaem meio aquoso e na presençade soroalbumina bovina sugeremque a bioluminescência vermelha requerum microambiente menos estruturadoque a bioluminescência verde(Viviani e Ohmiya, 2006).As luciferases de lampirídeos. A maioriados estudos de estrutura e funçãotem utilizado principalmente as luciferasesde lampirídeos. A construção dequimeras entre as luciferases de lampirídeosrevelou que a região entre osresíduos 209-318 é determinante dascores nas luciferases de lampirídeos(Ohmiya et al., 1986). Entretanto, a mutaçãode vários resíduos isolados ao longoda estrutura primária das luciferasesde lampírideos afeta drasticamente a corda bioluminescência, em geral resultandoem mutantes vermelhos (Kajiyama& Nakano, 1991). A mutação de váriosresíduos conservados do sítio-ativo,entre os quais R218, H245, T343, tambémteve efeitos dramáticos nos espectrosde bioluminescência das luciferasesde lampirídeos (Branchini et al.,1998,2000, 2003).As luciferases pH-insensitivas. As lu-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 11