Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 1

Tabela 03: Análise das médias de expressão positiva de anti-vimentina nas culturasdurante 2 semanas de cultivo:DISCUSSÃOA cultura em gel de alginato de sódio,embora não tenha proporcionado a proliferaçãocelular, possibilitou a formaçãode matriz pericelular com colágeno tipoII (resultado não mostrado). Por não sero ambiente próprio dos condrócitos,essas células apresentaram ao longo dacultura diminuição de suas viabilidadescelulares, tanto pelo método de marcaçãocom anexina V e iodeto de propídeoquando analisados tanto por citometriade fluxo, quanto com o coranteIlustração 07: Média da viabilidade celulare de cultura de CTM duas últimassemanas de cultivo. Linha azul: viabilidade celular feita por citometria de fluxoe marcação com anexina V e iodeto de propídeode viabilidade (azul de Tripan) na Câmarade Neubauer. A diminuição da viabilidadecoincidiu com a alta incidênciade morte celular, tanto por apoptosequanto por necrose, pois no final dacultura observamos mais de 60% deapoptose precoce, 73% de necrose e 35%de apoptose tardia ou necrose secundária.Quanto a progressão da apoptose,embora tenha diminuído pouco duranteo cultivo, ainda se apresentou altaao final deste, nos fazendo consideraro meio (hidrogel) ao qual essas célulasestão sendo expostas. Os mais prováveisfatores de interferência são: dificuldadedo meio de cultura e nutrientesem chegar as células dentro do alginatode sódio, dificuldade das toxinas celularesliberadas saírem do gel, falta deestímulo de crescimento, como o TGF âou problemas de manipulação durantea coleta e processamento da cartilagem.Para essa cultura, o índice apoptóticocomprova que as células, se re-implantadascom a finalidade de corrigir defeitosno tecido cartilaginoso, não atingiriamseus objetivos, uma vez que com aviabilidade baixa e grau de morte celularalto elas seriam incapazes de regenerarlesões. A avaliação dos parâmetrosanalisados neste trabalho deve serrefeita durante a realização de novocultivo celular em outros materiais hidrogeis,ou num alginato de sódio demenor concentração, assim como colocarjunto ao meio, fatores de crescimentoextras.O método pelo azul de tripan, emboraneste estudo tenha se mostrado tão eficazquanto os marcadores de morte celularpor citometria de fluxo, não permite identificaraquelas células que estão entrando emprocesso apoptótico.Pelos resultados aqui apresentados, sugerimosque os testes de viabilidade celular devemser feitos sempre durante o cultivo decondrócitos em matriz tridimensional. E sempreque a viabilidade celular diminuir, sugere-sefazer a curva de morte celular, principalmentepor apoptose, para tentar corrigiros erros do cultivo.Já a cultura em monocamada de célulasmononucleadas da medula óssea proporcionoua proliferação celular, e o aumento dasCTMs no cultivo.A diminuição da viabilidade total das célulasem cultura, e o aumento da apoptose (confirmadapelo aumento da marcação com anexinaV) se mostram compatíveis. A partir domomento em que o meio de cultura usadoserve para estimular o crescimento das CTM,é compreensível que vejamos diminuição dacompetição negativa proporcionada pelascélulas mononucleadas através da diminuiçãoda viabilidade total das células. Ao mesmotempo, a progressão do aumento daapoptose confirma tal resultado.A proliferação máxima das CTM ocorreudurante a terceira semana de cultivo, apósterceira passagem. Essa proliferação celularestá de acordo com a diminuição da mortecelular, tanto por apoptose quanto por necrose,observadas atráves da diminuição progressivada marcação com anexina V e iodetode propídeo. Na quarta semana observouseuma menor expressão de vimentina pelascélulas em cultura. Essa expressão diminuídapode estar relacionada com perda de fenótipopelas células (o que ocorre devidoao número de passagens) e não com a mortedas células, pois não há indício de aumentodos marcadores de morte celular naquarta semana. A partir da observação dograu de apoptose celular dessa cultura, sugere-seque a diferenciação celular ocorrana terceira semana, ponto em que as CTMssão em sua maioria homogêneas e o índicede apoptose/morte celular está diminuindoconsideravelmente.Tal perda de fenótipo das CTMs vem sidoamplamente estudada e discutida na literaturacomo nos relatos de Javazon, E. (2004).Por um lado as passagens (repiques) comtripsina estimulam o crescimento, e por outro,ao estimular a taxa de proliferação, estimulatambém mutações no DNA celular oque pode levar a perda do fenótipo pelacélula e diminuição da atividade das telomerases– enzimas responsáveis por manter ostelômeros celulares com tamanho suficientepara a célula não entrar em senescência.A pesquisa de CTMs elevou-se, somente, nosúltimos quatro anos, e ainda é difícil achartrabalhos coerentes, principalmente, em relaçãoa caracterização e expansão dessascélulas. Por falta de informação base (o queestá começando a ser produzido e divulga-74 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37