Sistema de teste de vasculite auto-imune Plus - ZEUS Scientific

APLICAÇÃO
O sistema de teste de vasculite auto-imune Plus AtheNA Multi-Lyte ®
da Zeus Scientific, Inc. destina-se à detecção qualitativa e semiquantitativa de
anticorpos da classe IgG contra três antigénios diferentes (membrana basal glomerular, mieloperoxidase e proteinase 3) em soro humano. O sistema
de teste deve ser utilizado como um meio auxiliar no diagnóstico de diversas vasculites auto-imunes caracterizadas por níveis elevados de autoanticorpos
seleccionados. A MPO e/ou a PR3 podem estar associadas a doenças auto-imunes, como a granulomatose de Wegener, a glomerulonefrite
crescente idiopática, a MPA e a PRS. Os anticorpos anti-membrana basal glomerular (GBM) ajudam no diagnóstico da síndrome de Goodpasture.
Estes testes devem ser utilizados exclusivamente no diagnóstico in vitro.
SIGNIFICADO E CONTEXTO
O anticorpo anti-citoplasma de neutrófilos (ANCA) foi inicialmente descrito por Davies, et al em 1982 (1). Desde esta descoberta inicial, foi descoberta a
associação de ANCA a diversas vasculites sistémicas (VS). Hoje em dia, reconhece-se que os ANCA contêm duas especificidades primárias: C-ANCA
dirigido contra a proteinase 3 (PR3) e P-ANCA dirigido contra a mieloperoxidase (MPO). O teste de ambos, P-ANCA e C-ANCA, é altamente
recomendado nos exames laboratoriais de doentes que apresentem sinais clínicos sugestivos de vasculites sistémicas. As síndromes clínicas mais
frequentemente associadas aos ANCA são:
Granulomatose de Wegener (2)
Poliarterite (3)
Vasculite de sobreposição (“overlap”) (4)
Glomerulonefrite crescente idiopática (GCI) (5)
Doença de Kawasaki (6)
Doenças renais auto-imunes, tais como a síndrome de Goodpasture (7)
Apesar de a identificação inicial de C-ANCA e P-ANCA se basear em procedimentos de imunofluorescência indirecta, a identificação e purificação
subsequentes da PR3 e da MPO resultaram no desenvolvimento de imunoensaios enzimáticos (ELISA) e imunoensaios baseados em micropartículas,
tanto para a PR3 como para a MPO.
A síndrome de Goodpasture caracteriza-se por hemorragia pulmonar, insuficiência renal e pela presença de anticorpos anti-GBM (8). Na síndrome de
Goodpasture, uma parte do domínio globular das cadeias de colagénio IV é antigénico e responsável pelo desenvolvimento de anticorpos anti-GBM na
glomerulonefrite progressiva (9, 10, 11).
PRINCÍPIO DO SISTEMA DE TESTE de vasculite auto-imune Plus AtheNA Multi-Lyte
O sistema de teste de vasculite auto-imune Plus AtheNA Multi-Lyte da Zeus Scientific, Inc. foi concebido para detectar anticorpos da classe IgG em
soro humano contra a MPO, a PR3 e a GBM. O procedimento de teste envolve duas etapas de incubação:
1. Os soros de teste (devidamente diluídos) são incubados num recipiente contendo uma mistura múltipla da suspensão de esferas. Esta suspensão
contém uma mistura de conjuntos diferenciáveis de microesferas de poliestireno, em que cada conjunto é conjugado com um antigénio diferente.
Se existirem anticorpos específicos nos soros do doente, estes ligar-se-ão aos antigénios imobilizados em um ou mais dos conjuntos de esferas.
As microesferas são lavadas para remover proteínas séricas não reactivas.
2. É adicionado ao recipiente de reacção um conjugado de ficoeritrina com IgG (γ específica de cadeia) de cabra anti-humana e a placa é incubada.
No passo 1, o conjugado irá reagir com o anticorpo IgG imobilizado na fase sólida. A suspensão de esferas é, em seguida, analisada pelo
instrumento AtheNA Multi-Lyte. O(s) conjunto(s) de esferas é(são) separado(s) (identificados) e é determinada a quantidade de molécula
indicadora (conjugado de PE) para cada um dos conjuntos de esferas. Com a Intra-Well Calibration Technology ®
, utilizam-se conjuntos de esferas
de calibração interna para converter a fluorescência em bruto em resultados (unidades).
COMPONENTES DO KIT
Reagentes reactivos: (Todos os reagentes reactivos contêm azida de sódio como conservante na concentração de 0.1% p/v.)
1. Suspensão de esferas múltipla. Pronta a usar, frasco de 5,5 mL. A suspensão contém esferas de poliestireno diferenciáveis e individuais de 5,6
µm conjugadas com os seguintes antigénios: mieloperoxidase (MPO), proteinase 3 (PR3) e membrana basal glomerular. A mistura de esferas
contém ainda um conjunto de esferas destinado a detectar anticorpos não específicos na amostra do doente (caso estejam presentes) e quatro
conjuntos de esferas separados usados para calibração do ensaio.
2. Conjugado de ficoeritrina com anticorpo IgG (γ específico de cadeia) de cabra anti-humano. Pronto a usar, frasco âmbar de 30 mL.
3. Controlo positivo de soro humano. Dois, frascos de 0,2 mL.
4. Controlo negativo de soro humano. Um, frasco de 0,2 mL.
5. SAVe Diluent ®
. Um frasco de 50 mL contendo soro fisiológico com tampão fosfato. Pronto a usar. OBSERVAÇÃO: O diluente mudará de cor na
presença de soro.
Sistema de teste de vasculite
auto-imune Plus
Um imunoensaio múltiplo (multiplex) à base de micropartículas para detecção de
anticorpos contra antigénios da membrana basal glomerular, da MPO e da PR3
Número do produto: A96101
6. Concentrado de tampão de lavagem: Dilua 1 parte do concentrado + 9 partes de água desionizada ou destilada. Um frasco de 50 mL contendo
concentrado 10X de soro fisiológico com tampão fosfato.
Componentes não reactivos:
1. Uma placa de diluição em polivinilo com 96 poços.
2. Uma placa de filtração com 96 poços para lavagem de microesferas.
3. Etiquetas de dados: Existe uma etiqueta aderente à tampa interna da caixa do kit e outra no interior da caixa do kit.
4. Folheto informativo com as instruções de utilização.
5. CD de calibração. Um CD que contém todos os valores de calibração do kit específicos do lote necessários para a análise da amostra e o controlo
de qualidade do ensaio.
ADVERTÊNCIAS
1. ATENÇÃO! POTENCIAL PERIGO BIOLÓGICO: Os controlos contêm material de origem humana. Os materiais de origem a partir dos quais estes
produtos foram derivados foram analisados por métodos de teste aprovados pela FDA e obtiveram resultados negativos para o antigénio VIH-1, o
HbsAg e anticorpos contra o VHC e o VIH. Contudo, como nenhum método de teste pode dar total garantia da ausência de agentes infecciosos,
estes produtos devem ser manuseados no Nível de Segurança Biológica 2, conforme recomendado para qualquer amostra de soro ou sangue
humano potencialmente infecciosos no manual “Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories”: edição actual (12) dos Centers for
Disease Control/National Institutes of Health e na Norma da OSHA relativa a Agentes Patogénicos Transmissíveis pelo Sangue (13). As
1

microesferas conjugadas do sistema de teste AtheNA Multi-Lyte Plus não contêm organismos viáveis. Contudo, o reagente deve ser considerado
como POTENCIAL PERIGO BIOLÓGICO e manuseado em conformidade.
2. Atenção: A azida de sódio pode reagir com a canalização de cobre e chumbo e formar azidas metálicas explosivas. Elimine os reagentes
juntamente com um grande volume de água para impedir a acumulação de azidas, caso esteja a proceder à eliminação para um esgoto em
conformidade com os requisitos nacionais e europeus.
3. Deve-se seguir as precauções normais relativas ao manuseamento de reagentes laboratoriais ao executar-se o ensaio AtheNA Multi-Lyte Plus.
Em caso de contacto com os olhos, lave imediatamente com água em abundância e consulte um médico. Use vestuário protector, luvas e
protecção ocular/facial adequados. Nunca pipete com a boca. Evite o contacto dos reagentes e amostras de doentes com a pele e as membranas
mucosas. Não inale os vapores. Elimine os materiais perigosos ou biologicamente contaminados de acordo com as práticas da sua instituição.
Elimine todos os materiais de forma segura e aceitável e em conformidade com todos os requisitos nacionais e europeus.
Precauções relativas ao procedimento:
1. Exclusivamente para diagnóstico in vitro.
2. A diluição ou a adulteração destes reagentes pode originar resultados erróneos.
3. Não se deve usar reagentes de outras origens ou fabricantes.
4. A suspensão de esferas e o conjugado são reagentes sensíveis à luz. Ambos foram embalados em recipientes que protegem contra a luz. As
exposições normais ocorridas no decurso da execução do ensaio não afectarão o desempenho do ensaio. Não exponha desnecessariamente
estes reagentes a fontes de luz visível e intensa.
5. Para optimizar os tempos de leitura, a suspensão de esperas tem de ser bem misturada imediatamente antes de ser utilizada. A forma mais eficaz
de ressuspender as esferas consiste em misturar primeiro a suspensão de esferas no agitador vórtex durante aproximadamente 30 s, seguido
pela sonicação da suspensão de esferas durante 30 s num pequeno sonicador (banho de ultra-sons).
6. Nunca pipete com a boca. Evite o contacto dos reagentes e amostras de doentes com a pele e as membranas mucosas.
7. Evite a contaminação microbiana dos reagentes. Poderão ocorrer resultados incorrectos.
8. A contaminação cruzada dos reagentes e/ou amostras pode originar resultados erróneos.
9. A adesão estrita ao tempo e à temperatura de incubação especificados é fundamental para a exactidão dos resultados. Todos os reagentes
devem atingir a temperatura ambiente (20-25 °C) antes do início do ensaio. Volte a refrigerar os reagentes não usados imediatamente após a
utilização.
10. Evite salpicos ou a formação de aerossóis.
11. Trate a solução de resíduos com lixívia de uso doméstico a 10% (hipoclorito de sódio a 0,5%). Evite a exposição dos reagentes aos vapores da
lixívia.
12. Não exponha nenhum dos reagentes reactivos a soluções com lixívia nem a odores fortes de soluções que contenham lixívia. Quantidades
vestigiais de lixívia (hipoclorito de sódio) podem destruir a actividade biológica de muitos dos reagentes reactivos incluídos neste kit.
CONDIÇÕES DE CONSERVAÇÃO
1. Conserve o kit não aberto a 2-8 °C.
2. Suspensão de esferas múltiplas: conserve a 2-8 °C. Retire apenas a quantidade de solução necessária para analisar as amostras a serem
testadas e volte a refrigerar o produto não usado a 2-8 °C.
3. Conjugado de ficoeritrina com anticorpo de cabra anti-humano: conserve a 2-8 °C.
4. Controlos humanos: conserve a 2-8 °C.
5. SAVe Diluent: conserve a 2-8 °C.
6. Concentrado de tampão de lavagem (10X): conserve a 2-25 °C. O tampão de lavagem diluído (1X) mantém-se estável no máximo 7 dias à
temperatura ambiente (20-25 °C) ou durante 30 dias a 2-8 °C.
COLHEITA DE AMOSTRAS
Recomenda-se que a colheita de amostras seja feita de acordo com o documento M29: Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease (14)
do NCCLS/CLSI. Nenhum método de teste conhecido pode oferecer total garantia de que amostras de sangue humanas não transmitirão infecção.
Portanto, todos os derivados do sangue devem ser considerados como potencialmente infecciosos.
Neste ensaio, só se deve utilizar soros recém-colhidos e devidamente conservados obtidos através de procedimentos de punção venosa assépticos e
aprovados. Não se deve adicionar anticoagulantes nem conservantes. Não utilize soros hemolisados, ictéricos, lipémicos ou contaminados
bacteriologicamente. Conserve a amostra à temperatura ambiente durante um período não superior a 8 h. Se o teste não for realizado no prazo de 8 h,
os soros podem ser conservados a 2-8 °C durante não mais de 48 h. Caso se prevejam atrasos no teste, os soros deverão ser conservados a uma
temperatura igual ou inferior a -20 °C. Evite múltiplos ciclos de congelação/descongelação que poderão resultar na perda de actividade dos anticorpos
e originar resultados erróneos. Os recipientes de amostras devem ser bem fechados antes de serem guardados. Para a congelação, recomenda-se a
utilização de tubos autovedantes estanques. Sempre que possível, evite utilizar congeladores com autodescongelação devido ao perigo de dessecação
das amostras.
PROCEDIMENTO DO ENSAIO
Materiais necessários mas não fornecidos:
1. Sistema AtheNA Multi-Lyte (instrumento Luminex ®
)
2. Pipetas com capacidade para distribuir exactamente 10 a 200 µL
3. Pipetas multicanal com capacidade para distribuir exactamente (10-200 µL)
4. Reservatórios de reagentes para pipetas multicanal
5. Pipetas serológicas
6. Pontas de pipetas descartáveis
7. Temporizador de laboratório para monitorizar as etapas da incubação
8. Água destilada ou desionizada
Preparação do ensaio:
Retire cada um dos componentes do armazenamento e deixe-os atingir a temperatura ambiente (20-25 °C). Determine o número total de controlos e
amostras a serem testados. É necessário incluir o controlo negativo e os controlos positivos em cada execução do ensaio. O controlo negativo deve ser
testado no poço A1. O controlo positivo 1 deve ser testado no poço B1 e o controlo positivo 2 deve ser testado no poço C1. Cada controlo e cada
amostra necessitam de um micropoço para processamento.
Observação 1. Para optimizar os tempos de leitura, a suspensão de esperas tem de ser bem misturada imediatamente antes de ser utilizada. A
forma mais eficaz de ressuspender as esferas consiste em misturar primeiro a suspensão de esferas no agitador vórtex durante
aproximadamente 30 s e depois sonicar a suspensão durante aproximadamente 30 s num pequeno sonicador (banho de ultra-sons).
2

Observação 2. Para um desempenho adequado, é importante que o conteúdo do ensaio seja bem misturado. O modo adequado para a mistura inclui
misturar a placa num agitador de placas durante aproximadamente 30 s a cerca de 800 RPM ou aspirar e expulsar repetidamente
(encher e esvaziar) o conteúdo do poço, durante um mínimo de 5 ciclos, com um pipetador com cerca de ½ do volume.
Incubação do soro
1. Prepare uma diluição de 1:21 do controlo negativo, dos controlos positivos e de cada um dos soros do doente. (Exemplo: Combine 10 µL de soro
com 200 µL de diluente de amostras.) O diluente de amostras sofrerá uma alteração de cor que confirma que a amostra foi combinada com o
diluente. Para um desempenho adequado, é importante que as diluições das amostras sejam bem misturadas. Misture de acordo com a
Observação 2 anterior.
2. Depois de determinar o número total de poços a processar, utilize um pipeta multicanal ou de repetição para distribuir 50 µL da suspensão de
esferas em cada um dos poços da placa de filtração.
3. Transfira 10 µL de cada amostra diluída (1:21) e controlo da placa de diluição para a placa de filtração. Para um desempenho adequado, é
importante que as diluições das amostras e a suspensão de esferas sejam bem misturadas. Misture de acordo com a Observação 2 anterior.
4. Incube a placa à temperatura ambiente (20-25 °C) durante 30 +/- 10 min.
5. Após a incubação, lave as esferas por filtração a vácuo utilizando o tampão de lavagem fornecido diluído numa concentração 1X.
a. Coloque a placa de filtração no distribuidor de vácuo e retire a solução, deixando as esferas para trás.
b. Desligue o vácuo e adicione 200 µL de tampão de lavagem diluído (1X).
c. Aplique o vácuo e remova a solução.
d. Repita os passos 5.b e 5.c para um total de três lavagens com o tampão de lavagem diluído (1X).
6. Após a lavagem final, absorva o excesso de líquido da base da placa de filtração e deixe-a secar ao ar durante 3-5 min. antes de prosseguir para
o passo seguinte.
Incubação do conjugado
1. Adicione 150 µL da solução do conjugado a cada poço, à mesma velocidade e pela mesma ordem de adição das amostras. Para um desempenho
adequado, é importante que a solução do conjugado e a suspensão de esferas sejam bem misturadas. Misture de acordo com a Observação 2
anterior. Opcionalmente, enquanto se mistura o conjugado, pode transferir-se a mistura de esferas e conjugado para poços vazios de uma placa
de reacção em poliestireno.
2. Incube a placa à temperatura ambiente (20-25 °C) durante 30 +/- 10 min.
Análise da amostra
OBSERVAÇÃO: Para uma correcta análise da amostra, é importante que o instrumento esteja configurado e calibrado e seja mantido de acordo com
as instruções do fabricante. Reveja a preparação do instrumento no respectivo manual antes de ler os resultados do ensaio.
1. Configure o instrumento AtheNA Multi-Lyte para analisar as reacções seleccionando o modelo AI Vasculitis Plus. Consulte no manual do
utilizador mais pormenores relativos ao funcionamento do instrumento AtheNA Multi-Lyte. Os resultados podem ser lidos a partir de uma placa de
filtração ou de reacção.
2. A placa deve ser lida no prazo de 60 minutos após a conclusão da incubação do conjugado. Poderá optar-se por agitar a placa durante
aproximadamente 15 s antes da leitura. Este passo opcional pode reduzir a quantidade de tempo necessário para ler a placa.
PROTOCOLO DE ENSAIO RESUMIDO:
Passo Procedimento
1 Dilua as amostras numa proporção de 1:21 em diluente de amostras. Misture bem.
2 Combine 50 µL de suspensão de esferas e 10 µL de amostra diluída num poço vazio. Misture bem.
3 Incube à temperatura ambiente durante 30 +/- 10 min.
4 Lave as microesferas 3X com tampão de lavagem 1X.
5 Absorva o excesso de líquido da base da placa e deixe-a secar ao ar durante 3-5 min.
6 Adicione 150 µL de conjugado a cada poço. Misture bem.
7 Transfira para uma placa de reacção (opcional).
8 Incube à temperatura ambiente durante 30 +/- 10 min.
9 Agite a placa (opcional).
10 Leia os resultados no prazo de 60 min.
CONVERSÃO DA FLUORESCÊNCIA EM VALORES UNITÁRIOS
A. Cálculos:
1. Calibração do ensaio
O sistema de teste AtheNA Multi-Lyte Plus utiliza a tecnologia Intra-Well Calibration Technology. A Intra-Well Calibration Technology inclui uma curva
padrão com vários pontos dentro da suspensão de esferas. Com a Intra-Well Calibration Technology, cada poço do ensaio é calibrado internamente
sem necessidade de intervenção do utilizador. A curva padrão foi concebida para se auto-ajustar com base nas características únicas do soro do
doente ou do soro de controlo. Os valores do calibrador são atribuídos a padrões internos pela Zeus Scientific, Inc. Estes valores são específicos do
lote e são codificados no CD de calibração específico do lote fornecido na caixa do kit.
2. Valores de “cut-off” dos analitos
Foi atribuído a cada analito do sistema de teste AtheNA Multi-Lyte Plus um valor de “cut-off”. Os valores de “cut-off” são determinados pela Zeus
Scientific, Inc. para cada lote do kit e são codificados no CD de calibração específico do lote fornecido na caixa do kit.
3. Cálculos
Através da Intra-Well Calibration Technology, todos os cálculos são automaticamente realizados quando se utiliza o sistema AtheNA Multi-Lyte. A
Intra-Well Calibration Technology efectua uma análise de regressão dos padrões internos e, em seguida, ajusta os valores unitários calculados com
base num padrão adicional e nas características da amostra de soro.
B. Interpretações:
Interpretação dos resultados do sistema de teste de vasculite auto-imune Plus:
Os valores unitários das amostras para a GBM, a MPO e a PR3 são interpretados da seguinte forma:
Valor unitário
Amostras negativas < 100 UA/mL
3

Amostras positivas > 120 UA/mL
Amostras ambíguas 100 a 120 UA/mL
CONTROLO DE QUALIDADE
1. É necessário incluir em todas as execuções do ensaio o controlo negativo (no poço A1), o controlo positivo 1 no poço B1 e o controlo positivo 2 no
poço C1.
2. A validade da execução é determinada pelo desempenho dos controlos positivos e negativos. Estes critérios foram analisados automaticamente
através da Intra-Well Calibration Technology.
a. O controlo negativo e o controlo positivo têm de ser todos negativos na esfera de antigénio de controlo ou não específica.
b. O controlo negativo tem de ser negativo para cada um dos analitos incluídos na suspensão de esferas múltiplas.
c. Os controlos positivos têm de ser positivos para um grupo predeterminado de analitos incluídos na suspensão de esferas multiplexada.
Estes intervalos estão codificados no CD de calibração.
d. Se algum dos critérios acima definido não for cumprido, toda a execução será considerada inválida e deverá ser repetida.
3. A validade da amostra baseia-se nas características das esferas de calibração e nas suas interacções com os soros dos doentes. São vários os
parâmetros monitorizados automaticamente através da Intra-Well Calibration Technology. Se algum dos critérios acima definido se encontrar fora
das especificações, os resultados do doente são considerados inválidos e devem ser repetidos. Se tal ocorrer, o relatório de dados indicará
especificamente a amostra que foi invalidada, bem como um código de resolução de problemas.
4. Podem ser testados outros controlos de acordo com as orientações ou requisitos das regulamentações nacionais e/ou europeias ou organizações
de acreditação. Os controlos externos têm de ser representativos de soro humano normal uma vez que o sistema de calibração do AtheNA Multi-
Lyte Plus se baseia parcialmente nas características da amostra de soro. Se a formulação da amostra for artificial (não for soro humano), os
resultados poderão ser erróneos.
5. Consulte o documento C24 do CLSI: Statistical Quality Control for Quantitative Measurements para obter orientações sobre práticas de CQ
adequadas.
LIMITAÇÕES
1. O sistema de teste AtheNA Multi-Lyte Plus é um meio auxiliar de diagnóstico, que, por si só, não tem capacidade de diagnóstico. Os resultados
do teste devem ser interpretados em conjunto com a avaliação clínica e os resultados de outros procedimentos de diagnóstico.
2. As amostras hemolíticas, ictéricas ou lipémicas podem interferir com o resultado deste ensaio. Além disso, amostras com concentrações anormais
de IgG podem interferir com o resultado deste ensaio. A utilização destes tipos de amostras deve ser evitada.
RESULTADOS ESPERADOS
A investigação clínica incluiu 122 amostras que foram enviadas para um laboratório para teste de ANCA de rotina, 173 amostras de doentes com
diagnóstico clínico e 150 amostras de dadores de sangue normais. Os resultados da MPO e da PR3 no ELISA foram usados para demonstrar o
resultado esperado para esses grupos.
Os resultados de cada população estão representados na tabela 1 e tabela 2, mais abaixo:
Tabela 1. Resultado esperado dos ensaios de MPO e PR-3 AtheNA com diferentes populações de amostras.
Resultado do AtheNA Multi-Lyte
Grupo Ensaio n
Inválido Ambíguo Positivo Negativo
Rotina MPO 122 Quantidade 2 2 21 97
% 1,6% 1,6% 17,2% 79,5%
Rotina PR-3 122 Quantidade 2 2 50 68
% 1,6% 1,6% 41,0% 55,7%
Clínico MPO 173 Quantidade 1 2 104 66
% 0,6% 1,2% 60,1% 38,2%
Clínico PR-3 173 Quantidade 1 6 104 62
% 0,6% 3,5% 60,1% 35,8%
Normal MPO 150 Quantidade 0 1 9 140
% 0,0% 0,7% 6,0% 93,3%
Normal PR-3 150 Quantidade 0 6 27 117
% 0,0% 4,0% 18,0% 78,0%
Tabela 2. Resultado esperado dos ensaios de MPO e PR-3 AtheNA com diferentes populações de amostras.
Resultado do AtheNA Multi-Lyte
Intervalo
Grupo Ensaio Média dos Mediana dos Valor inferior Resultado elevado
resultados
resultados
Rotina MPO 211,6 35,5 0 1887
Rotina PR-3 396,3 73 5 3405
Clínico MPO 272 50 14 2451
Clínico PR-3 267,2 62 18 3041
Normal MPO 53 35 0 684
Normal PR-3 128 57 0 1636
4

RESULTADOS ESPERADOS (GBM)
A investigação clínica incluiu 115 amostras que foram enviadas para um laboratório para teste de ANCA (vasculite sistémica) e 115 amostras que foram
enviadas para teste da GBM (síndrome de Goodpasture). Os dados resultantes foram usados para demonstrar o resultado esperado para esses
grupos.
Tabela 3. Resultado esperado do ensaio de GBM AtheNA Multi-Lyte ®
com diferentes populações de amostras.
Resultados do AtheNA Multi-Lyte
Amostras
Enviadas para:
n Inválido Ambíguo Positivo Negativo
ANCA
(vasculite)
115 Quantidade 0 0 20 95
GBM
(sínd. Goodpasture)
Tabela 4. Resultado esperado do ensaio de GBM AtheNA Multi-Lyte ®
com diferentes populações de amostras.
Resultados do AtheNA Multi-Lyte
Amostras
Enviadas para:
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Estudo comparativo:
Foi realizado um estudo comparativo interno com o objectivo de demonstrar a equivalência do sistema de teste de MPO/PR3 AtheNA Multi-Lyte Plus
da Zeus Scientific, Inc. com sistemas de teste de ELISA disponíveis no mercado. O desempenho foi avaliado usando 445 amostras: 150 de soros de
dadores normais, 122 amostras enviadas previamente para o laboratório para teste de rotina de auto-anticorpos ANCA e 173 amostras de doentes com
diagnóstico clínico de vasculite sistémica. Os resultados da investigação foram resumidos nas tabelas 5 e 6, mais abaixo. Dados comparativos para a
GBM, obtidos com 230 amostras (incluindo 115 soros de doentes suspeitos de terem a síndrome de Goodpasture), são apresentados na tabela 7.
Tabela 5. Desempenho do ensaio de IgG anti-MPO AtheNA Multi-Lyte em relação ao teste de IgG anti-MPO ELISA
Resultados
do AtheNA
Multi-Lyte
Positivo
Negativo
Ambíguos*
Totais:
Resultados do ELISA
Positivo Negativo Ambíguos* Totais:
55
2
1
39
338
59
383
Sensibilidade relativa = 55/57 = 96,5%
Especificidade relativa = 338/377 = 89,6%
Concordância relativa = 393/434 = 90,6%
* As amostras ambíguas foram excluídas dos cálculos da concordância
Tabela 6. Desempenho do teste de IgG anti-PR3 AtheNA Multi-Lyte em relação ao IgG anti-PR3 ELISA
Resultados
do AtheNA
Multi-Lyte
Positivo
Negativo
Ambíguos*
Totais:
% 1,6% 1,6% 17,4% 82,6%
115 Quantidade 0 0 13 102
% 0,00% 0,00% 11,3% 88,7%
n Média dos
resultados
4
Resultados do ELISA
Positivo Negativo Ambíguos* Totais:
85
6
4
Mediana dos
resultados
53
283
10
96
348
Concordância relativa = 85/91 = 93,4%
Concordância relativa = 283/336 = 84,2%
Concordância relativa = 368/427 = 86,2%
* As amostras ambíguas foram excluídas dos cálculos da concordância
Valor
inferior
Intervalo
2
1
0
3
1
0
0
1
Resultado
elevado
ANCA (vasculite) 115 105 26 2 1180
GBM (sínd. Goodpasture) 115 85 39 13 1336
96
341
5
445
139
289
14
445
5

Tabela 7. Desempenho do teste de IgG anti-GBM AtheNA Multi-Lyte em relação ao IgG anti-GBM ELISA
Resultados
do AtheNA
Multi-Lyte
Positivo
Negativo
Ambíguos*
Totais:
Resultados do ELISA
Positivo Negativo Ambíguos* Totais:
31
1
0
2
195
0
32
197
1
Percentagem de concordância positiva = 31/33 = 93,9%
Percentagem de concordância negativa = 195/197 = 99,0%
Percentagem de concordância global = 226/230 = 98,3%
* As amostras ambíguas foram excluídas dos cálculos da concordância
Tabela 8. Resumo do desempenho comparativo
n Sensibilidade relativa Especificidade relativa Concordância global
MPO 445 96,5% 55/57 89,6% 338/377 90,6% 393/439
PR3 445 93,4% 85/91 84,2% 283/336 86,2% 368/427
GBM 230 93,9% 31/33 99,0% 195/197 98,3 226/230
Reprodutibilidade:
Foi realizada uma avaliação interna da reprodutibilidade intra-ensaio e entre ensaios. Foram testadas seis amostras. Em cada dia de testes, cada
amostra foi diluída duas vezes e dividida em quatro replicados, o que resultou num total de oito poços de cada uma das seis amostras. Este protocolo
foi seguido durante três dias. Estes resultados foram depois usados para calcular os valores médios em UA/mL, os desvios-padrão e o CV percentual.
As amostras foram seleccionadas de forma a que duas delas fossem claramente negativas, duas fossem claramente positivas e duas estivessem
próximas do “cut-off” do ensaio.
Os resultados deste estudo estão resumidos nas tabelas 9, 10 e 11, mais abaixo:
Tabela 9. Estudo de precisão da MPO
Amostra: Características: Resultados do primeiro dia: Resultados do segundo dia: Resultados do terceiro dia:
Diluição 1 Diluição 2 Diluição 1 Diluição 2 Diluição 1 Diluição 2
Amostra 1 Positivos fortes 1350 1275 1905 1642 1478 1619
Amostra 1 Positivos fortes 1339 1453 1623 1623 1759 1655
Amostra 1 Positivos fortes 1298 1297 1817 1682 1778 1712
Amostra 1 Positivos fortes 1420 1360 1611 1571 1695 1766
Amostra 2 Positivos fortes 461 458 380 479 503 389
Amostra 2 Positivos fortes 422 397 412 454 482 417
Amostra 2 Positivos fortes 396 454 453 457 489 449
Amostra 2 Positivos fortes 441 416 405 444 496 412
Amostra 3 Próximo do “cut-off” 175 178 144 167 164 209
Amostra 3 Próximo do “cut-off” 169 173 156 175 195 187
Amostra 3 Próximo do “cut-off” 166 192 158 180 178 179
Amostra 3 Próximo do “cut-off” 171 175 134 167 169 171
Amostra 4 Próximo do “cut-off” 100 104 91 87 86 101
Amostra 4 Próximo do “cut-off” 110 99 114 98 94 84
Amostra 4 Próximo do “cut-off” 118 125 105 99 79 92
Amostra 4 Próximo do “cut-off” 130 114 101 80 108 101
Amostra 5 Negativo 25 24 23 26 19 20
Amostra 5 Negativo 27 27 29 19 23 23
Amostra 5 Negativo 31 21 30 23 26 20
Amostra 5 Negativo 24 24 28 22 28 25
Amostra 6 Negativo 17 24 19 28 15 21
Amostra 6 Negativo 19 19 17 21 17 23
Amostra 6 Negativo 19 22 15 7 14 33
Amostra 6 Negativo 18 16 18 19 31 39
1.º dia 2.º dia 3.º dia
Precisão intra-ensaio: Precisão intra-ensaio: Precisão intra-ensaio:
Amostra 1 Média 1349 Média 1684 Média 1683 Média 1572
desvpad 61,94467578 desvpad 115,781506 desvpad 99,69919043 desvpad 184,98343
CV (%) 4,6% CV (%) 6,9% CV (%) 5,9% CV (%) 11,8%
Amostra 2 Média 431 Média 436 Média 455 Média 440
desvpad 26,5757005 desvpad 33,03245158 desvpad 44,00304373 desvpad 35,33104
CV (%) 6,2% CV (%) 7,6% CV (%) 9,7% CV (%) 8,0%
Amostra 3 Média 175 Média 160 Média 182 Média 172
desvpad 7,881941385 desvpad 15,46828553 desvpad 14,92840055 desvpad 15,58334
CV (%) 4,5% CV (%) 9,7% CV (%) 8,2% CV (%) 9,1%
Amostra 4 Média 113 Média 97 Média 93 Média 101
desvpad 11,41427677 desvpad 10,68293031 desvpad 9,862446813 desvpad 13,32101
CV (%) 10,1% CV (%) 11,0% CV (%) 10,6% CV (%) 13,2%
Amostra 5 Média 25 Média 25 Média 23 Média 24
desvpad 2,973093627 desvpad 3,854496447 desvpad 3,207134903 desvpad 3,38769
CV (%) 11,7% CV (%) 15,4% CV (%) 13,9% CV (%) 13,9%
Amostra 6 Média 19 Média 18 Média 24 Média 20
desvpad 2,604940361 desvpad 5,879747322 desvpad 9,218575967 desvpad 6,76294
CV (%) 13,5% CV (%) 32,7% CV (%) 38,2% CV (%) 33,1%
0
1
0
33
197
0
230
Precisão entre ensaios
6

Tabela 10. Precisão da PR-3
Amostra: Características: Resultados do primeiro dia: Resultados do segundo dia: Resultados do terceiro dia:
Diluição 1 Diluição 2 Diluição 1 Diluição 2 Diluição 1 Diluição 2
Amostra 1 Positivos fortes 2535 2631 2723 2541 2447 2718
Amostra 1 Positivos fortes 2582 2674 2591 2713 2611 2596
Amostra 1 Positivos fortes 2501 2496 2649 2474 2597 2728
Amostra 1 Positivos fortes 2726 2521 2632 2636 2542 2633
Amostra 2 Positivos fortes 1349 1536 1434 1501 1785 1414
Amostra 2 Positivos fortes 1318 1348 1408 1383 1489 1438
Amostra 2 Positivos fortes 1268 1445 1367 1517 1520 1452
Amostra 2 Positivos fortes 1323 1505 1325 1484 1547 1280
Amostra 3 Próximo do “cut-off” 113 118 109 119 107 116
Amostra 3 Próximo do “cut-off” 118 114 132 96 137 93
Amostra 3 Próximo do “cut-off” 137 118 108 124 98 110
Amostra 3 Próximo do “cut-off” 119 126 111 101 127 110
Amostra 4 Próximo do “cut-off” 79 79 73 85 81 79
Amostra 4 Próximo do “cut-off” 73 98 87 84 88 81
Amostra 4 Próximo do “cut-off” 70 76 76 73 73 72
Amostra 4 Próximo do “cut-off” 82 66 72 89 84 73
Amostra 5 Negativo 15 22 28 15 14 16
Amostra 5 Negativo 26 18 21 23 15 29
Amostra 5 Negativo 21 23 7 27 22 19
Amostra 5 Negativo 26 22 19 21 26 31
Amostra 6 Negativo 53 53 54 48 52 56
Amostra 6 Negativo 57 63 54 50 58 51
Amostra 6 Negativo 52 61 56 50 66 46
Amostra 6 Negativo 52 57 57 48 63 58
Amostra 1 Média 2583 Média 2620 Média 2609 Média 2604
desvpad 85,75338394 desvpad 83,57791489 desvpad 90,7650027 desvpad 84,36488
CV (%) 3,3% CV (%) 3,2% CV (%) 3,5% CV (%) 3,2%
Amostra 2 Média 1387 Média 1427 Média 1491 Média 1435
desvpad 96,71017083 desvpad 68,84130301 desvpad 144,0217617 desvpad 111,87636
CV (%) 7,0% CV (%) 4,8% CV (%) 9,7% CV (%) 7,8%
Amostra 3 Média 120 Média 113 Média 112 Média 115
desvpad 7,763237543 desvpad 11,91637529 desvpad 14,41972855 desvpad 11,81921
CV (%) 6,4% CV (%) 10,6% CV (%) 12,8% CV (%) 10,3%
Amostra 4 Média 78 Média 80 Média 79 Média 79
desvpad 9,672309519 desvpad 7,059694449 desvpad 5,792544469 desvpad 7,38572
CV (%) 12,4% CV (%) 8,8% CV (%) 7,3% CV (%) 9,4%
Amostra 5 Média 22 Média 20 Média 22 Média 21
desvpad 3,739270364 desvpad 6,749338592 desvpad 6,568322247 desvpad 5,63311
CV (%) 17,3% CV (%) 33,5% CV (%) 30,6% CV (%) 26,7%
Amostra 6 Média 56 Média 52 Média 56 Média 55
desvpad 4,242640687 desvpad 3,563204817 desvpad 6,519202405 desvpad 5,09884
CV (%) 7,6% CV (%) 6,8% CV (%) 11,6% CV (%) 9,3%
Tabela 11. Precisão da GBM
1.º dia 2.º dia 3.º dia
Precisão intra-ensaio: Precisão intra-ensaio: Precisão intra-ensaio:
Amostra: Nível: Resultados do primeiro dia: Resultados do segundo dia: Resultados do terceiro dia:
Diluição 1 Diluição 2 Diluição 1 Diluição 2 Diluição 1 Diluição 2
Amostra 1 Positivos fortes 773 611 798 672 901 782
Amostra 1 Positivos fortes 829 809 651 700 812 752
Amostra 1 Positivos fortes 706 638 883 705 796 803
Amostra 1 Positivos fortes 840 659 743 766 865 782
Amostra 2 Positivos fortes 796 728 651 646 882 794
Amostra 2 Positivos fortes 736 674 729 824 970 790
Amostra 2 Positivos fortes 715 706 676 700 844 821
Amostra 2 Positivos fortes 846 732 777 706 859 779
Amostra 3 Próximo do “cut-off” 115 124 90 93 119 128
Amostra 3 Próximo do “cut-off” 127 95 76 80 118 107
Amostra 3 Próximo do “cut-off” 115 118 101 64 95 101
Amostra 3 Próximo do “cut-off” 130 103 98 91 116 109
Amostra 4 Próximo do “cut-off” 163 130 107 83 94 92
Amostra 4 Próximo do “cut-off” 118 89 103 101 115 106
Amostra 4 Próximo do “cut-off” 122 86 103 96 95 102
Amostra 4 Próximo do “cut-off” 108 82 97 90 89 94
Amostra 5 Negativo 41 15 29 36 14 2
Amostra 5 Negativo 25 29 21 20 24 29
Amostra 5 Negativo 13 17 20 26 30 31
Amostra 5 Negativo 13 23 16 3 38 32
Amostra 6 Negativo 41 26 16 50 39 24
Amostra 6 Negativo 7 18 35 32 17 27
Amostra 6 Negativo 33 31 55 33 19 11
Amostra 6 Negativo 30 37 32 10 15 14
1.º dia
Precisão intra-ensaio
2.º dia
Precisão intra-ensaio
Precisão entre ensaios
3.º dia
Precisão intra-ensaio Precisão entre ensaios
Amostra 1 Média 733,125 Média 739,75 Média 811,625 Média 761,5
desvpad 91,14734931 desvpad 75,46759002 desvpad 48,50018409 desvpad 79,34898153
CV (%) 12,4% CV (%) 10,2% CV (%) 6,0% CV (%) 10,4%
Amostra 2 Média 741,625 Média 713,625 Média 842,375 Média 765,875
desvpad 54,39521381 desvpad 61,63240683 desvpad 62,89887008 desvpad 80,31422664
CV (%) 7,3% CV (%) 8,6% CV (%) 7,5% CV (%) 10,5%
Amostra 3 Média 115,875 Média 86,625 Média 111,625 Média 104,7083333
desvpad 11,93359603 desvpad 12,39743637 desvpad 10,68961445 desvpad 17,28150347
CV (%) 10,3% CV (%) 14,3% CV (%) 9,6% CV (%) 16,5%
Amostra 4 Média 112,25 Média 97,5 Média 98,375 Média 102,7083333
desvpad 27,20687938 desvpad 7,855844048 desvpad 8,667467912 desvpad 17,73593544
CV (%) 24,2% CV (%) 8,1% CV (%) 8,8% CV (%) 17,3%
Amostra 5 Média 22 Média 21,375 Média 25 Média 22,79166667
desvpad 9,680613912 desvpad 9,738546386 desvpad 11,62509601 desvpad 10,05627283
7

CV (%) 44,0% CV (%) 45,6% CV (%) 46,5% CV (%) 44,1%
Amostra 6 Média 27,875 Média 32,875 Média 20,75 Média 27,16666667
desvpad 10,9078936 desvpad 15,10380747 desvpad 9,051440296 desvpad 12,50623033
CV (%) 39,1% CV (%) 45,9% CV (%) 43,6% CV (%) 46,0%
Reactividade cruzada e substâncias interferentes:
Os ensaios de MPO/PR3 AtheNA Multi-Lyte foram avaliados quanto à sua potencial reactividade cruzada com outros anticorpos e substâncias
interferentes dos componentes séricos. Neste estudo, foi avaliado um total de 35 amostras. Quinze amostras foram positivas para vários anticorpos de
doenças auto-imunes e infecciosas. Das quinze avaliadas, uma foi reactiva no ensaio de MPO AtheNA Multi-Lyte e positiva no ensaio de PR3 AtheNA
Multi-Lyte. O ensaio de GBM AtheNA Multi-Lyte foi avaliado quanto à sua potencial reactividade cruzada com outros anticorpos e substâncias
interferentes dos componentes séricos. Neste estudo, foi avaliado um total de 26 amostras. 26 amostras foram positivas para vários anticorpos de
doenças auto-imunes e infecciosas. Das 26 amostras avaliadas, todas foram negativas para a GBM, o que demonstra a reduzida probabilidade de
ocorrer reactividade cruzada. Além disso, foi testada a reactividade cruzada com a GBM em 10 amostras com altos níveis de MPO e 10 amostras com
altos níveis de PR3. Das 20 amostras avaliadas, todas foram negativas para a GBM, o que demonstra a reduzida probabilidade de ocorrer reactividade
cruzada entre a MPO e PR3 e a GBM.
Foi avaliado um total de 20 amostras de MPO/PR3 que continham substâncias potencialmente interferentes. Estas 20 amostras continham níveis
anormais de hemólise (n=5), bilirrubina (n=5), concentração de IgG acima do normal (n=5) ou níveis lipídicos acima do normal (n=5). Duas destas
amostras foram positivas em ambos os ensaios de MPO e de PR3 AtheNA Multi-Lyte. Foi avaliado um total de 6 amostras de GBM que continham
substâncias potencialmente interferentes. A estas 6 amostras foram adicionados níveis anormais de hemólise (n=2), bilirrubina (n=2), níveis lipídicos
acima do normal (n=2), albumina (n=2), colesterol (n=2) ou triglicéridos (n=2). O resultado qualitativo da totalidade das 6 amostras manteve-se
inalterado, com a excepção de 1 amostra, à qual foi adicionado um elevado nível de colesterol e de 2 amostras, às quais foram adicionados níveis
elevados de triglicéridos. As amostras lipémicas podem interferir com o resultado deste ensaio. A utilização destes tipos de amostras deve ser evitada.
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