Aprendendo com as agrobacterias - Biotecnologia

ano VII • número 32 • janeiro/junho de 2004
Sementes sintéticas - Entrevista
Biodiesel
Cultivares e genes
Receptores de Bacillus thuringiensis em insetos
Aprendendo com as agrobactérias
As ômicas: integrando a bioinformação
Criptosporidiose em camundongos
Micotoxinas em alimentos
Produção de fator FVIII por engenharia genética
Açúcares funcionais
Malária em camundongos imunodeficientes
Biotecnologia aplicada ao valor nutricional dos alimentos

EM MAIO DE 1997 PLANTAMOS A PRIMEIRA SEMENTE
DE BIOTECNOLOGIA NA IMPRENSA BRASILEIRA
2 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

AGORA VOCÊ PODE COLHER OS FRUTOS
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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 3

ENTREVISTA
Sementes sintéticas
O desenvolvimento de sementes encapsuladas
Entrevista concedida a
Fernanda Diniz
Sementes encapsuladas, também chamadas de sementes sintéticas,
facilita o intercâmbio de espécies vegetais entre países, pois reduz o
espaço, torna o transporte aéreo mais fácil e possibilita o envio de maiores
quantidades.
Uma nova modalidade de cultura de tecidos de plantas vai beneficiar muito o
intercâmbio de espécies vegetais entre diferentes países. Trata-se das sementes
sintéticas, uma técnica que vem sendo desenvolvida pela Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia – uma das 40 unidades de pesquisa da Embrapa,
localizada em Brasília, DF – que consiste no encapsulamento de embriões
somáticos, ápices caulinares ou gemas axilares. O encapsulamento é feito com uma
matriz de alginato de cálcio (que não é tóxico para a planta), na qual as partes da
planta ficam completamente envolvidas e protegidas, assemelhando-se fisicamente
a uma semente. Essa técnica vai facilitar e intensificar a troca de espécies
vegetais, já que ocupa pouco espaço e, por isso, permite que sejam enviadas, de
uma só vez, milhares de sementes.
O encapsulamento está sendo iniciado na Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia com brotos de mandioca, o que é absolutamente inovador no Brasil
e no mundo, como explica o coordenador da pesquisa, Dr. Luis Pedro Barrueto Cid.
Ele afirma ainda que essa é uma forma muito eficiente de conservação e propagação
da mandioca, já que as variedades comerciais não se propagam por sementes e sim
pela forma vegetativa, ou reprodução assexuada.
Os brotos, ou gemas, encapsulados ficam em geladeiras por 30 dias a uma
temperatura de 15ºC. Depois são retirados para germinação. Além de serem de fácil
acomodação, por ocuparem pouco espaço, as sementes sintéticas beneficiam
também a conservação das espécies vegetais, pois podem ser armazenadas sem
germinar e não precisam ser repicadas, como nas formas tradicionais de cultivo in
vitro.
Já está sendo investido, também, o desenvolvimento de testes experimentais
com sementes sintéticas de café e feijão e os resultados têm sido bastante positivos.
Para o café, em especial, será um resultado muito importante, já que um dos
problemas enfrentados para a conservação de sementes, nessa altura, é que elas não
podem ficar armazenadas por muito tempo pois perdem rapidamente o poder
germinativo.
Para falar sobre essa pesquisa inovadora no Brasil e os benefícios que pode
trazer para a pesquisa agrícola no país, a revista Biotecnologia, Ciência &
Desenvolvimento, entrevistou no dia 2 de setembro de 2004, o coordenador da
pesquisa de encapsulamento de plantas(ou sementes sintéticas), na Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, Dr. Luis Pedro Barrueto Cid, que é biólogo,
formado pela Universidade do Chile, é Ph.D em Fisiologia Vegetal pela Unicamp,
trabalhou em Cultura de Tecidos na Universidade de Londres e tem pós-doutoramento
pela Universidade da Califórnia. É pesquisador da Embrapa desde 1979.
Confiram, a seguir, a entrevista:
Luis Pedro Barrueto Cid
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
lpedro@cenargen.embrapa.br
4 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004
4 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

BC&D- O que são exatamente as
sementes sintéticas, ou encapsuladas?
Barrueto – O desenvolvimento de
sementes sintéticas é uma modalidade
da cultura de tecidos de plantas,
que consiste em encapsular embriões
somáticos, ápices caulinares ou gemas
axilares. O encapsulamento se faz
com uma matriz de alginato de cálcio
“as sementes sintéticas podem ser
enviadas em grandes
quantidades(milhares) e em
pequenas embalagens”
na qual os explantes ficam completamente
envolvidos e protegidos, parecendo
exatamente uma semente. Tudo
isto é claro, realizado sob condições
estritamente assépticas. O material
encapsulado permanece por 30 dias
em geladeira a 15ºC. Depois, é retirado
e colocado em estantes na sala de
cultura para germinação a 27ºC. Após
essa fase, vai para o tubo de ensaio,
onde continuará se desenvolvendo in
vitro até o campo. Os testes de
germinação feitos com o material após
esse período de 30 dias têm sido
muito satisfatórios e já comprovaram
que o alginato de cálcio não é tóxico às
plantas. Mas ainda não é o tempo ideal
de armazenamento. Vamos iniciar os
testes com 60 dias e depois passaremos
para 90 dias, que é o tempo ideal.
BC&D – E quais são as principais
vantagens dessa nova técnica?
Figura 01: Aspecto de micro-estaca de mandioca contendo uma gema axilar após
ser encapsulada numa matriz de alginato de cálcio- “semente sintética”
Barrueto - Hoje em dia, a redução de
custos é uma das nossas maiores preocupações.
E é aí que se encontra um
dos pontos principais de benefício
dessa técnica. O encapsulamento, ou
as sementes sintéticas, nos permitirão
usar menos espaço em laboratório e
racionalizar melhor a produção de
mudas, reduzindo os custos do processo
de cultivo in vitro. No caso de troca
de germoplasma livre de patógenos
com outros países, as sementes sintéticas
possibilitam a redução nos custos
de transporte aéreo, já que podem ser
enviadas em grandes quantidades (milhares)
em pequenas embalagens.
Além disso, a técnica beneficia também
a conservação das espécies vegetais,
pois o material fica armazenado
sem germinar e sem precisar ser repicado.
Para algumas culturas agrícolas,
que não se propagam por sementes
ou que tenham problemas de
armazenamento, essa técnica pode
ser bastante vantajosa.
BC&D – Com que culturas agrícolas
vocês estão trabalhando? E
por quê?
Figura 02: A semente sintética da Fig. 1 brotando após cinco dias a 27ºC, depois de
um período de 30 dias a 15ºC.
lhar com mandioca, o que é uma
experiência absolutamente inovadora
no Brasil e no mundo. A técnica de
encapsulamento é muito eficiente para
a conservação e propagação dessa
cultura porque as variedades comerciais
não se propagam por sementes e
sim pela forma vegetativa, ou reprodução
assexuada. No caso da mandioca,
são usadas gemas (brotos), mas
em outras culturas, podem ser usados
embriões somáticos – aqueles que
repetem as características iguais aos
pais e, por isso, dão origem a clones –
ou ápices caulinares. Até agora os
nossos resultados experimentais têm
Barrueto – Nós começamos a trabamostrado
que gemas axilares de mandioca
são perfeitamente encapsuláveis
e o que é melhor, os testes de germinação
com essas “sementes”, em condições
de laboratório, têm demonstrado
excelentes resultados mesmo depois
de 30 dias a 15º C, o que é muito
positivo, considerando o caráter tropical
da planta. Já iniciamos também o
processo de desenvolvimento de sementes
sintéticas de café, através do
encapsulamento de embriões
somáticos, e de feijão, a partir de
embriões zigóticos – oriundos de reprodução
sexual – e os resultados
também têm sido muito favoráveis.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 5
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 5

“o material fica armazenado sem
germinar e sem precisar ser
repicado. Para algumas culturas
agrícolas, essa técnica pode ser
bastante vantajosa.”
Figura 03: O broto da Fig. 2 crescendo e enraizando em tubo de ensaio contendo
meio SP e dando origem a uma nova muda de mandioca com 20 dias de idade
empresa de biotecnologia estava interessada
em comercializar mudas de
mandioca através de embriogênese
somática, porém estava se defrontando
com sérios problemas de vitrificação,
um distúrbio funcional de plantas in
vitro, que causa anomalias em sua
estrutura. Além de ameaçar a sobrevivência
da planta, esse fenômeno prejudica
e, às vezes, até anula o seu valor
comercial. Pois bem, a vitrificação não
ocorre no caso de sementes sintéticas
via gemas axilares e, por isso, percebi
que poderia ser uma ótima opção para
o mercado de comercialização de mudas
de mandioca. Trouxe a idéia para
a Embrapa e começamos a trabalhar.
Até agora, os resultados têm sido muito
positivos.
BC&D – Como é uma técnica nova,
vocês têm enfrentado problemas
técnicos para o desenvolvimento
dessa tecnologia?
Barrueto – Não. Até o momento não
nos defrontamos com problemas técnicos.
Mas, como em toda pesquisa,
há sempre novos parâmetros a serem
testados como, por exemplo, testes
de armazenamento mais longos, outras
temperaturas e cultivares, etc.
Figura 04: Aspecto de semente sintética de café: embrião somático encapsulado
num estágio bastante imaturo
Para o café, essa metodologia é especialmente
importante porque as sementes
não podem ser armazenadas
por muito tempo pois perdem rapidamente
o poder germinativo.
BC&D- Como surgiu a idéia de
desenvolver sementes sintéticas?
Barrueto - Bem, na literatura referente
à cultura de tecidos, existem relatos
de sementes sintéticas em banana,
6 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004
6 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004
morango, etc. Diante da relevância e
das possibilidades favoráveis de utilização
dessa técnica, a nossa equipe na
Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia resolveu tentar
desenvolvê-la com mandioca. Mas,
além disso, outro fato me chamou a
atenção para o desenvolvimento dessa
nova modalidade de cultura de
tecidos. Quando estive na Califórnia
em 2003, por ocasião do meu pósdoutorado,
soube que uma grande
BC&D – Essa é uma pesquisa básica
ou aplicada?
Barrueto - Essa é uma pesquisa de
caráter aplicado porque não busca
expandir o leque de conhecimento
por puro diletantismo, como nos
tempos de Newton ou Mendel.
Estamos em busca de soluções. Nessa,
como em outras pesquisas
desenvolvidas pela Embrapa, a
produção de conhecimento tem que
estar amarrada a uma solução
tecnológica, dentro de um prazo. Não
podemos esquecer que a Embrapa é
uma instituição publica que tem como
preocupação aumentar a eficiência

produtiva do setor agropecuário e
reduzir a dependência externa de
tecnologias, dentre outras atribuições.
BC&D – A pesquisa de sementes
sintéticas é desenvolvida isolada
ou faz parte de outras atividades
relacionadas à cultura da mandioca?
Barrueto – O desenvolvimento de
sementes sintéticas de mandioca está
inserido dentro de um projeto maior
de pesquisa de mandioca desenvolvido
pela equipe de pesquisadores da
Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, liderada pelo Dr. Luiz
Joaquim Castelo Branco, que tem como
objetivo enriquecer a raiz da planta
como alimento básico das populações
de baixa renda. A raiz da mandioca é
constituída basicamente de amido e o
que o projeto pretende é torná-la mais
nutritiva, através da incorporação de
proteínas e carotenóides(vitamina. A).
Essa é apenas uma das pesquisas desenvolvidas
pela Embrapa hoje para
atender e melhorar a qualidade de
vida das populações mais carentes.
Dessa forma, a Embrapa transforma o
dinheiro público em conhecimento
competitivo.
BC&D – De que forma essa pesquisa
pode beneficiar o mercado no
Brasil?
Barrueto - Com o fim da guerra fria,
surge uma nova economia, sensivelmente
dependente do conhecimento
científico renovado. Hoje, os setores
empresariais do agronegócio não só
no Brasil como no mundo estão bastante
conscientes acerca dessa nova
realidade e prontos para encarar em
melhores condições a lógica do custo/
beneficio e da competição. Prova disso
é que atualmente há muito interesse
dos empresários em conhecer os
novos caminhos que a ciência lhes
proporciona. Esse mês de setembro,
por exemplo, tenho marcada na minha
agenda uma reunião com dois
empresários do agronegócio, que vêm
em busca de novos subsídios
tecnológicos dentro da área da cultura
de tecidos. Pois então, é a ciência
criando novas expectativas para a sociedade.
A mandioca é uma cultura
“Estamos em busca de soluções. A
produção de conhecimento tem que
estar amarrada a uma solução
tecnológica, dentro de um prazo.”
agrícola com muito potencial para despertar
o interesse do empresariado
brasileiro, já que além de ser um alimento
nutritivo e saboroso, é também
uma verdadeira fábrica de produção
de amido com inúmeras possibilidades
de derivações industriais.
BC&D - Com tanta apologia feita
hoje aos produtos naturais e orgânicos,
você teme que possa haver
alguma reação negativa da sociedade
a essa pesquisa, por se tratar
de “sementes sintéticas”?
Barrueto – Essa é uma questão importante
e é fundamental que fique
claro que, apesar do nome, esse é um
processo natural, que tem como único
objetivo facilitar a conservação e a
propagação das espécies vegetais,
especialmente daquelas de importância
alimentar para a população brasileira.
Não há nada nesse trabalho que
possa comprometer a ética. Mas é
sempre bom salientar que o conhecimento
cientifico é neutro. Eu reconheço
e endosso a preocupação da
sociedade civil em impor limites éticos
às descobertas científicas. Por isso
mesmo é que acho importante que se
utilize dos mecanismos de controle
que tem à disposição, como a imprensa,
as ONG’s, o poder judicial, etc. O
problema é que muitas vezes as discussões
científicas tendem para o lado
emocional, o que só resulta em sensacionalismo
e mais confusão para o
público em geral. Nas discussões
entre ciência e sociedade, é premente
que ambos os lados tenham o mesmo
espaço na mídia, para que o debate
possa ser saudável e equilibrado.
Figura 05: Germinação de embrião da
Fig. 4 em meio básico SP, após 25 dias a
27ºC e depois de 30 dias a 15ºC
Figura 06: Aspecto de embrião zigótico de feijão logo após ter sido encapsulado
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 7
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Colaboraram nesta edição
BIOTECNOLOGIA Ciência & Desenvolvimento
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NOTA: Todas as edições da Revista Biotecnologia
Ciência & Desenvolvimento estão sendo indexadas
para o AGRIS (International Information System for
the Agricultural Sciences and Technology) da FAO
e para a AGROBASE (Base de Dados da Agricultura
Brasileira).
Os artigos assinados são de
inteira responsabilidade
de seus autores.
ISSN 1414-6347
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Conselho Científico
Dr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento Vegetal
Dr. Henrique da Silva Castro - Saúde;
Dr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia;
Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal;
Dr. Naftale Katz - Saúde;
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Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;
Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos;
Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.
Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi
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Fundação Dalmo Catauli Giacometti
Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética;
Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico;
Dra. Marisa de Goes - Recursos Genéticos
Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN
Dr. José Roberto Rogero
Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotec
Dr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPA
Dr. Diógenes Santiago Santos - UFRGS
Dr. José Luiz Lima Filho - UFPE
Dra. Elba P. S. Bon - UFRJ
Entrevista
Sementes sintéticas pág. 04
Pesquisa
Açúcares funcionais pág. 10
Aprendendo com as agrobactérias pág. 15
As ômicas: Integrando a bioinformação pág. 28
Biodiesel pág. 38
Biotecnologia aplicada ao valor nutricional dos alimentos pág. 47
Criptosporidiose em camundongos pág. 55
Cultivares e genes pág. 61
Malária em camundongos imunodeficientes pág. 64
Micotoxinas em alimentos pág. 69
Produção de fator FVIII por engenharia genética pág. 81
Receptores de Bacillus thuringiensis em insetos pág. 84
BioNotícias
pág. 90
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 9

Pesquisa
Açúcares funcionais
Galactooligossacarídeos
Produção de galactooligossacarídeos por β-galactosidase utilizando metodologia de superfície de resposta
Mareci Mendes de Almeida
Prof. Dr. Depto de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Ponta Grossa, UEPG
mareci@uepg.br
Gláucia Maria Pastore
Prof. Titular, Depto de Ciência de Alimentos
Universidade Estadual de Campinas -UNICAMP
glaupast@fea.unicamp.br
Fotos cedidas pelas autoras
1. Introdução
s oligossacarídeos são
açúcares encontrados
naturalmente em
muitos alimentos como
frutas, vegetais, leite e
mel. Alguns destes não apresentam só
a função nutricional ou de adoçante,
mas também exibem atividade
fisiológica, sendo assim denominados
de alimentos funcionais (Nakano,
1998). Eles melhoram a qualidade dos
alimentos, promovendo uma
modificação no “flavor”, nas
características físico-químicas
apresentam propriedades benéficas
para a saúde do consumidor
(Crittenden e Playne, 1996).
Nos últimos anos o interesse e
consumo de oligossacarídeos têm
crescido muito, particularmente no
Japão e Europa. Em 1991 o governo
japonês criou o termo FOSHU (food
for specified health use) para os
alimentos funcionais. Em 1996 havia
58 alimentos listados, e entre estes 34
incorporavam oligossacarídeos
(Crittenden e Playne, 1996), em 2003
foram mais de 300 alimentos relatados
como FOSHU, sendo que 30% destes
apresentavam oligossacarídeos em
sua formulação (Taniguchi, 2004).
Os açúcares dos alimentos são
determinantes para a composição da
microflora intestinal (Sako et al.,
1999). Os carboidratos que participam
da dieta podem ser classificados com
base nas propriedades fisiológicas de
digeríveis ou não-digeríveis, havendo
três principais tipos de carboidratos
não-digeríveis: os polissacarídeos nãoamídicos,
os amidos resistentes e os
oligossacarídeos não-digeríveis
(Voragen, 1998), estando neste grupo
incluídos os galactooligossacarídeos
(GOS).
Os GOS apresentam configuração
β e as enzimas digestivas gastrointestinais
humanas são principalmente
específicas para ligações α, sendo
então resistentes à digestão e absorção
no intestino atingindo o cólon, onde
são fermentados, promovendo um
aumento das bifidobactérias (Sako,
1999) e redução das bactérias deterioradoras,
consequentemente ocasionando
efeitos benéficos para a saúde
humana com a redução de metabólitos
tóxicos (Modler, 1994; Tomomatsu,
1994). A ingestão de GOS aumenta
a mineralização óssea e a resistência
contra fraturas, devido à estimulação
da absorção de cálcio (Brouns e
Vermmer, 2000). Ainda são usados em
confeitos, gomas de mascar, iogurtes
e bebidas como açúcares de baixa
cariogenicidade, pois não são metabolizados
pela microflora bucal para
formar ácidos e poliglucanas.
A formação de GOS a partir da
lactose é influenciada por diversos
fatores como a fonte e concentração
da enzima, pH, temperatura e
concentração do substrato (Mahoney,
1998; Rustom et al., 1998). Quanto
mais lactose houver no sistema maior
será a produção de GOS (López-Leiva
e Gusman, 1995; Albayrak e Yang,
2002; Roy et al., 2002). Os GOS são
compostos de lactose e unidades de
galactose, produzidos comercialmente
por reação enzimática onde resíduos
de galactose são ligados na lactose
(Zaraté e López-Leiva, 1990).
Para se estudar os efeitos dos
fatores por análise univariável, além
de necessitar de um grande número
10 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Tabela 1 – Fatores e níveis estudados no planejamento experimental
fatorial de 2 níveis
Fatores
Enzima
(U/mL)
Tabela 2 – Matriz dos experimentos para planejamento experimental fatorial de
dois níveis e a porcentagem de área de 4’gal-lactose formados
Ensaios
Enzima
pH
Níveis
-1,68
-1
0 + 1 +1,6 8
2,64
4 6 8 9,3 6
pH
4,3
2 5 6 7 7,6 8
T emperatura
( ºC)
31,
6 35
40
45
48, 4
T emperatura
4'gal-lactose (%)
1 -1
-1
-1
20,1 3
2 + 1 -1
-1
18,8 1
3 -1
+ 1 -1
20,2 5
4 + 1 + 1 -1
20,9 2
5 -1
-1
+ 1
18,8 3
6 + 1 -1
+ 1
16,3 7
7 -1
+ 1 + 1
20,3 0
8 + 1 + 1 + 1
19,4 5
9 -1,6
8 0 0 20,5 6
10
+ 1,6 8 0 0 18,2 0
11
0 -1,6
8 0 17,8 5
12
0 + 1,6 8 0 21,0 0
13
0 0 -1,6
8
20,4 5
14
0 0 + 1,6 8
17,8 5
15
0 0 0 19,5 6
16
0 0 0 19,1 9
17
0 0 0 19,3 1
Figura 1 – Estrutura do galactooligossacarídeo 4’galactosil lactose
de experimentos a avaliação só pode
ser feita individualmente, onde um fator
é fixado num valor e varia-se o
outro até descobrir o valor que produz
o maior rendimento, sem se levar em
conta que ocorre interação entre as
variáveis (Barros Neto et al., 1995).
Utilizando-se da metodologia de superfície
de resposta pode-se obter
como resultado a interação dos fatores
e uma faixa de melhor atuação.
2. Materiais e métodos
A enzima β-galactosidase foi sintetizada
pelo fungo Scopulariopsis sp
isolado por Pastore e Park (1979). O
microrganismo foi produzido por fermentação
semi-sólida, cultivado em
farelo de trigo e água na proporção
de 1:1 (p/v). Em frasco erlenmeyer
de 500 mL contendo 20g de substrato,
foi adicionada uma suspensão de
esporos (10 8 esporos/mL) e incubado
a 30ºC por 7 dias. Após o crescimento
foi adicionada água destilada e o meio
triturado com bastão de vidro para liberação
da enzima, obtendo-se após filtração
o extrato enzimático, que foi
tratado com sulfato de amônio a 80%.
O precipitado obtido (enzima bruta)
foi dialisado contra água, centrifugado
e liofilizado.
A atividade da β-galactosidase (EC
3.2.1.23 β-galactosídeo galactohidrolase)
foi determinada usando o-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo
(ONPG)
como substrato. O meio de reação
constou de 1,55 mL de ONPG 0,25%
em tampão acetato de sódio 0,1M a
pH 5,0; 0,15 mL de solução enzimática,
sendo a mistura incubada a 60ºC
por 15 minutos, a reação foi paralisada
com 0,15 mL de carbonato de sódio
a 10%. Para analisar o produto da
reação foi utilizado espectrofotômetro
e a absorbância medida a 420 nm,
contra branco. Uma unidade de atividade
de β-galactosidase foi definida
como a quantidade de enzima que libera
1µmol de o-nitrofenol por minuto
em 1 mL, nas condições de ensaio.
O sistema de reação para a
produção de galactooligossacarídeos
consistiu na mistura da enzima β-galactosidase
com solução de lactose a
40% (p/v), preparada em tampões
com valores de pH preestabelecidos.
Foi utilizado um planejamento fatorial
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Figura 2 – Efeito do pH e da temperatura na produção de 4’gal-lactose, utilizando
6U/mL de β-galactosidase
Figura 3 – Efeito da temperatura e da concentração de β-galactosidase na
produção de 4’gal-lactose em pH 6,0
Tabela 3 – Efeito da concentração da enzima, pH e temperatura na síntese de
galactooligossacarídeos
Efeitos
E rro puro
t(2)
Média
19,37
4 0,05
6 340,40
7 0,00000 9
( 1) Enzima (L) - 0,99 0 0,13
3 -7,41
6 0,01769 7
( 2) pH (L) 1,69
5 0,13
3 12,69
8 0,00614 4
(3) Temperatura
(L)
-1,290
0,13
3 - 9,66 4 0,01053 8
( 1) e (2) 0,90
0 0,13
3 6,74
2 0,02129 6
( 1) e (3) -0,66
5 0,13
3 -4,98
2 0,03800 7
( 2) e (3) 0,58
0 0,13
3 4,34
5 0,04909 5
p
completo 2 3 , os níveis de estudo estão
apresentados na tabela 1. Foram
analisadas as variáveis independentes:
pH, temperatura e concentração de
enzima, e a variável dependente:
síntese do galactoligossacarídeo
4’galactosil-lactose (Figura 1). Após 24
horas o experimento foi interrompido
pela inativação da enzima em banho
fervente por 10 minutos e os produtos
foram analisados por cromatografia
líquida de alta eficiência (cromatógrafo
Waters) com coluna Supelcogel TM Ca
(300x7,8mm), tendo como fase móvel
a água com fluxo de 0,5 mL/min a
80ºC e detectados por índice de
refração. A análise estatística dos
resultados foi realizada através do software
STATISTICA utilizando Experimental
design.
3. Resultados e discussão
Os resultados da análise
correspondentes ao planejamento
fatorial de dois níveis são apresentados
na tabela 2, toda a análise foi realizada
com os valores das variáveis
dependentes codificados. A resposta
considerada foi a porcentagem de
área do galactooligossacarídeo
4’galactosil-lactose (4’gal-lactose). As
variáveis pH, temperatura e
concentração de enzima e suas
interações foram significativas a nível
de 10%.
Conforme demonstrado na tabela
3, o efeito da concentração de enzima,
do nível –1 para +1, foi negativo,
indicando que 4U/mL (-1) de enzima
apresentou melhor produção de 4’gallactose
do que 8U/mL (+1), o que
pode ser comprovado analisando as
figuras 3 e 4, onde se observa a
tendência de aumentar a síntese de
galactooligossacarídeos com a
diminuição da concentração de
enzima.
O efeito do pH, quando houve
aumento do nível –1 para +1, foi
positivo, assim na faixa estudada o
valor de pH 7,0 foi melhor, para a
síntese do galactooligossacarídeo, que
o valor de pH 5,0, havendo uma
tendência de se trabalhar com valores
de pH menos ácidos (figuras 2 e 4).
Quando analisada a variação da
temperatura o efeito foi negativo
indicando que a temperatura no nível
12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Tabela 4 - Análise de variância (ANOVA) para formação de 4’gal-lactose
Soma
quadrática
Graus de
liberdade
mais baixo (35ºC) foi mais adequada
para o sistema, e em temperaturas
mais altas a tendência é diminuir a
produção de 4’gal-lactose (figuras 2 e
3).O modelo matemático obtido
através da análise estatística é
apresentado na equação abaixo com
R 2 = 0,9838, onde x 1
= enzima, x 2
=
pH e x 3
= temperatura:
Conforme a tabela 4, a análise de
variância demonstra que o modelo é
preditivo e estatisticamente significativo
com a relação Fcal/Ftab de 41,19;
p

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14 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Pesquisa
Aprendendo
com as Agrobactérias
Das plantas transgênicas aos mecanismos de crescimento e desenvolvimento vegetal
Leila Maria Gomes Barros
PhD.Biologia Molecular
Pesquisadora
Embrapa – Recursos Genéticos e Biotecnologia
leila@cenargen.embrapa.br
Antônio Américo Barbosa Viana
M.Sc. em Biologia Molecular
Consultor
Embrapa – Recursos Genéticos e Biotecnologia
aamerico@cenargen.embrapa.br
Mauro Carneiro
Ph.D. Biologia Molecular
Pesquisador
Embrapa – Recursos Genéticos e Biotecnologia
mauro@cenargen.embrapa.br
As agrobactérias e a colonização
genética
Os mecanismos de interação planta-patógeno
são extremamente complexos
e diversificados. Entre os diferentes
tipos de parasitismo, o que
utiliza a transferência de material genético
como estratégia de colonização
é um dos mais intrigantes, tendo sido
descritos nos vírus e agrobactérias. Os
vírus utilizam o sistema de transcrição
e tradução da célula hospedeira para
produzir suas próprias proteínas, o
que permite a sua multiplicação, debilitando
o hospedeiro e culminando,
geralmente, em sua morte. As
agrobactérias, por sua vez, transferem
parte de seu material genético para o
genoma da planta hospedeira, mecanismo
este denominado de Coloniza-
Figura 1. Plantas de Nicotiana tabacum infectadas com (A) Agrobacterium tumefaciens,
onde pode ser vista uma galha de coroa, e (B) A.rhizogenes, com raízes em
cabeleira in vitro.
ção Genética (Schell et al., 1979). Os
genes transferidos são replicados, transcritos
e traduzidos como se fossem da
própria célula vegetal, resultando no
desenvolvimento de tumores ou raízes
adventícias no sítio de infecção, conhecidos
como galha de coroa (“crown
gall”) ou raízes em cabeleira (“hairy
root”), respectivamente (Figura 1). As
células neoplásicas sintetizam e
excretam compostos derivados de
aminoácidos e açúcares, denominados
opinas, que servem de nutrientes apenas
para a agrobactéria (Petit et al.,
1983). Em outras palavras, a célula
vegetal é “subjugada” para produzir
nutrientes para a agrobactéria invasora
que, desta forma, obtém carbono e
nitrogênio sem competir com as demais
bactérias do solo.
Os primeiros estudos sobre
agrobactéria datam do início do século
XX quando Smith e Townsend (1907)
isolaram uma bactéria de galha de
coroa de Chrysanthemum frutescens
(margarida) e demonstraram que ela
também causa tumores em vários outros
vegetais, sendo denominada de
Bacterium tumefaciens. Riker e colaboradores
(1930) demonstraram que
a proliferação de raízes em cabeleira,
também é causada por uma bactéria,
por eles nomeada Phytomonas
rhizogenes. Mais tarde, Conn (1942)
agrupou as duas espécies em
um novo gênero denominado
Agrobacterium.
Hoje, o gênero Agrobacterium
encontra-se agrupado na família
Rhizobiaceae, juntamente com o gênero
Rhizobium, que são bactérias de
solo, Gram-negativas, causadoras de
neoplasias em plantas (Buchanan &
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 15

Gibbons, 1975). O gênero Rhizobium
é composto por bactérias fixadoras de
nitrogênio que estimulam nódulos nas
raízes de leguminosas, diferentemente
das neoplasias causadas por
agrobactérias.
As agrobactérias infectam inúmeras
dicotiledôneas e algumas
monocotiledôneas (De Cleene & De
Ley, 1976; Porter,1991) apresentam
temperatura ótima de crescimento
entre 25-30 ºC e somente se estabelecem,
em condições naturais, em locais
injuriados da planta (Buchanan &
Gibbons, 1975). Devido a estas características,
as galhas de coroa e raízes
em cabeleira são doenças importantes
em regiões de clima temperado, especialmente
em viveiros de fruteiras
(parreiras, amendoeiras, ameixeiras,
macieiras e pessegueiros) que são
propagadas vegetativamente ou por
enxertia. Os ferimentos, resultantes da
manipulação das plantas, favorecem a
instalação da agrobactéria (Hildebrand,
1934; Kerr, 1969a).
No Brasil, segundo Beriam e colaboradores
(1996), os primeiros trabalhos
sobre infecção de plantas por
agrobactéria foram feitos por Costa
Neto em 1937, que relata ser a galha
bacteriana do pessegueiro (Prunus
persica) uma doença comum no Estado
do Rio Grande do Sul. Nos anos
seguintes, as galhas de coroa foram
citadas em muitas culturas tais como
castanheiro (Castanea sativa), videira
(Vitis vinifera), ameixeira (Prunus
domestica), alface (Lactuca sativa),
chuchu (Sechium edule), mandioca
(Manihot esculenta), urucum (Bixa
orellana), etc. (Beriam et al., 1996).
Romeiro e colaboradores (1994) reportam
que nas culturas de roseiras
(Rosa spp.) na região de Barbacena,
Estado de Minas Gerais, as galhas
agrobacterianas são responsáveis pela
queda de 20 a 100% da produção de
botões florais comercializáveis.
O mecanismo molecular de
interação Agrobacterium-Planta
O fato de a agrobactéria alterar o
programa de desenvolvimento das
plantas hospedeiras, induzindo a formação
de tumores ou raízes, atraiu a
curiosidade dos cientistas, resultando
em avanços do conhecimento nesta
área. O primeiro grande passo no
sentido de elucidar o mecanismo de
infecção foi dado quando White &
Braun (1943) demonstraram que as
galhas de coroa poderiam crescer indefinidamente
in vitro, na ausência
da bactéria, lançando a hipótese da
existência de um princípio indutor de
tumor (“tumour-inducing principle -
t.i.p.”). Desde então, várias outras importantes
descobertas somaram-se no
sentido de solucionar este intrigante
mecanismo de infecção. Kerr (1969b)
observou que a virulência de uma
cepa de Agrobacterium fitopatogênica
poderia ser transferida para uma cepa
saprofítica (A. radiobacter). Petit e
colaboradores (1970) demonstraram
que a cepa que induz a síntese da
opina Octopina nas células tumorais
usa esse produto, seletivamente, como
fonte de carbono e nitrogênio, mas
não uma outra opina como a Nopalina,
sugerindo que a informação genética
para a síntese da opina seja transferida
da agrobactéria para a planta. Mais
tarde, foi demonstrado que um elemento
não cromossomal é responsável
pela virulência das agrobactérias,
sendo denominado de plasmídeo Ti
(“Tumor inducing”) em A.
tumefaciens (Van Larebeke et al.,
1974) e plasmídeo Ri (“Root inducing”)
em A. rhizogenes (Moore et al., 1979).
Essas descobertas culminaram na
Figura 2. Plasmídeo Ti ou Ri de Agrobacterium
tumefaciens ou A. rhizogenes, respectivamente.
T-DNA: região transferida, que
pode se apresentar como um único segmento
ou em dois segmentos, T L
e T R
-DNA; tra e
trb: regiões responsáveis pela conjugação
bacteriana; OPC: região responsável pelo
catabolismo de opinas, e vir: codifica proteínas
associadas ao processo de transferência
do T-DNA para a célula hospedeira.
elucidação do mecanismo de infecção:
a transferência de um segmento
do plasmídeo Ti ou Ri (T-DNA) da
Agrobacterium para o genoma vegetal
(Chilton et al., 1977; Chilton et al.,
1982; White et al., 1982).
O Ti e o Ri são plasmídeos grandes,
variando de 200 a mais de 800Kb,
apresentando estrutura modular, onde
genes de função similar encontram-se
agrupados, resultando em cinco regiões
definidas (Zhu et al., 2000) (Figura
2): (i) T-DNA (“transfer DNA”): região
do plasmídeo transferida para a planta,
codifica os genes indutores de tumores
ou raízes e genes responsáveis
pela síntese das opinas (octopina,
nopalina, manopina, agropina etc.).
(ii) região vir: dirige o processamento
e transferência do T-DNA para a célula
hospedeira; (iii) região rep: responsável
pela replicação do plasmídeo; (iv)
regiões tra e trb: dirigem o mecanismo
de conjugação entre agrobactérias;
e (v) região opc: envolvida na absorção
e catabolismo das opinas.
O mecanismo de transferência do
T-DNA para a célula vegetal já está
quase totalmente elucidado. A Figura
3 apresenta todos os passos para o
estabelecimento da infecção. Quando
um vegetal sofre uma injúria, um
exudado composto de fenóis e açucares
é secretado, servindo de proteção
e início da cicatrização do ferimento. A
agrobactéria, atraída por estes compostos,
chega ao local do ferimento.
Os seus genes cromossomais conhecidos
como chvA, chvB, chvD, chvE,
chvG, chvI, pscA, att, miaA, ros, e acvB
codificam proteínas envolvidas no reconhecimento
do exudado e no contato
entre a agrobactéria e a célula
hospedeira (Matthysse et al., 1981;
Douglas et al., 1982; Tzfira et al.,
2000). Os compostos fenólicos presentes
no exudado, principalmente a
acetosseringona, também ativam a região
de virulência “vir” através da
estimulação da proteína VirA, uma
quinase localizada na membrana da
agrobactéria que fosforila outra proteína
bacteriana, a VirG que, por sua vez,
estimula a transcrição das proteínas de
todos os seis operons Vir (A, B, C, D,
E e G) (Stachel et al., 1986b; Winans et
al., 1989; Joubert et al., 2002). Sugerese,
ainda, que a transferência do T-
DNA para a célula vegetal ocorra por
16 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Figura 3. Interação molecular agrobactéria-planta. A planta que sofreu injúria produz compostos fenólicos e açúcares que são
captados pela proteína VirA, que fosforila a VirG que, por sua vez, ativa os demais genes vir. A VirD2 cliva as bordas do T-DNA
e o direciona para a célula hospedeira através de canais formados pela VirB. Já na célula vegetal, as proteínas VirE2 se ligam à
fita-T formando o complexo T. Este complexo, então, entra no núcleo da célula vegetal com o auxílio das carioferinas e cicloferinas
do próprio hospedeiro, e integra no genoma da planta. Desta forma, a planta passa a produzir fitormônios e opinas que servem
de nutriente para a agrobactéria.
Adaptada de Zhu et al., 2000, por Marlene T. De-Souza e Antônio Américo B.Viana.
mecanismo semelhante à conjugação
bacteriana. Inicia-se com a clivagem
das bordas de uma das fitas do T-DNA
pelas endonucleases sítio específicas
VirD1 e VirD2 (Wang et al., 1987).
Subseqüentemente, uma nova fita de
DNA é sintetizada, iniciando na borda
direita e prosseguindo na direção da
borda esquerda (Stachel et al., 1986a;
Yanofsky et al., 1986). Um T-DNA de
fita simples, chamado de fita T, é
liberado no processo, no qual a proteína
VirD2 permanece covalentemente
ligada até seu destino final, que é o
núcleo da célula vegetal (Herrera-
Estrella et al., 1988). A fita T, com a
proteína VirD2 e outra proteína a VirE2,
são translocados da agrobactéria para a
célula vegetal através de um canal
semelhante ao “pilus” conjugativo estabelecido
entre a agrobactéria e a
célula vegetal por proteínas codificadas
no operon VirB (Baron & Zambryski,
1996; Christie PJ, 1997). No citoplasma
da célula vegetal, várias proteínas VirE2
juntam-se à fita T formando um complexo
T-DNA/proteínas (complexo T)
que é transportado para o núcleo, com
ajuda das proteínas da célula vegetal
carioferina alfa e cicloferinas (Zupan
et al., 1996; Gelvin, 2000). Uma vez
no núcleo, o T-DNA é integrado no
genoma vegetal por recombinação
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 17

Tabela 1. Exemplos de plasmídeos Ti e Ri
DNA não integrativo (White et al.,
1985), dependendo da linhagem
bacteriana. A Tabela 1 mostra alguns
exemplos de plasmídeos Ti e Ri especificando
o tipo de T-DNA e a principal
opina resultante.
Cada Região T é delimitada em
ambas extremidades por uma seqüência
de 25 pb, disposta na mesma
orientação, chamada de borda esquerda
e borda direita (“LB e RB”) (Wang
et al., 1984). Embora os genes do T-
DNA sejam provenientes de um organismo
procarioto, eles contêm seqüências
regulatórias eucarióticas, como
TATA box , CAAT box , “enhancers” e
um sítio para adição da seqüência de
poliadenina, que são reconhecidos pela
RNA polimerase II da célula vegetal
(Willmitzer et al., 1981). Desta maneira,
a agrobactéria pode utilizar a maquinaria
de expressão gênica do hospedeiro
para expressar seus genes e,
conseqüentemente, manipular a fisiologia
das plantas em seu favor.
A exata organização dos genes
dentro do plasmídeo Ti somente foi
conhecida após seu completo
seqüenciamento, realizado por Zhu e
colaboradores (2000). Este trabalho
mostrou que o T L
-DNA e T R
-DNA do
plasmídeo Ti da família octopina, possui
13 e 7,8 Kb, respectivamente,
codificando um total de 13 prováveis
genes. Esses genes são responsáveis
pela proliferação das células
neoplásicas e produção de opinas.
No T L
-DNA foi caracterizado o
locus tms (“tumour morphology
shoot”), que, quando inativado, provoca
o aparecimento de brotos nos
tumores (Garfinkel et al., 1981; Ooms
et al., 1981). Este locus possui dois
genes, o gene iaaM também chamado
de gene1, tms1, aux1 ou shi
(Thomashow et al., 1986; Van
Onckelen et al., 1986) e o iaaH também
conhecido como gene2, tms2,
aux2 ou shi (Schröder et al., 1984;
Thomashow et al., 1984). Eles codificam
enzimas responsáveis pela conversão
do triptofano via indolacetamida
em ácido indol-3-acético (AIA), resultando
em uma nova rota de produção
da auxina endógena mais abundante,
envolvida em vários processos do
desenvolvimento vegetal. No T L
-DNA
também foi caracterizado o locus tmr
(“tumour morphology root”) que, quan-
Plasmídeo
Ti
Ri
T-DNA
T-DNA
T-DNA
ilegítima, preferencialmente em locais
ativos do genoma (Mayerhofer et
al., 1991; Thomashow et al., 1980).
Os genes do T-DNA são então expressos
pela planta. Aqueles que codificam
enzimas responsáveis pela síntese
de fitohormônios levam à diferenciação
e proliferação celular e, os que
codificam para as opinas sintases produzem
nutrientes para as bactérias colonizadoras.
Da agrobactéria, engenheira
genética natural, às plantas
transgênicas atuais.
Opina
sintetizada
A descoberta de que a
agrobactéria é capaz de introduzir no
genoma da célula vegetal um segmento
do seu próprio plasmídeo, que
altera o programa de desenvolvimento
e o metabolismo da célula vegetal
em seu favor, em uma troca não convencional
de material genético, lançou
as bases da Transformação Genética
Vegetal.
O entendimento dos mecanismos
de transferência do T-DNA para a
célula vegetal, aliado a Tecnologia de
DNA Recombinante e a Cultura de
Tecidos Vegetais, resultou no desenvolvimento
das plantas transgênicas.
O homem, observando as
agrobactérias, tornou-se capaz de fazer
com que as plantas produzam
compostos do seu interesse. No entanto,
modificações no T-DNA tiveram
que ser feitas, de forma que os
genes responsáveis pela síntese dos
fitohormônios e das opinas fossem
retirados, resultando no chamado
plasmídeo Ti desarmado. Neste local,
genes de interesse podem ser inseridos,
incluindo genes que conferem à
célula transformada uma característica
passível de seleção. Desta forma, o Ti
com o T-DNA alterado é introduzido
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Manopina ou
Cucumopina
Hansen et al.,
de volta na agrobactéria, que é utilizada
no processo de transformação. O
tecido alvo da transformação é colocado
em contato com a agrobactéria
contendo o novo Ti e, subseqüentemente,
cultivado em meio que favoreça
a regeneração de plantas, em presença
do agente seletivo, de forma a
permitir a regeneração apenas das
células transformadas, ou seja, aquelas
que incorporaram o T-DNA. Deste
modo, a planta regenerada contém
em seu genoma uma ou mais cópias
do T-DNA, que serão transmitidas para
as futuras gerações por meiose, obedecendo
às leis de Mendel (Tepfer,
1984). As primeiras plantas
transgênicas obtidas utilizando-se A.
tumefaciens como vetor de transformação
foram plantas de Nicotiana
tabacum. Inicialmente, foram utilizados
protoplastos de células do mesófilo
para a transformação (De Block et al.,
1984; Horsch et al., 1984) e, em seguida,
passou-se a utilizar discos foliares
(Horsch et al., 1985). Protoplastos ou
discos foliares foram co-cultivados com
a agrobactéria, contendo no T-DNA o
gene nptII, que confere resistência ao
antibiótico canamicina. Depois de várias
semanas de cultivo em meio propício
à regeneração, contendo
canamicina, foram obtidas plantas transformadas
resistentes ao antibiótico.
Atualmente, em experimentos de
transformação, o co-cultivo com segmentos
foliares é utilizado preferencialmente,
devido à simplicidade da
manipulação.
O T-DNA
1991
Ti
T L
e T R
-DNA
Octopin
a Ooms et al., 198 2
Ri
T L
e T R
-DNA
Agropin
a Jouanin, 198 4
O T-DNA pode ser encontrado
como um único segmento de aproximadamente
20 kb, ou dividido em
dois segmentos, com até 20 kb cada,
separados por pelo menos 15 kb de
18 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Figura 4. T-DNA da A. tumefaciens (pTiAch5) e da A. rhizogenes (pRiA4). Ambos possuem genes codificadores de hormônios
vegetais (iaaM, iaaH, ipt e tml) e de síntese de opinas (ocs, ags, mas1 e mas2). Somente a A. rhizogenes possui os genes responsáveis
pela indução da formação de raízes (rolA, rolB, rolC e rolD).
do inativado, produz tumores com
raízes. Este locus contém apenas um
gene o ipt, também conhecido como
gene4, tmr ou roi que catalisa a síntese
da citocinina iso-penteniladenosina 5`monofosfato
a partir de dimetilalilpirofosfato
e 5`AMP (Akiyoshi et
al.,1984; Barry et al., 1984; Buchmann
et al., 1985). Aparentemente, enzimas
da planta hospedeira convertem isopenteniladenosina
5`-monofosfato na
citocinina zeatina. As citocininas são
hormônios que regulam o desenvolvimento
vegetal de forma antagônica às
auxinas. Dois outros genes, encontrados
no T L
-DNA do plasmídeo Ti, são
também responsáveis pela formação
da galha de coroa: o gene5 ou ila, que
é responsável pela síntese do composto
indol-3-lactato, um antagonista
da auxina (Körber et al., 1991) e, o
gene6b ou tml, que confere as células
transformadas um aumento de sensibilidade
à auxina, por um mecanismo
ainda não identificado (Hooykaas et
al., 1988; Tinland et al., 1992). No T L
-
DNA também existem genes responsáveis
pelo metabolismo das opinas.
Um deles é o gene ocs, que codifica a
enzima octopina sintase, responsável
pela condensação do piruvato com
quatro aminoácidos básicos, arginina,
lisina, histidina ou ornitina, dando origem
opinas octopina, lisopina,
histopina ou ácido octopínico, respectivamente
(De Greve et al., 1982).
Outro gene caracterizado é o nos, que
codifica uma proteína responsável pela
secreção das opinas (Messens et al.,
1985) (Figura4).
No T R
-DNA deste plasmídeo Ti
foram identificados três outros genes
responsáveis pela produção das opinas
são eles o mas2’, cujo produto é o
responsável pela condensação do ácido
glutâmico com a glicose formando
o precursor desoxifrutosilglutamina, e
o mas1’, responsável pela redução do
precursor, formando a opina manopina
(Dessaux et al., 1998). O outro gene
é o ags, cujo produto catalisa a
lactonização da manopina resultando
na agropina (Dessaux et al., 1998;
Hong et al., 1997). Dois outros possíveis
genes foram identificados no T L
-
DNA da família octopina, o gene 3 e o
gene 4, cujas funções ainda não foram
determinadas. Portanto, os plasmídeos
do tipo octopina produzem diferentes
tipos de opinas.
No caso da A. rhizogenes, em
contraste com o A. tumefaciens, ocorre
a indução de um tecido neoplásico
organizado na forma de raízes adventícias
(Figura 1). Não obstante, existe
uma significante homologia do T R
-
DNA do plasmídeo Ri com o T-DNA
do plasmídeo Ti, como por exemplo,
os genes de síntese de auxina iaaM e
iaaH e, os genes mas1’, mas2’ e ags,
responsáveis pela síntese das opinas
(White et al., 1985). Em contraste, o
T L
-DNA do plasmídeo RiA4, possui 18
regiões abertas para leitura (ORFs)
(Slightom et al., 1986) com baixa
homologia com o plasmídeo Ti da
família octopina (Nilsson & Olsson,
1997). Quatro destes genes, específicos
dos plasmídeos Ri, são considerados
responsáveis pela indução das
raízes em cabeleira (White et al.,1985,
Spena et al., 1987) (Figura 4). Esse
locus foi denominado de locus de raiz
(root locus) cujos genes foram designados
de rolA, rolB, rolC e rolD (White
et al.,1985), correspondendo as ORFs
10, 11, 12 e 15, respectivamente
(Slightom et al., 1986).
Diferentemente dos tumores, as
raízes neoplásicas provêm de uma
única célula transformada e podem
regenerar plantas férteis, quando
cultivadas in vitro. Essas plantas
apresentam fenótipo alterado, cujos
principais sintomas são: nanismo,
enrugamento foliar, formação de raízes
adventícias e plagiotrópicas,
dominância apical reduzida, alteração
na morfologia floral, redução do
número de sementes, entre outros
(Tepfer, 1984). Assim como a
descoberta da transferência do T-DNA
para a célula vegetal levou ao
desenvolvimento das plantas
transgênicas, o entendimento dos
mecanismos pelos quais as
agrobactérias alteram a morfologia da
planta pode ser útil nos estudos de
Biologia do Desenvolvimento e
Fisiologia Vegetal, bem como na
manipulação de características
agronômicas de interesse.
Os oncogenes rolA, rolB,
rolC e rolD
Como os genes rol participam da
estratégia de colonização, estabelecida
no decorrer da evolução planta/
patógeno? Qual é o papel de cada
gene na síndrome de raiz em cabeleira?
As respostas para estas perguntas
ainda não são totalmente conhecidas.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 19

No entanto, sabemos que os genes rol
atuam de maneira sinergística e que,
quando expressos em pares, provocam
efeitos mais acentuados do que
quando expressos isoladamente
(Spena et al., 1987). Isto sugere uma
certa redundância funcional, que pode
ser interpretada como um modo de
garantir o sucesso no processo de
infecção.
O gene rolB (ORF11) é o mais
eficiente na indução das raízes e o
único gene do T-DNA que, quando
inativado, suprime a indução de raízes
nas plantas infectadas pela A.
rhizogenes, exceto em plantas de
fumo (White et al., 1985). De fato, A.
rhizogenes contendo apenas o gene
rolB é capaz de induzir raízes tão bem
quanto cepas selvagens (Spena et al.,
1987; Capone et al., 1989). O gene
rolB expresso em plantas promove
alterações na morfologia das folhas e
flores, o desenvolvimento de raízes
adventícias no caule (Schumülling et
al., 1988)e a indução de raízes em
segmentos foliares cultivados, in vitro,
na ausência de auxina. Essas observações
levaram a conclusão de que plantas
transformadas com rolB apresentam
um estado hiperauxínico (Capone
et al., 1989).
A proteína RolB contém 259
aminoácidos com massa molecular de
30KDa, não possuindo nenhum motivo
típico ou similar a proteínas conhecidas.
Primeiramente, foi sugerido que
RolB provocaria um aumento da concentração
de auxina, resultado da
hidrólise dos conjugados inativos do
ácido indol acético (AIA), liberando
auxina ativa na célula (Estruch et al.,
1991b). Porém, plantas de fumo expressando
o gene rolB sob controle
do promotor 35S do vírus do mosaico
da couve-flor (CaMV35S) (Odell et
al.,1985) não apresentam níveis alterados
de AIA ou AIA-conjugado (Nilsson
et al., 1993). A segunda hipótese é
que RolB aumentaria a sensibilidade
da célula para o AIA, e não a sua
disponibilidade, como sugerido anteriormente.
Protoplastos de plantas
transgênicas de fumo expressando
RolB são até 100000 vezes mais sensíveis
à auxina do que plantas controle
(Maurel et al., 1991). Corroborando
este resultado, foi observado que preparações
de membrana plasmática de
células transformadas com rolB são
capazes de ligar mais auxina do que
membranas de plantas controle, e que
esta ligação é completamente abolida
na presença de anticorpos anti-RolB
(Filippini et al., 1994). Além disso,
protoplastos 35S::rolB se dividem e
formam calos na ausência de auxina
(Walden et al., 1993), e calos gerados
a partir de raiz de plantas 35S::RolB
tornam-se necróticos em um terço da
concentração de auxina necessária para
induzir a mesma resposta em calos
controle (Schmülling et al., 1993). Os
efeitos de rolB na organogênese foram
estudados utilizando cultura de
camada fina de células (TCL), onde foi
observado que rolB não somente induz
a formação meristemas radiculares,
mas também meristemas florais
(Altamura et al., 1994). Recentemente,
Altamura (2004) propôs um modelo
no qual rolB induziria a formação de
meristemas, sendo que o tipo de
meristema resultante depende do balanço
hormonal local. Apesar dos efeitos
da proteína RolB serem bem conhecidos,
ainda existem controvérsias
quanto ao seu modo de ação. Filippini
e colaboradores (1994) demonstraram
que a proteína RolB possui atividade
tirosina fosfatase, e a localizaram
em membrana plasmática das células
transformadas, sugerindo uma função
de receptor ou transdutor de sinal da
via do hormônio AIA. No entanto,
Moriuchi e colaboradores (2004) localizaram
a proteína quimérica GFP::RolB
no núcleo de células transformadas, o
que favorece a função de transdutor
de sinais.
O gene rolC (ORF 12), cuja proteína
possui 180 aminoácidos com
massa molecular de 20 KDa, também
não possui homologia com proteínas
conhecidas. A proteína RolC foi
imunolocalizada no citosol das células
transformadas (Estruch et al., 1991a;
Oono et al., 1987). As plantas
transgênicas de fumo expressando
RolC são menores, ramificadas, com
folhas afiladas e redução do conteúdo
de clorofila. A floração ocorre mais
cedo com flores pequenas e redução
do número de grãos de pólen (Oono
et al., 1987; Schmülling et al., 1988). A
função da proteína RolC ainda não foi
determinada, tendo sido descrito um
aumento de citocinina ZR nas regiões
apicais (Nilsson et al., 1996), sugerindo
que RolC influencia positivamente
a síntese de citocinina em folhas jovens.
Foi observado, ainda, uma diminuição
dos níveis de giberilina (GA)
em plantas expressando o gene rolC
devido, provavelmente, à inibição da
conversão do GA 19
para o GA 20
(Nilsson
et al., 1993, 1996). No entanto, a
aplicação de GA exógeno em plantas
expressando a proteína RolC reflete
somente no aumento do tamanho das
plantas, não revertendo os outros
fenótipos, tornando evidente que o
decréscimo de GA é um efeito secundário
(Schmülling et al., 1993).
O gene rolD (ORF15) codifica
uma proteína de 344 aminoácidos
(Slightom et al., 1986). A. rhizogenes
contendo no locus rol apenas o gene
rolD é incapaz de induzir a formação
de raízes em plantas de fumo (Mauro
et al.,1996). Por outro lado, A.
rhizogenes contendo mutações apenas
no gene rolD induz o desenvolvimento
de raízes, porém, as raízes
resultantes são pequenas (White et
al., 1985). A proteína RolD provoca a
floração precoce em plantas de fumo
e a potenciação da organogenese floral
em culturas de células (Mauro et al.,
1996; Altamura, 2004). Em 2001,
Trovato e colaboradores demonstraram
que o produto protéico deste
gene é a enzima ornitina
ciclodesaminase (OCD), que converte
ornitina em prolina. Existem evidências
de que a prolina atue como
um indutor da floração.
O gene rolA (ORF10) é, entre os
genes rol, o que causa maiores alterações
morfológicas em plantas, sendo
este objeto de estudo em nosso laboratório.
A. rhizogenes contendo apenas
o gene rolA é capaz de induzir
raízes em N. tabacum, mas não em
outras plantas testadas (Spena et al.,
1987). Plantas de fumo transformadas
com o gene rolA apresentam redução
do porte, folhas enrugadas, arredondadas
e verdes escuras, atraso na floração,
(Figura 5), sistema radicular pobre,
reduzido número de flores e retardo
na senescência (Schmülling et al.,
1988; Sinkar et al., 1988; Slightom et
al.,1986; Carneiro & Vilaine, 1993). Da
mesma forma, foram observadas alterações
fisiológicas tais como redução
de giberilina GA 1
(Dehio et al., 1993;
20 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Moritz & Schmülling 1998) e redução
da síntese de poliaminas, através de
interferência na via da ornitina (Burtin
et al., 1991; Sun et al., 1991; Ben-
Hayyim et al.,1996). Plantas de fumo
expressando rolA, quando tratadas com
giberilina, não revertem completamente
o fenótipo (Dehio et al., 1993;
Schmülling et al., 1993), o que sugere
que esta redução de giberelina represente
um efeito secundário. Curiosamente,
plantas transgênicas com reduzido
nível de AIA apresentam
fenótipo semelhante a plantas rolA
(Romano et al., 1991), sendo especulado
que o fenótipo rolA seja o resultado
de um aumento da relação
citocinina/auxina. Em consonância com
esta hipótese, nanismo, folhas
enrugadas e verdes escuras são
fenótipos típicos de plantas com alta
produção de citocininas (Eklöf et al.,
1996).
A expressão do gene rolA em
plantas transgências mostrou que seu
promotor é ativo, essencialmente, em
todos os órgãos (Schmülling et al.,
1989). Carneiro & Vilaine (1993) mostraram
que o nível do RNA mensageiro
é maior no caule, cinco vezes menor
na folha e cinqüenta vezes menor na
raiz, e que, além disso, o promotor do
gene é composto por módulos que
determinam a expressão tecido específica.
A proteína RolA possui 100
aminoácidos com massa molecular estimada
em torno de 11,4 KDa e ponto
isoelétrico de 11,2 (Slightom et al.,
1986). Análises computacionais mostraram
que não existe similaridade da
RolA com proteínas conhecidas. Devido
à sua natureza extremamente básica
e à presença do motivo SPXX encontrado
em proteínas regulatórias, a
possibilidade de interação com ácidos
nucléicos foi proposta (Levesque et
al.,1988; Hansen et al., 1994). Alternativamente,
foi sugerido uma função de
receptor ou transdutor de sinal de
auxinas na membrana plasmática
(Maurel et al.,1991; Vansuyt et
al.,1992). Experimentos de
fracionamento celular de plantas de
fumo transformadas com o gene
rolA::gus indicam que a proteína RolA
estaria associada, preferencialmente,
à fração da membrana plasmática, embora
a atividade do gene repórter gus
tenha sido detectada em outras frações
celulares (Vilaine et al.,1998).
Sendo assim, as informações quanto à
localização da proteína RolA na célula
vegetal e sua provável função são
contraditórias, e, apesar das alterações
hormonais detectadas nas plantas rolA
explicarem parcialmente os fenótipos
resultantes, faz-se necessário um
aprofundamento das investigações
para se chegar a sua verdadeira função
biológica.
Estratégia adotada para estudar
a função da proteína RolA
em plantas
A capacidade de RolA alterar vários
aspectos do crescimento e desenvolvimento
de plantas tem atraído a
atenção dos cientistas, pois decifrar a
função de RolA pode levar ao entendimento
de como os fenótipos baixo
porte, enrugamento foliar, crescimento
deficiente de raízes, retardo na
floração e senescência são gerados.
Estas informações podem resultar em
avanços na Fisiologia Vegetal e Biologia
do Desenvolvimento, possibilitando
ainda, o controle de características
agronômicas desejáveis em uma determinada
cultura.
Tendo como base as hipóteses
existentes na literatura, de localização
da proteína RolA na membrana
plasmática ou no núcleo, desenhamos
algumas estratégias com o objetivo de
testar essas duas hipóteses.
Estudos de modelagem molecular
da proteína RolA, realizados por Rigden
e Carneiro (1999) culminaram com a
proposição de um modelo para a proteína
RolA, no qual esta estaria atuando
na forma dimérica e interagindo
com seqüências de DNA em dois pontos
específicos de sua estrutura, os
resíduos lisina 24 e arginina 27, via
pontes de hidrogênio. Para testar este
modelo, experimentos de mutação
sítio-dirigida foram realizados, substituindo
os aminoácidos lisina 24 e
arginina 27 por asparagina 24 e 27 e
por glutamina 24 e 27 (Assis, 2003).
Asparagina e glutamina foram escolhidos
por apresentarem tamanhos similares
aos aminoáciodos lisina e arginina,
mas diferentes quanto às características
físico-químicas, o que poderia alterar
a especificidade de ligação de RolA
com os promotores, sem alterações
consideráveis na estrutura da proteína.
Os genes rolA mutados foram inseridos
em plantas de fumo, e análises
fenotípicas estão sendo realizadas em
nosso laboratório.
Para testar a hipótese de que
Figura 5. (A) Planta de N. tabacum expressando o gene rolA sob controle do seu
próprio promotor, à esquerda, e uma planta não transformada, à direita. Ambas
possuem a mesma idade. (B) Detalhe da planta expressando o gene rolA.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 21

Figura 6. Perfil de hidrofobicidade e seqüência primária de RolA. Destacada em verde, a região hidrofóbica
com 22 resíduos de aminoácidos, e em vermelho, uma região hidrofílica de 14 resíduos. As cores representam
as propriedades físico-químicas dos resíduos de aminoácidos: verde – apolares, e vermelho – carregados
positivamente.
RolA atue como regulador da expressão
de genes, DNA de Arabdopsis
thaliana foi digerido com enzimas de
restrição de corte freqüente, gerando,
assim, um banco de fragmentos de
DNA. Estes fragmentos foram então
incubados com a proteína de fusão
GST::RolA (Santos, 2002) e,
concomitantemente, com a proteína
GST isolada. A A. thaliana foi escolhida
como modelo experimental, dado
à disponibilidade da seqüência do seu
genoma completo em bancos de dados,
o que facilita os estudos posteriores.
Por análise diferencial, foi possível
isolar trinta fragmentos de DNA com
os quais RolA se ligou. Para verificar se
esses fragmentos são promotores de
genes regulados pela proteína RolA,
eles foram clonados adjacentes à seqüência
codante do gene repórter
uidA (gus), que codifica a enzima β-
Glucuronidase (Jefferson et al., 1986),
em vetores de planta, de forma a
tornar possível a verificação da capacidade
dos fragmentos de promover a
expressão da Gus. Esses vetores foram
então transferidos por
eletroporação para protoplastos de
fumo, onde foi observada atividade
promotora em alguns fragmentos
(Barreto et al.,1998). Dois destes fragmentos,
quando expressos em plantas
de fumo, foram capazes de promover
a expressão de Gus nos grãos de
pólen de plantas de fumo (Viana,
2003).
Alternativamente, uma outra estratégia
foi estabelecida para possibili-
22 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

tar a localização subcelular e evidenciar
a existência de domínios funcionais
na proteína RolA. O perfil de
hidrofobicidade da RolA foi determinado,
utilizando o programa ProtScale
disponível no endereço (http://
www.expasy.ch/). Duas regiões bem
definidas ficaram evidentes no N-terminal
da proteína RolA: uma região
hidrofóbica seguida de outra hidrofílica
(Figura 6). A região hidrofóbica possui
23 resíduos de aminoácidos, dos quais
16 são resíduos apolares (em verde) e
a região básica corresponde a 14 resíduos
de aminoácidos, sendo que 9 são
resíduos básicos (em vermelho) e 5
apolares (em verde) (Figura 6). Em
acordo com a hipótese da RolA ser
uma proteína reguladora da expressão
gênica, foi observado dentro da região
básica, uma região homologa ao sinal
de endereçamento nuclear da proteína
antígeno “large T” do vírus SV40.
Por outro lado, os 23 primeiros resíduos
de aminoácidos, presentes no N-
terminal, essencialmente hidrofóbicos,
seguidos de resíduos básicos,
hidrofílicos, configuram um possível
motivo conhecido como “Reversesignal-ancor”,
que, nas bactérias, permitem
o ancoramento em membranas
(Barros et al., 2003). Os resíduos básicos
interagem com as porções
hidrofílicas dos lipídeos das membranas
promovendo o ancoramento das
proteínas na membrana de maneira
estável (van Heijne e Manoil, 1990).
Com base nessas informações
experimentos foram desenhados para
estudar estes motivos putativos encontrados
no N-terminal da proteína
RolA. Foram construídas fusões
traducionais da proteína RolA inteira,
ou apenas segmentos do seu N ou C-
terminal, com a enzima repórter Gus
(RolA::Gus). Os genes quiméricos foram
inseridos no plasmídeo Ti desarmado,
sob o controle do promotor
CaMV35S. Plantas de fumo transformadas
com essas construções foram
regeneradas, sendo que o fenótipo
característico de plantas rolA está presente
apenas nas plantas que contém
o gene rolA completo. Surpreendentemente,
a atividade específica desta
proteína de fusão aumentou mais de
50 vezes, devido ao acúmulo da fusão,
em torno de 36 vezes maior que a
proteína Gus isolada (Barros, 2003). É
possível, que o acúmulo da proteína
de fusão observado possa estar relacionado
com a função biológica da proteína
RolA (Barros et al., 2003). Curiosamente,
ensaios preliminares de
citoquímica e imunocitoquímica sugerem
a presença da proteína RolA::Gus
em cloroplastos, em vez de membrana
celular ou núcleo, como previsto
(Barros, 2003). Desta maneira, é possível
que a função da proteína RolA
esteja relacionada com esta organela,
que tem um papel central no metabolismo
vegetal.
Considerações finais
O conhecimento dos mecanismos
moleculares de interação
Agrobacterium-planta permitiu ao
homem manipular geneticamente espécies
vegetais, introduzindo genes
de interesse agronômico, resultando
em variedades mais produtivas, resistentes
a estresses bióticos e abióticos,
e com aumento no seu valor nutricional.
Por outro lado, os genes rol são
ferramentas importantes para o entendimento
dos mecanismos de crescimento
e desenvolvimento vegetal.
Porém, apesar dos esforços de diversos
grupos de pesquisa, a função primária
de vários desses genes ainda é
controversa. Serão necessários, ainda,
estudos para se alcançar o completo
conhecimento do modo de ação de
cada um dos genes rol em plantas
transgênicas, e seus papéis na interação
Agrobacterium-planta.
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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 27

As ômicas:
Pesquisa
Integrando a bioinformação
O papel da bioinformática em expansão
Dr. Eliseu Binneck
Consultor/Pesquisador na área de Bioinformática
Embrapa Soja, Londrina – PR.
binneck@cnpso.embrapa.br
Imagens cedidas pelo autor
Como resultado dos crescentes
investimentos na área da genômica nos
últimos anos, a lista de sequências de
genomas completos vem crescendo
a uma velocidade cada vez maior e
contribuindo com a disposição de um
volume de dados para acesso público
sem precedentes na história. Hoje
(maio de 2004) são 190 genomas completos
publicados, dos quais, 145 de
procariotos, 18 de archaea e 27 de
eucariotos. Além disso, existem 900
genomas sendo seqüenciados; 460 de
procariotos, 26 de archaea e 414 eucariotos
(http://www.genomesonline.org).
A Figura 1 apresenta a evolução na
obtenção de sequências genômicas
completas de organismos de vida livre.
Um forte componente que tem (Mewes et al, 2004), são de domínio
auxiliado tremendamente essa público e possibilitam a obtenção de
evolução da informação genômica são informações organizadas, além de integrarem
as ferramentas de bioinformática.
ferramentas poderosas, pos-
Atualmente os dados de sequências sibilitando, por exemplo, a análise
podem ser explorados com o uso de comparativa entre dados de diferentes
poderosas ferramentas de busca, genomas.
acessando fontes de informação Entretanto, em meio a esse clima
eletrônica associada e integrada de um de novidade e excitação, parece ter
modo inconcebível há menos de uma se estabelecido uma expectativa
década, quando, em 1995, foi seqüenciado
excessiva sobre a aplicação de dados
o primeiro genoma de um orga-
de sequências genômicas em busca
nismo de vida livre, Haemophilus influenzae
de inferências biológicas. Por outro
(Fleischmann et al, 1995). lado, existe um crescente
Muitas dessas ferramentas, como Ensembl
reconhecimento e entendimento de
Genome Browser (http:// que tais metodologias baseadas na
www.ensembl.org/) (Stalker et al, seqüência de DNA terão que ser
2004), KEGG (http://www.genome.ad.jp/ complementadas pela análise direta
kegg/kegg2.html) (Kanehisa et al, dos produtos codificados pelos genes;
2004), GeneQuiz (http:// os RNAs e as proteínas. Sabe-se que
www.sander.ebi.ac.uk/gqsrv/submit/) conhecer a seqüência de um genoma
(Hoersch et al, 2000) e MIPS (http:// não garante que as proteínas
www.mips.biochem.mpg.de/) codificadas por esse genoma possam
Fig.1: Plântula de café cv Rubi, crescida in vitro e obtida a partir
de 28 gema Biotecnologia axilar de Ciência uma & Desenvolvimento outra plântula n.32 similar - janeiro/junho a ela. Assim 2004 por
diante, outros clones podem ser obtidos
Figura 1. Evolução no número de genomas
sequenciados desde 1995 até abril de 2004.
Gráfico produzido com permissão a partir de
informações disponíveis no banco de dados
GOLD (http://www.genomesonline.org) (Bernal
& Kyrpides, 2001).
ser imediatamente determinadas (por
exemplo, por homologia com
proteínas, já conhecidas, de outros
organismos). Há uma estimativa,
baseada em genomas recémcompletos,
que cerca de 30% do
conteúdo gênico de um organismo seja
de proteínas específicas deste (Rubin
et al, 2000). É claro que esse número
tende a diminuir à medida que mais e
mais genomas vão sendo
seqüenciados, mas mostra a
dificuldade em proceder-se a uma
anotação automatizada [confiável e
completa] dos genomas.
As predições computacionais a
partir de dados de seqüências são complicadas
e nem sempre geram resultados
confiáveis, principalmente no caso
de genomas mais complexos como o
genoma humano. Embora o término
do Projeto Genoma Humano tenha
sido comemorado em abril de 2003

(Collins et al, 2003; Pennisi, 2003a), o
número exato de genes codificados
pelo genoma é ainda desconhecido e
podem ser necessários anos ainda até
que tenhamos uma contagem confiável
do número de genes no genoma
humano.
A razão para tanta incerteza é que
as predições são derivadas a partir de
diferentes métodos computacionais e
programas de predição gênica. Alguns
programas detectam genes
procurando por parâmetros diferentes
que definem onde um gene começa
e termina (predição “ab initio”).
Outros programas procuram por genes
pela comparação de segmentos de
sequência com homologia com genes
e proteínas conhecidos (predição
comparativa). Enquanto a predição ab
initio tende a sobrestimar o número
de genes pela contagem de qualquer
segmento que pareça um gene, o
método de predição comparativa
tende a subestimar este número, já que
é limitado por reconhecer somente os
genes similares aos já conhecidos. A
definição de gene é problemática
porque pequenos genes podem ser
difíceis de detectar, um gene pode
codificar para vários produtos
protéicos, alguns genes codificam para
RNA, dois genes podem se sobrepor,
e há muitas outras complicações
(Pennisi, 2003b). Sendo assim,
métodos computacionais por si só não
são suficientes para gerar o número
real e o conhecimento de todos os
genes de um genoma eucariótico
complexo; pelo menos com as
informações existentes atualmente.
Até que se gere um conjunto de dados
bastante informativo para as predições
comparativas, essas precisarão ser
verificadas por trabalho intensivo de
laboratório antes de se chegar a um
consenso real.As últimas estimativas a
partir de programas de predição
gênica sugerem que no genoma
humano devem existir 24500 ou
menos genes que codificam para
proteínas (Pennisi, 2003c). A
estimativa do Ensembl (versão
20.34c.1, de 08-02-2004) é de 23531
genes, incluindo 1744 pseudogenes
(http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/)
(Stalker, 2004). Essa estimativa é
muito menor do que aquelas das
anotações iniciais, que contavam mais
de 70.000 genes (Write et al, 2001).
Considerando que os genes no
genoma humano apresentam um
tamanho médio de 3000 pares de
bases, menos de 2% do genoma
codificam para proteínas. Assim
mesmo, atualmente é desconhecida
a função de mais de 50% dos genes
descobertos.
Observando a inesperada
equidade relativa no número de genes
de organismos bastante diferentes em
termos de complexidade (Quadro 1),
sugere-se que o fator que determina
a complexidade de um organismo não
está no número de genes, mas em
como as partes gênicas são usadas
para construir diferentes produtos em
um processo chamado splicing
alternativo. Outra razão para essa
maior complexidade são as milhares
de modificações químicas pós
traducionais que ocorrem nas proteínas
e o repertório de mecanismos de
regulação que controlam esses
processos (Genomics and Its Impact
on Science and Society: The Human
Genome Project and Beyond, 2003).
A versão 34.00 do banco de dados
RESID (http://pir.georgetown.edu/
pirwww/dbinfo/resid.html) (Garavelli,
2003) apresenta 339 modificações
pós ou co-traducionais conhecidas em
proteínas, modificações essas que não
podem ser evidenciadas diretamente
a partir da seqüência gênica.
Informação versus ação
Em qualquer sistema biológico, se
um trabalho é realizado, quase sempre
a molécula responsável por essa
ação é uma proteína. A vida depende
de milhares de proteínas diferentes,
cujas estruturas são ajustadas para que
moléculas individuais de proteínas
combinem, numa precisão impressionante,
com outras moléculas. Reações
químicas na célula dependem da combinação
de enzimas com substratos e
essas são geralmente controladas por
outras moléculas combinando com sítios
específicos da proteína. Estruturas
como os músculos dependem da
interação proteína-proteína, o controle
da expressão gênica depende da
combinação proteína-DNA, o controle
hormonal depende da interação do
hormônio com receptores protéicos,
o transporte através da membrana
envolve interações soluto-proteína,
proteções imunes requerem a interação
antígeno-anticorpo, atividades
neuronais requerem a interação substância
transmissora-proteína. Estes
são apenas alguns exemplos do
universo quase infindável de interações
específicas em que as proteínas
são envolvidas. Todas essas interações
dependem do reconhecimento
exato de estruturas específicas nas
moléculas das proteínas envolvidas
(Goodsell, 1991). Neste contexto,
bancos de dados como o LIGAND
(http://www.genome.ad.jp/ligand/)
(Goto, 2002) possibilitam visualizar
cada uma entre o universo de reações
químicas conhecidas envolvendo a
interação de enzimas com metabólitos
e outros compostos. Interações
proteína-proteína, proteína-DNA e
proteína-RNA podem ser encontradas
em bancos de dados como BIND –
Biomolecular Interaction Network
database (http://www.bind.ca/) (Bader
et al, 2003), DIP – Database of Interacting
Proteins (http://dip.doe-
Quadro 1 – Tamanho do genoma e número estimado de genes de diferentes organismos.
Organismo Tamanho do Genoma (pares de bases) N° Estimado de Genes
Homem (Homo sapiens) 3 bilhões 30.000
Rato (M. musculus) 2,6 bilhões 30.000
Mostarda (A. thaliana) 100 milhões 25.000
Roundworm (C. elegans) 97 milhões 19.000
Mosca das frutas (D. melanogaster) 137 milhões 13.000
Levedura (S. cerevisiae) 12,1 milhões 6.000
Bactéria (E. coli) 4,6 milhões 3.200
Virus da AIDS (HIV) 9700 9
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 29

mbi.ucla.edu/) (Salwinski et al, 2004)
e MINT – Molecular INTeractions
(http://cbm.bio.uniroma2.it/mint/)
(Zanzoni, et al, 2002). Informações
sobre interação antígeno-anticorpo são
disponíveis no IMGT – International
Immunogenetics Database
(imgt.cines.fr) (Lefranc, 2004).
Cada vez mais se torna evidente
que a aplicação de dados de seqüências
de DNA, utilizando informações
sobre a relação entre a seqüência de
DNA do gene e a função protéica, não
sustenta a atribuição infalível de função
para as proteínas. Muitas evidências
mostram a fragilidade das constatações
feitas puramente a partir de
seqüências genômicas, sugerindo que
(i) embora a seqüência genômica possa
ser usada para predizer “open reading
frames” (ORFs), tais predições são
ainda muito grosseiras e passíveis de
erro, principalmente em eucariotos.
(ii) O processamento do mRNA tem
uma influência importante no produto
final da expressão gênica; o proteoma.
É o caso do splicing alternativo,
em que, pela montagem de diferentes
combinações de exons, um prémRNA
dá origem a dois ou mais mR-
NAs diferentes, que codificam para
produtos protéicos diferentes. Como
resultado, as modificações advindas do
processamento do mRNA permitem
que seja produzida uma variedade de
proteínas superior ao número de genes
do genoma. (iii) Existe uma enorme
diversidade de modificações pós-traducionais
que uma proteína pode sofrer,
influenciando a sua função, localização
celular e atividade. A informação
da seqüência de DNA ainda não
dá um discernimento claro sobre modificações
pós-traducionais a que cada
produto protéico está sujeito, sendo
difícil, se não impossível, estabelecer
um número de proteínas produtos
que cada gene codifica. (iv) Os mecanismos
de controle da expressão gênica
envolvem uma rede complexa e
variável de interações moleculares,
cujo entendimento é ainda bastante
rudimentar. Esses mecanismos não são
prontamente evidentes a partir do
conhecimento da seqüência de DNA
Fig.5: Fruto de mamão
do genoma, havendo ainda grandes
(Carica papaya L. cv tainung
limitações em se utilizar a informação
1) mostrando aspectos e
da seqüência de DNA com o intuito
quantidade de sementes por
de conhecer o conteúdo e a dimani-
fruto
cidade das proteínas codificadas por
um determinado genoma.
Fotografia versus filme
Certos grupos de proteínas interagem
entre si para realizar determinados
trabalhos celulares. Um exemplo
bem típico são as proteínas organizadas
em vias metabólicas como a
glicólise, o ciclo de Krebs, e outras,
em que os produtos gênicos chamados
enzimas precisam trabalhar em
harmonia. Outro exemplo bem conhecido
é o caso das proteínas estruturais
que devem estar juntas e organizadas
precisamente para exercer a
sua função, como exemplo, os componentes
de uma unidade ribossomal,
as histoproteínas que são essenciais
para manter a estrutura da cromatina
etc. Desse modo, em estudos de
expressão gênica é habitual assumir
que grupos de genes cujos modelos
de expressão são similares entre si,
sejam provavelmente funcionalmente
relacionados.
Um problema com as técnicas de
agrupamento de dados de expressão
gênica (ESTs, SAGE, Microarrays), no
entanto, é que elas são baseadas na
suposição de que os genes que apresentam
modelos de expressão similares
são de fato relacionados funcionalmente,
isto é, eles têm funções que
são relacionadas. Essa interpretação
geralmente leva a erros na tentativa
de entender a relação real entre os
genes [através dos seus produtos].
Existem razões para pôr em dúvida
essa suposição: primeiro, ainda é
muito inconsistente o conhecimento
de quão discretamente trabalham os
grupamentos funcionais de genes na
maquinaria celular. Pode ser que
produtos gênicos individuais tenham
tantos papéis diferentes em diferentes
circunstâncias, que vários deles participem
de papéis essenciais em mais
de uma função. Por exemplo, os processos
de defesa contra estresses bióticos
(originados do ataque de agentes
patogênicos), ou estresses ambientais,
podem ser extremamente complexos
e envolverem diferentes mecanismos
atuando em conjunto. Segundo,
o termo “relacionados funcionalmente”
é por si só mal especificado.
Se o modelo de expressão de um
gene é similar ao de um outro gene,
isso pode significar vários tipos de relacionamento,
desde “dois genes tendo
produtos que interagem fisicamente”,
“um gene que codifica para
um fator de transcrição para outro
gene”, “dois genes ambos com seqüências
promotoras ligadas por repressores
que são liberados quando
um receptor nuclear é ativado, mesmo
que os dois genes tenham funções
muito distantes”. É claro que existe um
nível de abstração no qual todos os
genes são funcionalmente relacionados
no trabalho de manter a célula viva
e produzindo todos os componentes
necessários para o organismo como um
todo. Mas abaixo desse nível de abstração
existem muitos alternativos,
pela sua natureza, favorecendo a
definição de agrupamento. Portanto,
é perfeitamente questionável a atribuição
indistinta de que similaridade
em expressão corresponde à similaridade
em função.
Além disso, o que constitui realmente
um modelo de expressão similar
é ainda pouco preciso, ou pelo
menos existem múltiplas definições
alternativas. Por exemplo, similaridade
poderia significar ter um modelo de
mudança similar ao longo do tempo.
Pode significar também níveis absolutos
de expressão a qualquer dado
momento, ou pode significar a perfeita
oposição, mas bem coreografada
no modelo de expressão. Pensando
em métodos comparativos, qual
medida de discrepância exatamente
escolhida para medir os modelos de
expressão influenciará o tipo de agrupamento
funcional esperado. Métodos
confiáveis e exeqüíveis em escala
genômica para medição absoluta da
expressão gênica precisam ainda ser
desenvolvidos.
Corretamente interpretados ou
não, dados de expressão gênica vêm
sendo acumulados em volume e variedade
cada vez maior. Um ensaio isolado
de hibridação com DNA Microarrays,
por exemplo, fornece na melhor
das hipóteses uma visão estática
do nível de expressão comparativo entre
os genes amostrados. Seria como
a fotografia do evento. Mas dificilmente
uma fotografia consegue mostrar
todo o panorama. Uma nova fotografia,
tomada de um outro ângulo,
30 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

pode mostrar nuances que não haviam
sido captadas anteriormente, e
assim por diante. Conhecer as
mudanças é diferente de percorrer o
caminho que leva aos estados diferenciados.
Por exemplo, entender a
trajetória da ocorrência de vários RNAs
mensageiros em vez de conhecer
apenas valores absolutos ou comparativos
em um dado momento, proporciona
muito mais informação sobre
a operacionalidade do sistema.
A vida é essencialmente dinâmica.
Apenas o filme, isto é, a análise
dinâmica do sistema, pode dar suporte
para o entendimento completo dos
processos biológicos. E aí está o
grande desafio da bioinformática. A
integração comparativa dos dados
precisa ser realizada in silico, transformando
o conjunto de imagens estáticas
no filme da vida.
As ômicas
larga escala, deu campo para o surgimento
de uma lista de novos termos,
Antes da era da bioinformática, que não pára de crescer. Estamos entrando
somente duas maneiras de fazer experimentação
na era das ômicas (Pals-
em biologia eram disponíveis:
son,2002). Com centenas de milhares
utilizando um organismo vivo de proteínas para identificar, correlason,2002).
(também chamado in vivo) ou em cionar e entender, por exemplo, não
um sistema artificial (também chamado
é suficiente estudar um gene, um
in vitro). Seguindo essa analogia, produto gênico ou um processo de
podemos dizer que a bioinformática cada vez. Por outro lado, estudar em
é de fato a biologia in silico. A bioinformática
larga escala um conjunto de molécu-
veio para facilitar o uso de las com o objetivo de entender mecan-
computadores no sentido de organizar ismos celulares, dificilmente podem
e analisar integradamente uma montanha
responder questões interessantes sem
Fig.6:
de
Germinação
dados complexos
de sementes
e variados,
de mamão
a assistência
sob condições
da informação
in vitro,
gerada
após
pela
ter-se retirado a sarcotesta e realizado sua assepsia
possibilitando enfrentar o desafio de
decifrar componentes importantes
dentro de um universo crescente de
informações. Isso somado ao desenvolvimento
de equipamentos poderosos
para a miniaturização e automação
da aquisição de dados biológicos em
pesquisa tradicional dirigida por hipóteses.
Por isso, os dois tipos de ciência
atualmente disponíveis, as ômicas
e as pesquisas dirigidas por hipóteses
(Weinstein, 2001), são sinérgicas e
devem ser utilizadas de modo a se
complementarem.
Genômica
A genômica se caracteriza pelo estudo dos genes e suas funções. A sua chegada, com o projeto genoma humano
no final da década de 1980, alavancou toda a revolução atual no campo da biologia. Muitas expectativas e investimentos
têm sido empregadas na genômica, visando aplicações nas áreas da indústria farmacêutica, agricultura, produção de
energia e proteção do meio ambiente. Mas a determinação da seqüência completa de vários genomas não é o final da
história. É apenas o começo, principalmente pelo fato de que mecanismos biológicos não podem ser inferidos simplesmente
a partir do conhecimento da seqüência sem o auxílio de outras estratégias de estudo, as ômicas em geral.
Genômica comparativa. Esse novo ramo da genômica, que vem se tornando cada vez mais comum dada a
quantidade de seqüências de genomas sendo produzidas, tem o objetivo de comparar todo o conteúdo de DNA do
genoma de um organismo particular com outros genomas já conhecidos. Através dessa análise pode ser possível
identificar diferenças, tanto no conteúdo gênico quanto não-gênico, que podem ser responsáveis por importantes
propriedades fenotípicas ou evolutivas, como patogenicidade, reações a condições ambientais adversas, proximidade
taxonômica entre grupos e até mesmo a aquisição (ou manifestação?) de determinados comportamentos individuais.
Transcriptômica (ou genômica funcional)
O produto inicial da expressão gênica em um organismo é conhecido como transcriptoma e se caracteriza por
uma coleção de moléculas de RNA mensageiro cuja informação biológica é requerida pela célula em um determinado
momento. Essas moléculas de mRNA são sintetizadas a partir de genes que codificam proteínas e, assim, direcionam a
síntese do produto final da expressão gênica, o proteoma, que especifica a natureza das reações bioquímicas que a
célula está apta a realizar. Um ponto importante a notar é que o transcriptoma nunca é sintetizado de novo, isto é, não
começa do zero. Cada célula recebe parte de seu transcriptoma materno quando é formada pela divisão celular, e
depois é responsável pela manutenção e adaptação do transcriptoma conforme os diferentes estágios de sua vida e o
tipo de diferenciação tomado.
Como regra geral, RNAs mensageiros bacterianos têm meias-vidas de não mais de poucos minutos e em eucariotos
a maioria dos mRNAs são degradados poucas horas após a sua síntese. O “turnover” rápido significa que a composição
do transcriptoma não é fixa e pode ser rapidamente reestruturada pela mudança no nível de síntese de mRNAs
específicos. Assim, a transcrição não resulta na síntese do transcriptoma, mas apenas o mantém pela reposição de
mRNAs que foram degradados, e promove mudanças na composição do transcriptoma ligando ou desligando os diferentes
genes ou conjuntos de genes.
Avanços tecnológicos baseados na PCR, intenso sequenciamento de cDNA e síntese de novo de ácidos nucléicos,
têm contribuído para o desenvolvimento de técnicas de quantificação de mRNA em larga escala, em muitos casos em
escala genômica, possibilitando que centenas ou milhares de genes sejam estudados em paralelo em vez de um gene
de cada vez. Métodos como Differential Display (DD), Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) e DNA array
hibridization ou DNA microarray, todos trouxeram benefícios significativos em relação ao Northern blotting em
termos de sensibilidade e número de ensaios. Entre essas tecnologias, a que vem ganhando preferência para estudar a
composição de um transcriptoma, e fazer comparações entre diferentes transcriptomas, é a técnica de DNA microarray,
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 31

que se baseia na hibridação em paralelo de ácidos nucléicos. Experimentos de expressão gênica com DNA microarrays
vêm sendo largamente utilizados para explorar o modelo de expressão simultânea e em paralelo de milhares de genes.
Isso requer ferramentas poderosas de correlação computacional.
Um DNA microarray consiste de uma coleção de sequências parciais de genes (normalmente cDNAs) que são
espotados individualmente em locais específicos de uma lâmina. Essas sequências geralmente variam de 500 a 4000
bases (idealmente 500 a 2000 bases) e podem ser escolhidas a partir de diferentes regiões do gene dependendo do
objetivo do projeto. Uma variação da técnica, chamada DNA chip, é baseada na deposição ou síntese in situ de
oligonucleotídeos para a geração de alvos. Esses chips contêm oligômeros curtos variando de 25 a 80 bases como
seqüências-alvo. Enquanto essas sequências curtas podem conferir alta sensibilidade, elas podem apresentar baixa
especificidade de ligação comparada com DNA microarrays, uma vez que as seqüências são curtas e usualmente não
representam genes conhecidos.
O uso de DNA microarrays para o estudo do modelo de expressão gênica baseia-se em dois princípios. Primeiro,
considera-se que cada gene é expresso ou não e as diferenças no seu nível de expressão em uma célula ou tecido, em
determinado momento, são um reflexo de quais mRNAs estão presentes e a sua abundância, e; segundo, as fitas de
DNA podem hibridar-se com seqüências complementares formando uma molécula estável em fita dupla.
Tipicamente, a primeira face dos dados experimentais de DNA microarrays é uma lista de genes/sequências ou
números de identificação e o seu perfil de expressão. Modelos de correlação dentro do conjunto massivo de dados de
pontos não são óbvios por uma inspeção visual. Diferentes algoritmos de agrupamento computacional precisam ser
usados simultaneamente para reduzir a complexidade dos dados e para encurtar a relação entre genes de acordo com
o seu nível de expressão ou mudanças nos níveis de expressão. Problemas relacionados com as técnicas de agrupamento
são considerados na seção anterior.
Uma das maiores vantagens da utilização da técnica de DNA microarray, comparando-a com outros métodos, é
a facilidade da análise simultânea e em paralelo de um grande número de genes e de um grande número de amostras.
Deve ser notado, entretanto, que todas essas técnicas usadas para a quantificação de mRNA proporcionam um nível de
informação empírica e não uma condição estável absoluta. Além disso, sabe-se que a detecção de uma diferença na
abundância de um mRNA específico entre duas amostras biológicas não é necessariamente refletida por uma diferença
quantitativa equivalente no nível de abundância da proteína, o que muitas vezes está implícito nos estudos.
Existem, portanto, limitações intrínsecas da técnica, entre as quais (i) a abundância do mRNA nem sempre é bem
correlacionada com a abundância da proteína, (ii) a sensibilidade e variação dinâmica dos métodos existentes são tais
que os mRNAs menos abundantes, potencialmente codificando as proteínas regulatórias mais importantes, não são
facilmente medidos como acontece com os mRNAs mais abundantes, e (iii) a atividade das proteínas codificadas pelos
mRNAs é regulada a vários níveis após a sua expressão. Por exemplo, a localização subcelular e/ou a extensão em que
as proteínas são pós-traducionalmente modificadas, não são reveladas pela medição da abundancia do mRNA.
Proteômica
Para entender a função de todos os genes em um organismo, é necessário conhecer não só quais genes são
expressos, quando e onde, mas também quais são os produtos da expressão e em que condições esses produtos
(proteínas) são sintetizados em certos tecidos. A proteômica tenta descrever o conjunto completo de proteínas produto
da expressão do genoma (James, 1997), e fornece informações importantes para complementar os estudos de transcriptômica
e metabolômica.
Os organismos podem sintetizar muitos milhares de proteínas ao mesmo tempo, e a diversidade potencial de
tipos de proteínas no proteoma certamente excede o número estimado de genes no genoma. Isso ocorre porque os
produtos de um gene podem diferir devido a splicing alternativo e uma variedade de modificações pós-traducionais
possíveis, como apresentado acima. O crescente interesse no campo da proteômica vem concentrando esforços para
acelerar o desenvolvimento e implementação de estratégias mais apropriadas para a análise de expressão e função de
proteínas em escala genômica.
Esse interesse tem ocorrido, em parte substancial, devido ao sucesso dos projetos de sequenciamentos genômicos,
considerando que a realização bem sucedida desses projetos tem resultado em uma apreciação mais extensa de
que, por si só, eles revelam menos do que se esperava sobre a biologia do organismo. Os dados de sequências
genômicas proporcionam uma plataforma essencial para um conhecimento mais amplo das estratégias experimentais
complementares que darão suporte à caracterização dos genes contidos nos genomas. A utilização integrada dessas
ferramentas possibilitará o entendimento de como os produtos desses genes atuam conjuntamente para regular as
atividades do organismo.
A proteômica depende da extração, separação, visualização, identificação e quantificação das proteínas presentes
em um organismo ou tecido, em um determinado momento. Todos esses estágios têm limitações. Portanto, atualmente,
é impossível descrever o proteoma completo de um organismo.
Atualmente, o ponto de partida para muitas tentativas na investigação das mudanças na expressão protéica
envolve a resolução das proteínas de uma mistura complexa por eletroforese 2-D e a sua subsequente identificação
usando métodos analíticos cada vez mais precisos e poderosos. Eletroforese 2-D, complementada com HPLC, permite
32 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

separar e purificar vários milhares de proteínas extraídas de um tecido ou células, em um determinado momento ou
condição. Embora a eletroforese 2-D apresente significantes limitações, parece ser o melhor método até o momento
para resolver um grande número de proteínas de uma mistura, ao mesmo tempo em que permite acessar as mudanças
no nível de expressão e a purificação de proteínas chave para subsequente caracterização.
Avanços relativamente recentes na caracterização de proteínas têm surgido da automatização de métodos como
matrix-assisted laser desortion-ionization (MALDI) e eletrospray ionization (ESI) mass spectrocopy (MS) para se
obter o fingerprinting de massa e sequenciamento de peptídeos.
Metabolômica
A metabolômica é uma área da genômica funcional que estuda as mudanças na expressão de pequenas moléculas
orgânicas, conhecidas como metabólitos, em sistemas biológicos. Ela promete complementar a genômica por permitir
avaliações objetivas do fenótipo (Weckwerth, et al, 2004).
Grande importância vem sendo dada para a combinação de dados de metabolômica com dados de expressão
gênica e proteômica. A metabolômica ajudará na revelação de como os genótipos são associados com os fenótipos e
fazer simulações de mecanismos celulares em larga escala. Em uma escala maior, o fenomenoma (Schilling et al, 1999;
Palsson, 2000) ajudará a materializar métodos de análise com a melhor tecnologia para estudos [e interpretações] do
metaboloma.
O fenomenoma requer uma organização de descobertas biológicas, quantificando e identificando todos os
metabólitos em um complexo de amostras biológicas, rápida e simultaneamente. Isso deve ser obtido sem qualquer
seleção a priori dos metabólitos de interesse, para evitar tendenciosidades. Softwares de bioinformática são necessários
para organizar e facilitar a visualização dos dados de modo a auxiliar na sua interpretação (Steuer et al, 2003; Covert et
al, 2004). Os softwares devem combinar dados obtidos por DNA microarrays, proteômica e metabolômica numa
mesma visualização.
Essa tecnologia permitirá, em última instância, a integração e correlação das mudanças globais no metabolismo e
expressão gênica. Uma análise quantitativa de todos os metabólitos em uma célula pode ajudar no entendimento de
problemas como, por exemplo, os efeitos pleiotrópicos, em que um único gene determina um número de características
não relacionadas. Problemas assim podem ser mais bem entendidos se uma alteração detectada no conteúdo de um
metabólito, utilizado em vias metabólicas diferentes, estiver relacionado com uma mutação no gene ou a sua sobreexpressão
ou inibição.
O Quadro 2 mostra a evolução
das principais novas áreas da pesquisa
biológica no últimos anos, baseada no
número de ocorrências de termos relacionados
na literatura científica.
Além dessas, uma variedade de
ômicas vem surgindo e uma sobreposição
de propósito é inevitável.
Entre outras tantas, a farmacogenômica
(Marshall, 1997) visa entender
a interação da constutuição
genética de um indivíduo com a resposta
a drogas.
A fisiômica (Sanford et al, 2002)
se dedica a fazer uma descrição quantitativa
das funções fisiológicas de um
organismo intacto. É necessário predi-
zer o fenótipo a partir do genótipo,
mas isso é difícil por causa das influências
do ambiente e as circunstâncias
do crescimento, desenvolvimento
e doenças. O objetivo é obter o
um discernimento de toda a fisiologia
de um organismo, incluindo as vias
metabólicas e todas as moléculas e
suas interações, que fazem o organismo
completo. Uma das primeiras iniciativas
nesse campo é o Projeto Fisioma
(http://physiome.org/), cujo
principal objetivo é entender o organismo
humano, descrevendo quantitativamente
a sua fisiologia e patofisiologia,
utilizando inclusive informações
provenientes dos fisiomas de outros
organismos, para melhorar a saúde
humana (Bassingthwaighte, 2000).
A regulômica (Werner, 2004) é
o estudo das instruções bioquímicas
da rede de interação gênica que controla
os mecanismos de regulação da
expressão dos genes para fazer todos
os tipos de célula necessários para
construir organismos completos (Kondro,
2004; Gao et al 2004; Roven &
Bussemaker, 2004).
A peptidômica se dedica a estudar
peptídeos pequenos (0,5 a 15
kDa), como hormônios, citoquinas,
fatores de crescimento, venenos, toxinas,
peptídeos antimicrobianos etc.
Essas moléculas têm papel fundamental
em muitos processos biológicos
(Schulz-Knappe et al, 2001; Prates &
Bloch, 2002).
A degradômica é a aplicação de
dados gerados pela genômica e proteômica
para identificar as proteases
Quadro 2 – Número de ocorrências de referências no PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih/) em algumas novas áreas da pesquisa
biológica, desde 1998. Busca limitada para os campos Título e Abstract.
Palavra chave 1988 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 Abril2004
“Genomics” 3 12 23 38 52 64 90 130 208 386 678 1263 2081 3104 4199 4660
“Comparative genomics” — — — — — — 4 8 18 37 69 126 192 291 427 503
“Functional genomics” — — — — — — — — 10 46 131 277 480 736 1016 1127
“Transcriptomics” — — — — — — — — — — 1 3 7 23 41 63
“Proteomics” — — — — — — — — 1 20 67 277 631 1254 2022 2444
“Pharmacogenomics” — — — — — — — — 1 11 37 136 249 472 702 795
“Metabolomics” — — — — — — — — — — — 2 7 28 59 81
“Peptidomics” — — — — — — — — — — — — 5 8 18 23
“Bioinformatics” — — — — 3 12 20 44 78 144 230 420 657 1058 1604 1852
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 33

e os seus substratos em escala genômica,
para descobrir novos papéis para
proteases in vivo. O objetivo é facilitar
a identificação de novos alvos para
o desenvolvimento de fármacos visando
o tratamento de doenças (Lopez-
Otin & Overall, 2002).
A epigenômica busca esclarecer
como o genoma funciona como um
PESQUISA
todo. Ela combina a genética com o
ambiente para buscar uma compreensão
dos sistemas biológicos complexos
como a plasticidade do genoma.
Embora todas as células nucleadas de
um organismo levem o mesmo
genoma, elas expressam diferentes
genes em diferentes momentos e
condições. Esses mecanismos de regulação
da expressão gênica são complexos,
e um dos principais fatores
envolvidos são as mudanças epigenéticas
resultantes da metilação
diferencial do genoma. Daí, diz-se que
resultam diferentes epigenomas. Alguns
estudos têm demonstrado o envolvimento
da metilação do DNA num
processo chamado imprinting
genômico, que controla a expressão
de alguns genes em mamíferos, podendo
ter efeito no surgimento de
doenças, especialmente o câncer.
Novik et al (2002) apresenta uma revisão
sobre o assunto.
A toxicogenômica (Kramer &
Kolaja, 2002 e Guerreiro et al, 2003)
marca um novo paradigma no desenvolvimento
de drogas e análise de
risco, que promete gerar uma enorme
quantidade de informação na direção
de aumentar o entendimento do
mecanismo molecular que leva à toxicidade
da droga e eficiência. É esperado
que a toxigenômica seja mais e
mais integrada com todas as fases do
processo de desenvolvimento de drogas,
particularmente na toxicologia
mecanística e preditiva, e descobrimento
de biomarcadores, buscando
identificar polimorfismos no DNA relacionados
com a suscetibilidade individual
à toxicidade em relação a uma
determinada droga. O objetivo é a
seleção de candidatos no sentido de
ajudar a desenvolver e utilizar drogas
que produzam menor toxicidade.
Antes e depois da genômica:
a velha e a nova biologia
Depois do descobrimento da
dupla fita de DNA, do código genético,
enzimas de restrição, PCR e tantos
avanços na biologia molecular durante
a segunda metade do século
passado, na última década experienciamos
uma nova revolução no campo
da biologia com a era da genômica,
e com ela muitas outras ômicas,
como apresentado acima. Nesse contexto,
muitas perguntas surgiram e
permanecem ainda sem respostas
satisfatórias, como: quais os impactos
da genômica nos projetos de
pesquisa nas diversas áreas das ciências
biológicas? o método científico
Figura 2. Ilustração do processo
de obtenção de novas
descobertas nos diversos
campos da ciência.
ainda é relevante? a bioinformática é
uma disciplina separada? como pode
ser melhorada a comunicação entre
as culturas científicas atuais e a tecnologia
da informação (IT) para solucionar
a necessidade da integração
dos dados disponíveis, que apresentam-se
em fontes e formatos tão variados?
perguntas como essas são
chaves para as ações futuras nas biociências.
Fazendo um paralelo entre a
velha biologia e a situação atual, podemos
notar que o predomínio de
pesquisadores mais ou menos independentes
e profundamente especializados
em um domínio estreitamente
focado, não é adequado para
a nova ciência cada vez mais integrada
e ampla. Os estudos voltados para
um gene ou uma função de cada vez
dão lugar para a análise quantitativa
de centenas de milhares de genes, e
não mais focalizando apenas uma espécie,
mas com uma abordagem de
integração comparativa de dados interespecíficos.
Os grandes investimentos
voltados para enfoques
científicos muitas vezes pouco
abrangentes e hipóteses dirigidas pela
pesquisa são substituídos pela automação
e miniaturização, reduzindo
o custo e aumentando a velocidade
da coleta de dados. A necessidade da
busca de ferramentas computacionais
básicas e somente para analisar conjuntos
de dados é suplantada pela rápida
disponibilidade de bancos de dados,
grandes demais para um pesquisador
conseguir analisar os dados
sozinho. E, assim, onde estão as hipóteses?
poderíamos caracterizar essa
revolução como uma grande expedição
para o acabamento da ciência
da vida? quais são os impactos para a
sociedade?
Embora se tenha observado uma
grande mudança no tipo e quantidade
de dados obtidos, e a validade do
método científico ser colocado em
xeque, o plano clássico no curso da
ciência continua sendo válido. Os dados
geram informação, que gera novos
conhecimentos, que proporcionam
o caminho para novas descobertas.
No final, algumas vezes, paradigmas
são transpostos (Figura 2). A principal
diferença é que até algumas
décadas atrás, esse processo requeria
somente poder de raciocínio, lápis e
papel. Agora requer tecnologia computacional
sofisticada. Para isso, os
centros de pesquisa e universidades
cada vez mais terão que ter seus próprios
grupos de bioinformática, mantendo
equipes multidisciplinares com atividades
que de um lado promovam
uma melhor exploração dos dados biológicos
através de ferramentas de
bioinformática e, por outro lado, as
questões geradas pelos dados biológicos
obtidos possibilitem melhorar as
ferramentas de bioinformática. A bioinformática
será cada vez mais importante
em termos de integração da informação,
buscando impulsionar a
aquisição de conhecimento sobre os
sistemas biológicos para a geração de
novas saídas para problemas na agricultura,
medicina, produção de energia
e conservação do meio ambiente.
O papel da bioinformática
em expansão
Os projetos genoma transformaram
a biologia em muitos sentidos, mas
34 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

o mais impressionante avanço foi a
emergência da bioinformática e o treinamento
dos cientistas em tecnologias
modernas de pesquisa. Inicialmente
a bioinformática teve como
aplicação principal facilitar o manuseio
da grande quantidade de dados gerados
pelos projetos genoma, como a
montagem de contigs e fechamento
de seqüências genômicas, além de dar
suporte para outras estratégias experimentais
no campo da biologia molecular.
De lá para cá, muitas informações
foram disponibilizadas em bancos de
dados públicos de seqüências gênicas,
proteínas, estruturas de macromoléculas,
perfil metabólico, filogenia e outros,
cujo valor ainda não pode sequer
ser estimado. Hoje não é mais possível
avançar em biotecnologia sem a
integração da tecnologia da informação
com a tecnologia experimental.
As abordagens de estudos biotecnológicos
atualmente buscam resolver
questões específicas, optando-se
normalmente por fazer uma análise
computacional inicial com a utilização
dessas informações para direcionar e
selecionar as estratégias experimentais,
com considerável economia financeira
e de tempo, sem considerar a
efetividade de tais procedimentos na
aceleração da obtenção dos resultados
e descobertas científicas.
Além disso, muitas descobertas
estão sendo feitas simplesmente pela
análise sistematizada dessas fontes de
dados, que não param de crescer tanto
em volume como em complexidade
e variabilidade. A tendência atual
é para descobertas científicas e síntese
sendo dirigidas pela informação
emergindo intrinsecamente a partir da
biologia em si e a partir da diversidade
e heterogeneidade das observações
experimentais. Um projeto típico de
pesquisa pode começar com a coleção
de sequências genômicas conhecidas
ou não conhecidas. Para sequências
não conhecidas, pode-se conduzir uma
busca em bancos de dados por sequências
similares ou usar algoritmos computacionais
procurando predizer as
suas possíveis identidades e funções.
Isso requer o acesso à versão mais
atual da coleção de dados, em bancos
de dados mundiais, e as ferramentas
fundamentais da bioinformática agora
são cada vez mais parte dos métodos
experimentais. Entretanto, essas informações
estão espalhadas em múltiplas
fontes, impossibilitando que os cientistas
obtenham direta e eficientemente
a informação requerida para
converter os dados complexos e heterogêneos
em dados úteis, informação
organizada e sistematizada conforme
as linhas de pesquisa específicas.
Nesse ambiente, para responder
uma simples questão pode ser
necessário acessar várias fontes de
dados e utilizar ferramentas de análise
sofisticadas, como alinhamento de
sequências, agrupamento, modelagem
molecular etc. Enquanto a integração
dos dados é uma área de pesquisa
dinâmica, necessidades específicas
dos biocientistas têm levado ao
desenvolvimento de numerosos sistemas
que acabam desconectando o
acesso aos dados em um ambiente
direcionado por resultados. O resultado
é o crescente número de bancos
de dados e web sites representando
uma coleção confinada de dados, governada
por sistemas próprios de gerenciamento
e formatos particulares de
input e output dos dados, apresentações
gráficas dos resultados, e problemas
sérios de compatibilidade e
interoperabilidade com outros sistemas.
Uma evidência disso é o número
crescente de novos bancos de dados
relatados a cada ano na edição de
janeiro da Nucleic Acids Research
(http://nar.oupjournals.org/). A edição
atual lista 548 bancos de dados, 162 a
mais em relação ao ano anterior (Galperin,
2004). Boa parte desses bancos
ainda são construídos com enfoques
extremamente limitados para
aplicações restritas, sem a preocupação
com relação à compatibilidade
e troca de informações com outros
sistemas. Adaptações são lentas e
muitas vezes difíceis de implementar
quando a filosofia básica do banco precisa
ser mantida.
O acesso a esses dados precisa
melhorar em termos de eficiência,
velocidade e facilidade. Para facilitar
o entendimento dos processos biológicos,
é necessário fazer novos arranjos
aos recursos de dados disponíveis. Por
exemplo, o que se faz inicialmente
em uma rota metabólica, uma rede de
interações moleculares etc., é
necessário generalizar para outros
sistemas biológicos; a partir de E. coli
para levedura, e chegar à biologia de
organismos mais complexos, como o
homem, animais e plantas economicamente
importantes. Trabalhar toda
essa informação conjuntamente é fundamental
para a geração de novos insights.
O rápido crescimento do volume
de dados é um desafio para cada
um, e com a produção de dados mais
diversos e em larga escala (por e-
xemplo, dados de DNA microarrays)
esse crescimento está apenas
começando.
As atividades de bancos de dados
e desenvolvimento de algoritmos
computacionais precisam estar integradas
para produzir uma infra-estrutura
de informação coesiva delimitando
toda a biologia. Para isso é necessário
o desenvolvimento de ferramentas
para disseminar e analisar massivas
quantidades de dados, inclusive literatura,
e a construção de comunidades
de bancos de dados baseadas em
princípios operacionais padronizados
e com padrões interoperacionais.
Muitos dos problemas da bioinformática
são genéricos, por isso
soluções em um domínio podem ser
naturalmente aplicáveis para outros.
O entendimento da informação molecular
até a célula, órgão e o sistema
biológico do organismo será o maior
desafio (fenomenoma). A passagem
do genótipo para o fenótipo requererá
um novo conjunto de ferramentas
computacionais altamente robustas. O
principal enfoque da bioinformática
para os próximos anos será integrar
esses dados de modo a permitir buscas
transparentes através dos dados.
Fazer isso de forma robusta abrangendo
todo o conjunto de dados é um
desafio real.
Apesar do avanço já feito, é
necessário continuar a pesquisa no
campo da genômica, principalmente
para microrganismos associados a
plantas economicamente importantes,
incluindo fungos, e buscar entender
as interações hospedeiro-microrganismo
ou planta-patógeno. No caso da
medicina, a necessidade atual é por
dados clínicos bem estruturados e consistentes
sobre grandes populações.
Tais dados, que são difíceis de coletar
e caros, serão críticos para ligar os
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 35

dados moleculares com o fenótipo.
Embora exista um crescente número
de centros de bioinformática, a maior
tendência é que ela esteja presente
nos centros de pesquisa e nas universidades,
em cada departamento de
biologia ou biotecnologia, em cada
faculdade na área das ciências biológicas
em todo o mundo. Todos os
grandes centros de pesquisa terão que
ter profissionais especializados em bioinformática/biologia
computacional.
Hoje é consenso geral que essas instituições
necessitam de pessoas com
esse entendimento em seus departamentos
de biologia e necessitarão formar
os seus estudantes de graduação
em biologia quantitativa em vez de
somente biologia experimental. Os
experimentos precisam ser feitos no
contexto do conhecimento corrente,
e os dados gerados precisam ser rapidamente
armazenados e explorados
computacionalmente juntamente com
o universo de informação disponível.
Nunca na história da ciência as
informações foram tão democraticamente
acessíveis como hoje. Especialmente
as informações e ferramentas
disponibilizadas pela bioinformática.
Não importa quem e onde. O mesmo
tipo de informação pode ser acessada
por qualquer pessoa, em qualquer
lugar do mundo. Praticamente todas
as ferramentas de bioinformática e
bancos de dados disponíveis podem
ser dispostos de modo que possam
ser acessadas e utilizadas na web. Basta
fazer a pergunta correta e buscar a
resposta.
Conclusão
O debate que está emergindo
atualmente é se existe uma pletora
ou escassez de dados experimentais
proveitosos derivados pala plataforma
das ômicas. O grande desafio, no entanto,
é o que se pode fazer com esses
dados. Não há dúvida de que a
tecnologia da informação precisa ser
tomada como parte integral do processo
de descoberta pelos pesquisadores
no campo da biologia. Este é o
problema fundamental que precisa ser
resolvido pela bioinformática, promovendo
um profundo impacto no processo
de descobertas biológicas. É
necessário que ocorram discussões
freqüentes entre todos os especialistas
participantes de estudos relacionados,
visando um emprego mais adequado
da cultura científica dos participantes,
já que, de modo simplificado,
os biólogos querem entender
como os organismos funcionam e os
cientistas da computação querem fazer
ferramentas que resolvam problemas.
O estabelecimento de uma linguagem
comum entre os especialistas em diferentes
áreas, o monitoramento de quais
ferramentas são mais usadas e importantes
para o escopo do estudo, uma
filosofia orientada para novas
descobertas, não orientada por dogmas,
são recomendações importantes
para o sucesso dos empreendimentos
científicos. Treinamentos constantes
e workshops devem fazer parte
dos investimentos previstos nos projetos.
O bom entendimento entre os
pesquisadores de diferentes áreas é
fundamental. Por exemplo, os cientistas
da computação devem ser pacientes
com o biólogo, já que este
geralmente não sabe exatamente
onde quer chegar ou o que espera dos
dados (o que é natural nos estudos
biológicos). Deve ensinar pelo menos
os conceitos básicos de computação
para estabelecer uma plataforma comum
de comunicação, encorajar os
biólogos a mostrar como eles estão
realmente usando as ferramentas disponibilizadas
e buscar sempre proporcionar
o máximo de acesso aos dados.
A retenção longa dos dados inibe
o espírito de comunidade. Por parte
do biólogo, espera-se que não espere
muito ou tente fazer as coisas sozi -
nho, fale com uma variedade de cientistas
da computação, encontre aqueles
mais interessados no seu problema,
encontre aqueles com quem gosta
de trabalhar, faça perguntas com
freqüência e logo que surjam, use uma
variedade de novas ferramentas, fazendo
comentários/sugestões assim
que puder e busque entender os desafios
da computação para solucionar
problemas novos. A obtenção de novos
conhecimentos acelera quando
todos contribuem.
Agradecimentos
Aos colegas Dr. Francisco Prosdocimi,
Dr. Newton Portilho Carneiro
e Dr. Alexandre Lima Nepomuceno
pela revisão crítica deste artigo.
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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 37

BIODIESEL
Pesquisa
Produção de biodiesel por transesterificação de óleos vegetais
Gabriela Alves Macedo
Dra. em Ciência de Alimentos
Professora da Faculdade de Eng. de Alimentos
UNICAMP
gmacedo@fea.unicamp.br
Juliana Alves Macedo
Graduanda em Engenharia de Alimentos
UNICAMP
macedo@fea.unicamp.br
Resumo
biodiesel (ésteres de ácidos
graxos), que é derivado de
triglicerídeos por transesterificação
com metanol ou
etanol, tem atraído considerável atenção
como combustível renovável, biodegradável
e não-tóxico. Muitos processos
têm sido desenvolvidos para
produção de biodiesel, mas a transesterificação
usando álcali como catalisador
tem gerado altos níveis de conversão
de triglicerídeos em ésteres
metílicos em curto tempo de reação.
Por essa razão, este processo tem sido
adotado para produção de biodiesel
em muitos países da Europa e América
do Norte. Recentemente, a tran-
Figura 01. Transesterificação de triglicerídeos com álcool. (a) Equação
geral; (b) Três reações consecutivas e reversíveis. R1, R2, R3 e R’
representam os grupos alquila.
sesterificação enzimática, empregando
lipases, tornou-se mais atrativa para
a produção de biodiesel, uma vez que
o glicerol produzido como subproduto
pode ser facilmente recuperado e
a purificação dos ésteres é completa.
A maior dificuldade da comercialização
deste sistema ainda é o custo da
produção de lipases. O custo de produção
das lipases pode ser reduzido
através da aplicação de genética molecular
produzindo lipases de alta produtividade,
seletividade e estabilidade
e da imobilização das mesmas, viabilizando
a reutilização seguida em
reações.
Introdução
Combustíveis alternativos para
motores a diesel são cada vez mais
importantes devido à escassez das
reservas de petróleo e aos problemas
de poluição ambiental. Um grande
número de estudos tem mostrado que
os triglicerídeos são uma alternativa
promissora ao diesel (Bartholomeu,
1981-Ziejewski and Kaufman, 1983).
Contudo, o uso direto de óleos vegetais
e/ou misturas de óleos são considerados
insatisfatórios e não práticos
tanto para motores de injeção direta
como indireta, movidos a diesel. Dentre
os principais problemas apresentados
estão: a composição de ácidos
graxos dos óleos vegetais, a alta viscosidade,
a acidez, a presença de gomas
formadas por oxidação e polimerização
durante a estocagem e a deposição
de carbonos, entre outros (Ma
and Hanna, 1999). Conseqüentemente,
um grande número de estudos têm
sido conduzidos a fim de desenvolver
derivados de óleos vegetais, cujas propriedades
e performance se aproxi-
38 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

mem do tridiocarboneto óleo diesel.
Os principais problemas encontrados
são a viscosidade muito alta, baixa
volatilidade e caráter polinsaturado
dos óleos vegetais (Srivastava and
Heyes, 1962).
São três os processos mais investigados
a fim de sobrepor os problemas
encontrados na substituição do
diesel por óleos vegetais: a pirólise, a
micro-emulsificação e a transesterificação.
Pirólise é a conversão química
causada pela aplicação de energia térmica,
na presença de nitrogênio. Muitos
estudos foram realizados com a
pirólise de triglicerídeos com o objetivo
de obter produtos adequados aos
motores a diesel (Grossley et al.,
1962- Billaud et al., 1995). A decomposição
térmica dos triglicerídeos produz
diferentes tipos de compostos,
incluindo alcanos, alcenos, alcadienos,
ácidos carbonílicos e aromáticos, dependendo
da fonte do óleo vegetal
decomposto. A pirólise do óleo de soja,
por exemplo, contém 79% de carbonos
e 12% de hidrogênio (Schwab et
al., 1988), apresentando baixa viscosidade
e alto número de cetano comparado
ao óleo puro. Contudo, apesar
de os óleos vegetais pirolisados possuírem
concentrações de enxofre,
água, sedimentos e cobre satisfatórios,
são inaceitáveis os níveis de cinzas,
resíduos de carbono e o ponto de
ignição alcançado. Embora o produto
da pirólise seja quimicamente similar
ao diesel proveniente do petróleo, a
remoção do oxigênio durante o processo
térmico elimina qualquer benefício
ambiental do produto (Ma and
Hanna, 1999).
O uso de microemulsões com
solventes como metanol, etanol e 1-
butanol é outro processo que vem
sendo estudado com o objetivo de
resolver o problema da viscosidade
dos óleos vegetais (Schwab et al.,
1987- Ziejewski et al., 1984).
Microemulsões são dispersões
isotrópicas, termodinamicamente estáveis,
de óleo, água, sulfactante e
geralmente uma molécula pequena
amfifílica, chamada cosurfactante
(Schwab et al., 1987). Ziejeuski et al.,
1984, prepararam uma emulsão de
53,3% (v/v) de óleo de girassol, 13,3%
(v/v) de etanol e 33,4% (v/v) de 1-
butanol. Esta emulsão não-iônica apresentou
viscosidade de 6,31.10 -6 m 2 /s
a 40ºC, número de cetano de 25,
0,01% de enxofre e 0,01% ácidos graxos
livres e cinzas inferior a 0,01%. A
Tabela 1. Propriedades físicas e químicas do biodiesel.
viscosidade obtida foi ainda menor
quando se aumentou a concentração
de 1-butanol.
Schwab et al, 1987, reportaram
que o 2-octanol foi efetivo na solubilização
micelar de metanol em trioleína
e óleo de soja. Contudo, foram
observados, em escala laboratorial,
depósitos de carbono e aumento da
viscosidade.
A transesterificação, também
chamada alcóolise, é a troca de um
álcool de um éster por outro álcool
em um processo similar ao da hidrólise,
exceto o fato de que não se trata
de um álcool no lugar da água. Os álcoois
que podem ser utilizados são o
metanol, etanol, propanol, butanol ou
álcool amílico. Metanol e etanol são
utilizados mais freqüentemente. Nos
estudos publicados, o metanol tem
sido o mais empregado devido a seu
baixo custo e grande disponibilidade
na Europa, Japão e EUA. O etanol
pode também ser utilizado e visto que,
no Brasil existe grande disponibilidade
deste produto a baixo custo, provavelmente
será este o substrato para
o biodiesel brasileiro.
A transesterificação tem sido
largamente utilizada para diminuição
da viscosidade dos triglicerídeos, me-
Óleo vegetal
metil éster
a
Clark et al., 1984
b
Smith, 1949.
c
Sprules and Price, 1950.
Viscosidade
2
cinemática
(mm /s)
Número
de cetano
Poder
calorífico
inferior (MJ/l)
Ponto de
n évoa ( º C)
Ponto de
f lash ( º C)
Densidade (g/l)
a
Amendoim
4 .9(37. 8º C)
54
33.
6
5 176
0.88
3
-
Soja
ª
4 .5(37. 8 º C)
45
33.
5
1 178
0.88
5
-
b
Soja
4 .0(4 0º) 45.7-56
32.
7
- - 0 .880 (15º C)
-
a
Babaçu
3 .6(37. 8º C)
63
31.
8
4 127
0.87
9
-
a
Palma
5 .7(37. 8º C)
62
33.
5
13
164
0.88
0
-
b
Palma
4 .3-4.5(4 0º C)
64.3-70
32.
4
- - 0 .872-0.877 (15º C)
-
a
Girassol
4 .6(37. 8º C)
49
33.
5
1 183
0.86
0
-
a
Gordura
vegetal - - - 12
96
- -
b
Semente
de colza 4 .2(4 0º C)
51-59.
7 32.
8
- - 0 .882 (15º C)
-
c
Óleo de colza usado 9 .48(3 0º C)
53
36.
7
- 192
0.89
5
0.00 2
Sulfur.
(wt%)
c
Óleo de milho usado 6 .23(3 0º C)
63.
9 42.
3
- 166
0.88
4
0.001 3
Óleo diesel
c
JIS-2D
(gasolina)
b
12-3.5(40
º C)
2 .8 (30º C)
51
58
35.5
42.7
-
-
-
59
0.830-0.840
( 15º C)
0.833
-
0.05
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 39

lhorando as propriedades físicas dos
combustíveis para o motor a diesel
(Clark et al., 1984). Assim, ésteres etílicos
ou metílicos de ácidos graxos
(conhecidos por biodiesel) obtidos por
alcóolise de óleos vegetais podem ser
usados como combustíveis alternativos
para os motores a diesel.
As propriedades do biodiesel e
diesel são comparadas na tabela 1 (Srivastava
and Prasad, 2000; Yamane et
al., 2001; Varese and Varese, 1996).
O biodiesel produzido a partir
de vários óleos vegetais possui viscosidade
próxima ao do diesel convencional.
Os valores de poder calorífico
inferior são menores, mas possuem
número de cetano e ponto de flash
altos. Uma vez que as características
do biodiesel são geralmente similares
às do diesel, teoricamente, este é um
forte candidato a substituir parcialmente
o diesel, caso sua produção a se
viabilizar economicamente.
Dentre as vantagens da utilização
do biodiesel podem ser citadas:
(I)
(II)
(III)
(IV)
É um combustível nãoderivado
do petróleo,
mas proveniente de plantas,
portanto sua combustão
não aumenta o nível
atual de CO 2
na atmosfera,
Pode ser produzido localmente
e em pequenas
escalas, reduzindo importação
de petróleo,
É biodegradável,
Comparativamente, sua
combustão produz reduzidos
níveis de CO, NO
e material particulado.
Trata-se de um fato estabelecido
que a queima de biodiesel reduz
substancialmente a emissão de SO x
óxidos de enxofre e hidrocarbonetos.
Existe um pequeno aumento atribuído
à adaptação dos motores a diesel
(Yamane et al., 2001-Sams, 1998).
Yamane et al., 2001; recentemente
publicaram que um biodiesel
com boa taxa de ignição, assim como
alta concentração de metil oleato, gera
menores níveis de NO, hidrocarbonetos,
HCHO, CH 3
CHO e HCOOH. Sheehan
et al, 1998, publicaram um estudo
mostrando que o benefício ambiental
de utilizar o biodiesel é proporcional
ao nível de mistura com o diesel
comum.A queima do biodiesel
(100%) pode reduzir em 78,45% as
emissões de CO 2
. Misturado na faixa
de 20% ao diesel comum, reduz
15,66% a emissão de CO 2
.
As conseqüências disto podem
ser vantajosas tanto do ponto de vista
ambiental como do ponto de vista
econômico, o que justifica o crescente
interesse no desenvolvimento das
tecnologias referentes à produção de
biodiesel.
Este trabalho busca sintetizar os
processos de transesterificação de óleos
existentes para a produção de biodiesel,
enfatizando a importância da
transesterificação enzimática.
A reação de transesterificação
Como já foi mencionado, o biodiesel
pode ser produzido por pirólise,
microemulsões ou transesterificação.
A transesterificação (também
chamada de alcóolise) é a reação de
formação de ésteres a partir de óleos
e álcoois, resultando em glicerol.
Dentre os álcoois que podem
ser empregados neste tipo de reação
o metanol e o etanol são os mais empregados,
principalmente pelo custo
e suas propriedades físico-químicas
(menor cadeia carbônica). Estes podem
reagir rapidamente com os triglicerídeos
e o catalisador NaOH é facilmente
dissolvido. Para completa transesterificação
estequiométrica é necessário
ter uma relação molar de 3:1,
no mínimo, entre o álcool e triglicerídeos.
A reação de transesterificação
pode ser catalisada por álcalis, ácidos
ou enzimas, e é o processo usado para
produção de biodiesel nos Estados
Unidos e na Europa. Essa reação também
é usada na produção de ésteres
metílicos para outras aplicações como
detergentes e cosméticos. Os parâmetros
importantes na reação de transesterificação
são:
a) A concentração de ácidos graxos
livres nos óleos é fator
importante na reação quando
catalisada por NaOH, pois
será maior seu requerimento
para a neutralização. O conteúdo
de água nos reagentes
deve ser baixo, pois podem
ser formados sabões no processo,
o que aumenta a viscosidade
final do produto e
dificulta a separação do glicerol.
(Bradshaw and Meuly,
1944; Freedman et al., 1984;
Feuge and Grose, 1949).
b) O efeito da relação molar
entre os reagentes é outro
fator importante no rendimento
da reação. Este fator
está associado ao tipo de catalisador
utilizado, por exemplo:
Na catálise ácida necessita
de 30:1 de butanol e óleo
de soja, enquanto na alcalina
só foi requerido 6:1 para atingir
a mesma taxa de esterificação,
por exemplo (Freedman
et al., 1986).
c) Os tipos de catalisadores possíveis
são os ácidos (H 2
SO 4
,
HCL, derivados H 2
PO 4
), alcalinos
(KOH, NaOH) ou enzimas
(lipases). A catálise alcalina
é muito mais rápida do
que a ácida, contudo, quando
se utilizam óleos usados
com alto teor de água e ácidos
graxos livres, a catálise
ácida é mais indicada (Sprules
and Price, 1950- Freedman
et al., 1986). Os estudos
empregando lipases
como biocatalizadores começaram
a ser publicados no
início da década de 90.
d) O efeito do tempo de reação:
normalmente o grau de
esterificação aumenta com o
tempo. As reações são rápidas
se a dispersão é boa, duram
até 15 minutos nas catálises
químicas.
e) O efeito da temperatura é
variável em função dos tipos
de óleos e do catalisador. A
metanólise alcalina de óleo
de mamona ocorreu bem
entre 20-35ºC (Smith, 1949).
Cinética das reações de
transesterificação
Existem muitos estudos relatados
na literatura sobre a cinética da
40 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Catálise
Alcalina
Catálise Enzimática
Temperatura
de reação
60-70ºC 30-40ºC
Ácidos graxos livres no óleo não
refinado
Água
na matéria-prima
Rendimento de
metil ésteres
Recuperação do glicerol
Purificação de
metil ésteres
Produtos saponificados
Interferência
na reaçã o
Norma
l
difíci
l
Lavagens consecutiva s
Tabela 2. Comparação entre catálise alcalina e catálise enzimática com lipases para
a produção de biodiesel
Metil éstere s
Sem influênci a
Alto
Fáci l
Nenhum a
catálise ácida (Freedman et al., 1986-
Eckey, 1956) e básica (Freedman et
al., 1986; Noureddini and Zhu, 1997)
das reações de transesterificação. Dufek
et al., 1972; estudaram a esterificação
e transesterificação por catálise
ácida do ácido 9(10)-carboniesterático
e seus mono e di ésteres metílicos.
Freedam et al., 1986; relatam a reação
de transesterificação de óleo de
soja e outros vegetais com álcoois,
examinando o efeito do tipo de álcool,
a relação molar entre os reagentes,
tipo e concentração do catalisador e
temperatura de reação na ordem e
curso da reação. Tanto na presença
de ácido, quanto na presença de base
como catalisadores, a reação apresentou-se
como sendo de pseudo-primeira
ordem para o butanol e óleo de soja
na proporção de 30:1. Na proporção
de 6:1 de butanol e óleo de soja com
catalisador alcalino, a reação apresentou
cinética de segunda ordem. Para
metanol e óleo de soja (6:1) com
0,5% de metóxido de sódio, a cinética
foi combinada de segunda e quarta
ordem. Serão discutidos brevemente
a seguir os efeitos da presença de ácidos
graxos livres, da relação molar
entre os reagentes e do tipo de catalisador
no processo de transesterificação.
Efeito da relação molar entre os
reagentes: Uma variável importante na
taxa de esterificação é a relação molar
entre o álcool e o óleo. A
estequiometria da reação de
transesterificação requer 3 moles de
álcool por mol de triglicerídeos, para
render 3 moles de éster e um mol de
glicerol (veja a Fig.1a). Alta relação
molar resulta em maior obtenção de
ésteres em menor tempo de reação.
Na reação de alcóolise de óleo de
amendoim com etanol, na proporção
de (6:1), foi liberada maior quantidade
de glicerol do que na proporção
(3:1). Freedman et al.1984, estudaram
ainda, o efeito da relação molar (de
1:1 para 6:1) na conversão de óleos
vegetais em ésteres metílicos. Os óleos
de soja, girassol, amendoim e algodão
apresentaram comportamento similar,
com maior taxa de conversão atingida
na proporção 6:1. Krisnangkura e
Simamaharunop, 1992, estudaram a
transesterificação de óleo de palma a
70ºC em presença de solvente orgânico
com metóxido de sódio como
catalisador. Observaram que a taxa de
conversão aumentou com o aumento
da relação molar entre o metanol e o
óleo de palma. Assim, a relação molar
de 6:1 é geralmente a mais empregada
em processos industriais para obter
ésteres metílicos em taxas de 98%
de conversão (Feuge and Grose,
1949; Fillieres and Delmas, 1995).
Efeito do tipo de catalisador: O
metóxido de sódio tem se mostrado
mais efetivo do que o hidróxido de
sódio, provavelmente por produzir
menor concentração de água durante
a reação, do que NaOH e MeOH
(Freedman et al., 1984; Hartman,
1956). Alcântara et al., 2000; reagiram
três óleos – óleo de soja, óleo de
fritura, e gordura de porco - com
metóxido de sódio em dois tipos diferentes
de reação: a transesterificação
e a amidação, com metanol e
dietilamina, respectivamente. As
amidas aumentam as propriedades de
ignição do óleo diesel. Como, tanto o
hidróxido de sódio, quanto o de potássio
são capazes de catalisar a
transesterificação, e sendo ambos
muito baratos, são extensivamente
aplicados na produção de biodiesel
industrialmente.
Catalisador químico: A reação de transesterificação
com álcool pode ser representada
pela equação geral ilustrada
na Figura 1a. A Figura 1b mostra as
reações consecutivas e reversíveis que
sofrem os triglicerídeos na transesterificação.
O primeiro passo é a conversão
dos triglicerídeos em diglicerídeos,
que é seguida pela conversão
dos últimos em monoglicerídeos e finalmente
em glicerol, rendendo uma
molécula de éster etílico em cada passo
(Freedman et al., 1986; Noureddini
and Zhu, 1997).
Catalisador enzimático: A cinética de
transesterificação de triglicerídeos com
metanol (metanólise) catalisada por
lipase de Rhyzopus oryzal parece
estar de acordo com o modelo teórico
proposto (Kaieda et al.,2001), ou
seja, inicialmente os triglicerídeos são
hidrolisados pela lipase em glicerídeos
parciais e ácidos graxos livres, e depois
são sintetizados os ésteres
metílicos com metanol e os ácidos
graxos livres (veja Fig. 1b). Isso sugere
que, diferentemente da catálise alcalina,
ácidos graxos livres contidos
em óleos usados podem ser convertidos
facilmente em ésteres na catálise
enzimática.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 41

Transesterificação catalisada
por ácidos in situ
Os ácidos utilizados para transesterificação
incluem sulfúrico, fosfórico,
hidroclórico e ácidos sulfônicos
orgânicos. Embora a transesterificação
por catálise ácida seja mais lenta que
a alcalina (Ma and Hanna, 1999; Srivastava
and Prasad, 2000; Freedman
et al., 1984), a transesterificação ácido
é melhor quando o óleo usado tem
alta concentração de ácidos graxos livres
e água, como é o caso de óleos
já utilizados para frituras e etc. (Freedman
et al., 1984; Aksoy et al., 1988).
Aksoy et al. 1988, relatam que foi
necessário realizar a reação de transesterificação
em catálise ácida quando
o óleo utilizado foi de oliva com
muitos compostos de enxofre. Em
geral, os ésteres etílicos de ácidos graxos
monossaturados ou de cadeia curta,
com 2% de ácido sulfúrico podem
ser bons combustíveis alternativos
(Klopfenstein, 1983).
Transesterificação in situ difere
do processo convencional porque
se utiliza de óleo cru, diretamente com
álcool acidificado, em vez de óleo e
álcool purificados. Ou seja, a extração
e transesterificação ocorrem no mesmo
processo com o álcool atuando
em dois papéis: o de solvente extrator
e na esterificação. A transesterificação
in situ do óleo de girassol com
metanol acidificado produz ésteres
metílicos com rendimento maior do
que os obtidos com óleo pré-extraído
(Harrington and D’Arey-Evans, 1985;
Harrington and D’Arey-Evans, 1985).
Kildiran et al., 1996; propuseram a
transesterificação in situ do óleo de
soja, enquanto Özgul e Türkay, 1993,
relataram a esterificação in situ de óleo
de arroz com diferentes álcoois monohidratados,
explorando a vantagem
de extração simultânea dos lipídeos
neutros de sementes, quando a transesterificação
in situ é empregada.
Transesterificação catalisada
por alcalina.
As bases empregadas na catálise
do processo de transesterificação
incluem NaOH, KOH, carbonatos e
alcóxidos como metóxido de sódio e
butóxido de sódio. A transesterificação
alcalina ocorre, aproximadamente,
4000 vezes mais rápido do que a
ácida (Formo, 1954), e é a mais empregada
comercialmente.
No caso da transesterificação
alcalina, os glicerídeos e o álcool devem
ser anidros, pois a presença de
água favorece a reação de saponificação
dos ácidos com o sal, formando
sabões (Wright et al., 1944). O sabão
consome o catalisador reduzindo a
eficiência catalítica e aumentando a
viscosidade. As conseqüências são a
formação de gel e a dificuldade de
separação do glicerol.
Ma et al. 1998, sugeriram que
a concentração livre de ácidos graxos
no óleo refinado deve ser a menor
possível, abaixo de 0,5%. Feuge e
Grose, 1949, também reforçaram a
importância dos óleos estarem livres
de água e de ácidos graxos. Freedman
et al. 1984, reportam que as taxas de
transesterificação são significativamente
reduzidas se os reagentes não seguirem
os requerimentos acima.
Transesterificação utilizando
fluidos supercríticos
Com o objetivo de desenvolver
um novo processo de metanólise
de óleos sem qualquer catalisador,
Saka e Kusdiana, 2001, fizeram um
estudo fundamental para produção de
biodiesel em metanol supercrítico.
Demonstraram que o pré-aquecimento
a 350ºC por 240s em metanol supercrítico,
foi suficiente para converter
óleo de semente de colza em ésteres
metílicos. Os ésteres metílicos
produzidos em metanol supercrítico
foram os mesmos obtidos em catálise
alcalina, mas com taxa de conversão
maior. As análises cinéticas das reações
demonstraram que a conversão de
ésteres metílicos é muito mais rápida
em condições supercríticas. As melhores
condições foram a 350ºC e relação
molar de 42:1 entre metanol e óleo
(Kusdiana and Saka, 2001).
Uma hipótese para a aceleração
da reação é que metanol supercrítico
tenha natureza hidrofílica com
baixa constante dielétrica, dessa forma,
os triglicerídeos não polares podem
ser bem solvatados pelo metanol
supercrítico, formando um sistema
unifásico de metanol/óleo. Além
disso, o metanol líquido é um solvente
polar e apresenta pontes de hidrogênio
entre o OH-oxigênio e OH-hidrogênio
formando clusters de metanol,
dificultando o acesso do triglicerídeo.
Estas podem ser algumas razões
para a transesterificação supercrítica
apresentar maior velocidade de reação.
Assim como na transesterificação
enzimática, e ao contrário da
alcalina, os ácidos graxos livres contidos
no óleo também podem ser esterificados
em metanol supercrítico.
Além deste aspecto positivo, adiciona-se
o fato de não utilizar catalisadores
químicos, o que torna mais fácil a
separação dos produtos dessa reação
em relação à catálise alcalina. Devese
observar que neste novo processo
são requeridas altas temperaturas
(350ºC) e pressões (45 MPa), além de
grandes quantidades de metanol, e
que, para aplicação industrial, são necessárias
mais investigações do processo.
Transesterificação enzimática
de óleos vegetais
Nelson et al., 1996; foram os
primeiros a estudar a alcóolise enzimática
de triglicerídeos com o objetivo
de produzir biodiesel. Quando a
alcóolise de vários óleos e gorduras
com metanol e etanol foi conduzida
usando lipase imobilizada de R. michei
na presença de hexano, mais de
95% dos triglicerídeos foram convertidos
em metil ou etil ésteres. A metanólise
de gordura de carne atingiu
65% de conversão, sem adição de solventes
orgânicos. Foi observado que,
quanto maior a cadeia carbônica do
álcool empregado, maior foi a conversão
da gordura de carne.
Embora a transesterificação química,
empregando catálise alcalina,
resulte em altas taxas de conversão
de triglicerídeos em seus respectivos
ésteres, quando se trata de curtos tempos
de reação, existem alguns inconvenientes
ou desvantagens:
1) tem altos gastos energéticos,
2) a recuperação do glicerol é
difícil e demorada,
3) remoção do catalisador é necessária,
42 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

4) tratamento da água alcalina
residual é requerida,
5) Os substratos/reagentes devem
ter baixa concentração
de água e ácidos graxos livres.
As lipases extracelulares e as
intracelulares são também capazes de
catalisar efetivamente a transesterificação
de triglicerídeos em sistemas
aquosos ou não-aquosos. Isto pode ser
observado na Tabela 2, que compara
qualitativamente a catálise alcalina e
enzimática em relação às características
do substrato e dos produtos obtidos.
Em particular, deve ser observado
que o subproduto glicerol pode ser
facilmente recuperado, sem processos
complexos, e que os ácidos graxos
livres nos óleos também são convertidos
em seus ésteres correspondentes.
Por outro lado, o custo de produção
das lipases é significativamente
maior do que dos catalisadores químicos.
Transesterificação utilizando
lipases extracelulares:
Vários tipos de álcoois podem ser
empregados na transesterificação ca-
talisada por lipases. Linko et al., 1998,
demonstraram a viabilidade da produção
de diferentes ésteres biodegradáveis
e poliésteres empregando lipase.
Na transesterificação de óleo de
colza com 2-etil-1-hexanol, foi obtida
uma taxa de 97% de conversão com
lipase de cândida rugosa. De et al.,
1999, estudaram a conversão de álcoois
graxos em ésteres (C4-C18:1)
empregando lipase imobilizada de
Mucor miehei (Lipozyme IM-20) em
sistema livre de solventes orgânicos.
A percentagem de conversão molar
foi entre 86,8-99,2%. Estes resultados,
entre outros, estão sintetizados na
Tabela 3.
Macedo et al., 2004; estudaram a
esterificação direta de ácido acético,
butírico e propiônico com álcool
isoamílico para produção de ésteres
de aroma. As lipases empregadas foram
microbianas não-comerciais de
Geotrichum e Rhyzopus sp, e atingiram
até 90% de conversão após 48h
em meio aquoso.
A transesterificação de
triglicerídeos dos óleos de peixe, girassol
e gordura vegetal com etanol,
ou, etanólise, também foi estudada. Em
todos os casos, foram observadas taxas
de conversão acima de 80%, empregando
lipases de M. miehei (Selmi
and Thomas, 1998), Cândida
antartica (Breivk and Kriatinsson,
1997), Pseudomonas cepacia (Wu et
al., 1999) respectivamente.
Nelson et al., 1996, investigaram
as habilidades de lipases
transesterificarem triglicerídeos com
álcoois de cadeia curta. A lipase de M.
miehei foi a mais eficiente na conversão
de triglicerídeos em suas alquilas
e ésteres com álcoois primários, enquanto
a lípase de C. antartica foi a
mais eficiente na transesterificação de
triglicerídeos com álcoois secundários
na produção de ésteres ramificados.
As taxas máximas de conversão para
os álcoois primários: metanol, etanol,
propanol, butanol, isobutanol, foram
de 94,8-98,5% e para os álcoois secundários:
isopropanol e 2butanol, de
61,2-83,8%, sempre na presença de
hexano. Nas reações livres de hexano,
contudo, as taxas de conversão para
etanol e metanol decresceram até
19,4%.
Mittelbach, 1990, reportou a
transesterificação dos álcoois
primários: metanol, etanol e 1butanol,
com e sem éter de petróleo como
solvente. Os resultados mostram que
as taxas de conversão obtidas para
Tabela 3. Transesterificação enzimática utilizando diferentes tipos de álcoois e lipases
Óleo
Álcool
L ipase
Conversão(%
)
S olvente
Ref.
Semente
de colza
2-etil-1-hexano
l C.
rugos a
97
n enhu m Linko, at al, 1998 .
Mowrah,
Manga, Kernel
Girassol
álcooi
s
4-
C . miehei (Lipozyme IM-20)
C 18:
1
M 86.8-99.
2 Nenhu m
E tano l
M.
miehei (Lipozyme ) 83
Nenhu m
De and Bandhu,
1999
Selmi and
Thomas, 1998
Peixe
Etano
l
C.
antartic a
100
Nenhu m
Breivik at al.,
1997
Gordura reciclada
restaurantes
de
Etanol
P. cepacia (Lipase OS-30)+ C.
antártica (Lipase SP435)
85.4
Nenhu
m Wu at al., 199 9
Sebo, soja, óleo de
semente de colza
a
Álcoois primários
álcoois secundários
metanol etanol
b
M.miehei (LipozymeIM60)
C. antartica (SP435)
M.miehei (LipozymeIM60)
M.miehei (LipozymeIM60)
94.8-98.5
61.2-83.8
19.4
65.5
Hexano
Hexano
Nenhum
Nenhum
Nelson at al.,
1996
Girassol
Metanol
Metanol
Etanol
P. fluorescens
3
79
82
Nenhum
Éter de petróleo
Nenhum
Mittelbach, 1990
Palma
M etanolEtano l P.
cepacia (Lipase PS-30)
157
2
NenhumNenhu
m Abigor at al., 200 0
a
Metanol, etanol, propanol, butanol e isobutanol.
b
Isopropanol e 2-butanol.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 43

Tabela 4. Processos de metanólise efetivos tanto com lipases intracelulares quanto com lipases extracelulares.
Lipase
Regioespecifidade
Processo
e operação
Metil éster
Tempo de
reação(h)
Ref.
a
C.
antártica
(Novozym 435)
Nenhuma
Processo semi-contínuo
Operação contínua
Processo em batelada
96-98
92-94
87
48
7 h
3. 5
Shimada at al., 1999
Watanabe at al., 2000
Samukawa at al., 2000
b
C.
rugosa , P. cepaci a b
,
b
Nenhum
a
P.
fluorescence
Processo em batelad a 80-100
80-90
Kaieda at al., 2001
b
R.
oryzae (F-AP15) 1(3)-regioespecificidad e
Processo em batelada
Processo em batelada
80-90
80-90
70
72
Kaieda at al., 1999
Ban at al., 2001
c
R.
oryzae IFO4697 1(3)-regioespecificidad
e Processo semi-contínu o 70-80
72
Ban at al., 200 2
a
Lipase extracelular imobilizada em resina de troca iônica.
b
Lipase extracelular em pó.
c
Células de lipase intracelular imobilizada.
d
Adição de metanol em três passos; mistura de reagentes óleo/metanol (1:1, mol/mol) alimentada a cada passo.
e
Reação contínua com alimentação de metanol em três etapas.
f
Pré-tratamento da lípase imobilizada com metil oleato e óleo de soja.
g
Tratamento de células imobilizadas utilizando glutaraldeido.
h
Tempo de residência total.
etanol e 1butanol foram relativamente
altas, tanto na presença, quanto na
ausência de solvente orgânico. No
entanto, na reação com metanol,
somente traços de ésteres metílicos
foram obtidos.
Abigor et al., 2000; também
observou que na conversão de óleo
de palma por lipase P. cepacia, o
etanol atingiu melhores taxas de conversão
(72%) que o metanol (15%).
As lipases são conhecidas por
terem a propensão a agir mais efetivamente
em moléculas de cadeia
carbônica longa do que de cadeias
carbônicas curtas (Shimada et al.,
1997; Shimada et al., 1998). Assim, de
modo geral, a eficiência da
transesterificação dos triglicerídeos
com metanol parece ser muito menos
favorecida do que com etanol,
tanto em sistemas com, como em sistemas
sem solventes orgânicos.
Recentemente, uma série de
trabalhos de pesquisa foram publicados
a respeito da alcóolise de óleos
por lipases, a síntese dos resultados
principais destes trabalhos encontrase
na Tabela 4. Shimada et al., 1999;
observaram que a lipase imobilizada
de C. antartica (Novozym 435) mostrou-se
mais efetiva na metanólise do
que outras lipases testadas. O grupo
desenvolveu um processo de adição
do metanol em etapas, o que se mostrou
necessário, uma vez que a enzima
foi inativada pela agitação em sistemas
contendo mais de 1,5 moles de
metanol por mol de óleo. Como resultado,
foi mantida uma taxa de mais
de 95% de conversão após 50 ciclos
de reação, em processo de adição
contínua de metanol.
Watanabe et al.,2000; demonstrou
um processo de metanólise efetivo,
utilizando um sistema em
batelada, com 2 e 3 etapas e a
Novozym 435. A taxa de conversão
molar no final do último estágio foi de
90-93%, e a lipase pode ser reutilizada
por 100 ciclos, sem perder atividade.
O efeito do pré-tratamento da
lipase 435 em metanol para
metanólise de óleos foi investigada por
Samukaiva et al.2000.
A metanólise progrediu muito
mais rápido quando a Novozym 435
foi pré-incubada em metiloleato por
0,5 horas e subseqüentemente em
óleo soja por 12h. Como resultado, a
taxa de conversão atingiu 97% em
3,5horas de reação, com adição contínua
de 0,33 moles de metanol após
cada 0,25-0,4h de reação.
Kaieda et al., 2001; estudaram
a metanólise de óleo de soja com
lipases não regioseletiva e 1(3)-
regioespecífica em sistema aquoso. As
lipases não regioespecíficas de C. rugosa,
P. cepacia e P. fluorescens mostraram
alta atividade catalítica com
presença de 4-30% de água no sistema.
A lipase de R. oryzae, que exibe
1(3)-regioseletividade (Okumura et
al., 1976; Scheib et al., 1998) também
foi efetiva na metanólise do óleo de
soja atingindo 80% de conversão.
Os principais resultados dos
estudos mencionados (entre outras
publicações) podem ser sintetizados
da seguinte forma (Shimada et al.,
2002):
a) as lipases catalisam a
alcóolise de triglicerídeos e as
reações ocorrem mais eficientemente
se a cadeia
carbônica for maior do que a
do etanol e metanol;
b) a alcóolise de metanol e
etanol ocorre mais eficientemente
na presença de
solvente orgânico do que em
meio aquoso;
c) a não ser que a lipase seja
imobilizada e permita a
reutilização, o processo pode
ser muito dispendioso;
d) as vantagens ambientais do
processo enzimático são
evidentes: menor gasto
energético com temperatura
e pressão alta, mais fácil
recuperação dos produtos e
menor quantidade de glicerol
como subproduto.
44 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Conclusão
Os estudos de transesterificação
enzimática ainda são muito recentes,
mas já demonstram o potencial desta
tecnologia na transesterificação de
óleos vegetais. As vantagens da reação
enzimática frente às tecnologias
químicas são evidentes, e justificam o
investimento em pesquisas e desenvolvimento
de tecnologia nacional para
implantação no Brasil.
Tomando como exemplo o
que ocorreu com a indústria de gorduras
e óleos na década de oitenta,
tendo sido substituído o processo de
hidrólise química pelo enzimático
com aumento de qualidade e de produtividade,
a indústria do biodiesel
deve conhecer e testar as tecnologias
enzimáticas para este processo.
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46 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Biotecnologia aplicada ao valor
Pesquisa
nutricional dos alimentos
Biofortificação
Neuza Maria Brunoro Costa
PhD em Nutrição Humana, professora do
Departamento de Nutrição e Saúde, Universidade
Federal de Viçosa, Viçosa, MG
nmbc@ufv.br
Fotos cedidas pela autora
biotecnologia baseia-se na
habilidade de introduzir,
com precisão, construções
gênicas em um organismo,
usando a tecnologia
do DNA recombinante ou técnicas de
engenharia genética para alterar os
seus processos metabólicos favoravelmente.
A maioria das pesquisas de melhoramento
de plantas das duas últimas
décadas tem sido direcionada para
aumentar a produtividade e resistência
a doenças e pragas. Atualmente, a
aplicação de biotecnologia às plantas
tem sido direcionada para aumentar
sua qualidade nutricional (Zimmermann
e Hurrel, 2002).
Segundo Kishore e Shewmaker
(1999), o desenvolvimento da biotecnologia
pode ser dividido em três fases.
A primeira fase consistiu na introdução
de características agronômicas.
Desde 1995, alguns produtos com
melhores aspectos culturais têm sido
lançados no mercado, com a soja Roundup
Ready, tolerante ao glifosato, um
ingrediente ativo do herbicida Roundup.
Outro exemplo de produto com
melhores aspectos culturais é o milho
YieldGard. Este milho possui um gene
que codifica para uma proteína inseticida
que ocorre naturalmente na bactéria
Bacillus thuringiensis e confere
resistência à broca no milho, inseto que
infesta a cultura e reduz sua produção
de 6% a 20%.
A segunda fase da biotecnologia
visa à produção de culturas de melhor
qualidade. O melhoramento genético
clássico tem produzido alimentos diferenciados,
como a canola com alto teor
de ácido erúcico e glicosinolato, milho
ceroso com alto teor de amilose, arroz
com grão longo e trigo durrun. Vários
produtos para ração animal estão sendo
desenvolvidos, entre os quais aqueles
com grãos com alta densidade calórica,
devido ao elevado conteúdo de
óleo; e os de grãos com alta densidade
de nutrientes, principalmente teor de
proteína, aminoácidos essenciais ou
micronutrientes. O milho com alto teor
de óleo (6% ou mais) e/ou alto teor de
proteína é resultado do melhoramento
molecular. Outro exemplo da biotecnologia,
introduzindo genes que alteram
vias metabólicas, é a produção de
gordura sólida ou semi-sólida sem ácidos
graxos trans nas sementes oleaginosas.
Isso é possível, inibindo-se a
conversão de ácido esteárico para oléico
em soja e canola. A melhoria de
atributos como flatulência, flavor do
feijão, propriedades de textura e emulsificação
da soja também são exemplos
de novos produtos da biotecnologia
da segunda fase.
A terceira fase da biotecnologia
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 47

objetiva o uso de plantas como
“biofábricas” produzindo alimentos
nutricionalmente fortificados
e substituindo a adição
de constituintes sintéticos aos
alimentos. Um exemplo é o
óleo de canola rico em caroteno.
Desse modo, a biotecnologia
pode ser utilizada para suprir
as deficiências nutricionais,
como a vitamina A. A biotecnologia
também pode ser usada
para reduzir o conteúdo de fatores
antinutricionais, assim
como para fornecer novos nutrientes
nos grãos, como os fitoesteróis,
os quais têm o potencial de reduzir
de 10% a 15% os níveis de colesterol
em humanos. Outras aplicações da
biotecnologia para um futuro próximo
incluem a modulação de doenças pela
manipulação de compostos antioxidantes,
antiinflamatórios e estimulantes
do sistema imune nos alimentos.
Proteínas
A melhoria do valor nutricional de
plantas, enfocando a composição de
aminoácidos das proteínas, tem sido
objeto de programas de melhoramento
de plantas há várias décadas. As
proteínas dos cereais são normalmente
pobres em certos aminoácidos essenciais.
Em milho, lisina é o primeiro
aminoácido limitante e triptofano, o
segundo. Metionina e cisteína também
estão presentes em pequenas concentrações,
o que pode prejudicar a absorção
de ferro e zinco no intestino
(Graham et al., 1999).
A lisina é sintetizada junto com
outros aminoácidos essenciais, como
treonina, metionina e isoleucina, a partir
do aspartato. A introdução dos genes
que codificam as enzimas aspartato
quinase e diidrodipicolinato sintase
de bactérias menos sensíveis à inibição
por lisina dentro da batata resultou em
aumentos de 6, 8 e 2 x nos teores de
lisina, treonina e metionina, respectivamente.
O nível de lisina chegou a
15% do aminoácido total, enquanto
nas plantas não transformadas esse
nível foi de 1% (Sévenier et al., 2002).
A soja, embora seja uma das melhores
fontes protéicas de origem vegetal,
contém proteínas inferiores às
de origem animal, por apresentarem
Lipídios
deficiência em aminoácidos sulfurados.
Portanto, a melhoria do valor nutricional
e das propriedades funcionais
da soja tem sido importante objetivo
da indústria de alimentos. A metionina
é o aminoácido limitante da soja e,
devido à sua hidrofobicidade, sua inserção
resulta na melhoria do valor
nutricional e funcional dessa oleaginosa.
O aumento da hidrofobicidade aumenta
a formação de gel induzido pelo
calor e a capacidade emulsificante da
soja.
O gene que codifica uma proteína
específica da semente, rica em aminoácidos
essenciais e não-alergênica,
AmA1, albumina do amarantos (Amaranthus
hipochondriacus), foi introduzido
na batata, resultando na melhoria
de seu valor nutricional, com aumento
do conteúdo total de proteínas
e, principalmente, de aminoácidos essenciais.
Um aumento de 2,5 a 4 vezes
no teor de lisina, metionina, cisteína e
tirosina foi observado em batatas contendo
o gene AmA1 (Chakraborty et
al., 2000). Portanto, a introdução desse
gene possibilita aumento do valor protéico
da batata, com perfil de aminoácidos
essenciais semelhante ao padrão
estabelecido pela FAO/OMS, e, ao
contrário do que ocorreu com o gene
da castanha-do-brasil, não apresenta
alergenicidade.
As plantas transgênicas podem
ser uma fonte alternativa viável de
hemoglobina, uma vez que elas constituem
uma fonte de biomassa barata,
e as produções de culturas transgênicas
têm sido disponíveis comercialmente
em alguns países. As proteínas
α e β-globinas da hemoglobina humana
foram expressas em tabaco transgênico
(Nicotiana tabacum var. Xanthi),
transformadas usando Agrobacterium
tumefaciens.
Embora o tabaco tenha sido
usado como planta-modelo,
outras espécies podem fornecer
maiores produções
com etapas de purificação e
esterilização mais simples.
As plantas transgênicas oferecem
consideráveis vantagens
para produção em larga
escala de hemoglobina
recombinante e poderiam
aliviar a dependência de limitados
suprimentos de resíduos
de sangue humano, assim como
eliminando a contaminação de origens
bacteriana e animal (Dieryck et al.,
1997).
Plantas transgênicas podem expressar
várias proteínas do leite humano.
Por exemplo, tem sido demonstrado
que o gene que codifica a β-caseína
pode ser introduzido na batata, de
forma que essa proteína possa ser
detectada nas folhas e nos tubérculos
na proporção de 0,01% das proteínas
solúveis. Da mesma forma, α-lactoalbumina
e lactoferrina podem ser expressas
em tabaco. Essas tecnologias
poderão, num futuro breve, possibilitar
o uso de plantas na produção de
alimentos infantis, com os benefícios
dessas proteínas do leite humano (Dunwell,
1999).
Lipídios
A manipulação do perfil de ácidos
graxos por meio da biotecnologia pode
trazer benefícios nutricionais. O melhoramento
convencional tem produzido
óleos de girassol e amendoim
ricos em ácido oléico, os quais são
normalmente ricos em ácido linoléico.
Por meio de mutações, em girassol, o
conteúdo de ácido oléico aumentou
de 29% para 84%. Mutantes da soja
com menores teores de ácido palmítico
e maiores teores de ácido esteárico
têm sido obtidos (Liu et al., 2002).
Essas alterações no perfil de ácidos
graxos, aumentando o teor de ácidos
graxos monoinsaturados e reduzindo o
teor de ácido palmítico, têm implicações
na redução do risco de doenças
cardiovasculares.
Ácidos graxos trans
48 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Os ácidos graxos trans têm sido
associados a efeitos indesejáveis nos
lipídios sangüíneos, o que tem levado
a indústria a reexaminar o uso de
gordura hidrogenada na produção de
margarinas e molhos. Através da biotecnologia,
foi desenvolvida canola com
elevado teor de ácido esteárico (18:0),
pela supressão da enzima ∆9 dessaturase.
O ácido esteárico, embora seja
saturado, tem menos implicações no
perfil lipídico, uma vez que pode ser
convertido em ácido oléico no organismo.
O óleo requer menor ou nenhuma
hidrogenação e, portanto, não são produzidos
ácidos graxos trans.
Outra forma de evitar a hidrogenação
e a geração de ácidos graxos
trans é aumentando a expressão do
ácido oléico (18:1 n-9) no lugar do
ácido linoléico (18:2 n-6) e α-linolênico
(18:3 n-3), pela supressão da enzima
∆12 dessaturase. O óleo com mais
ácido oléico é menos suscetível à oxidação.
Ácido γ-linolênico (GLA)
Os ácidos graxos ∆6-dessaturados
são de grande importância para as
Arroz Dourado
células animais, por desempenharem
papel na manutenção da estrutura e
função da membrana, na regulação da
síntese e transporte de colesterol e na
prevenção da perda de água pela pele
e como precursores de eicosanóides,
incluindo prostaglandinas e leucotrienos.
Em animais, esses ácidos graxos
são sintetizados a partir do ácido graxo
essencial linoléico (C18:2 ∆9,12), sendo
a primeira etapa a dessaturação
para ácido γ-linolênico (GLA; C18:3
∆6,9,12), catalisada pela ∆6-dessaturase.
A atividade reduzida dessa enzima
pode ser observada no envelhecimento,
estresse, diabetes, eczema e
em algumas doenças infecciosas, ou
no catabolismo aumentado do GLA
pela oxidação ou aumento da divisão
celular (como exemplo, no câncer ou
inflamação). Óleos contendo GLA são
amplamente usados como suplementos
e têm sido relatados como de uso
farmacêutico. No reino vegetal, o GLA
não é comumente produzido, entretanto,
com o uso da biotecnologia, o
DNA que expressa a enzima ∆6-dessaturase
foi introduzido no tabaco a partir
de Borago officinalis L., cujas sementes
contêm cerca de 20% a 25% de
GLA. Com isso, outras culturas com
maior produtividade podem se tornar
fontes e GLA (Sayanova et al., 1997).
Zinco
As principais fontes de zinco em
populações pobres, que têm acesso
limitado a alimentos de origem animal,
são cereais, tubérculos e leguminosas,
os quais têm baixa quantidade ou biodisponibilidade
de zinco. O principal
fator que reduz a biodisponibilidade de
zinco em cereais e leguminosas é o
ácido fítico (Ruel e Bouis, 1998).
As estratégias do melhoramento
de plantas para controlar deficiências
de zinco incluem o aumento da concentração
de zinco nas plantas, redução
da quantidade de ácido fítico e
aumento da concentração de aminoácidos
sulfurados (metionina e cisteína),
os quais aumentam a absorção de zinco
pelas plantas.
Ferro
A alta prevalência de anemia ferropriva
nos países em desenvolvimento
tem sido associada ao consumo de
ferro de baixa biodisponibilidade. O
consumo de alimentos que aumentam
a absorção de ferro não-heme, como
frutas e vegetais, é freqüentemente
limitado. Além disso, os grãos e leguminosas
são ricos em ácido fítico, que
é um potente inibidor da absorção de
ferro (Lucca et al., 2002).
O enriquecimento com ferro, através
do melhoramento genético ou da
biotecnologia (biofortificação), tem sido
uma alternativa com perspectivas sustentáveis
para alimentos que fazem
parte da dieta básica de populações,
substituindo os suplementos dietéticos
ou a fortificação de alimentos.
Oferece, ainda, a possibilidade de aumentar
a produtividade, que geralmente
é limitada pela deficiência mineral
da planta (Grotz e Guerinot,
2002).
O conteúdo de ferro nos tecidos
da planta pode ser aumentado pela
maior captação de ferro do solo. Na
deficiência de ferro, as plantas liberam
prótons, os quais reduzem o pH em
torno da raiz, aumentando o teor de
Fe 3+ livre e estabelecendo um gradiente
eletroquímico que direciona o transporte
de ferro para dentro da raiz.
Além disso, na deficiência de ferro, a
enzima Fe 3+ quelato redutase, que reduz
o Fe 3+ para a forma Fe 2+ mais
solúvel, é induzida e, finalmente, o
Fe 2+ é captado por transportadores.
Essa redução do Fe 3+ é uma etapalimite
para a maioria das plantas. Gene
que induz a superexpressão da redutase-oxidase
2 férrica (FRO2) de levedura
tem sido expressa em tabaco, aumentando
a atividade da Fe 3+ quelato
redutase (Grotz e Guerinot, 2002).
Proteínas transportadoras de ferro,
como a Nramp (natural resistanceassociated
macrophage protein) e IRT1
(iron regulated transporter 1), podem
ser superexpressas, aumentando a
concentração de ferro nas plantas.
Culturas de milho, trigo e arroz usam da
quelação com compostos de baixo
peso molecular como estratégia para
obter ferro do solo. Esses compostos
da família dos fitossideróforos são liberados
no solo, onde se ligam ao Fe 3+ ,
transportando-o para a planta. A superexpressão
do gene NAAT (nicotinamide
aminotransferase) leva ao au-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 49

mento de fitossideróforos, que por sua
vez eleva o conteúdo de ferro nessas
plantas.
Para aumentar o conteúdo mineral
em algum tecido específico das
plantas através da manipulação transgênica,
é necessário não somente aumentar
a absorção do mineral pela raiz,
mas também conduzi-lo aos diversos
órgãos da planta (Grusak, 2002).
Com o objetivo de elevar o teor
de ferro do arroz branco ou polido, foi
realizada a inserção de genes que expressam
três proteínas no endosperma
central: fitoferrina de Phaseolus,
proteína semelhante à metalotioneína,
rica em cisteína endógena, e uma fitase
de Aspergillus fumigatus termorresistente.
A proteína semelhante à metalotioneína,
rica em cisteína, superexpressa
em arroz aumentou o conteúdo
de resíduos de cisteína sete vezes e o
nível de fitase 130 vezes. Isso possibilita
uma atividade da fitase suficiente
para degradar o ácido fítico completamente.
Entretanto, a proteína fitase do
fungo perde sua atividade após a cocção
do arroz. A expressão de fitoferrina
pode dobrar o conteúdo de ferro do
endosperma do arroz, variando de 1,15
a 2,21 mg/100 g, em comparação com
arroz-controle, que apresenta de 1,0 a
1,1 mg/100 g.
Os peptídios ricos em cisteína
melhoram a absorção de ferro no intestino,
pois são considerados os principais
contribuidores na absorção de ferro.
Outra opção para aumentar o conteúdo
de ferro em plantas é a introdução
de ácido ascórbico, hemoglobina e
peptídeos contendo cisteína no tecido
vegetal (Zimmermann e Hurrel, 2002).
O consumo extra de ferro no arroz
transgênico parece ser de significância
nutricional, considerando-se um consumo
diário de 300 g de arroz por um
adulto, o que representaria elevar de
3mg para 6 mg de ferro provenientes
do arroz, o equivalente a 20% das
recomendações diárias de ferro.
Beta caroteno e vitamina A
A deficiência de vitamina A é
problema de saúde pública em mais
de 70 países. Duzentos e cinqüenta
milhões de crianças são deficientes de
vitamina A, e a cada ano três milhões
de crianças desenvolvem xeroftalmia
(FAO/WHO, 1998).
A vitamina A é requerida para
visão, crescimento, reprodução, proliferação
e diferenciação celular e integridade
do sistema imune. É fornecida
na dieta como retinol pré-formado,
principalmente como éster de retinol,
pelos alimentos de origem animal e
pelos carotenóides, pró-vitamina A,
presentes em alimentos de origem
vegetal.
O consumo de micronutrientes
deve ser suficiente para prevenir deficiências
e manter boa saúde. Em condições
normais, uma dieta bem balanceada
fornece quantidades suficientes
de todos os nutrientes para o funcionamento
adequado do organismo. Em
condições fisiológicas específicas, o
consumo de nutrientes por meio de
alimentos naturais pode, entretanto,
ser inadequado. Em tais casos, suplementos
ou produtos fortificados podem
prevenir a inadequação. A aplicação
da biotecnologia em alimentos
para aumentar o teor de β-caroteno
(biofortificação) tem sido considerada
uma opção atrativa (Winter e Rodrigues,
1997).
Em mandioca, o conteúdo de b-
caroteno atinge mais de 20 mg/kg em
algumas variedades. A intensidade da
cor da raiz está altamente correlacionada
com a concentração de caroteno, a
qual parece ser determinada por dois
genes, um que controla o transporte
de intermediários para a raiz e outro
responsável pelo processo de estocagem.
O cultivar de tomate Caro-Red
possui 10 vezes mais caroteno que
cultivares normais, entretanto ele teve
problemas de aceitação devido a cor
menos vermelha (Graham et al., 1999).
Nos países tropicais, o arroz é
beneficiado para remover a camada de
aleuroma rica em óleo, para reduzir a
rancificação durante a estocagem. Na
porção restante, assim como no farelo,
50 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

a provitamina A é deficiente (Zimmermann
e Hurrel, 2002). A engenharia
genética foi usada para produzir grãos
de arroz ricos em β-caroteno. O endosperma
de arroz imaturo pode sintetizar
o composto intermediário geranilgeranil
difosfato, uma molécula isoprenóide
de 20 carbonos. A condensação de
duas moléculas de geranilgeranil difosfato
produz o fitoeno, uma molécula
com 40 carbonos. O fitoeno é o primeiro
carotenóide precursor na via biossintética
para a produção de β-caroteno,
pela expressão da enzima fitoeno
sintase. Entretanto, alterando o precursor
geranilgeranil difosfato para a produção
de β-caroteno, pode reduzir os
níveis de outros compostos.
A síntese de β-caroteno a partir do
fitoeno requer complementação com
três enzimas: a dessaturase fitoeno, a
dessaturase β-caroteno e a licopeno β-
ciclase (Zimmermann e Hurrel, 2002).
O fitoeno é precursor do licopeno, o
qual é convertido a caroteno (Dunwell,
1999).
A introdução simultânea desses
genes foi um dos maiores avanços
tecnológicos, e 1,6 a 2 µg de β-caroteno/g
de arroz fresco foram expressos
(Zimmermann e Hurrel, 2002). O Goden
rice, o arroz-dourado e geneticamente
modificado para expressar alto
conteúdo de carotenóide, tem recebido
atenção da mídia pelo seu potencial
em suprir provitamina A para milhões
de indivíduos. Foi desenvolvido em
1990 por pesquisadores alemães e
suíços, com financiamento da Fundação
Rockefeller, e tende a ser cruzado
com variedades locais de arroz. Três
genes tirados do narciso-silvestre e da
bactéria Erwinia sp foram introduzidos
no arroz para produzir um grão amarelo,
com altos níveis de β-caroteno, que
é convertido em vitamina A no organismo.
Esforços iniciais com o Golden
rice têm-se concentrado na Índia, mas
esta tecnologia deverá se estender a
outros países da Ásia, África e América
do Sul.
O arroz com vitamina A produzido
geneticamente tem sido indicado
como importante alternativa no combate
à cegueira. Mais de dois milhões
de crianças estão sob o risco de cegueira
devido à deficiência de vitamina A.
Trata-se, portanto, de um esforço para
melhorar a saúde de milhões de pessoas,
a maioria na Ásia, visto que é difícil
obter uma grande abrangência aos malnutridos
do mundo inteiro com o uso
de pílulas.
Projeto similar ao Golden rice está
sendo realizado para introduzir a enzima
fitoene sintase na canola (Brassica
napus). A concentração de caroteno
obtida foi de 1.000 a 1.500 µg/g de
semente. Essa tecnologia foi também
transferida para a mostarda (Brassica
juncea), cultivada em muitas partes do
mundo, incluindo Índia, Nepal e Bangladesh,
sendo o segundo maior óleo
consumido na Índia. O óleo de mostarda
deverá conter β-caroteno suficiente
para reduzir a deficiência de vitamina
A na população indiana e, visto tratarse
de óleo, é esperado que tenha alta
biodisponibilidade (Mackey, 2002).
Vitamina C
Vitamina C, cujos nomes químicos
são ácido ascórbico ou ascorbato, é um
doador de elétrons, antioxidante ou
agente redutor. A vitamina C promove
a absorção de ferro não-heme, reduzindo,
assim, a anemia.
As pessoas que possuem estoques
máximos (20 mg/kg) de vitamina
C podem viver durante dois meses,
sem o consumo de vitamina C, sem
que os sinais clínicos de deficiência
apareçam. Com um consumo abaixo
de 30 mg/dia, as concentrações plasmáticas
ficam em 11 µmol/L. Acima
desse consumo, as concentrações aumentam
rapidamente para 60 µmol/L
(FAO/WHO, 1998).
Uma justificativa para o aumento
do teor de vitamina C em alimentos é
o fato de esta conferir proteção contra
cataratas, câncer e lesões oxidativas no
DNA do esperma. Segundo Ames
(2001), os fumantes deveriam ingerir
muito mais vitamina C que os nãofumantes
para alcançar o mesmo nível
de vitamina C no plasma. O risco de
câncer para descendentes de pais fumantes
é maior quando o consumo de
antioxidante da dieta é baixo.
O nível de vitamina C pode ser
aumentado, expressando-se o gene
que codifica a enzima L-galactona-αlactona
desidrogenase (Dunwell,
1999). Em plantas e alguns animais,
mas não no homem, o ácido ascórbico
é sintetizado a partir da glicose.
Genes codificando sorbose desidrogenase
e sorbosone desidrogenase
de Gluconobacter oxydans inseridas
no mesmo organismo possibilitam a
conversão de sorbitol a 2-ceto-L-gulonato.
Erwinia herbicola contendo o
gene de Corynebacterium sp. converte
glicose em ácido 2-cetogulônico, o
qual pode ser facilmente convertido
em ácido ascórbico (Demain, 2000).
Fitato
O fitato, uma molécula de açúcar/
álcool ligado a seis grupos fosfato, é
uma fonte de fósforo para a semente,
necessária para a germinação (Raboy,
2001). Uma redução no teor de fitato
pode ser inaceitável, já que reduziria o
teor de fósforo total. Além disso, altos
conteúdos de fitato estão associados
com altos conteúdos de ferro e zinco
(Grahan et al., 1999). Entretanto, na
alimentação, o fitato é um fator antinutricional
porque quela ferro, cálcio,
zinco e outros íons divalentes, tornando-os
indisponíveis para absorção. Tal
efeito negativo do ácido fítico tem
maior impacto em países em desenvolvimento,
onde grande parte da
população tem como principais fontes
de zinco os cereais, tubérculos e as
leguminosas e acesso limitado a alimentos
de origem animal. Os efeitos
benéficos do mioinositol na saúde,
como agente anticancerígeno e antioxidante,
têm maior impacto nos países
desenvolvidos, onde a maior preocupação
é com patologias associadas ao
envelhecimento, como dano oxidativo
e câncer (Brinch-Pedersen et al.,
2002).
A adição de fitase de Aspergillus
ninger em soja e canola, via transgênese,
levou a uma menor excreção de
fósforo nas fezes de frangos e de
suínos, indicando maior biodisponibilidade
de fósforo e de outros minerais
normalmente quelados ao fitato, como
ferro e zinco. Além disso, a menor
liberação de fósforo no ambiente reduz
seu arraste pela água, reduzindo o
impacto ambiental. O uso de fitase em
vez da remoção do fitato do alimento
tem a vantagem de não reduzir o teor
de fósforo do alimento, além de aumentar
a sua biodisponibilidade (Brinch-Pederson
et al., 2002).
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 51

Para melhorar o valor nutritivo
mineral, a biotecnologia (biofortificação)
pode ser aplicada de três formas:
para elevar a concentração de minerais
em tecidos apropriados, como endosperma
de cereais; para elevar os
níveis de compostos que aumentam o
uso do mineral e reduzir os fatores
antinutricionais, como mioinositol. Em
humanos, milho com baixo teor de
fitato, contendo 73% do fosfato disponível,
teve a absorção de zinco aumentada
em 76% (Raboy, 2001).
Produtos de origem animal
O melhoramento genético, as técnicas
de reprodução e a manipulação
da alimentação animal têm levado a
melhorias na produção e valor nutritivo
da carne de suínos, aves, peixes e
ruminantes em geral.
A manipulação da composição da
carne de suínos tem possibilitado alterações.
Por exemplo, o aumento do
teor de ácidos graxos monoinsaturados,
a redução da relação de ácidos
graxos ω-6/ω-3 de 7 a 10 para 4 a 5 e
o aumento do conteúdo de ácidos
graxos polinsaturados de cadeia longa
(EPA e DHA), elevando, assim, a sua
qualidade nutricional e propiciando
maiores benefícios à saúde.
A qualidade da carcaça e a homogeneidade
dos animais quando abatidos
poderiam ser melhoradas com o
uso da clonagem ou da produção in
vitro de embriões em larga escala. Em
médio prazo, é possível a integração
da biotecnologia da reprodução com a
genética quantitativa e molecular. No
longo prazo, a competitividade das
carnes de ovelha e cabrito poderia ser
amplamente aumentada pelas novas
técnicas reprodutivas e genéticas. Entretanto,
ainda não está claro se esses
avanços serão bem aceitos pelos consumidores
nos países desenvolvidos.
Pesquisa no Reino Unido apontou os
organismos geneticamente modificados
(OGM) como a principal preocupação
do consumidor, entretanto técnicas
de manipulação na criação de
peixes, como a ginogênese, a androgênese
e a transgênese, têm sido usadas
rotineiramente. Existem previsões
de uso de carnes com baixos teores de
gordura e de colesterol obtidas de
animais transgênicos. Questiona-se,
entretanto, se a obtenção dessas características
desejáveis só será possível
por meio da modificação genética,
utilizando-se transgênicos.
O papel da biotecnologia será,
num primeiro momento, limitada à
preservação da biodiversidade e à autenticidade
do produto, mas desempenhará
um papel importante em termos
de desenvolvimento sustentável
da produção animal extensiva.
O número e as condições das
fibras musculares são parâmetros fisiológicos
importantes no animal vivo e
determinantes-chave da qualidade e
quantidade da carne. A interação entre
genes e fisiologia pode determinar a
qualidade e quantidade da carne. Isso
pode beneficiar a indústria da carne
pelo aumento da quantidade de tecido
magro da matéria-prima, com ótimas
características de qualidade e menor
variabilidade do produto final (Garnier
et al., 2002).
A aceitação da biotecnologia animal
encontra-se nos dias de hoje apoiada
em preocupações de ordem ética,
segurança alimentar e ambiental, bemestar
dos animais, benefícios para os
consumidores, produtores e agroindústria
e impacto socioeconômico. A
biotecnologia pode ser aplicada para
melhorar a performance dos animais
com uma melhor nutrição, aumento do
potencial de produção, melhoria do
estado de saúde e redução dos resíduos
pela melhor utilização dos recursos
(Bonneau e Laarveld, 1999).
A adição de enzimas pode melhorar
a disponibilidade de nutrientes de
alimentos, diminuir custos de alimentação
e reduzir os dejetos de produção
no ambiente. Pré e probióticos ou
suplementos imunes podem inibir
microrganismos intestinais patogênicos
ou tornar o animal mais resistente
a eles. A biotecnologia pode melhorar
o valor nutricional das plantas, ou incorporar
vacinas ou anticorpos na alimentação,
o que protegerá o animal
mais eficientemente contra doenças.
A administração de somatotropina
recombinante acelera o crescimento
e proporciona carcaça mais magra e
aumenta a produção de leite. Entretanto,
quando administrada em longo prazo,
aumenta a incidência de osteocondrose,
cartilagem macia, úlcera estomacal,
resistência à insulina e estresse.
Pode também reduzir a capacidade de
detoxicação do fígado, reduzindo a
eliminação de xenobióticos pelos animais
(Bonneau e Laarveld, 1999).
A expressão do gene somatotropina
em peixes e porcos proporciona
crescimento mais rápido, melhor eficiência
alimentar e carcaça mais magra.
A expressão do hormônio IGF-1 (fator
de crescimento semelhante à insulina)
no músculo aumenta o crescimento
muscular em porcos. O gene c-ski em
porcos e gado resulta em hipertrofia
muscular (Bonneau e Laarveld, 1999).
Os avanços da engenharia genética
podem ser aplicados para melhorar
a produção e sua eficiência, alterar a
composição do leite e auxiliar na prevenção,
diagnóstico e tratamento de
doenças. Algum progresso já foi alcançado,
como o desenvolvimento de
bactérias que produzem grandes quantidades
de proteína e são importantes
reguladoras do metabolismo; seleção
mais rápida e melhoria no cruzamento
de animais e plantas pela transferência
de genes; desenvolvimento de testes
de DNA no diagnóstico de doenças
infecciosas; e produção de anticorpos
monoclonais para o tratamento de
doenças, dentre outras. A biologia
molecular tem ainda o potencial de
produzir animais transgênicos capazes
de produzir leite com diferente composição;
a concentração de caseína
poderá ser aumentada ou modificada,
visando à produção de queijo; a proteína
β-lactoglobulina, que causa problemas
na manufatura do leite, poderia
ser suprimida; a concentração de gordura
no leite poderia ser reduzida pela
supressão da enzima CoA carboxilase,
assim como a concentração de lactose
poderia ser reduzida pela remoção da
α-lactoalbumina ou pela introdução de
uma enzima capaz de quebrar a lactose
em glicose e galactose; e outras
modificações de interesse da indústria
e do consumidor (Chalupa et al., 1996).
Embora sejam muitas as aplicações
da biotecnologia para a produção
animal, sua aceitação é pequena. Os
benefícios podem ser grandes para a
indústria de alimentos, como a melhoria
na carcaça dos animais. Também
pode beneficiar tanto a indústria como
a população, pela redução dos custos
de tratamentos medicamentosos dos
animais, menor produção de resíduos,
52 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

menor resistência a antibióticos, menor
impacto ambiental e melhor saúde
animal (Bonneau e Laarveld, 1999).
Considerações finais
Diversos compostos, como vitaminas
e minerais, antioxidantes, ácidos
graxos insaturados, fibras alimentares,
flavonóides, prebióticos e probióticos,
são reconhecidos por prevenir ou retardar
o aparecimento de doenças como
aterosclerose e câncer, dentre outras, e
podem ter seus teores aumentados
nos alimentos pela biotecnologia.
A biotecnologia apresenta grande
potencial para a produção de alimentos
com melhores propriedades nutricionais
e funcionais, entretanto o baixo
acesso à literatura científica atualizada
acerca das suas possíveis aplicações
tem gerado insegurança e resistência
de certos indivíduos na aceitação dos
seus produtos.
Segundo Roberts et al. (2001), o
conhecimento do genoma e as possíveis
modificações na composição nutricional
e funcional dos alimentos podem
ser uma perspectiva futura para a
manipulação de doenças como fenilcetonúria,
enteropatias induzidas pelo
glúten e intolerância à lactose. Ainda
doenças crônico-degenerativas nãotransmissíveis,
como doenças cardiovasculares,
câncer, obesidade, diabetes
mellitus, doença de Parkinson e de
Alzheimer poderão ser melhores conhecidas,
diagnosticadas, prevenidas e
tratadas.
O uso do genoma na prevenção
dietética de doenças está por ser estabelecido,
e o campo da nutrição tem
que se tornar mais ativo na demonstração
de mecanismos que direcionem a
conexão entre dieta e fenótipo de
acordo com variações genéticas específicas.
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54 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Pesquisa
Criptosporidiose
em camundongos imunodeficientes
Dinâmica da eliminação de oocistos de Cryptosporidium sp em linhagens de camundongos imunodeficientes
Delma Pegolo Alves
Doutoranda do Depto de Parasitologia
IB - Unicamp
Diretora Associada do CEMIB
Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica
delma@cemib.unicamp.br
Maria Helena Seabra Soares de Britto
Mestre em Imunologia - Unicamp
Doutoranda do Depto de Parasitologia
IB - Unicamp
Professora do Depto de Farmácia da
Universidade Federal do Maranhão
mhssb@elo.com.br
Ana Maria Aparecida Guaraldo
Prof a Dr a do Instituto de Biologia
Departamento de Parasitologia - Unicamp
Diretora do CEMIB - Centro Multidisciplinar para
Investigação Biológica
guaraldo@cemib.unicamp.br
Fotos cedidas pelos autores
1. Introdução
Em 1907, TYZZER descreveu
Cryptosporidium muris para designar
um pequeno protozoário coccídio,
encontrado nas glândulas gástricas de
camundongo. Posteriormente, em
1912, TYZZER descreveu uma nova
espécie Cryptosporidium parvum.
Por meio de infecção experimental em
camundongos, ele demonstrou que C.
parvum desenvolvia somente no intestino
delgado, e os oocistos eram
menores em relação aos oocistos do
C. muris. (FAYER et al, 1997).
Somente em 1976 foram relatados
os dois primeiros casos de
criptosporidiose humana, sugerindo
um comportamento oportunista do
parasito em indivíduos imunocomprometidos
(NIME et al, 1976).
Em indivíduos imunocompetentes
e com sistema imunólogico
comprometido, a criptosporidiose é
reconhecida como uma importante
doença diarréica. Geralmente a infecção
pode ser assintomática em indivíduos
imunocompetentes, enquanto
nos indivíduos portadores de HIV
ou outras desordens imunológicas,
freqüentemente a infecção se torna
crônica (TZIPORI et al, 1986).
As características clínicas da
criptosporidiose são bem descritas. A
doença pode apresentar quatro formas:
assintomática, importante por
causar a transmissão endêmica, transitória
ocorrendo em indivíduos imunocompetentes,
com período de incubação
de 6 dias e uma duração de 2 a
30 dias. Na forma sintomática são
freqüentes a anorexia, diarréia aquosa,
desconforto abdominal e febre. A forma
crônica é comum nos pacientes
HIV positivos, levando à desidratação
e agravamento clínico em indivíduos
desnutridos. A forma fulminante é
exclusiva de pacientes HIV positivos
ou imunossuprimidos devido à terapêutica,
apresentando-se como uma
doença semelhante ao cólera (GRIF-
FITHS, 1998).
Morgan-Ryan et al, 2002,
descreveram uma nova espécie de
Cryptosporidium, designando a de
genótipo humano de C. parvum,
genótipo 1 ou genótipo H.
Considerando as diferenças biológicas
e moleculares, esta nova espécie foi
denominada:Cryptosporidium
hominis.
Alguns estudos consideram que
esta nova espécie não infecta camundongos,
ratos, cães e bezerros. Porém,
a infecção com o C. hominis foi reportada
em mamífero marinho Dugong
dugon e ovelhas, experimentalmente
foi demonstrada em ovelhas,
gado e leitões (XIAO et al., 2004).
Os surtos de criptosporidiose têm
ocorrido devido a transmissão do C.
parvum pela água, pois os oocistos
não são retidos pelos sistemas de filtros
no tratamento da água e são resistentes
aos produtos desinfetantes
(SMITH & ROSE, 1998).
Um dos maiores surtos de
criptosporidiose já registrado ocorreu
em abril de 1993, nos Estados Unidos,
na cidade de Milwaukee, onde
aproximadamente 400.000 pessoas
foram infectadas com oocistos de
Cryptosporidium parvum veiculados
pela água (MCKENZIE et al, 1994).
Franco et al, 2001, realizaram uma
investigação sobre a ocorrência de
oocistos de Cryptosporidium e cistos
de Giardia, na Região Sudeste do Bra-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 55

Figura1: Oocistos da linhagem humana MMC de Cryptosporidium sp em esfregaço de suspensão fecal de camundongos
neonatos da linhagem BALB/c/Uni. Coloração Ziehl-Neelsen. Aumento 40X
sil, em água superficial do rio Atibaia.
Os autores relataram que todas as
amostras examinadas foram positivas
para ambos os protozoários.
Experimentalmente a criptosporidiose
ocorre em animais de laboratório
que são imunologicamente
imaturos, ratos tratados com drogas
imunossupressoras, camundongos
atímicos, camundongos tratados com
anticorpos anti-CD4, camundongos
NIH-III (bg/nu/xid) e camundongos
bg (TZIPORI & GRIFFITHS, 1998).
Um problema associado com o
estudo experimental da criptosporidiose
em mamíferos é que muitas espécies
de hospedeiros são susceptíveis
à infecção com C. parvum durante
as três primeiras semanas de vida
(UNGAR et al, 1990). Os camundongos
imunocompetentes das linhagens
BALB/c e C57BL/6 infectados ao nascer,
apresentam resolução da infecção
no decorrer da maturação do sistema
imunológico e da colonização da microbiota
associada (HARP et al, 1988).
ENRIQUEZ & STERLING (1991)
se propuseram a identificar um modelo
animal com potencial de uso para
o estudo da infecção pelo C. parvum.
Para tanto, avaliaram 19 linhagens
diferentes de camundongos adultos e
uma de gerbil (Meriones unguiculatus).
Os resultados mostraram que
somente os camundongos beige
(C57BL/6J-bg j ), apresentaram
números significantes de oocistos no
7 o dia após a infecção.
O modelo scid torna-se importante
por se infectar cronicamente
com C. parvum e desenvolver sintomas
similares aos apresentados por
pacientes com imunodeficiência
(MEAD, et al, 1991). Camundongos
scid tratados com anti-interferon-gama
são usados para o estudo da infecção
pelo C. parvum, na fase aguda durante
os vinte primeiros dias após o
desafio com o C. parvum, quando a
infecção é limitada ao trato gastrointestinal.
Na fase crônica da doença, do
32 o ao 47 o dias após a infecção pelo
C. parvum, ocorre comprometimento
hepatobiliar e dos ductos pancreáticos
(TZIPORI et al, 1995).
Os camundongos knockout (KO)
para IFN-γ (interferon-gama), são utilizados
para o estudo da criptosporidiose,
devido ao desenvolvimento de
sinais clínicos e perda de peso. Estes
animais se infectam com baixas doses
de oocistos de C. parvum, com apenas
10 oocistos o animal desenvolve
a infecção, tornando-se um modelo
importante para avaliação de drogas
terapêuticas (GRIFFITHS et al, 1998).
Com base nas diferenças imunológicas
entre as linhagens de camundongos
C57BL/6 KO para IFN-γ,
C.B-17 scid, C57BL/6 bg e C3H nu, o
presente estudo tem como objetivo a
avaliação da dinâmica da eliminação
de oocistos da linhagem MMC de
Cryptosporidium sp em animais adultos.
2. Material e métodos
O protocolo experimental nº428/
1 referente a esta pesquisa foi aprovado
pela CEEA (Comissão de Ética
em Experimentação Animal) do Instituto
de Biologia da UNICAMP - Universidade
Estadual de Campinas.
2.1 Manutenção
“in vivo” da linhagem MMC de
Cryptosporidium sp
Conforme relatado por Britto et
al, 2000, a linhagem MMC foi isolada
a partir de fezes humanas de um único
paciente HIV positivo com
criptosporidiose, do Hospital das Clínicas
da Unicamp. A manutenção desta
linhagem foi realizada em camundongos
neonatos S.P.F. (Specific
56 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Tabela I – Mortalidade de camundongos imunodeficientes e imunocompetentes
infectados com 10 5 oocistos de Cryptosporidium sp.
L inhagens de Camundongos Mortalidade (%)
C.B-17/Uni
scid
0
BALB/c/Uni
0
2.3 Análise morfométrica de
oocistos de Cryptosporidium sp
Para a análise morfométrica dos
oocistos da linhagem MMC, foi utilizado
o material obtido do intestino e
fezes dos animais sacrificados no 7º
dia após a infecção, conforme metodologia
descrita (item 2.1). Foram
feitos esfregaços durante as primei-
C57BL/6 KO para IFN- γ 40
C57BL/6/Uni
bg
20
C3H/Uni
nu
40
C57BL/6/Uni
0
Pathogen Free), imunocompetentes
isogênicos das linhagens BALB/c/Uni,
C57BL/6/Uni, CBA/Uni, C.B-17/Uni e
heterogênico da linhagem Swiss/Uni
no período de dezembro/1999 a julho/2002.
A partir de novembro/2002
a fevereiro/2004, a linhagem MMC foi
mantida em camundongos de 04 a 06
semanas de idade da linhagem C57BL/
6 KO para IFN-γ. A manutenção “in
vivo” do Cryptosporidium sp foi realizada
em ambiente controlado, no isolador,
com manejo preconizado por
Passos & Alves (1996). Os oocistos
foram obtidos do intestino dos animais
sacrificados no 7º dia após a infecção.
Foi realizada a maceração do intestino
em homogeneizador de Biozzi,
com solução salina tamponada 0,01M
pH 7.2. Em seguida foi realizada a
filtração em malhas de nylon e centrifugação
2 a 3 vezes a 1500g, por
10 minutos a 4ºC. A camada superior
do precipitado foi recolhida para determinação
do número de oocistos
(PEETERS & VILLACORTA, 1995). Foi
feita a diluição da suspensão dos oocistos
(20 µL) em solução de verde
de malaquita (80 mL), contendo SDS.
O nº de oocistos foi determinado em
câmara de Neubauer, com microscopia
de contraste de fase, utilizando
objetiva de 40X.
2.2 Infecção de camundongos
imunodeficientes com oocistos
de Cryptosporidium sp
Fêmeas SPF com 4 a 6 semanas
de vida , provenientes do CEMIB,
foram infectadas com 10 5 oocistos de
Cryptosporidium sp por tubagem
esofágica. Foram utilizados 10 animais
de cada uma das seguintes linhagens
imunodeficientes:
- C.B-17/Uni scid; linhagem imunocompetente
controle BALB/c/Uni
- C57BL/6 KO para IFN-γ, C3H/
Uni nu, C57BL/6/Uni bg; linhagem
imunocompetente controle C57BL/6/
Uni.
A colônia das linhagens citadas
foram monitorizadas pela Seção de
Controle de Qualidade Sanitária do
CEMIB, com metodologia descritas
por Gilioli et al, 1996 e Gilioli et al,
2000).
Os ensaios experimentais foram
realizados no Departamento de Parasitologia
da UNICAMP, em unidade isoladora
de PVC flexível tipo Trexler.
Após os experimentos, os materiais
retirados do isolador foram tratados
antes do descarte, como padrão de
biossegurança. Para a descontaminação,
os materiais de laboratório foram
submetidos a fervura durante 15
minutos, antes da lavagem. Os dejetos
retirados do equipamento foram
enviados para inativação em equipamento
para tratamento de resíduo de
serviço de saúde mediante ondas
eletromagnéticas.
Foram considerados resistentes os
animais que apresentaram liberação
de oocistos de Cryptosporidium sp na
fase aguda da doença e não apresentaram
mortalidade no período de 15
dias.
ras 28 passagens da infecção, no
período de dezembro/1999 a julho/
2000. Os esfregaços foram corados
pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada
(HENRIKSEN & POHLENZ,
1981). As medidas de 35 oocistos foram
realizadas com auxílio de ocular
micrométrica, em microscópio Zeiss
acoplado à câmara clara, com aumento
de 1000X. Os resultados foram expressos
como índice de forma, conforme
XIAO et al, (2004).
2.4 Dinâmica da eliminação de
oocistos de Cryptosporidium sp
As fezes dos animais adultos infectados
foram colhidas diariamente,
durante 15 dias, individualmente e
armazenadas em dicromato de potássio
na concentração final de 2,5%,
mantidas a 4ºC. Posteriormente, as
amostras de fezes foram centrifugadas
a 1500 g durante 15 minutos. Em
seguida, retirou-se a camada superior,
para a contagem dos oocistos adicionando-se
solução de verde de malaquita
a 0,16%, contendo 0,1% de SDS. O
número de oocistos foi determinado
em câmara de Neubauer, sob microscopia
de contraste de fase
(PEETERS & VILLACORTA, 1995). O
peso corporal individual dos camundongos,
devidamente identificados
por marcação auricular, foi registrado
em balança semi-analítica, no início e
ao final do experimento.
2.5 Metodologia estatística
O estudo estatístico da eliminação
de oocistos de Cryptosporidium sp.
foi realizado mediante a comparação
das médias obtidas em cada uma das
amostras, referente aos 6 o , 9 o , 12 o e
15 o dias após a infecção. Este período
está associado com a mortalidade dos
animais e eliminação dos oocistos nas
fezes. Foi utilizado o procedimento de
Análise de Variância (ANOVA) e comparações
pareadas pelo método de
Tukey, com nível de confiança de
95%. As análises foram realizadas no
software estatístico Minitab – Versão
13.
3. Resultados
A dimensão de 35 oocistos de
Cryptosporidium sp (média e desvio
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 57

padrão), foram as
seguintes: comprimento
4,91 ±0,44µm e largura
5,85 ±0,35µm. O índice
de forma (C/L) obtido
foi 0,84.
Foi possível estabelecer
a manutenção
do cultivo “in vivo” da
linhagem humana MMC
de Cryptosporidium sp
em camundongos neonatos
imunocompetentes,
e camundongos
adultos C57BL/6 KO
para IFN-g. Esta linhagem
de Cryptosporidium
sp encontra-se na
67º passagem da infecção e mantém
alta infectividade .
Para a implantação e manutenção
do cultivo “in vivo” do
Cryptosporidium sp, correspondente
ao período de Dezembro/1999 a fevereiro/2004,
foram utilizados 1265
animais, entre camundongos neonatos
das linhagens BALB/c/Uni, C57BL/6/
Uni, CBA/Uni, C.B-17 /Uni, Swiss/Uni,
e camundongos adultos C57BL/6 KO
para IFN-γ, em ambiente controlado
(Fig.1).
Considerando a taxa de mortalidade
nos animais imunodeficientes
e imunocompetentes (Tabela I), não
houve morte na linhagem scid, assim
como no controle. Os camundongos
nude, KO e bg apresentaram mortalidade
no 11º dia após infecção.
O comportamento das linhagens
imunodeficientes e imunocompetentes,
quanto a liberação de oocistos
nas fezes, foi avaliado a partir do 6º
dia até o 15º dia após a infecção
(Figura 2).
4. Discussão
A manutenção da linhagem de
origem humana de Cryptosporidium
sp em camundongos SPF ainda não
foi descrita no Brasil e tornou-se uma
fonte de antígeno para diagnóstico da
criptosporidiose.
Um dos fatores limitantes para
entender a biologia do C. parvum é
a dificuldade de obtenção de amostras
purificadas de vários estágios de
desenvolvimento intracelular do parasito.
Conseqüentemente, muitas
Figura 2 - Dinâmica da eliminação de oocistos de Cryptosporidium sp em
camundongos imunodeficientes: KO, nude, scid, bg e imunocompetentes
BALB/c/Uni e C57BL/6/Uni no 6º, 9º, 12º e 15º dia após a infecção (d.a.i.)
com 10 5 oocistos.
pesquisas com o parasito procuram
caracterizar e identificar os antígenos
expressos na superfície das formas
invasivas, tais como esporozoítos e
merozoítos (WIDMER et al, 2002).
O isolamento da linhagem
MMC de Cryptosporidium sp em camundongo
propicia a padronização
de um genótipo, possivelmente humano
como fonte de antígenos para
diagnóstico e infecção de cultura de
células.
Atualmente são reconhecidas
treze espécies de Cryptosporidium
(XIAO et al, 2004). As medidas obtidas
dos oocistos da linhagem MMC,
comprimento 4,91 ±0,44µm e largura
5,85 ±0,35µm sugerem que a
linhagem MMC, de origem humana
se enquadra dentro da espécie
Cryptosporidium hominis, conforme
CAREY et al, 2004. No entanto, o
índice de forma (C/L) obtido foi de
0,84, divergindo das observações de
XIAO et al, 2004, que indica para C.
hominis índice de forma 1,15. Porém,
a análise morfométrica não pode ser
usada como ferramenta para classificação
das espécies de Cryptosporidium,
pois além dos parâmetros biológicos,
deve-se considerar principalmente
as diferenças genéticas (MOR-
GAN-RYAN et al, 2002; FALL et al,
2003).
A hipótese de se tratar de
Cryptosporidium hominis, pode ser
sustentada pelos resultados de
Mclauchlin et al, 1999, quando comparado
com C. parvum.
Outra diferença entre C. hominis
e C. parvum é quanto a liberação
de oocistos. O estudo
conduzido por Mclauchlin
et al, 1999, em 218
pacientes, com diagnóstico
de diarréia,
demonstrou que os pacientes
que apresentaram
infecção pelo C.
hominis liberaram
maior quantidade de oocistos,
em relação aos
pacientes que se infectaram
pelo C. parvum.
Todos os camundongos
utilizados neste
estudo foram classificados
na categoria VAF (Virus
Antibody Free), pelos
resultados de monitorização sanitária.
Desta forma foi assegurada a infecção
“in vivo” sem a interferência
de outros patógenos murinos. Poucos
são os relatos de interferência do
Cryptosporidium na pesquisa experimental
associado a outros patógenos
em camundongos. Há autores que relataram
o efeito sinérgico do
Cryptosporidium parvum, isolado
CPB-0, com rotavírus em leitões SPF
(Enemark et al, 2003).
Dentre as linhagens de camundongos
imunodeficientes estudadas, a
linhagem scid apresentou resistência
à infecção pelo Cryptosporidium sp,
quando comparada com as outras linhagens
imunodeficentes. Os nossos
resultados corroboram com Hayard et
al, 2000, que comprovaram a importância
do IFN-γ para a sobrevida
do scid .
Mead & You, 1998, investigaram
à susceptibilidade frente a infecção
pelo C. parvum entre duas linhagens
diferentes de camundongos, ambas
KO para interferon-gama (BALB/c-
Ifg (m)@ e C57BL/6J-Ifg (m)@ ). Os camundongos
BALB/c-Ifg (m)@ desenvolveram
infecção moderada com média de
eliminação de oocistos 100 vezes
menor em relação ao camundongo
C57BL/6J-Ifg (m)@ .
O estudo da ação de citocinas
durante a infecção pelo
Cryptosporidium parvum em
camundongos knockout (KO) para IL-
4, IL-10, IL12 e CCR5, com background
de BALB/c, evidenciou as
diferenças entre as linhagens, pois os
animais KO mostraram-se resistentes
58 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

(CAMPBELL et al, 2002). Os autores
também observaram que o KO para
IL-12, com “background” de C57BL/
6, quando infectado com 100 oocistos,
apresentou alta susceptibilidade,
liberando grandes quantidades de
oocistos, em relação às outras
linhagens knockout. Após duas
semanas o KO para IL-12 foi capaz
de controlar a infecção, sugerindo que
a IL-12 é um importante indutor de
IFN-γ.
Os camundongos nude
mostraram controle parcial da infecção.
Nossos resultados encontram respaldo
nos trabalhos de Rasmussen & Healey,
1992, foi demonstrado que a ausência
de linfócitos T em modelos animais
estabelece a infecção pelo
Cryptosporidum parvum. Conforme
descrito pelos autores, os
camundongos CD4 - apresentam
perfil de infecção semelhante aos
camundongos nude.
Ungar et al, 1991, avaliaram o
papel de INF-γ, células CD4 e CD8
em camundongos adultos BALB/c
nude submetidos a tratamento com
anticorpo monoclonal. Os autores
demonstraram que o controle da
infecção requer a produção de IFN-γ
e contribuição do linfócito CD4. Na
defesa do hospedeiro contra a
infecção pelo Criptosporidium sp,
também é acionado um mecanismo
independente de linfócitos T, no qual
os macrófagos ativados induzem a
secreção de IFN-γ, pelas células NK
(BANCROFT & KELLY, 1994).
A análise estatística da eliminação
de oocistos no decorrer da infecção
evidenciou que a linhagem KO para
IFN-γ apresentou significativamente
maior liberação de oocistos em todos
os períodos. A linhagem nude superou
a linhagem controle apenas no 6º
dia após infecção, apresentando diferenças
significativas em relação à linhagem
scid. No 15º dia após infecção,
houve diferença significativa
entre as linhagens de camundongos
bg e scid comparada aos respectivos
controles. É importante destacar que
a linhagem imunocompetente mais
refratária à infecção foi C57BL/6/Uni,
que apresentou oocistos apenas no 9º
dia, enquanto a linhagem BALB/c/Uni
apresentou oocistos no 6º, 9º e 12º
dias após a infecção.
A literatura relata que as linhagens
de Cryptosporidium sp estudadas até
o momento, mesmo as de origem
humana, são mantidas em bezerros,
por vários anos. No estudo de Griffiths
et al, 1998, utilizando o camundongo
KO para IFN-γ com “background”
C57BL/6, o pico de eliminação
de oocistos aconteceu no 9º dia
após a infecção. Em nossos resultados,
a linhagem MMC de Cryptosporidium
sp, no mesmo modelo evidenciou
maior eliminação de oocistos no 6º dia
após a infecção, uma característica que
sugere tratar-se genótipo humano.
Foi possível constatar que não
houve controle da infecção pela linhagem
KO, enquanto a linhagem bg
apresentou uma resposta tardia quanto
à eliminação dos oocistos associada
a significativa perda de peso no 15º
dia após a infecção (dados não mostrados).
A análise conjunta da mortalidade
dos camundongos imunodeficientes
infectados pelo Cryptosporidium sp
e da eliminação de oocistos (Fig.2)
indica que o perfil de resistência à
infecção nas linhagens estudadas obedece
o seguinte padrão: C57BL/6/Uni
> BALB/c/Uni > scid >bg > nude > KO.
Os resultados indicam a importância
do interferon-gama, linfócitos T e
células NK na resistência à infecção
pelo Cryptosporidium sp.
5. Referências Bibliográficas
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60 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Pesquisa
Cultivares e genes
Pesquisa
Entidades distintas e essenciais à agricultura
Aluízio Borém
Eng. Agrônomo, M.S. Ph.D., Professor da
Universidade Federal de Viçosa e Presidente da
Sociedade Brasileira de Melhoramento de Plantas
borem@ufv.br
Imagens cedidas pelo autor
Figura 01
Até por volta do ano 1900 não se
entendia a razão da semelhança entre
pais e filhos ou entre parentes. Alguns
acreditavam que o sangue era responsável
pela semelhança entre indivíduos
aparentados. Intrigado por esta
questão Gregor Mendel, em 1865, realizou
uma série de cruzamentos entre
ervilhas com diferentes tipos de grãos
e cor de flor. Estudando os resultados
dos seus trabalhos Mendel concluiu
que uma determinada estrutura presente
nos órgãos reprodutivos eram
responsáveis pela hereditariedade, os
genes. Gene é a unidade física e
funcional da hereditariedade que codifica
uma proteína funcional ou molécula
de RNA. Os botânicos e em geral
a comunidade cientifica da época consideraram
a argumentação de Mendel
sem consistência e ele morreu sem ter
seus trabalhos reconhecidos. Somente
em 1900 que seus trabalhos foram
descobertos, dando origem a ciência
que hoje conhecemos como genética.
Gene é, portanto, uma seqüência
de ácidos desoxirribonucléicos (DNA),
que codifica as características herdáveis
dos seres vivos. Cada gene sozinho, ou
em muito casos, associados a um ou
mais genes determinam se uma variedade
de milho apresenta elevado teor
de proteína ou se é de ciclo precoce.
Os genes encontram-se na estrutura
constituída de uma hélice dupla denominada
cromossomo. Cada espécie
possui um número típico de
cromossomos e, o conjunto de todos
os genes, distribuídos nos
cromossomos, constituem o genoma
do indivíduo.
As células não podem produzir uma
proteína pelo simples alinhamento de
aminoácidos ao longo do gene (DNA),
e para isso usam o RNA; os aminoácidos
não se aderem ao DNA. Adicionalmente,
o uso de um molde intermediário
(RNA) na síntese protéica reduz o risco
de danos ao DNA. Novamente, o
dogma central da genética postula que
a molécula intermediária RNAm, uma
cópia do DNA, é utilizada repetidamente
para a síntese protéica,utilizando
a maquinaria celular e resultando na
expressão das características dos indivíduos
(Figura 01).
Os genes são, portanto, a receita de
cada indivíduo ser como é. Neste
sentido, os genes em seu conjunto, o
genoma, são a receita de cada indivíduo.
Embora um indivíduo não possa
existir sem os genes, cada gene isoladamente
não possui capacidade autônoma
de reprodução e não pode se
multiplicar por si só. A perpetuação de
um gene só é possível se ele estiver
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 61

inserido em um indivíduo ou uma de
suas partes, a exemplo das sementes
ou estruturas vegetativas, como os
bulbos, estolons, rizomas etc. A estrutura
mínima de reprodução de uma
planta é uma célula, que no seu núcleo
possui pelo menos um exemplar de
cada gene da espécie. A replicação
gênica ocorre dentro do núcleo da
célula, com o envolvimento da enzima
DNA polimerase, presente na celula
(Figura 02).
Para a funcionalidade do gene, ele
precisa apresentar outras regiões além
da região codificadora, denominada
éxon. O esquema da figura abaixo
ilustra um gene típico de organismos
eucarióticos: animais e plantas. Nessa
figura está evidenciado o promotor,
que é a região do DNA que regula o
local, momento e intensidade da expressão
do gene. A região à direita do
promotor constitui a sua seqüência
codificadora com seus éxons e íntrons,
os quais são transcritos, ou seja, são
convertidos em uma molécula de RNA
durante a expressão do gene. Os íntrons
funcionam com o preenchimento do
loco gênico (região do DNA onde se
encontra o gene), os quais, embora
sejam transcritos, são eliminados no
Figura 02
processamento do RNAm, antes de
ocorrer a tradução (produção da proteína).
Os éxons contêm a seqüência
codificadora da proteína a ser sintetizada
(Figura 03).
Variedade geneticamente modificada
é aquela na qual foi inserido um
gene isolado de um outro indivíduo,
via técnicas do DNA recombinante,
também conhecida como engenharia
genética. O gene assim transferido,
tem sido designado de transgene e
possui as mesmas propriedades característica
dos genes, qual sejam, são
essenciais para a formação do ser vivo
porém não se perpetuam autonomamente,
isto é, independentemente do
indivíduo.
Variedade é um grupo de plantas
com características distintas, homogêneas
e estáveis, com identidade própria,
que a distingue das demais. Os
descritores varietais que conferem identidade
às variedades podem ser: ciclo,
cor das sementes, caracteres
morfológicos, reação a doenças, produção
de grãos, padrões isoenzimáticos
ou de ácidos nucléicos. A estabilidade
da variedade é importante para sua
identificação, geração após geração.
O termo cultivar, que tem sido
usado como sinônimo de variedade,
foi cunhado a partir da contração das
palavras inglesas cultivated variety (variedade
cultivada). Há uma discussão
sobre o gênero do termo cultivar. Alguns
periódicos científicos nacionais
consideram-no feminino, como a Revista
da Pesquisa Agropecuária Brasileira,
PAB, enquanto a Revista Ceres
considera-o masculino.
Tipos de variedade
Vários são os tipos de variedades
que o melhorista desenvolve para que
o agricultor possa explorar comercialmente
as plantas. Embora as variedades
só possam ser multiplicadas se
seus genes estiverem presentes na
unidade de reprodução, sementes ou
partes vegetativas, os genes por sua
vez não podem se reproduzir isoladamente,
isto é, autonomamente.
Linhas puras
As linhas puras são constituídas por
um grupo de indivíduos em
homozigose que apresentam basicamente
a mesma constituição genética,
o que as torna homozigóticas e homogêneas.
Estatisticamente, Kempthorne
(1957) definiu uma linha pura como
um grupo de indivíduos homozigóticos
com um coeficiente de parentesco
superior ou igual a 0,87.
Híbridos
Os híbridos são resultantes do cruzamento
entre indivíduos geneticamente
distintos, visando à utilização
prática da heterose. São heterozigóticos
e homogêneos e primariamente utilizados
em espécies alógamas. Híbridos
de algumas espécies autógamas, como
tomate e berinjela e, de forma menos
representativa, trigo e cevada, estão
disponíveis em diferentes países
(Carlsson e Leijon, 1986; Lehmann,
1986).
Os híbridos podem ser obtidos do
cruzamento de duas linhagens
Figura 03
62 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

endogâmicas, (P 1
x P 2
), híbrido simples;
de três linhagens endogâmicas,
[(P 1
x P 2
) x P 3
], híbrido triplo; ou de
quatro linhagens endogâmicas, [(P 1
x
P 2
) x (P 3
x P 4
)], híbrido duplo. Além das
linhagens endogâmicas, podem-se utilizar
variedades de polinização aberta,
clones ou linhas puras na obtenção dos
híbridos.
Clone
O clone é constituído por um grupo
de indivíduos que descendem, por
propagação assexuada, de um único
genitor. Os clones são heterozigóticos
e, em geral, homogêneos. Os indivíduos
de um mesmo clone são geneticamente
idênticos.
Nas espécies de propagação
assexuada, há uma correlação positiva
entre grau de heterozigose e vigor.
Por isso, as variedades clonais são em
geral altamente heterozigóticas.
Outros tipos de cultivares como
multilinhas, sintéticos, variedades de
polinização aberta e outras podem
eventualmente ser utilizadas pelos
agricultores.
Conclusões
Genes convencionais ou transgenes
não possuem capacidade autônoma
de reprodução ou de multiplicação por
si só. Para a perpetuação de um gene
ele precisa estar inserido em uma planta
ou em uma de suas partes, que
possua viabilidade, a exemplo das sementes.
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Pesquisa
Malária em camundongos
imunodeficientes
A malária experimental por Plasmodium chabaudichabaudi em camundongo scid
Fabiana Martins Batista Motta
Mestre em Parasitologia (Unicamp).
fabiana@cemib.unicamp.br
Ana Maria Aparecida Guaraldo
Profa. Dra. Do Instituto de Biologia –
Departamento de Parasitologia (Unicamp);
Diretora do CEMIB (Centro Multidisciplinar
para Investigação Biológica).
guaraldo@cemib.unicamp.br
Imagens cedidas pelos autores
1. Introdução
malária é um dos
maiores desafios de
saúde pública que afeta
o desenvolvimento dos
países mais pobres. Segundo
a OMS, a cada ano são registrados
aproximadamente 300-500 milhões
de casos e 1 milhão de mortes
por malária, acometendo principalmente
crianças menores de cinco anos
e mulheres grávidas. Deste número
alarmante, 90% se concentram na África
e os outros 10% estão distribuídos
nas Américas Central e do Sul, Sudeste
Asiático e Ilhas da Oceania (RBM –
OMS).
Na América Latina, 99% ocorrem
na Amazônia brasileira, dos quais
78% dos casos relatados referem-se ao
Plasmodium vivax e 22% ao Plasmodium
falciparum (Funasa-2002).
A malária murina é útil na pesquisa
científica, pois a escolha de linhagem
do hospedeiro e do parasita
pode simular a doença humana. O P.
chabaudi chabaudi tem sido adotado
pelos pesquisadores como modelo
para estudar imunidade adquirida para
o estágio eritrocítico, pois é um parasita
de roedor equivalente ao P. falciparum.
Estudos demonstraram que a
imunidade na malária depende de linfócitos
T e B malária-específica e seus
respectivos anticorpos, onde células T
regulam a fase inicial da infecção e as
células B e anticorpos se encarregam
de finalizar a infecção (Meding & Langhorne,
1991).
A importância das células T
CD4+ na resolução do estágio sangüíneo
da infecção por P. chabaudi linhagem
AS tem sido estabelecida com
base na incapacidade do camundongo
nude, camundongo scid e camundongo
deficiente de célula T CD4+
para controlar a infecção. O mecanismo
pelo qual as células T CD4+
fornecem proteção imune tem sido
alvo de recentes e intensivas investigações.
Com base no padrão de
produção de citocinas e na habilidade
em promover ajuda para as células B,
foi demonstrado que células T CD4+
correspondem ao tipo inflamatório ou
subconjunto Th1, que predominam
durante a fase aguda ou inicial da
malária, seguida pelo aparecimento,
durante a fase crônica ou tardia da infecção,
das células Th2, que são capazes
de induzir a produção de anticorpos
Plasmodium-específico e citocinas,
como IL-4 e IL-10 (Larghorne
et al. 1998). Conclusões similares foram
alcançadas por Taylor-Robinson
em 1996.
Além dos linfócitos T CD4+, linfócitos
T CD8+ também contribuem
para o desenvolvimento de imunidade
adquirida para infecção por P. chabaudi
AS. Nos estudos realizados por Podoba
& Stevenson, 1991, a depleção de
células T CD4+ provocou significativo
aumento da parasitemia já no 7º dia
da infecção. Em contraste, na ausência
de linfócitos T CD8+, a infecção
aguda com P. chabaudi AS foi definitivamente
resolvida. No entanto, duas
crises recorrentes de parasitemia foram
observadas durante a fase de eliminação,
que requisitou mais de 5 semanas
em vez de 4 semanas , característica
dessa infecção em C57BL/
6, demonstrando então a contribuição
que o linfócito T CD8+ exerce para a
imunidade adquirida na malária.
As células NK, definidas como
células citotóxicas , dotadas de
64 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

morfologia predominante de grande
linfócito granular, possuem a habilidade
de secretar as citoquinas INF-gama e
TNF-alfa, em resposta à infecção por
parasitas intracelulares e ainda
respondem à indução pela IL-12. As
células NK são células efetoras da
resistência inata contra agentes
infecciosos (Scott et al 1995).
Seixas et al. (2001), comprovaram
a capacidade de células dendríticas
produzirem TNF-alpha dentro
de 30 minutos da exposição aos esquizontes
de P. chabaudi chabaudi, independentemente
de células T ou NK.
Portanto, o estágio eritrocítico deste
parasita ativa células dendríticas diretamente,
propiciando a rápida ativação
de células Th1 e indução de imunidade.
Apesar de estudos comprovarem
que as células NK e suas citocinas
exercem papel importante no controle
imunológico da malária, sabe-se que
fatores genéticos representam um dos
maiores determinantes da resistência
do hospedeiro contra a malária. Estudos
sobre o modelo P. chabaudi AS,
usando análise genética,
mostraram que a
atividade da célula NK
e a resistência a esse
parasita segregam independentemente
(Skamene et al 1983).
De acordo com Fortin
et al (2002), as linhagens
A/J, BALB/c,
AKR, DBA/1, C3H/
HeJ, SJL e 129/ICR são
susceptíveis ao P. chabaudi,
enquanto que
as linhagens C57BL/6,
B10. A, CBA, DBA/2 e
C57L são resistentes ao
P. chabaudi.
A linhagem P.
chabaudi chabaudi
CR, não-letal, representa a malária experimental
de autocontrole, apropriada
para estudos de imunidade em estágio
sangüíneo (Garnica et al., 2002).
Esta linhagem propicia o estudo da fase
crônica da infecção em linhagens imunodeficientes.
O objetivo deste trabalho é
estudar a importância das células NK
no controle do P. chabaudi em camundongos
mediante a comparação
Figura 01
da parasitemia, após inoculação do
parasita nas linhagens de camundongos
scid e C57BL/6 Knockout para interfero-gama.
2. Material e Métodos
Camundongos. Quatro linhagens de
camundongos machos livres de
patógenos específicos (SPF), com 6 a
8 semanas de idade, provenientes do
CEMIB/Unicamp foram adotadas :
C.B17 scid/Uni (12 animais); BALB/c/
Uni (48 animais); C57BL/6 knockout
(KO) para interferon gama (4 animais);
e C57BL/6/Uni (3 animais) .
Plasmodium chabaudi chabaudi
CR. A linhagem de P. chabaudi chabaudi
(CR) foi cedida pelo Prof. Dr.
Heitor F. Andrade Junior, do Instituto
de Medicina Tropical de São Paulo. Um
camundongo da linhagem C57BL/6 foi
a fonte de P. chabaudi. Os parasitas
foram mantidos mediante passagens
semanais sucessivas no camundongo
BALB/c Uni por 12 semanas antes da
infecção do scid e KO. Após este
período um “pool” de células
sangüíneas foi coletado da veia da cauda
dos animais, para o preparo do i-
noculo em solução NaCl 0,15 M. A
contagem destas células foi realizada
em câmara de Neubauer sob microscopia
de contraste de fase.
A manutenção do P. chabaudi
chabaudi CR foi realizada mediante
repiques semanais do inoculo de 10 7
hemácias parasitadas em camundongos
macho BALB/c/Uni mantidos em
isoladores. Amostras de esfregaços também
foram coradas pelo Giemsa, para
avaliação das formas de Plasmodium.
Manutenção dos animais em isolador
de PVC. Os camundongos infectados
foram mantidos em isolador
de plástico flexível (LNF – Ind. & Com.
Ltda.), de pressão positiva, com 16 a
18 trocas de ar por hora, no Departamento
de Parasitologia da UNICAMP.
O material necessário para a manutenção
dos animais (gaiolas, tampas,
ração, água, maravalha, bebedouros,
pinças etc.) foi devidamente submetido
a processos de esterilização em autoclave,
conforme normas de procedimentos
adotados pelo CEMIB.
Determinação da Parasitemia.
Amostras de 20 ml de sangue foram
coletadas com micropipeta da cauda
do camundongo infectado. A coleta
aconteceu a intervalos semanais até a
6 ª semana de infecção. Após este
período, os intervalos para determinação
da parasitemia
foram de 15 dias. Para
a contagem de parasitas,
o sangue foi diluído
1000 x em NaCl
0,15 M. As hemácias
parasitadas e os parasitas
livres foram contados
em câmara de
Neubauer sob microscopia
de fase (Figura
1). Os valores foram
expressos em
número de hemácias
parasitadas x 10 8 /mL.
Os camundongos do
experimento foram infectados
com 10 6 parasitas
(hemácias parasitadas
+ parasitas
livres) mediante injeção intraperitoneal.
No decorrer do experimento foi
registrada a morta-lidade dos animais.
Monitoramento imunológico da
linhagem C.B-17 scid/Uni. A classificação
dos animais homozigotos ou
heterozigotos da linhagem C.B-17 scid/
Uni foi realizada pelo teste Dot-Elisa
para imunoglobulinas. (Alves et al.,
2002).
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 65

Figura 2 - Média e erro padrão dos valores de parasitemia em camundongos C.B-
17 SCID, BALB/c/Uni, C57BL/6 KO para interferon gama durante 6 semanas de
infecção com Plasmodium chabaudi chabaudi (CR) e durante as semanas 1, 2, 3 e
4 nos camundongos C57BL/6/Uni.
Mouse Antibody Production (MAP
– teste). Considerando que a linhagem
do Plasmodium chabaudi chabaudi
(CR) foi proveniente de manutenção
“in vivo” em animais com padrão sanitário
desconhecido, tornou-se
necessário avaliar os patógenos associados
ao parasita. Desta forma, os camundongos
imunocompetentes foram
avaliados quanto à presença de 11
antígenos de patógenos murinos
(MHV-3, TMEV-GDVII, SENDAI, MVM,
LCM, Ectromelia, Adenovirus, Rotavirus,
Reovirus tipo 3, Mycoplasma pulmonis
e Toxoplasma gondii). Os camundongos
SPF inoculados com o Plasmodium
foram mantidos em isoladores
por mais de 60 dias e o respectivo soro
coletado para análise sorológica de
patógenos murinos pelo Laboratório
de Controle de Qualidade do CEMIB.
Estatística. Os valores da parasitemia
dos três grupos de animais (BALB/c/
Uni, C.B-17 scid/Uni, C57BL/6 KO) no
intervalo das seis primeiras semanas
foram submetidos a Análise de Variância
de Medidas Repetidas e o teste
de Duncan, executados pelo programa
estatístico SAS (SAS Institute 1987).
3. Resultados
A maior parasitemia da linhagem
C.B-17 scid aconteceu por volta
da 6 ª semana e uma recrudescência
foi observada na 12 ª semana. No controle
correspondente, BALB/c/Uni , a
maior parasitemia aconteceu na 10 ª
semana.
A análise estatística comparativa
entre as linhagens BALB/c e scid
nas primeiras 6 semanas de infecção
permitiu constatar a capacidade do
animal competente em controlar a
parasitemia na 6 ª semana (Figura 2).
Os camundongos C57BL/6 KO
para INF-g atingiram níveis mais elevados
de parasitemia quando comparados
com o seu controle C57BL/6 (Figura
2) e também em relação ao modelo
scid (Figura 2). A maior parasitemia
em KO ocorreu na 10 ª semana.
Foi feita a comparação estatística
entre os valores médios de parasitemia
durante as primeiras seis semanas
no grupo de animais C.B-17 scid,
BALB/c/Uni e KO para INF-γ . Os resultados
evidenciaram o aumento marcante
de parasitemia em animais KO
e scid, resultando em diferença significativa
entre a 1 ª e 6 ª semanas de infecção
(Figura 2).
Durante o período máximo de
observação, correspondente a 23 semanas
para as linhagens KO e scid,
não foi observada mortalidade em KO.
Entretanto, do grupo de doze scid,
quatro morreram: um, na segunda semana;
um, na décima semana; um, na
décima terceira semana; e, outro, na
décima sexta.
É importante ressaltar que
houve mortalidade dos camundongos
BALB/c/Uni (2/48), linhagem de manutenção
do P. chabaudi: um, na décima
primeira semana; e, outro, na décima
nona semana após infecção.
Os camundongos scid são considerados
homozigotos quando os
níveis de imunoglobulina sérica forem
inferiores a 5 mg/ml. O critério de
seleção dos animais homozigotos scid/
scid foi adotado para seleção das matrizes
na colônia do CEMIB/Unicamp,
com o objetivo de minimizar e retardar
a expressão do fenótipo “leaky”
(capacidade de alguns camundongos
scid desenvolver um limitado número
de células T e B entre 3 e 9 meses de
idade) (Bosma et al 1988).
Todos os animais scid adotados
nos experimentos apresentaram-se
homozigotos.
Todos os soros testados das
linhagens de camundongos imunocompetentes
do experimento, assim
como o soro do animal infectado no
Instituto de Medicina Tropical de São
Paulo (fonte do P. chabaudi chabaudi
linhagem CR), que foi mantido durante
65 semanas, revelaram-se negativos
para os 11 antígenos de patógenos
murinos avaliados (MHV-3,
TMEV-GDVII, SENDAI, MVM, LCM, Ectromelia,
Adenovirus, Rotavirus, Reovirus
tipo 3, Mycoplasma pulmonis e
Toxoplasma gondii).
4. Discussão
O ambiente controlado – isoladores
– onde são mantidos os animais
SPF (Specific Pathogen Free) permitiu
o controle dos fatores externos
evitando riscos de contaminação dos
animais experimentais, o que poderia
influenciar e comprometer os resultados
da pesquisa. Em se tratando de
camundongos da linhagem C.B-17 scid,
o fato de a colônia ser mantida em
condições ambiente e sanitária controladas
colabora para o nível baixo de
animais com o fenótipo “leaky”. Os
últimos levantamentos sorológicos
detectaram o fenótipo “leaky” em 9%
da colônia com idade de 40 semanas
(Alves et al 2002). Camundongos scid
são desprovidos de resposta imune
dependentes de linfócitos T e B. Desta
maneira, são muito susceptíveis a
patógenos oportunistas que podem
ser bactérias: (Proteus mirabilis, Streptococcus
viridans e Escherichia coli)
e vírus (vírus da hepatite murina
(MHV), vírus Sendai e vírus respiratório
66 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

murino), e ainda o Pneumocystis carinii.
(Percy & Barta 1993).
Um exemplo de co-infecção
com P. chabaudi e a respectiva interferência
no desempenho de resposta
imune foi estudado por Yoshida et al
(2000) onde constataram que camundongos
A/J susceptíveis à malária, infectados
com P. chabaudi e coinfectados
com Schistosoma mansoni desenvolveram
resistência ao Plasmodium.
Os resultados desse estudo mostraram
que, apesar de o S. mansoni na fase
de oviposição, induzir resposta Th2,
dentro de certas circunstâncias, a coinfecção
Schistosoma/Plasmodium promoveu
resposta imune tipo Th1 no
camundongo A/J, tornando-o resistente
ao Plasmodium.
Células tipo Th1 são responsáveis
por mediar o controle da parasitemia
aguda através da ativação de
mecanismos imune mediados por célula,
enquanto que as células tipo Th2
mediam o crescimento e diferenciação
de células B para controlar a infecção
através de mecanismos dependentes
de anticorpos (Yap et al 1994).
Skamene et al (1983) descreveram
a inexistência de relação
entre resistência na infecção com Plasmodium
chabaudi e atividade de células
NK. Em seu experimento mostraram
que camundongo C57BL/6 bg/
bg deficiente de célula NK obteve a
resolução da infecção por P. chabaudi
da mesma forma que o seu camundongo
parental +/+.
Kitaguchi et al (1996) injetaram
células NK de camundongo C57BL/6
infectado com P. chabaudi em outro
camundongo que também seria
infectado. Essa transferência não
conferiu proteção, pois o curso desta
infecção foi similar ao do camundongo
controle. Entretanto, tratamento de
camundongos com anticorpos
monoclonais anti-NK resultou no
aumento da morta- lidade. Concluíram,
então, que células NK podem não
impedir o aumento da parasitemia,
mas elas podem exibir um papel
importante na recuperação da parasitemia,
provavelmente por secretar
INF-γ, e conseqüentemente diminuir
a mortalidade em infecções por P.
chabaudi.
O tratamento de camundongo
susceptível A/J com IL-12 murina
reduziu muito a parasitemia e
melhorou a sobrevida do hospedeiro.
Essa proteção induzida por IL-12 é
mediada por INFγ- e TNF-α secretados
por células NK durante infecção inicial
(Stevenson et al 1995; Mohan et al
1997). Além disso, foi observado que
em camundongos deficientes de receptor
para INF-γ (Balmer et al 2000;
Favre et al 1997) e camundongo KO
para INF-γ (Su & Stevenson 2000),
infectados com P. chabaudi AS,
ocorreu incapacidade para reduzir a
parasitemia primária e alta
mortalidade. Batchelder et al 2003,
comprovaram também em seus
estudos, a importância que o INF-γ
exerce na imunidade celular contra P.
chabaudi adami.
Camundongos KO para IL-12
(gene p 40) infectados com P.
chabaudi AS, tiveram os níveis de INFg
diminuídos bem como IgG2a e IgG3
Th1-dependente. Com esses
resultados concluiu-se que a citocina
IL-12 produzida na fase inicial do
estágio sangüíneo da infecção por P.
chabaudi AS é importante para indução
de resposta imune INF-γ-dependente
tipo Th1 responsável pelo controle da
fase aguda da infecção e sobrevivência
do hospedeiro, influenciando
fortemente a imunidade tipo Th2
mediada por anticorpo necessária para
resolução da fase crônica (Su &
Stevenson, 2002; Bastos et al, 2002).
Os resultados obtidos em
animais KO para INF-γ corroboram os
de Su & Stevenson (2000) no que se
refere à incapacidade de reduzir a parasitemia.
Por se tratar de linhagem
distinta de P. chabaudi, a mortalidade
observada em nossos animais KO foi
zero. Não foi possível observar o clearance
do parasita.
Os modelos animais utilizados
em nosso trabalho, scid, KO para IFNγ
e BALB/c são considerados
geneticamente susceptíveis por Fortin
et al (2002).
A linhagem scid, cuja única
fonte de resposta imune é a célula NK,
revelou-se extremamente suceptível
ao P. chabaudi CR, com 25% de morte
em 12 animais.
Em C57BL/6 não se observou a
parasitemia além das quatro semanas
porque trata-se de linhagem resistente
ao Plasmodium.
As células NK sozinhas não controlam
a parasitemia. Entretanto, em
camundongos C57BL/6 KO para INFγ,
os picos parasitêmicos foram muito
altos, levando à conclusão de que, as
células NK, provavelmente devido à
produção de inrterferon gama, contribuem
para a redução da parasitemia.
Estudos (Prakash et al, 2003)
demonstram correlação entre falência
renal aguda e casos de malária severa
por P. falciparum (79,6%), o que conduz
à necessidade de avaliar a ocorrência
de lesões histopatológicas renais
provocadas por P. chabaudi CR em
camundongos, o que possivelmente
contribuiria para com a mortalidade
desses animais.
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Pesquisa
Micotoxinas
em alimentos
Progressos na imunodetecção
Elisabete Yurie Sataque Ono
Dra., Prof., Departamento de Bioquímica e
Biotecnologia - Centro de Ciências Exatas
Universidade Estadual de Londrina
eysono@uel.br
Aline Maísa Mendes
Especialista em Bioquímica Aplicada
Departamento de Bioquímica e Biotecnologia
Centro de Ciências Exatas,
Universidade Estadual de Londrina
alinempinheiro@yahoo.com.br
Paula Garcia Meirelles
Pós-graduanda do Programa de Mestrado em
Biotecnologia, Departamento de Bioquímica e
Biotecnologia, Centro de Ciências Exatas,
Universidade Estadual de Londrina
paulag@uel.br
Elisa Yoko Hirooka
Doutora, Professora, Depto. de Tecnologia de
Alimentos e Medicamentos
Centro de Ciências Agrárias
Universidade Estadual de Londrina
hirooka@uel.br
Mario Augusto Ono
Doutor, Professor, Departamento de Ciências
Patológicas - Centro de Ciências Biológicas
Universidade Estadual de Londrina
marioono@uel.br
Fotos cedidas pelos autores
Introdução
Micotoxinas são metabólitos secundários
tóxicos produzidos por fungos
que freqüentemente contaminam
produtos agrícolas, no campo, durante
a colheita, transporte e estocagem.
Estes compostos apresentam estruturas
químicas diversas e são produzidos
por fungos de campo e de estocagem,
incluindo muitas espécies de Fusarium,
Aspergillus e Penicillium (Figura
1) (Ayres, 1979).
Muitas micotoxinas são capazes
de apresentar uma ampla gama de
efeitos biológicos em várias espécies
animais, incluindo o homem, em concentrações
relativamente baixas (i.e.,
na faixa de mg/kg [ppm] a µg/kg
[ppb]).
A ocorrência natural de micotoxinas
em grãos de cereais pode, além
dos problemas de saúde, ter implicações
econômicas importantes para diversos
setores comerciais incluindo
produtores de grãos, criadores de animais
e aves, assim como processadores
de alimentos e rações (Pestka et
al., 1995). As perdas acarretadas podem
advir da baixa qualidade dos
grãos (Figura 2), baixa produtividade,
baixa performance animal e/ou necessidade
de descontaminação dos
grãos.
Segundo uma estimativa da FAO
(Food and Agriculture Organization)
anualmente cerca de 25% do suprimento
alimentar mundial é contaminado
por micotoxinas. Os riscos à
saúde humana associada à ocorrência
natural de determinadas micotoxinas
resultaram na adoção de medidas de
controle em alguns países (FAO, 1997).
O principal meio de eliminar
micotoxinas consiste em detectar e
desviar as matérias-primas contaminadas
de produtos destinados ao consumo
humano e animal. A vigilância
analítica permite identificar regiões
geográficas onde as micotoxinas constituem
um problema recorrente, além
de fornecer uma base de dados sobre
a exposição humana em estudos epidemiológicos
(Pestka et al. 1995).
Uma vez que o problema relacionado
às micotoxinas é difícil de ser
evitado, as medidas mais efetivas de
controle dependem de um rigoroso
programa para monitorar a contaminação
em alimentos e rações (Chu, 1984).
Os métodos para análise de
micotoxinas incluem cromatografia de
camada delgada (Stockenström et al.,
1994), cromatografia gasosa (Sydenham
et al., 1990), cromatografia gasosa-espectroscopia
de massa (Plattner
et al., 1990) e cromatografia líquida
de alta eficiência (CLAE) (Shephard
et al., 1990). Embora a CLAE tenha
sido adotada como um método oficial
Figura 1. Colônias de Fusarium spp. (a),
Aspergillus spp. (b) e Penicillium spp. (c)
em ágar batata dextrose
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 69

Recentemente, foi desenvolvido
um novo método de produção de
anticorpos com grande potencial. O
método é baseado em técnicas de
biologia molecular e consiste no isolamento
e recombinação dos genes que
codificam a região variável dos anticorpos
(Lee & Morgan, 1993). Esta
técnica apresenta vantagens como
baixo custo e possibilidade de manipulação
do DNA que codifica para o
anticorpo a fim de melhorar características
como afinidade e especificidade
(Yau et al., 2003).
Princípios de imunoensaio
Figura 2. Grãos de milho de boa qualidade (a) e de baixa qualidade (b)
para análise de micotoxinas (Sydenham
et al., 1996a,b), requer instrumentação
de alto custo, pessoal altamente
treinado, uma pré-limpeza extensiva
da amostra, tornando cada análise
muito demorada.
Nos últimos anos, ocorreu um
grande avanço no uso de imunoensaios
na análise de micotoxinas devido à
especificidade, sensibilidade e simplicidade
aliadas à rapidez e a possibilidade
de análise de um grande número
de amostras simultaneamente (Hefle,
1995).
Em seguida serão descritos os
princípios básicos de imunoensaios e
alguns dos desenvolvimentos mais recentes
na aplicação de técnicas imunoquímicas
para a determinação de
micotoxinas (aflatoxinas e fumonisinas).
Conceitos básicos
Os imunoensaios são procedimentos
analíticos baseados na ligação
não covalente entre antígeno e anticorpo,
e podem ser desenvolvidos
para detectar o antígeno ou o anticorpo.
Os imunoensaios utilizados na área
de alimentos são baseados na pesquisa
de antígenos.
Os imunoensaios podem ser realizados
com anticorpos policlonais,
anticorpos monoclonais e anticorpos
recombinantes.
Anticorpos policlonais
Os anticorpos policlonais são obtidos
pela imunização de um animal
(coelho, carneiro, cabra, cavalo) e purificados
posteriormente a partir do
soro imune.
A estimulação de linfócitos B induz
a produção de anticorpos. Cada
clone de linfócito produz anticorpo de
uma determinada especificidade, portanto
a estimulação de muitos linfócitos
do organismo determina a produção
de muitos anticorpos diferentes,
com diferentes especificidades e afinidades.
O soro obtido de um animal
imunizado contém anticorpos produzidos
por diferentes clones de linfócitos
B e, portanto, é denominado anticorpo
policlonal (Abbas, 2000).
Os anticorpos policlonais são
relativamente fáceis de produzir e
apresentam alta afinidade, porém podem
apresentar reações cruzadas.
Anticorpos monoclonais
Os anticorpos monoclonais são
produzidos por hibridomas, que são
obtidos pela fusão de linfócito B com
célula tumoral (mieloma). O hibridoma
tem a capacidade de proliferar,
produzindo anticorpos monoclonais em
grandes quantidades (Abbas, 2000).
Os anticorpos monoclonais oferecem
vantagens como afinidade e
especificidade de ligação, homogeneidade
e capacidade de serem produzidos
em quantidades ilimitadas
(Deshpande, 1996).
Anticorpos recombinantes
Inicialmente o radioimunoensaio
foi o método mais utilizado para quantificação
de micotoxinas, porém, devido
a problemas relacionados à manipulação
de material radioativo e o
reduzido tempo de prateleira dos reagentes
foi substituído pelos ensaios
imunoenzimáticos (Pestka et al., 1995).
Imunoensaios que utilizam antígeno
ou anticorpo marcado com uma
enzima são denominados ensaios imunoenzimáticos,
entre os quais o mais
empregado é o método de ELISA
(Enzyme-linked Immunosorbent Assay).
O ensaio imunoenzimático é um
método em que a reação antígenoanticorpo
é monitorada pela medida
da atividade enzimática, utilizando a
conversão de um substrato (cromogênico,
fluorescente ou quimioluminescente)
por um antígeno ou anticorpo
marcado com a enzima como meio de
detecção/quantificação do analito
(Gazzaz et al., 1992). Os imunoensaios
apresentam alta sensibilidade, especificidade
e facilidade na execução
e permitem a quantificação do analito
em níveis de ng ou pg.
A enzima utilizada no ELISA deve
apresentar alta atividade específica e
o produto da reação enzimática deve
ser estável, de fácil quantificação, facilmente
conjugada a vários antígenos,
anticorpos e haptenos, sem perda
da atividade e ter custo acessível (Sanchez,
1998).
Várias enzimas podem ser utilizadas
no ELISA, como peroxidase, fosfatase
alcalina, β-galactosidase, entre outras
(Gazzaz et al., 1992).
Tipos de ELISA
Atualmente, os tipos de ELISA
mais empregados para análise de substâncias
biologicamente ativas, como
70 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Figura 3. ELISA competitivo direto (dc-ELISA)
as micotoxinas, são ELISA competitivo
direto e ELISA competitivo indireto.
ELISA competitivo direto
(dc-ELISA)
No dc-ELISA, as microplacas são
sensibilizadas com anticorpo específico
para a micotoxina, incubadas com o
conjugado micotoxina-enzima, na presença
da amostra em que se deseja
pesquisar a micotoxina (Figura 3). Após
a obtenção do equilíbrio da reação
antígeno-anticorpo é adicionado o substrato
da enzima. Há uma relação inversamente
proporcional entre a concentração
de micotoxina na amostra e a
intensidade da cor desenvolvida (Sanchez,
1998).
O dc-ELISA é um método fácil e
rápido para detecção de micotoxinas,
visto que a amostra e o conjugado
(micotoxina conjugada à enzima) podem
ser adicionados ao mesmo tempo
(Gazzaz et al, 1992).
ELISA competitivo indireto
(ic-ELISA)
No ic-ELISA o anticorpo específico
(anticorpo primário) para a micotoxina
é incubado com a amostra em
uma microplaca sensibilizada com a
micotoxina (Figura 4). Quanto maior a
concentração de micotoxina na amostra,
menos anticorpo livre estará disponível
para ligar-se à micotoxina fixada
à microplaca. A quantidade de
anticorpo primário ligado à placa pode
ser estimada pela incubação com anticorpo
secundário marcado com enzima,
específico para o anticorpo primário,
seguida de adição do substrato. A
concentração de micotoxina na amostra
é inversamente proporcional à intensidade
da cor desenvolvida (Hefle,
1995).
Aplicação de técnicas
imunoquímicas
Diversos métodos imunoquímicos
têm sido aplicados na detecção de
micotoxinas, incluindo ELISA, colunas
de imunoafinidade, métodos que empregam
membranas, imunofiltração e
biosensores (Tabela 1).
As técnicas de ELISA são amplamente
utilizadas na análise de lotes de
amostras e podem fornecer resultados
qualitativos baseados no desenvolvimento
de cor pela reação enzimática
com um substrato cromogênico, ou
semiquantitativo/quantitativo pela determinação
espectrofotométrica. A
principal desvantagem do ELISA resulta
das interações inespecíficas de componentes
alimentares (proteínas, ácidos
graxos) com o anticorpo, que
podem causar reações falso-positivas
ou superestimação da concentração
de micotoxinas (Hefle, 1995; Barna-
Vetró et al., 1996). As interferências
podem ser minimizadas pela diluição
das amostras antes do ensaio, ou pela
inclusão de uma etapa de pré-limpeza
(Pestka et al., 1994; Barna-Vetro et al.,
1996; Ono et al., 2000).
Recentemente a “Association of
Official Analytical Chemists” (AOAC)
validou diversos métodos analíticos
baseados na pré-limpeza do extrato
alimentar por coluna de imunoafinidade
antes da análise por CLAE (Burdaspal
et al., 2001; Dragacci et al., 2001;
Entwisle et al., 2001; Visconti et al.,
2001). A utilização de cromatografia
em camada delgada (CCD) associada
a colunas de imunoafinidade é um
procedimento promissor com desempenho
comparável à CLAE (Stroka &
Anklam, 2002), principalmente se a
CCD de alta performance for utilizada
(Valenta, 1998). A desvantagem em
relação ao elevado custo das colunas
de afinidade comerciais tende a ser
minimizada pelo processo de regeneração
da coluna (Scott & Trucksess,
1997; Fazekas & Tar, 2001; Watanabe
et al., 2001; Kondo et al., 2002).
Os limites regulatórios cada vez
mais rigorosos sobre os níveis de contaminação
de micotoxinas por países
importadores de grãos aumentaram a
demanda por métodos rápidos e confiáveis
para condições de campo. Diversos
métodos que empregam membranas
(“dip-sticks”, tiras imunocromatográficas,
dispositivos de fluxo)
foram desenvolvidos para aplicação
no campo (De Saeger & Van Peteghem,
1996; Sibanda et al., 2000; Ho
& Wauchope, 2002). Entretanto, geralmente
esses métodos apresentam
baixa sensibilidade e são inadequados
para a análise de grande número de
amostras. Ultimamente, houve um
progresso expressivo em bio-sensores
tais como “surface plasmon resonance”
(SPR), sondas de fibra óptica e
ensaios baseados em micropartículas
(Carlson et al., 2000; Daly et al., 2000;
Maragos, 2002; Nasir & Jolley, 2002),
mas apenas uma amostra pode ser
avaliada de cada vez. As principais
limitações desses métodos consistem
na baixa reutilização da imunosuperfície
e elevado consumo de reagentes
(Gonzalez-Martinez et al., 1999).
Aflatoxinas
As aflatoxinas, compostos heterocíclicos
consistindo de diidrofurano
ou tetraidrofurano ligado a uma cumarina
substituída (Figura 5), são produzidas
por Aspergillus flavus e A. parasiticus
(Stoloff, 1976). Os principais
membros deste grupo de micotoxinas
consistem de quatro toxinas que ocorrem
naturalmente, AFB 1
, AFB 2
, AFG 1
e
AFG 2
, juntamente com seus produtos
metabólicos (AFM 1
, AFM 2
, AFP 1
, AFQ 1
e aflatoxicol) produzidos pelos sistemas
metabólicos microbianos e animais
(Bradburn et al., 1993).
As aflatoxinas são encontradas
como contaminantes de milho, aveia,
cevada, amendoim e outras nozes,
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 71

especialmente em regiões tropicais e
subtropicais, onde as condições de
temperatura e umidade são ótimas
para o crescimento do fungo e para a
produção da toxina (Rustom, 1997).
As aflatoxinas provocam sintomas
tóxicos agudos em várias espécies
de animais, e o fígado é o alvo
principal (Wogan, 1969). A AFB 1
apresenta
atividade teratogênica, mutagênica
e hepatocarcinogênica, por meio
da ativação metabólica para a forma
epóxido, que pode se ligar covalentemente
ao DNA. Devido à associação
com o câncer hepático primário foi
classificada pela “International Agency
for Research on Câncer” (IARC)
como carcinógeno do grupo 1 (IARC,
2002).
Dentre as micotoxinas
para as quais os limites legais
de contaminação já foram
estabelecidos, as
aflatoxinas são as mais amplamente
reguladas. A
“Food and Agriculture
Organization” (FAO, 1997)
relatou 77 países onde existe
alguma forma de controle
para aflatoxinas. Em países
onde o regulamento
especifica apenas o nível
de AFB 1
, os níveis permitidos
se encontram numa faixa
de zero detectável a 50
µg/kg , sendo que a maioria
é de 5 µg/kg. Além dos níveis de AFB 1
,
alguns países regulam os níveis de
aflatoxinas totais dentro da mesma
faixa de concentração.
A aflatoxina M 1
é um derivado
hidroxilado da AFB 1
, sendo produzida
e excretada no leite de animais que
consomem ração contaminada com
AFB 1
. A preocupação existente acerca
da AFM 1
advém de sua semelhança
estrutural com a AFB 1
e também do
fato das crianças estarem entre os
maiores consumidores de leite (Gremmels,
1999). A AFM 1
foi classificada
como carcinógeno do grupo 2B (possivelmente
carcinogênico para seres
humanos) (IARC, 2002).
Anticorpos policlonais e monoclonais
para aflatoxinas foram desenvolvidos
para utilização em ic-ELISA e
dc-ELISA (Morgan et al., 1983; Chu et
al., 1987; Kawamura et al., 1988; Li et
al., 1994; Aldao et al., 1995, Devi et al.,
1999; Thirumala-Devi et al., 2002;
Lipigorngoson et al., 2003).
Lipigorngoson et al. (2003) desenvolveram
um dc-ELISA baseado
em anticorpos monoclonais para
detecção de AFB 1
com um limite de
detecção de 4 µg/kg, recuperação de
88,1% a 99,5%. Os coeficientes de
correlação com kit de ELISA comercial
e CCD foram 0,912 e 0,802 para
milho, 0,941 e 0,832 para amendoim,
respectivamente (p

Figura 5. Estruturas químicas das principais aflatoxinas
Figura 6. Estruturas químicas das principais fumonisinas
utilizada como base para detecção de
< 20 ng de AFB 1
marcada com lipossomos
contendo um corante (Ho &
Wauchope, 2002). Neste método, a
amostra migra ao longo da tira por
capilaridade em uma área contendo
anticorpos imobilizados, então a AFB 1
marcada com lipossomos contendo
corante migra pela mesma área com a
subseqüente ligação com os anticorpos
que não se ligaram à AFB 1
da
amostra, desenvolvendo uma coloração
intensa.
Um imunoensaio colorimétrico
para detecção de AFB 1
baseado na
injeção seqüencial de amostras (SIIA),
utilizando uma célula de fluxo circular
empacotada em uma fase sólida de
polimetilmetacrilato, apresentou um
limite de detecção de 0,2 ng/mL em
amostras de alimentos artificialmente
contaminados (Garden & Strachan,
2001). Esta sensibilidade é comparável
à sensibilidade do ELISA em microplaca,
com a vantagem de ser realizado
em apenas dez minutos, enquanto
o ELISA demora 2 horas. A desvantagem
do novo sistema é a realização de
análises seqüenciais de no máximo 15
amostras, enquanto o ELISA permite a
análise de dezenas de amostras ao
mesmo tempo.
Diversos trabalhos sobre a performance
de kits para determinação de
aflatoxinas foram realizados (Dorner &
Cole, 1989; Koeltzow & Tanner, 1990;
Beaver et al., 1991; Sabino et al.; 1997;
Oliveira et al., 2000). Hongyo et al.
(1992) comparando a análise de extratos
de milho por dc-ELISA baseado
em anticorpos monoclonais com CCD
e CLAE, encontraram coeficientes de
correlação de 0,93 e 0,95, respectivamente,
quando o nível de contaminação
era até 200 µg/kg.
Oliveira et al. (2000) compararam
as técnicas de CCD com quantificação
visual e densitométrica e ELISA,
para análise de aflatoxinas em amostras
de milho naturalmente contaminadas.
As concentrações de aflatoxinas
totais encontradas pelas técnicas
de CCD e ELISA apresentaram maior
freqüência na faixa de 0-30 µg/kg e
acima de 300 µg/kg. Os coeficientes
de correlação entre os métodos foram
altamente significativos para as relações
entre as quantificações visual e
densitométrica (r= 0,92), ELISA e visual
(r= 0,83), ELISA e densitometria (r=
0,74), na determinação de aflatoxinas
totais em todas as amostras de milho
pesquisadas, confirmando haver equivalência
das técnicas estudadas.
Sabino et al. (1997) avaliaram a
eficiência de dois kits de ELISA (Cite
Probe Aflatoxin Test Kit-Idexx) para
detecção de AFB 1
em níveis de 5 e 20
ng/g em comparação à CCD. Os kits
de ELISA apresentaram resultados falsopositivos
indicando que o método de
ELISA pode superestimar os níveis de
aflatoxinas, demonstrando a
necessidade de confirmar resultados
positivos. Resultados falso-negativos
foram encontrados em amostras com
traços de aflatoxinas e, portanto, abaixo
do limite de detecção dos kits. Os
resultados obtidos permitiram concluir
que os kits mostraram-se adequados
para testes de triagem de AFB 1
em
amostras de milho, ração, amendoim e
seus derivados.
Diversos estudos colaborativos
sobre kits de ELISA e colunas de imunoafinidade
têm sido relatados desde
1988 (Mortimer et al., 1988; Park et al.,
1989; Trucksess et al., 1989; Patey et
al., 1992; Trucksess & Stack, 1994;
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 73

Tabela 1. Limites de detecção de diferentes tipos de imunoensaios para aflatoxinas e fumonisinas
Micotoxina Tipo de imunoensaio Limite de detecção Referência
AFB 1
ELISA (Cite Probe) 5 ng/g Sabino et al. (1997)
AFB 1
dc-ELISA 4 ng/g Lipigorngoson et al. (2003)
AFB 1
Imunofiltração 0,01 ng/mL Pal & Dhar (2004)
AFB 1
SIIA b 0,2 ng/mL Garden & Strachan (2001)
AFM 1
Ensaio imunoenzimático
de análise em fluxo 0,05 ng/mL Sibanda et al. (1999)
AFM 1
cd-ELISA (Ridascreen) 0,01 ng/mL López et al. (2003)
FB 1
cd-ELISA 7,6 ng/g Barna-Vetró et al. (2000)
FB 1
FILIA c 1 ng/mL Ho & Durst (2000)
FB 1
Polarização de fluorescência 500 ng/g Maragos et al. (2001)
FB 1
Biosensor (SPR) d 50 ng/mL Mullet et al. (1998)
FBs totais a ic-ELISA 93 ng/g Ono et al. (2000)
FBs totais a cd-ELISA 1000 ng/g Desjardins et al. (2000)
FBs totais a cd-ELISA 5 ng/g Kim et al. (2002)
FBs totais a cd-ELISA (Veratox) 200 ng/g Castelo et al. (1998)
FBs totais a cd-ELISA (Ridascreen) 3 ng/mL Torres et al. (1998)
FBs totais a cd-ELISA (Ridascreen) 3,4 ng/g Danielsen & Funck-Jensen (1998)
a
FBs totais: Fumonisinas totais
b
SIIA: Imunoensaio de injeção seqüencial
c
FILIA: “Flow-injection liposome immunoanalysis”
d
SPR: “Surface Plasmon Resonance”
Patey et al., 1991; Trucksess et al.,
1990, 1991; Barmark & Larsson, 1994).
A coluna de imunoafinidade Aflatest-P
acoplada à fluorimetria ou CLAE foi
adotada como método oficial pela
AOAC para aflatoxinas totais em milho,
amendoim e pasta de amendoim
em concentrações > 10 µg/kg (Trucksess
et al., 1991).
Souza et al. (1999) avaliaram um
kit de cd-ELISA (Ridascreen, R-Biopharm)
na detecção e quantificação
de AFM 1
em leite e relataram uma
eficiência qualitativa, sensibilidade elevada
e especificidade considerável.
Na faixa de contaminação de 0,019 a
0,090 µg/L o kit apresentou exatidão e
precisão, porém para níveis de contaminação
de 0,200 a 0,970 µg/L não foi
observada a mesma eficiência.
López et al. (2003) analisaram
AFM 1
em 77 amostras de leite da
Argentina, empregando o kit comercial
dc-ELISA (Ridascreen, R-Biopharm)
e observaram que 23% das amostras
estavam contaminadas com AFM 1
em
níveis de 0,01 a 0,03 µg/L. Sarimehmetoglu
et al. (2003) também empregaram
o kit de dc-ELISA (Ridascreen,
R-Biopharm) para a detecção de AFM 1
em 400 amostras de queijos consumidos
na província de Ankara (Turquia)
e relataram contaminação de 81,75%,
sendo que 27,5% apresentaram níveis
que excediam os limites legais de 250
ng/kg.
Sibanda et al. (1999) desenvolveram
um novo ensaio imunoenzimático
baseado em um sistema de fluxo
através de membrana, que foi acoplado
a uma coluna de imunoafinidade. O
limite de detecção visual foi de 0,05
ng/mL de AFM 1
no leite e o tempo
total de ensaio foi de 30 minutos. A
reatividade cruzada dos anticorpos
monoclonais anti-AFM 1
foi de 100, 20,
74 e 57% contra AFM 1
, AFM 2
, AFB 1
e
AFB 2
, respectivamente.
Um ic-ELISA baseado em anticorpos
policlonais foi desenvolvido
para detecção de AFM 1
em leite e
derivados. O ensaio apresentou resultados
precisos em concentrações de
AFM 1
superiores a 0,25 ng/mL, e a
reação cruzada foi de 5% para AFB 1
e
menor que 5% para AFB 2
, AFG 1
e
AFG 2
; não houve reação cruzada com
a ocratoxina A (Thirumala-Devi et al.,
2002).
Fumonisinas
As fumonisinas constituem um
grupo de metabólitos secundários produzidos
por Fusarium verticillioides,
F. proliferatum e outras espécies relacionadas
morfologicamente. Vinte e
oito análogos de fumonisinas foram
caracterizados, porém fumonisina B 1
(FB 1
), FB 2
e FB 3
são os principais
contaminantes naturais de milho e
derivados (Rheeder et al., 2002).
As fumonisinas causam leucoencefalomalacia
em eqüinos (Kellerman
et al., 1990) e edema pulmonar
em suínos (Harrison et al., 1990). Em
seres humanos, altos níveis de fumonisinas
em derivados de milho têm sido
associados com câncer esofágico na
África do Sul e China (Rheeder et al.,
1992; Chu & Li, 1994). As toxinas de F.
verticillioides foram classificadas pela
“International Agency for Research on
Cancer” como possivelmente carcinogênicas
para seres humanos (IARC,
2002).
Embora os limites legais para as
fumonisinas não tenham sido estabelecidos,
o “Mycotoxin Committee of
the American Association of Veterinary
Laboratory Diagnosticians” recomenda
5, 10, 50 e 50 µg/g para ração de
eqüinos, suínos, bovinos e aves, respectivamente
(Munkvold & Desjardins,
1997). A Suíça recomenda o
limite de 1 µg/g para derivados de
milho destinados ao consumo humano
(Visconti & Boenke, 1995)
Anticorpos policlonais e mono-
74 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

clonais para fumonisinas foram produzidos
para aplicação em dc-ELISA e ic-
ELISA (Azcona-Olivera et al. 1992a, b;
Usleber et al., 1994; Iijima et al., 1996;
Yeung et al., 1996; Yu & Chu, 1996;
Barna-Vetró et al., 2000; Christensen
et al., 2000).
Um dc-ELISA baseado em anticorpos
monoclonais desenvolvido para
detecção de FB 1
em cereais (Barna-
Vetró et al., 2000) apresentou um
limite de detecção de 7,6 ng/g FB 1
e
uma reatividade cruzada média de
100%, 91,8%, e 209% para FB 1
, FB 2
, e
FB 3
, respectivamente. A recuperação
da toxina a partir de cereais artificialmente
contaminados em níveis de 50-
200 ng/g FB 1
variou de 61% a 84%.
Kulisek & Hazebroek (2000) desenvolveram
um cd-ELISA empregando
anticorpos policlonais para a triagem
rápida de contaminação por FB 1
.
Esse ensaio foi aplicado num estudo
comparativo para determinar a eficiência
de extração de FB 1
em água
deionizada, tampão fosfato salina (PBS),
PBS-Tween e em solventes orgânicos
(70% metanol, 50% acetonitrila) utilizando
16 amostras de milho. O tampão
fosfato mostrou-se adequado para
a extração de FB 1
. As determinações
realizadas por ELISA apresentaram boa
correlação (r = 0,94) com CLAE em
amostras artificialmente contaminadas
entre 1 e 50 mg/mL de extrato.
Desjardins et al. (2000) avaliaram
a ocorrência de fumonisinas em milho
nepalense por dc-ELISA baseado em
anticorpos monoclonais e os níveis de
fumonisinas foram >1 µg/g em 22% de
74 amostras. O limite de detecção do
método foi de 1 µg/g.
Danielsen & Funck Jensen (1998)
avaliaram 35 amostras de milho proveniente
de três regiões geográficas
de Costa Rica, e detectaram
fumonisinas em níveis de 4 a 16.000
ng/g, com uma média de 2500 ng/g,
utilizando um cd-ELISA comercial baseado
em anticorpos monoclonais
(Ridascreen Fumonisin Fast, R-
Biopharm). Os anticorpos apresentaram
reatividade cruzada com FB 2
(40%)
e FB 3
(100%), resultando em uma
superestimação média de

Torres et al. (1998) avaliaram a
ocorrência de fumonisinas em 32 amostras
de cerveja da Espanha, empregando
cd-ELISA (Ridascreen, R-Biopharm).
O limite de detecção do kit foi
de 3 ng de fumonisinas/mL de cerveja.
Das 32 amostras analisadas, 14 (43,8%)
estavam contaminadas por fumonisinas
com concentrações variando de
4,76 ng/mL a 85,53 ng/mL.
Outra variante de métodos imunoquímicos
consiste na detecção de
fumonisinas por imunosensor de “surface
plasmon ressonance” (SPR). Neste
método, anticorpos policlonais de alta
afinidade específicos para FB 1
são
imobilizados em uma película de ouro,
que é acoplada a um prisma de vidro.
Um raio de luz é focalizado através do
prisma para excitar a SPR na película
de ouro. Quando uma amostra contendo
FB 1
é adicionada a uma célula na
parte externa da película de ouro, o
perfil angular da intensidade da luz
refletida é alterado, provocando mudança
no ângulo de ressonância que é
proporcional à concentração de FB 1
. O
limite de detecção deste método é de
50 ng/mL com um tempo de análise
inferior a 10 minutos (Mullett et al.,
1998).
Os trabalhos relatados demonstraram
que as técnicas imunoquímicas
preenchem os requisitos de rapidez e
eficiência na triagem de micotoxinas,
devendo-se concentrar os esforços na
redução da reatividade cruzada.
Considerações finais
A ocorrência de micotoxinas
como contaminantes alimentares, bem
como o impacto desses compostos na
saúde humana e animal, resultaram no
desenvolvimento e no aperfeiçoamento
de vários métodos de imunodetecção
para monitorar os níveis de contaminação
em alimentos. Atualmente
existem kits de ELISA para análise das
principais micotoxinas, porém as reações
falso-positivas dificultam ainda, a
sua utilização como alternativa aos
métodos reconhecidos pela AOAC,
sendo necessária a confirmação por
métodos químicos como a CLAE. As
colunas de imunoafinidade proporcionam
especificidade e eficiência como
técnica de pré-limpeza e concentração
antes da análise por CLAE e têm
sido amplamente utilizadas na determinação
de micotoxinas. Recentemente
foram desenvolvidos métodos
rápidos baseados em biosensores, “surface
plasmon resonance”, “dipstick”,
imuno-análise baseada em lipossoma,
que podem ser utilizados na análise
rápida de um grande número de amostras.
Os imunoensaios desempenharão
um papel cada vez mais importante
na análise de alimentos, principalmente
de micotoxinas, pois disponibilizam
uma gama de métodos que
podem ser utilizados tanto nos laboratórios
como ensaios quantitativos, como
no campo, para a triagem. Considerando
que os kits, bem como grande
parte dos insumos para realização de
imunoensaios são importados, elevando
os custos, é de extrema importância
alcançar a auto-suficiência na produção
e desenvolvimentos de kits e
reagentes imunológicos.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio
financeiro recebido pelo Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (CNPq) e Fundação
Araucária.
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80 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

Produção de fator FVIII
Pesquisa
por engenharia genética
Produção de fator FVIII da coagulação por tecnologia do DNA recombinante
Virginia Proenca Picanco
Doutoranda em Ciencias Biomédicas-FMRP-
USP e participante do programa de doutorado
sanduiche DAAD/Cnpq com a Universidade
de Frankfurt
v.picanco@pegasus.fmrp.usp.br
Prof. Dr Dimas Tadeu Covas
Faculdade de Medicina de Ribeirao Preto
Hemocentro de Ribeirao Preto
dimas@fmrp.usp.br
Dr. Sven Becker
Institute for Transfusion Medicine and
Immunohematology
Red Cross Blood Bonor Service Baden-
Wuerttemberg / Hessen
Frankfurt am Main
Alemanha
sbecker@bsdhessen.de
Dr. Torsten Tonn
Institute for Transfusion Medicine and
Immunohematology Red Cross Blood Bonor
Service - Baden-Wuerttemberg / Hessen
Frankfurt am Main
Alemanha
ttonn@bsbhessen.de
Imagem cedida pelos autores
Hemofilia A no Brasil
hemofilia é uma doença
hemorrágica hereditária
resultante da deficiência
de uma das várias proteínas
do sangue envolvidas no processo
de coagulação. Cerca de 350.000
pessoas em todo o mundo sofrem de
hemofilia A em que o fator VIII não é
produzido, não funciona ou existe em
quantidades reduzidas.
No Brasil, estima-se que existam
cerca de 7000 hemofílicos que
são tratados, na sua maioria, com concentrados
de fator VIII obtidos a partir
do plasma humano. Este tipo de tratamento
é caro e muitas vezes não disponível
na quantidade necessária. No
mercado brasileiro cada unidade internacional
(UI) de fator VIII é comercializada
ao preço médio de US $ 0,50.
A dispensação anual média por
hemofílico é de 30.000 UI, aproximadamente
US $ 15.000,00/ paciente/
ano, totalizando cerca de 100 milhões
de dólares por ano. O tratamento atual
para a hemophilia A é baseado na
infusão intravenosa de concentrados
de FVIII, profilaticamente ou na ocorrência
de um sangramento. Os problemas
com estes concentrados, incluindo
o alto custo, a inconveniência, e
o risco da transmissão de doenças virais,
tais como, hepatitis e HIV, aumentaram
o interesse em expressar este
fator em sistemas celulares in vitro ou
in vivo.
Gene do fator VIII
O gene do fator VIII foi clonado
e caracterizado em 1984. Seu locus
situa-se na região 28 do braço longo
do cromossomo X (Xq28). É
constituído por 26 exons cujo tamanho
varia entre 69 e 3106 pb e 25 íntrons
que podem atingir o tamanho
de 32,4 kb, pertencendo a um dos
maiores genes humano (0,1% do cromossomo
X) 1-3 .
Estrutura e função
A proteína deduzida da seqüência
de nucleotídeos do cDNA
contém 2351 aminoácidos. A análise
da estrutura primária mostrou a organização
em domínios: A1- a1- A2- a2-
B- a3- A3- C1- C2 , sendo a cadeia
pesada constituída pelos domínios A1-
a1-A2-a2-B e a cadeia leve pelos
domínios a3-A3-C1-C2.
O fator VIII é uma glicoproteína
que ativa o fator X no processo da
coagulação sangüínea. É sintetizada
como um polipeptídeo de cadeia única
de cerca de 330 kDa e é clivada,
gerando a cadeia pesada de 210 kDa
e a cadeia leve de 80 kDa que se associam
por interaçoes eletrostáticas e
hidrofóbicas. O domínio B, o maior
domínio, não participa da atividade
coagulante da proteína e sua função
ainda permanece desconhecida. 4
Expressão do fator VIII em
sistemas in vitro
Vários experimentos testaram
a transfecção do gene do fator VIII,
na sua forma inteira ou sem o dominio
B, em sistemas celulares, seguida
da avaliação de sua atividade funcional.
Os estudos iniciais mostraram
níveis muito baixos de expressão
em todas as linhagens celulares
2, 4-7
estudadas.
Em princípio, três seriam os
fatores limitantes para a obtenção de
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 81

A
B
Figura 1: A. Construções Lentivirais. As construções lentivirais foram realizadas no
vetor 1054 (cedido gentilmente por Naldini L), onde o FVIII sem o dominio B foi
clonado sob controle dos promotores CMV, HAAT, FVIIIp e EF1-alpha B. Construcoes
plasmidiais. Nas construções plasmidiais o vetor utilizado foi o pCDNA3.1 e
diferentes promotores (CMV, HAAT, FVIIIp e EF1-alpha) foram clonados juntamente
com o FVIII sem o domínio B.
níveis elevados de expressão da proteína
do fator VIII: 1) o tamanho do
gene; 2) o seu baixo nível de expressão
de mRNA; e, 3) a secreção
ineficiente do produto deste gene.
É conveniente destacar que,
apesar de mais elevados, os níveis de
expressão obtidos com o fator VIII são
muito baixos quando comparados aos
obtidos para diversas outras proteínas.
Informações adicionais sobre as modificações
pós-traducionais e o mecanismo
de secreção do fator VIII tornam-se
primordiais para maior entendimento
deste aspecto.
Terapia gênica para hemofilia A
A hemofilia A é uma doença
que se presta para a terapia gênica,
uma vez que se sabe muito sobre a
sua transmissão, sobre a localização
do gene defeituoso e sobre a estrutura
e função do fator produzido por este
gene. É de se salientar que a concentração
sanguínea de fator VIII obtida
não é crítica, sendo que um pequeno
aumento da concentração plasmática
de FVIII pode converter um quadro
de hemofilia grave em hemofilia moderada.
O desenvolvimento da terapia
gênica para a hemofilia A tem sido
extensivamente explorado, utilizando
estratégias com vetores adenovirais e
retrovirais ex vivo e in vivo. Na terapia
ex vivo tem sido utilizada uma
variedade de células transduzidas com
retro ou adenovirus e transplantadas
em camundongos hemofílicos. Apesar
de níveis terapeuticos de FVIII
serem detectados na circulação, a expressão
declina gradualmente devido
ao tempo limitado de sobrevivência
das células transplantadas ou devido
ao silenciamento da transcrição do
transgene. 8-12
O uso de vetores retrovirais
é dificultado pelo baixo título do vetor
e por baixos níveis de expressão do
FVIII. Recentemente, modificações
nos vetores retrovirais permitiu a
produção de altos títulos do vetor 13-15 ,
apesar da incapacibilidade destes
vetores retrovirais de transduzir células
quiescentes, limitando o seu uso
na terapia gênica in vivo.
Vetores adenovirais podem
transduzir uma variedade de células,
incluindo células quiescentes e foi
observada eficiente produção de FVIII
em transdução in vivo. 16 Esta expressão
do FVIII foi gradualmente
perdida devido á resposta imune contra
o vetor ou contra o produto do
transgene.
Vetores lentivirais, baseados
no HIV, são uma ferramenta promissora
para terapia gênica, diferentemente
do retrovirus MLV (Moloney
murine leukemia based), os lentivirus
são capazes de transduzir estavelmente
células quiescente em vários
órgaos 15, 17 . Contudo, a resposta i-
mune do hospedeiro contra o produto
transgênico expresso pode resultar
na perda da expressão da proteína na
circulação 18 .
Resultados obtidos no Instituto
de Medicina Transfusional de
Frankfurt mostram que células endoteliais
progenitoras derivadas de
cordão umbilical (CBECs) 19 e células
Hematopoiéticas 20 transduzidas com
vetor lentiviral contendo o cDNA do
FVIII mantêm a expressão estável do
FVIII por várias gerações, indicando
que estas células podem ser usadas
futuramente na terapia gênica. Além
disso, um estudo detalhado da via de
secrecão do FVIII mostra que do FVII
recombinante, com ou sem o domínio
B, expresso em células que não secretam
o FVIII fisiologicamente fica retido
em compartimentos celulares,
como o retículo endoplasmático, limitando
a secrecão deste fator 21 . Análise
de fatores envolvidos na secrecão
do FVIII, linhagens celulares adequadas
à expressão e secrecão, assim
como a utilizacão de determinados
promotores poderão facilitar a expressão
do FVIII recombinate.
Objetivos
O objetivo principal deste
projeto é produzir o fator VIII de coagulação
em sistemas celulares in vitro,
por técnicas de engenharia recombinante.
Este objetivo se justifica com
base no pressuposto de menor custo
e maior segurança, visto que seriam
produtos praticamente isentos de
agentes patogênicos, ao contrário do
produto obtido do plasma humano.
Em colaboração com o Instituto
de Medicina Transfusional de
Frankfurt objetivamos obter altos
níveis de fator VIII em linhagens celulares
de mamífero e também a construção
de vetores lentivirais para uma
futura aplicação em estudos in vivo
(terapia gênica).
Construções
Estudos usando a primeira
geração de vetores adenovirais
82 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

mostraram que promotores específicos
para fígado, em vez de promotores
celulares fortes, podem aliviar a
ativação do sistema imune do
hospedeiro, sugerindo que a resposta
imune está relacionada com a
transdução de células apresentadoras
de antígeno 16 . Baseado nesses
resultados, foram construídos vetores
contendo, além dos promotores
universais CMV e EF-1a, promotores
específicos de fígado, HAAT e F8p
(Figura 1).
Vetores lentivirais e
plasmidiais foram construídos com
diferentes tipos de promotores, para
observar a especificidade dos
promotores em linhagens celulares de
fígado. Em todas as construções
realizadas foram utilizado o cDNA do
FVIII sem o dominio B (Figura 1).
No momento, estes vetores
estão sendo testados em culturas
celulares para posteriormente serem
aplicados em estudos in vivo.
Considerações finais
O crescente interesse em se
entender os mecanismos de regulação
da secreção e função do fator VIII
leva à realização de experimentos
engenhosos que combinam
abordagens de bioquímica e
engenharia genética, trazendo
informações inusitadas sobre esse fator
de coagulação sanguínea. Apesar
dos avanços no desenvolvimento de
vetores mais seguros e nas técnicas
de transferência gênica, a resposta
imunológica do hospedeiro contra o
transgene, as dificuldades de
produção em larga escala e sua
padronização, ainda são grandes
barreiras para seu uso clínico.
Estabelecer linhagens celulares
de mamíferos transformadas
com construções recombinantes contendo
o FVIII que expressem a proteína
em níveis elevados será um passo
fundamental para novos avanços
na terapêutica da hemofilia e na caracterização
dos processos envolvidos na
biossíntese do fator VIII. Isto permitirá
também estabelecer, no Brasil, a
metodologia para a produção de
fatores de coagulação através de tecnologia
de DNA recombinante.
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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 83

Pesquisa
Receptores de Bacillus
thuringiensis em insetos
Análises in vitro de receptores membranares de proteínas Cry em larvas de lepidópteros
Lídia Mariana Fiuza
Drª em Ciências Agronômicas pela ENSAM -
Montpellier (França)
Profª Adjunta do PPG-Biologia: Diversidade e
Manejo de Vida Silvestre, Líder do Grupo de Pesquisa:
Manejo de Populações de Insetos, Coordenadora do
Laboratório de Microbiologia, Universidade do Vale
do Rio dos Sinos, São Leopoldo, RS
Pesquisadora Consultora da Fitotecnia, EEA/
Instituto Rio-Grandense do Arroz, Cachoeirinha, RS.
fiuza@bios.unisinos.br
Bacillus thuringiensis
1. Introdução
bactéria ubíqua, Bacillus
thuringiensis tem ação
entomopatogênica relacionada
ao corpo de inclusão
paraesporal, que se
forma durante a esporulação, sendo
este constituído de proteínas Cry codificadas
por genes cry (Höfte & Whiteley,
1989; Schnepf et al., 1998). As
proteínas Cry têm mostrado atividade
inseticida altamente específica entre
as diversas ordens de insetos, como:
Lepidoptera, Diptera, Coleoptera
(Zhong et al., 2000); Hymenoptera,
Hemiptera, Orthoptera, Isoptera e
Malophaga (Feitelson et al., 1992; De
Maagd et al., 2001; Castilhos-Fortes et
al., 2001), além de Nematóides (Marroquin
et al., 2000), Ácaros, Protozoários
e Fitopatógenos.
Os dados atuais, na escala mundial,
revelam mais de 60.000 isolados de
B. thuringiensis, correspondentes a
82 subespécies descritas até 1999,
com cerca de 300 genes cry distribuídos
em 34 classes (Pinto & Fiuza,
2002). A revisão da nomenclatura dos
genes cry de B. thuringiensis foi publicada
por Crickmore et al. (1998), a
qual vem sendo atualizada no Web
Site: http://biols.susx.ac.uk/Home/
Neil_Crickmore/Bt/index.html.
Como mecanismo de ação, entre
a ingestão das proteínas Cry de B.
thuringiensis e a morte das larvas dos
insetos suscetíveis, destacam-se as seguintes
fases:
* solubilização do corpo de inclusão
paraesporal em pH alcalino no
intestino médio dos insetos, liberando
as proteínas Cry com massa molecular
de 130-140 kDa a 70 kDa (Schnepf et
al., 1998). Essa fase é determinante à
especificidade do isolado de B. thuringiensis
e à espécie-alvo, tanto pela
alcalinidade do sistema digestivo quanto
pela composição dos cristais (Aronson
et al., 1991).
* ativação das proteínas Cry pelas
enzimas digestivas formando fragmentos
tóxicos de 60-65 kDa (Schnepf
et al., 1998). Nessa fase tanto a
composição proteolítica quanto à estrutura
protéica do cristal são importantes
(Choma et al., 1990).
* ligação das toxinas aos receptores
específicos às microvilosidades
das células epiteliais do intestino médio
das larvas suscetíveis. Os estudos
realizados com Brush Border Membrane
Vesicles (BBMV) isoladas de larvas
de lepidópteros mostram que ligações
de forte afinidade entre as proteínas e
os receptores são consideradas fatores
determinantes do espectro inseticida
(Hofmann et al., 1988; Van Rie et al.,
1989 e 1990; Fiuza et al., 1996). Esses
autores mostram que há uma correlação
positiva entre a ligação, in vitro, da
toxina no receptor intestinal e a toxicidade,
in vivo. Por outro lado, outros
estudos descrevem que o reconhecimento
do receptor é necessário, mas
não é suficiente para provocar a toxicidade,
sugerindo a existência de outros
fatores relacionados ao modo de
ação das delta-endotoxinas (Wolfersberger,
1990). Em 1994, Knight et al.
isolaram, das BBMVs de larvas de Manduca
sexta (Lep., Sphingidae), uma
aminopeptidase N implicada na interação
da toxina Cry1Ac. Os modelos de
receptores atualmente descritos mostram
que um inseto pode apresentar
quantidade variável de diversas classes
de receptores, os quais podem ser
reconhecidos por diferentes toxinas
(Hua et al., 2001). Diversos autores
84 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

sugerem que estes modelos podem
explicar a especificidade das proteínas
Cry de B. thuringiensis.
* indução à formação de poros na
membrana celular do epitélio intestinal
(Höfte & Witeley, 1989; Schnepf et
al., 1998).
* desequilíbrio iônico entre o citoplasma
e o meio externo à célula
(Gill et al., 1992; Knowles & Bow,
1993). As análises histopatológicas realizadas
após a intoxicação dos insetos
mostram a destruição das microvilosidades,
hipertrofia das células epiteliais,
vacuolização do citoplasma e lise celular,
levando o inseto à paralisia e morte
(Endo & Nishiitsuji-Uwo, 1981; Bravo
et al., 1992a,b; Denolf et al., 1993a,b).
Considerando a especificidade
inseticida das proteínas Cry de B. thuringiensis,
de acordo com Meadows
(1993), até o momento não foram
descritos casos de intoxicações de
mamíferos através dos alimentos. Por
outro lado, em estudos com toxinas de
B. thuringiensis israelensis, administradas
via parenteral, foi observada a
atividade citolítica para diversas células
de mamíferos (Thomas & Ellar,
1983; Armstrong et al., 1985; Meadows,
1993). Face aos referidos dados,
esse entomopatógeno tem sido considerado
seguro ao homem e ao ecossistema.
Na seleção das proteínas inseticidas,
sintetizadas por essa bactéria, as
análises in vitro dos receptores membranares
podem viabilizar uma rápida
determinação do espectro de ação das
proteínas Cry contra as espécies alvo,
sendo em seguida efetuada a avaliação
da toxicidade in vivo, apenas para os
isolados pré-selecionados como ativos
in vitro. Sendo assim, o presente trabalho
trata de diferentes métodos de
análise de receptores de proteínas de
B. thuringiensis em formas imaturas
de lepidópteros.
2. Material e métodos
2.1. Tecidos dos insetos
As larvas de lepidópteros (Chilo
suppressalis, Heliothis armigera e Plutella
xylostella) foram obtidas da criação
massal de insetos mantida em
laboratório, a 25±1ºC, 70±5ºC e 12h de
fotofase. Os tubos digestivos foram
dissecados e fixados durante 24h em
BHS a 10%, sendo em seguida lavados
por 12h em água destilada e desidratados
em séries crescentes de etanol, 70
a 100% (Brandtzaeg, 1982). Os tecidos
foram impregnados em banhos mistos
(etanol/tolueno/paraplasto) e incluídos
em paraplasto 100% a 58ºC. Os
cortes longitudinais de 7 µm de espessura,
preparados com micrótomo LKB,
foram montados em lâminas de vidro,
tanadas com poly-l-lysina (Sigma) a
10%, e conservadas a 4ºC.
2.2. Purificação das
proteínas Cry
As proteínas Cry1Aa, Cry1Ac e
Cry1Ba foram obtidas de B. thuringiensis
dendrolimus HD 37, B. thuringiensis
kurstaki HD 73 e B. thuringiensis
thuringiensis 4412, respectivamente.
Essas cepas contêm apenas
um gene cry que codifica a referida
proteína Cry inseticida, as quais foram
cedidas para essa pesquisa pelo Instituto
Pasteur (IEBC-Paris, França) e a
Pant Genetics Systems (PGS-Ghent,
Bélgica). As cepas de B. thuringiensis
foram cultivadas conforme o método
de Mahillon & Delcour (1984). Após a
lise bacteriana foram centrifugadas e
lavadas com tampão fosfato (100 mM
NaH 2
PO 4
; 100 mM NaCl; 0,01 % Triton
X-100; pH 6).
Os cristais foram separados dos
esporos e das células bacterianas em
gradiente de renografina por ultracentrifugação,
conforme metodologia descrita
por Sharpe et al. (1975). As bandas,
contendo os cristais puros, foram
lavadas e diluídas em água milli-Q
esterilizada, contendo 0,1 mM phenylmethylsulfonyl
(PMSF). As proteínas
Cry foram solubilizadas em tampão
fosfato (50 mM Na 2
, CO 3
; 10 mM dithiothreitol;
0,1 mM PMSF; pH 10). O
pH foi ajustado a 8,6 por diálise contra
o tampão 20 mM Tris e as proteínas
Cry foram clivadas por bovine pancreatic
trypsin (Type I; Sigma), sendo a
reação inativada com trypsin inhibitor
(Type II-S; Sigma).
A pureza e a integridade das proteínas
foram avaliadas por eletroforese
em gel de poliacrilamida a 10%,
SDS-PAGE (Laemmli, 1970). A concentração
foi determinada pelo método
Bradford (1976), usando a bovine
serum albumin (BSA) como proteína
padrão.
2.3. Proteínas Cry biotiniladas
As proteínas Cry foram preliminarmente
biotiniladas conforme o
método descrito por Bayer & Wilcheck
(1990), onde a incorporação da biotina
na parte N-terminal da proteína é feita
usando o BNHS (biotinyl-N-hydroxysuccinimide
éster - Amersham) em
tampão de bicarbonato de sódio
(100 mM NaHCO 3
; 150 mM NaCl; pH
9). O produto da reação foi purificado
em sephadex G-25 (Sigma) e as frações
biotiniladas identificadas por dotblot,
onde foi utilizada membrana de
nitrocelulose, o conjugado de estreptavidina-fosfatase-alcalina
diluída no
tampão Tris-Saline-Triton (10 mM
Tris; 150 mM NaCl; 0,1% Triton X-100;
pH 7;6) e o substrato de revelação (5-
bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate e
nitroblue tetrazolium, diluídos no tampão
100 mM Tris; 100 mM NaCl; 5 mM
MgCl 2
; pH 9,5). A concentração das
proteínas Cry biotiniladas foi determinada
pelo método Bradford (1976),
usando a BSA como proteína padrão. A
pureza e a integridade das proteínas
marcadas foi avaliada em western-blot,
usando membrana de nitrocelulose
(Sigma) e o tampão Towbin (12.5 mM
Tris, 96 mM glycine; pH 8,3 com 10%
ethanol). As membranas foram reveladas
usando a mesma técnica descrita
no dot-blot.
2.4. Anticorpos policlonais
As proteínas, Cry1Aa, Cry1Ac e
Cry1Ba, foram preparadas conforme
descrito anteriormente na purificação.
Os anticorpos foram produzidos em
coelhos (Eurogentec – Bélgica), sendo
as imunoglobulinas (IgGs) separadas
em colunas de sepharose protein-A e
as frações purificadas por afinidade
incubando os IgGs e as membranas de
nitrocelulose, contendo os antígenos
previamente transferidos por westernblot
conforme descrito por Burke et al.
(1982). A especificidade e sensibilidade
dos anticorpos policlonais foi determinada
pelo método de ELISA (Enzyme-linked
immunosorbent assay) e
dot-blot.
2.5. Detecção in vitro dos
receptores membranares
O estudo in vitro dos receptores
foi efetuado sobre cortes histológicos
do intestino dos insetos, utilizando as
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 85

toxinas sintetizadas pelas cepas de B.
thuringiensis em estudo. A detecção
propriamente dita corresponde a incubação
dos tecidos, previamente desparafinados
e reidratados, com as proteínas
Cry.
Nas análises com proteínas Cry
biotiniladas, os cortes histológicos foram
incubados à temperatura ambiente,
durante 1h, com as proteínas biotiniladas
(10 µg/ml). As proteínas não
ligadas aos sítios receptores foram removidas
com TST (10 mM Tris; 150
mM NaCl; 0,1% Triton X-100; pH 7,6).
Em seguida, os tecidos foram tratados
com estreptavidina conjugada a uma
enzima (peroxidase ou fosfatase
alcalina) ou fluorocromo
(fluoresceína ou ficoeritrina),
diluídos em tampão TST. O
complexo da reação “proteína-receptor”,
usando o conjugado
com enzimas foi revelado
com substrato DAB para
peroxidase e BCIP/NBT para
fosfatase alcalina, sendo as
secções montadas com Pertex,
entre lâmina e lamínula
de vidro. Nas revelações com
a fluoresceína ou ficoeritrina,
as secções foram montadas
com Mowiol e conservadas a
4ºC.
Nas análises imunohistoquímicas
com proteínas nativas (não
biotiniladas), os receptores foram revelados
com o complexo anticorpo
primário (AC 1
, específico contra a proteína
Cry) e anticorpo secundário (AC 2
,
dirigido contra o AC 1
) conjugado a uma
enzima ou fluorocromo, os quais foram
revelados e montados de acordo com
o método descrito anteriormente. Na
imunodetecção, os cortes histológicos
foram incubados com as proteínas nativas
e na imunolocalização, as lagartas
foram previamente tratadas in vivo
com as proteínas Cry e posteriormente
foram preparados os tecidos e as reações
imunohistoquímicas.
Em ambos os métodos, as testemunhas
foram preparadas pela omissão
alternada de cada etapa da reação,
a fim de eliminar a hipótese de reações
falso-positivas. As amostras reveladas
com enzimas, tipo peroxidase e fosfatase
alcalina, foram avaliadas em microscopia
óptica de contraste de fase
Nomarski (Leitz DMRB). Para as análises
onde foram utilizados os fluorocromos
foi utilizada a microscopia de
varredura laser (ACAS 570, Meridian).
3. Resultados
3.1. Localização de receptores
com proteínas Cry biotiniladas
Os cortes histológicos das lagartas
de Chilo suppressalis, tratados com
proteínas biotiniladas de Cry1Aa e
Cry1Ac (Fig. 1A), revelaram uma marcagem
uniforme ao longo das microvilosidades
intestinais. Na mesma espécie
a marcagem de Cry1Ba (Fig. 1B)
também foi intensa. Os tecidos de
Figura 1: Detecção de receptores de proteína Cry1 de Bacillus
thuringiensis em cortes longitudinais de lagartas de Chilo
suppressalis (A e B), Heliothis armigera (C) e Plutella xylostella
(D), analisados em microscopia óptica de contraste de fase
Nomarski e Fluorescência.
Heliothis armigera também apresentaram
marcagem uniforme nas microvilosidades
intestinais para a proteína
Cry1Ac (Fig. 1C), sendo os mesmos
resultados obtidos nos ensaios com as
lagartas de Plutella xylostella, quando
tratadas com as proteínas Cry1Aa e
Cry1Ac (Fig. 1D).
No caso dos tecidos tratados como
controle, representantes da omissão
alternada dos diferentes componentes
da reação, observou-se a ausência de
coloração nas microvilosidades das células
do epitélio intestinal dos insetos
em estudo. As marcagens detectadas
na região das microvilosidades das células
do epitélio intestinal revelam a
presença de receptores membranares
às proteínas Cry, em estudo, nas referidas
espécies de insetos alvo.
3.2. Imunodetecção de receptores
com proteínas Cry nativas
Os resultados das análises de
imunohistoquímica, utilizando os anticorpos
policlonais, confirmam a detecção
dos receptores membranares intestinais
nas lagartas de: Chilo suppressalis
às proteínas nativas Cry1Aa,
Cry1Ac e Cry1Ba; Heliothis armigera à
proteína Cry1Ac; Plutella xylostella às
proteínas Cry1Aa e Cry1Ac (Fig. 2).
3.3. Imunolocalização de receptores
com proteínas Cry nativas
Nessas análises apenas a espécie
Chilo suppressalis foi avaliada, demonstrando
a localização de receptores
intestinais às proteínas Cry1Aa,
Cry1Ac e Cry1Ba nos tecidos das lagartas
previamente intoxicadas in vivo,
confirmando assim os dados
obtidos nas análises in vitro
de receptores por imunodetecção
e biotinilação de proteínas.
3.4. Receptores membranares
em microscopia
de varredura
laser
As amostras de imunodetecção
(Fig. 2) e biotinilação
de proteínas, reveladas
com fluorocromos, foram
avaliadas em microscopia de
varredura laser, que permite
uma análise semiquantitativa
dos receptores através da
varredura da totalidade das secções
longitudinais dos tubos digestivos das
lagartas, podendo-se obter imagens:
bidimensional (Fig. 2A), tridimensional
(Fig. 2B) ou um gráfico que representa
o pico de fluorescência numa linha
imaginária do epitélio intestinal (Fig.
2C).
Nos estudos com Chilo suppressalis
foi avaliada a distribuição dos
receptores das proteínas Cry1Aa e
Cry1Ac ao longo do epitélio intestinal,
cujos dados foram convertidos em valores
numéricos correspondentes à intensidade
de fluorescência e analisados
estatisticamente pelo teste de homogeneidade
de variância de Bartlett
(Dagnelie, 1970), sendo as duas proteínas
comparadas pelo teste de Student–Neuwman-Keuls
em três porções
intestinais. Os resultados revelaram
uma diferença significativa na intensidade
de fluorescência detectada
para Cry1Aa e Cry1Ac (Fig. 3), sendo
a primeira mais intensa, representando
86 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004

competição de duas proteínas, como
por exemplo Cry1Aa e Cry1Ba, reveladas
com fluorocromos detectados em
diferentes comprimentos de onda, sobre
a mesma porção intestinal da lagarta
(Chilo suppressalis), revelando assim
que a fluorescência pode ser sobreposta
(Fig. 4) e que essas proteínas
se ligam aos mesmos receptores membranares
intestinas.
4. Discussão
Figura 2: Imunodetecção de receptores de proteína Cry1A de Bacillus thuringiensis
em cortes longitudinais de lepidópteros, analisados em microscopia de varredura
laser (barra = 35 µm).
Figura 3: Distribuição de receptores de proteínas Cry1 ao longo intestino médio de
lagartas de Chilo suppressalis, avaliadas em microscopia de varredura laser.
uma maior concentração de receptores
intestinais na espécie em estudo.
Por outro lado, ambas as proteínas
revelaram uma maior quantidade de
receptores na porção anterior (Fig. 3A)
e posterior (Fig. 3C) do intestino mé-
dio, quando comparadas à porção central
(Fig. 3B).
A microscopia de varredura laser
permite a leitura simultânea de dois
fluorocromos (fluoresceína e ficoeritrina),
permitindo assim a análise da
Figura 4: Competição de proteínas Cry1 biotiniladas, reveladas com fluoresceína
(Cry1Aa - detector1) e ficoeritrina (Cry1Ba - detector 2), na análise de receptores
membranares intestinais de Chilo suppressalis, em microscopia de varredura laser.
As análises de receptores membranares
intestinais, através de técnicas
de imunohistoquímica e detecções
de proteínas Cry biotiniladas, foram
realizadas por diversos autores em larvas
de diferentes espécies de lepidópteros
(Bravo et al., 1992a; Denolf et al.,
1993a; Estada e Ferre, 1994; Fiuza,
1995), dípteros (Ravoahangimalala et
al., 1993) e coleópteros (Bravo et al.
1992a; Boets et al., 1994). Esses autores
comprovaram que as ligações das
proteínas Cry nas microvilosidades do
intestino médio das larvas de insetos
correspondem à existência de um receptor
específico à referida proteína
no inseto-alvo.
As análises in vitro de receptores
de proteínas Cry de B. thuringiensis
reveladas com enzimas mostram
que em geral os receptores estão distribuídos
uniformemente ao longo do
intestino médio dos lepidópteros (Bravo
et al., 1992b; Denolf et al., 1993a),
porém Bravo et al. (1992b) revelaram
que essas proteínas se ligam preferencialmente
nas microvilosidades da porção
posterior do intestino médio das
larvas dos coleópteros. No presente
estudo, as semiquantitativas dos receptores,
avaliadas em microscopia de
varredura laser, em larvas de lepidópteros,
também revelaram que a distribuição
desses receptores membranares
intestinais foi diferenciada ao longo
do epitélio, sendo mais concentrada
nas porções anteriores e posteriores
do intestino médio.
Nas avaliações de competição
das proteínas de B. thuringiensis, as
toxinas Cry1Aa e Cry1Ba mostraramse
em competição pelos receptores
celulares de Chilo suppressalis, cujos
dados também foram demonstrados
em outras espécies de lepidópteros.
Por outro lado, os estudos desenvolvi-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 87

dos por Denolf et al. (1993a,b), utilizando
as proteínas Cry1Ac e Cry1Ba
(marcadas com moléculas de biotina e
de iodo radioativo), em larvas de Ostrinia
nubilalis, revelaram que essas toxinas
se ligam a diferentes receptores
intestinais, sugerindo que a utilização
simultânea dessas proteínas pode apresentar
um efeito inseticida sinérgico
contra O. nubilalis.
Relacionando o estudo dos receptores
in vitro e a análise da toxicidade
in vivo, pode-se inferir que os métodos
de detecção de receptores membranares
podem ser aplicados na seleção
das proteínas ativas contra insetos,
havendo uma correlação positiva entre
as análises in vitro e in vivo. Porém,
para determinar a Concentração Letal
Média (CL 50
) de uma proteína Cry fazse
necessário o bioensaio uma vez que
as ligações das proteínas aos receptores
podem variar em concentração e
afinidade, como já descrito por diversos
autores, para diferentes espécies
de insetos (Denolf et al., 1993a; Van
Rie et al., 1990; Fiuza et al., 1996; Lee
et al., 1996; Hua et al., 2001). Também
há estudos demonstrando que as proteínas
Cry tóxicas aos insetos correspondem
àquelas que se ligam de forma
irreversível aos receptores das células
epiteliais do inseto-alvo (Liang et
al., 1995).
No contexto, controle microbiano
de insetos, a espécie Bacillus thuringiensis
oferece as melhores alternativas
à produção de biopesticidas e à
engenharia genética de plantas. Sendo
assim, é fundamental avaliar o espectro
de ação e a especificidade das
proteínas potencialmente inseticidas
e, nesse sentido, a análise in vitro dos
receptores membranas pode ser considerada
uma ferramenta indispensável
face ao grande número de isolados,
cepas e proteínas de B. thuringiensis
já identificados, que representam um
potencial no manejo de insetos-praga.
5. Agradecimentos
À equipe Biotrop do Centre Internationale
de Recherche Agronomique
pour le Dévélopement (Montpellier,
França), especialmente a Drª Nicole
Michaux-Ferriere, assim como aos pesquisadores
Dr. Jeroen Van Rie (Plant
Genetic Systems, Ghent, Bélgica) e ao
Dr. Jean-François Charles (Institut Pasteur,
Paris, França), por suas contribuições
nessa pesquisa.
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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 89

Nanotecnologia é arma na luta contra o câncer
O Instituto do Câncer dos Estados
Unidos (NCI) anunciou um plano de
cinco anos para desenvolver a utilização
da nanotecnologia no combate ao
câncer. A área, que abrange a criação
de aparelhos microscópicos, é considerada
promissora para a obtenção de
novas formas de diagnóstico e tratamento
da doença em estágio inicial e
com poucos efeitos colaterais.
“Se pudermos alcançar esses objetivos,
seremos capazes de eliminar a
doença”, previu Richard Smalley, professor
de nanotecnologia da Rice
University. O plano de US$ 144,3 milhões
incluirá a Aliança para a
Nanotecnologia no Câncer, uma iniciativa
que reunirá pesquisadores, médicos,
empresas e grupos sem fins lucrativos.
A medicina já emprega dispositivos
do tamanho de moléculas na forma
de proteínas - como os anticorpos -
naturais ou criadas artificialmente. “A
novidade é que podemos construir
nano-objetos que nunca existiram”,
comentou Smalley. Esses dispositivos
seriam cobertos de substâncias que
encontrariam as células cancerosas.
Os nano-objetos também poderão
levar drogas para matar as células
ou agentes de obtenção de imagens
para ajudar a detectar o câncer, explicou
o médico Mauro Ferrari, consultor
do NCI e professor de engenharia
biomédica da Ohio State University.
“Ao realizar isso em uma escala
muito pequena, haverá efeitos distintos.
As possibilidades são enormes para
se encontrar tumores muito pequenos,
muito antes do que conseguimos hoje,
e tratá-los com drogas poderosas, ao
mesmo tempo reduzindo os efeitos
colaterais. A iniciativa permitirá que
exploremos o uso dessa tecnologia em
seu pleno potencial”, disse Samuel
Wickline, da Washington University.
técnica possibilita tratamento preciso
Uma droga conduzida por um
equipamento nanométrico poderia, por
exemplo, atingir células cancerosas com
uma precisão que não existe na
quimioterapia e na radioterapia. Segundo
os especialistas, isso já é possível
com os anticorpos monoclonais,
mas essa área seria ampliada de maneira
significativa.
Os lipossomos, cápsulas minúsculas
usadas para carregar drogas, podem
ser considerados a primeira geração de
dispositivos desse tipo. A médica Janet
Woodcock, comissária-adjunta da FDA,
disse que a agência tem se preparado
para aprovar novos dispositivos médicos
em escala nanométrica - um
nanômetro corresponde a um
bilionésimo do metro. “Vemos um grande
potencial em novas formas de administração
de remédios”, disse.
Qualquer produto novo, porém,
terá de passar pelas etapas normais de
aprovação nos quesitos segurança e
eficácia. Janet Woodcock lembrou que
Especialistas aprofundam pesquisas sobre a Amazônia
também haverá algumas questões burocráticas,
principalmente se os produtos
forem classificados ao mesmo tempo
como dispositivos e drogas.
A diretora-adjunta do NCI, Anna
Barker, informou que o plano incluirá
US$ 90 milhões para pelo menos cinco
centros de excelência em cinco anos,
US$ 16 milhões para treinamento e
US$ 38 milhões em bolsas para projetos
específicos.
Primeiras aplicações >> Os
lipossomos, a primeira geração de dispositivos
nanométricos para administração
de remédios, foram desenvolvidos
para levar tratamentos anticâncer
diretamente aos tumores. A
doxorubicina lipossômica é usada para
tratar alguns tipos de câncer, enquanto
a anfotericina lipossômica B combate
infecções por fungos, freqüentemente
associadas a tratamentos anticâncer
agressivos. >>Recentemente, uma formulação
de nanopartículas do conhecido
composto anticâncer taxol foi submetida
ao FDA como um novo tratamento
para câncer de mama em estágio
avançado. >> Outras aplicações
clínicas da nanotecnologia têm como
foco a identificação do câncer em estágios
iniciais; a visualização do desenvolvimento
da doença; a administração
de tratamentos melhorados para
aumentar a eficácia e reduzir os efeitos
colaterais das drogas; e a detecção de
sinais de eficácia de medicamentos.
Jornal do Commercio - RJ
Durante três dias, entre amanhã
(28/09) e a próxima quinta-feira (30/
09), especialistas e pesquisadores de
prestígio internacional discutem, em
Rio Branco (AC), questões relativas à
ciência e tecnologia, experiências e
resultados concretos na Amazônia,
exploração florestal, genética, ecologia,
mercado e organização comunitária.
A programação é parte do seminário
Manejo Florestal para Pequenas Propriedades:
a Experiência do Projeto de
Colonização Pedro Peixoto.
O seminário será uma oportunidade
para sintetizar a experiência acumulada
no projeto de assentamento Pedro
Peixoto, onde 25 produtores estão
envolvidos com manejo florestal comunitário
há quase 10 anos sob orientação
de pesquisadores da Embrapa
Acre.
O modelo desenvolvido no local
tornou-se referência para o Estado e o
Instituto Nacional de Colonização e
Reforma Agrária (Incra) já manifestou
interesse em adotá-lo em projetos de
assentamentos florestais na Amazônia.
90 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004
90 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

Pedro Peixoto foi um dos primeiros
trabalhos de manejo articulado com
produtores rurais que, tradicionalmente,
viam a floresta como um entrave ao
desenvolvimento da propriedade.
Entre os pesquisadores de maior
expressão, está Milton Kanashiro, da
unidade Amazônia Oriental da Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária
(Embrapa), vinculada ao Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento.
Kanashiro é líder do Projeto
Dendrogene, que busca os pontos de
Células mortas por raios
Tratamento com radiação
ultravioleta artificial é usado para
linfoma cutâneo
Trabalho sobre o uso da radiação
ultravioleta artificial para o tratamento
do câncer linfoma cutâneo será apresentado
no Simpósio de Imunologia
Clínica e Experimental (ImunoRio),
que acontece dias 16 e 17 na Santa
Casa de Misericórdia, no Centro. A
doença se manisfesta na pele, mas
pode se alastrar para órgãos como
pulmão e fígado. ´
Durante quatro anos, o professor
Luiz Werber Bandeira, chefe do Serviço
de Imunologia Clínica e Experimental
da Santa Casa, realizou pesquisa
com nove pacientes portadores do
linfoma. A radiação foi aplicada três
vezes por semana, durante quatro
equilíbrio ente o uso e conservação da
floresta e a exploração madeireira, geradora
de 600 mil empregos e R$ 3
bilhões de renda ao Brasil. O projeto
desenvolve meios de avaliar os impactos
da exploração florestal sobre a
biodiversidade. Trata dos impactos sobre
a capacidade da floresta de se
regenerar e garantir, por meio de processos
de reprodução, a continuidade
das diferentes espécies. O Dendrogene
conquistou o Prêmio Ford de Conservação
Ambiental 2003 e o Super Ecologia
2004, concedido pela revista
Super Interessante.
O seminário é uma iniciativa da
Embrapa Acre, Instituto Brasileiro do
Meio Ambiente (Ibama), Pro-Manejo e
Associação dos Produtores Rurais em
Manejo Florestal e Agricultura
(Apruma). O encontro conta com patrocínio
da KfW Group e apoio do
Sebrae e Governo do Estado do Acre.
A programação completa pode
ser vista em www.cpafac.embrapa.br.
Fonte: www.agricultura.com.br
meses. No fim do estudo, concluiu-se
que as células cancerígenas diminuíam
consideravelmente. Não houve efeitos
colaterais.
Colocados em uma câmara com
lâmpadas que emitem raios ultravioletas
artificiais, os pacientes tomaram
psoraleno, substância imunomoduladora
que previne complicações
Fonte: O Dia - RJ
Biorremédio é mais eficiente na degradação de herbicidas no solo
Uma forma de remediar solos contaminados
pelo herbicida atrazina, utilizando
técnicas da indústria farmacêutica,
está sendo desenvolvida pela professora
Julieta Mieko Ueta, da Faculdade
de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão
Preto (FCFRP) da USP. Ela conseguiu
isolar microrganismos redutores
de atrazina e condensá-los em
microcápsulas, formando uma espécie
de biomedicamento - em que o princípio
ativo, ao invés de uma substância
química, é um ser vivo.
Em parceria com o CNPMA (unidade
Meio Ambiente da Embrapa, localizada
em Jaguariúna), Ueta coletou
mensalmente, durante dois anos, amostras
de solo de fazendas da região de
Ribeirão Preto. “Escolhemos uma propriedade
monocultora, produtora de
cana-de-açúcar - cultivo que demanda
larga aplicação de atrazina”, explica a
pesquisadora. Em laboratório, ela mediu
o impacto do uso do herbicida
sobre a biodiversidade bacteriana do
solo. “As bactérias, além de
metabolizarem materiais orgânicos e
contribuírem para a fertilidade do terreno,
conseguem biodegradar substâncias
xenobióticas, como pesticidas
e herbicidas. No entanto, quando a
aplicação do herbicida é exagerada, a
capacidade biorremediadora da população
microbiana é reduzida, com conseqüente
prejuízo à qualidade do solo
e do ambiente”, diz.
A atrazina é um herbicida triazínico,
empregado largamente na agricultura
para o controle de ervas daninhas.
“Estima-se que a cultura canavieira no
Brasil vem consumindo acima de 20
mil toneladas desse tipo de substância
por ano”, afirma Ueta. O dado é
preocupante na medida em que a
atrazina, graças ao seu alto potencial
de escoamento e elevada persistência
nos solos, é um potencial contaminador
da água. Essas características ganham
maiores proporções na região de Ribeirão
Preto, onde se localiza um dos
pontos de afloramento do Aqüífero
Guarani. “Durante o processo de poluição,
a atrazina infiltra-se no solo,
podendo atingir lençóis freáticos”, explica
a pesquisadora. “Analisamos amostras
da água do Aqüífero e não encontramos
indícios concretos de contaminação.
No entanto, como a atrazina é
amplamente usada nas culturas de canade-açúcar
da região, o risco existe.”
Biorremédio
Foi justamente com o objetivo de
evitar possíveis contaminações do solo
e, principalmente, da água que Ueta
vem desenvolvendo microcápsulas
com microrganismos do gênero
Pseudomonas - que conseguem degradar
a atrazina com grande eficiência.
O biorremédio para o solo é composto
utilizando técnicas da fabricação
de medicamentos pela indústria farmacêutica.
“Os princípios ativos dos
‘comprimidos’ são as bactérias. Porém,
na formulação das microcápsulas, adicionamos
alguns nutrientes cujo papel
é facilitar o desenvolvimento dos microrganismos
de forma que eles degradem
mais rapidamente a atrazina”,
esclarece Ueta.
91 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 91

Biodiesel ganha status de fonte alternativa de energia
92 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
92 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004
Pesquisadores, professores, estudantes,
especialistas de órgãos públicos
e parlamentares participam amanhã
(28/09), às 8h15, no auditório da
Reitoria da Universidade de Brasília
(UnB), do 5º Encontro do Projeto Café
com Ciência, cujo tema será “Biodiesel:
Uma alternativa de Energia Renovável”.
Promovido pelo Decanato de
Pesquisa e Pós-Graduação da UnB, o
encontro mostrará as pesquisas desenvolvidas
pela universidade sobre o
biocombustível. A palestra dos pesquisadores
Kleber Carlos Mundim e João
Nildo de Sousa Vianna abordará os
aspectos fundamentais do uso do
biodiesel no Brasil, como a caracterização,
produção, utilização e
sustentabilidade da cadeia produtiva.
O trabalho envolve o Instituto de
Química, onde são estudados os processos
tecnológicos da utilização dos
diversos óleos vegetais, como os derivados
da soja, girassol e mamona, além
do Departamento de Engenharia Mecânica
e o Centro de Desenvolvimento
Sustentável, que investigam o desempenho
do biodiesel e as questões
de sustentabilidade.
Emprego - O governo federal
pretende autorizar a entrada do biodiesel
no mercado nacional de combustíveis
até o final deste ano. O produto poderá
ser adicionado ao óleo diesel mineral
Resina para imobilização da invertase apresenta vantagens em relação ao carvão ativo
Pesquisadores do Departamento
de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica,
da Faculdade de Ciências Farmacêuticas
(FCF) da USP, patentearam
um novo método de imobilização de
invertase - enzima usada no processo
de produção do açúcar invertido. “Desenvolvemos
uma nova maneira de
reaproveitar várias vezes a invertase”,
comenta o professor Michele Vitolo,
que juntamente com sua orientanda,
Ester Junko Tomotani, patentearam o
produto.
O açúcar invertido é uma mistura
de frutose com glicose, e resulta da
quebra das moléculas da sacarose - o
açúcar comum, obtido da cana-de-açúcar.
É muito utilizado pela indústria de
alimentos, uma vez que a frutose tem
mais capacidade de adoçar do que a
sacarose.
“Nós imobilizamos a invertase em
uma resina de troca iônica (tipo
DOWEX®)”, explica o professor. Essa
resina é um polímero orgânico, insolúvel
em água, capaz de adsorver
macromoléculas (no caso, a invertase)
por meio de interação eletrostática.
“Dizemos que as moléculas de invertase
presas ao polímero (chamado de suporte
ou carreador) encontram-se na
forma imobilizada”, conta Vitolo. “Com
a invertase imobilizada, podemos
utilizá-la várias vezes, sem nenhum
tipo de perda”.
Vantagens
A invertase imobilizada já é conhecida
desde 1916 - e usada regularmente
na indústria. Só que a fórmula
comercial atual de maior uso traz
invertase imobilizada em carvão ativo.
“É um método eficiente, mas acreditamos
que a imobilização em DOWEX®
apresenta vantagens”, comenta o professor.
Uma delas é a facilidade em
separar após a reação, geralmente por
filtração, a invertase imobilizada do
restante da mistura, sem deixar vestígios
de resina no produto final (açúcar
invertido). “Como as partículas de carvão
ativo têm dimensões extremamente
reduzidas, para evitar a presença
delas no produto final torna-se necessário
o uso de microfiltros - muito
caros - ou realizar várias filtrações sucessivas,
quando se empregam filtros
comuns”, diz Vitolo.
Para desenvolver esse método, o
Nos testes em laboratório, a
biorremediação obteve sucesso. No
entanto, ela ainda não foi aplicada em
campo “porque deve-se estudar a fundo
as conseqüências que a introdução
de seres vivos estranhos ao ambiente
pode provocar. Caso contrário, ao invés
de melhorar a situação, podemos
causar um desequilíbrio ambiental”, alerta
a pesquisadora. Segundo ela, as
melhores ferramentas biológicas são
aquelas que, quando lançadas na natureza,
cumprem seu papel e morrem,
“como as bactérias utilizadas em derrames
de petróleo no oceano”. Por isso,
conclui Ueta, o ideal é mesmo não
poluir.
Tadeu Breda
Mais informações:
(0XX16) 602-4158 ou jueta@usp.br
Fone: Agência USP de Notícias
na proporção de até 2%, sem comprometer
a garantia dos motores dos veículos.
O Brasil dispõe de um grande
número de matérias-primas para a produção
de biodiesel, como soja, girassol,
mamona e dendê. O governo federal
espera que a entrada do novo combustível
no mercado nacional permita a
redução da importação do diesel, que
hoje corresponde a 9% do consumo.
Além disso, o biodiesel deve apoiar o
desenvolvimento econômico do meio
rural com a geração de empregos e
renda e incrementar o desenvolvimento
da indústria nacional de pesquisa e
equipamentos.
Fonte: www.agricultura.gov.br
professor Vitolo e Ester Tomotani testaram
vários tipos de resinas de troca
iônica. “Foram testadas mais de vinte
resinas com características distintas.
Quatro ou cinco variedades de resina
se mostraram favoráveis, mas a
DOWEX® (tipos 1X2, 1X4 e 1X8)
adsorveu 100% das moléculas de
invertase”, explica. “As vantagens dessa
resina são a não toxicidade, o baixo
custo, o amplo uso e a plena disponibilidade
no mercado”.
Márcia Blasques, especial para a Agência
USP
Mais informações:
(0XX11)091-2382, com o professor
Michele Vitolo, ou pelo e-mail
michenzi@usp.br
Fonte: Agência USP de Notícias

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