Biotecnologia

Vacina para Dengue
ENTREVISTA
Entrevista concedida a
Evanildo da Silveira
As perspectivas de uma vacina contra o virus da Dengue com a tecnologia do DNA recombinante
odos os anos, algo entre 50 e 100 milhões de
pessoas no mundo contraem algum dos quatro
tipos de dengue. Calcula-se que cerca de dois
bilhões de pessoas vivem em áreas de risco da
doença. Apenas em 1995, foram notificados,
somente nas três Américas, 250 mil casos de dengue, sete mil
da forma grave da doença (hemorrágica).
Segundo a Organização Mundial da Saúde, hoje as áreas de
maior risco são as Américas Central e do Sul (exceto Argentina
Chile e Paraguai), México, África, Austrália, Caribe (com
exceção de Cuba e Ilhas Caymam), China, Índia e Sudeste
Asiático. Embora nos Estados Unidos a dengue seja rara,
houve registros de alguns casos no Texas, em 1995.
No Brasil, a doença foi considerada erradicada já na
década de 30 do século passado. Na época, o combate à febre
amarela levou praticamente à extinção do mosquito transmissor
da dengue, o Aedes aegypti, vetor das duas moléstias. No
entanto, em 1981, a doença voltou a fazer vítimas, principalmente
na Região Norte. A partir de então, a dengue começou
a se alastrar para outras regiões do país, notadamente as mais
quentes.
As primeiras epidemias, depois do seu ressurgimento,
foram registradas no Rio de Janeiro, uma em 1986-87, com
cerca de 90 mil casos, e outra em 1990-91, com 100 mil. Daí
em diante, o número de vítimas só fez crescer. Em 1998, foram
registrados, segundo o Ministério da Saúde, mais de 570 mil.
Campanhas de conscientização da população e o trabalho do
governo no combate ao mosquito transmissor reduziram o
número de vítimas para 210 mil, em 1999. No entanto, a queda
do número de casos foi passageira, pois, desde então, o
número de vítimas voltou a crescer: 240 mil em 2000 e 390.765
casos em 2001. Neste ano, só em janeiro e fevereiro, foram
registrados 190.389 casos em todo o país, segundo dados da
Funasa. Além disso, o problema se agravou recentemente por
causa da introdução de mais um sorotipo de dengue no Brasil.
Antes, só havia a dengue tipo 1 e 2, agora o 3 também chegou.
A dengue é uma doença infecciosa causada por um
arbovírus, da classe dos flavivírus (existem quatro tipos diferentes
de vírus do dengue- 1, 2, 3 e 4), que ocorre principalmente
em áreas tropicais e subtropicais do mundo, como o
Brasil. É transmitida principalmente por duas espécies de
mosquitos, Aedes aegypti e Aedes albopictus. As epidemias, que
são mais comuns no verão, estão, atualmente, se expandindo
rapidamente. A previsão para os próximos anos é que
aumentem em todo o planeta, principalmente nos trópicos.
Apesar do esforço de cientistas de todo o mundo, ainda
não existem vacinas contra a doença. A forma mais eficaz de
evitá-la, por enquanto, é combater os mosquitos transmissores.
A infecção causada por
qualquer um dos quatro tipos
do vírus da dengue produz
manifestações semelhantes. Em
mais de 95% dos casos, os
sintomas são desconforto, febre
alta, dor de cabeça e no
corpo e, às vezes, vômitos.
Também podem aparecer,
três ou quatro dias após o
início dos primeiros sintomas,
coceira (prurido) e manchas
vermelhas na pele, parecidas
com as do sarampo ou rubéola.
Além disso, é comum aparecer
pequenos sangramentos
no nariz e nas gengivas. A dengue, entretanto, raramente coloca
em risco a vida da pessoa. A maioria das vítimas começa e
melhorar após quatro ou cinco dias e recupera-se totalmente
em cerca de dez dias.
O médico pernambucano Ernesto Marques, doutor em
Farmacologia e Ciências Moleculares pela prestigiada universidade
norte-americana The Johns Hopkins University School of
Medicine (JHU/SOM), de Baltimore, onde trabalha, tem um
interesse pessoal em descobrir uma vacina contra a dengue. Em
1998, no Recife, viu sua mãe, na época com 60 anos, contrair
dengue. Marques imaginou, então, que o seu interesse por
vacinas de DNA, que já vinha desde 1995, pudesse ajudar a
combater uma doença que atinge milhões de pessoas em todo
o mundo.
Ele resolveu aproveitar sua experiência com a chamada
tecnologia LAMP (Lysosome Associated Membrane Protein),
em vacinas de DNA, que havia sido descoberta na JHU/SOM.
“Meu primeiro projeto com essa tecnologia foi com HIV”,
lembra. “Mas não estavámos progredindo muito rápido. Tínhamos
alguns problemas que não estávamos conseguindo resolver
com as nossas vacinas. Pensando sobre o assunto, achei
que a dengue era um bom modelo para aplicar a tecnologia
LAMP. Também imaginei que teria mais chance de encontrar
uma vacina contra dengue do que contra HIV/AIDS.”
Com sua equipe, ele começou, então, a trabalhar com
dengue em colaboração com a Marinha Americana. “Foi
evidente, desde o início, que estávamos tendo sucesso e
progredíamos rápido”, conta. “Em dezembro 2000, fizemos
uma descoberta que nos permitiu avançar muito em nosso
programa de HIV e resolvemos, então, diminuir um pouco os
nossos esforços com as pesquisas contra a dengue. Agora
estamos trabalhando de novo, no entanto, com o máximo da
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nossa capacidade nos dois projetos.”
Graduado em medicina em 1993, na
Universidade Federal de Pernambuco
(UFPE), Marques iniciou a carreira científica
no Brasil, trabalhando com Biossensores
para Vitamina C e Glicose. Em
1994, ele ingressou no programa de pósgraduação
da JHU/SOM e em 1999,
concluiu o doutorado. “Fui imediatamente
contratado para o corpo docente
da JHU/SOM pelo Dr. Thomas August,
na época chefe do departamento de
Farmacologia”, orgulha-se. “Hoje, tenho
cursos avançados em Biologia Molecular,
Bioquímica, Biofísica, Genética, Biologia
Celular, Imunologia, Virologia, Bioinformática
entre outros.”
Sua tese de doutorado envolveu a
caracterização bioquímica e molecular
da enzima Fucosiltransferase do Schistosoma
mansoni e o desenvolvimento de
inibidores para essa enzima, com o
objetivo de criar uma nova droga para
tratamento da esquistossomose. Publicou
vários trabalhos nesse campo.
Para que ele falasse sobre suas pesquisas
com a vacina contra a dengue, a
tecnologia LAMP e suas perspectivas, a
revista Biotecnologia, Ciência & Desenvolvimento
entrevistou o médico
Ernesto Marques Jr., M.D./Ph.D, pesquisador
associado do Departamento de
Farmacologia e Ciências Moleculares, da
Johns Hopkins University School of
Medicine.
BC&D - Desde quando o senhor está
pesquisando uma vacina para a dengue?
Ernesto Marques - Desde o final de
1998, começo de 1999
BC&D - Como surgiu o seu interesse
por uma vacina para essa doença?
Ernesto Marques - Bem, a idéia surgiu
principalmente por conseqüência da
epidemia que está ocorrendo no Brasil,
inclusive até alguns familiares meus a
tiveram também.
BC&D - O senhor poderia explicar o
que é a tecnologia “Naked DNA”?
Ernesto Marques - É uma resposta longa,
mas, de forma bastante simplificada,
eu diria que o termo “Naked DNA” surgiu
no início dos anos 90. Ele refere-se ao
uso de DNA puro na forma de plasmídeos
(vetores de expressão de proteínas)
em células de animais, sem o uso de
nenhum agente para revestir o DNA - por
isso chamado de Naked (nu, despido). A
grande surpresa foi a capacidade destes
plasmídeos entrarem dentro das células
dos animais vivos e produzirem a proteína
codificada por eles (plasmídeos) sem
a ajuda de um vetor. Como vacinas, de
um modo geral, funcionam induzindo
uma resposta imunológica contra antígenos
- que são proteínas na maioria das
vezes - se pensou, imediatamente, em
aplicar esta tecnologia para desenvolvêlas.
Hoje, com as tecnologias de engenharia
genética é fácil construir plasmídeos
capazes de sintetizar a proteína
(antígeno) que se deseja. Um dos grandes
contribuidores para o avanço das
tecnologias de engenharia genética foi o
Dr. Daniel Natans, nosso professor aqui
na JHU e laureado com o prêmio Nobel
de Medicina, em 1978, devido às suas
descobertas de enzimas de restrição,
que foram a base da engenharia genética.
"O que se espera de uma vacina
contra dengue é que ela seja
capaz de prevenir a infecção dos
quatro sorotipos dos vírus, não
produza efeitos colaterais, seja
muito segura, não aumente o
risco da dengue hemorrágica e
tenha um baixo custo."
BC&D - O senhor poderia explicar a
estratégia “LAMP”? O que ela significa?
Como funciona?
Ernesto Marques - LAMP é a abreviação
de “Lysosome Associated Membrane
Protein”. LAMP é uma proteína das nossas
células que se localiza especificamente
nos lisossomos, que são organelas
celulares especializadas na digestão
celular. A “estratégia LAMP”, se refere ao
uso de uma pequena porção da proteína
LAMP, que é responsável pela localização
da mesma nos lisossomos, é um
“sinal de tráfego celular”. Nós utilizamos
este “sinal de tráfego celular” da proteína
LAMP e o colocamos em outras proteínas
para fazer com que elas também se
dirijam aos lisossomos. No caso da vacina
para dengue, colocamos o sinal LAMP
na proteína do envelope do vírus da
dengue e a fizemos se dirigir para o
lisossomo. A vantagem de se colocar
proteínas antigênicas direto no lisossomo
é que, em certas células especializadas
do sistema imune (células apresentadoras
de antígenos, como as células
dendríticas), os lisossomos são o centro
de processamento dos antígenos. Ou
seja, o direcionamento ao lisossomo
torna os antígenos muito mais visíveis
ao sistema imune e, portanto, às vacinas
mais eficientes.
BC&D - O senhor poderia explicar o
que é exatamente o “sinal de tráfego
celular” da proteína LAMP? O que é o
tráfego celular”?
Ernesto Marques - As células possuem
vários compartimentos bem organizados
que têm funções bem específicas e
são chamados de organelas. As células
transportam materiais entre estes compartimentos
para serem processados. É
como nós fazemos na indústria, por
exemplo. Alguém coleta o minério de
ferro e põe no caminhão para ser
levado à usina siderúrgica. Na usina,
eles fabricam o aço e o mandam para a
indústria automobilística. E assim por
diante. Quando o material é transportado
de um local para o outro, você deve
pôr o endereço do destinatário. As
células têm sistemas similares. Os sinais
de tráfego celulares são indicadores
que determinam este endereçamento
dentro da célula. O sinal celular da
LAMP, portanto, é o sinal que determina
que LAMP vai ser transportada ao compartimento
endossomo/lisossomo (endossomo
é organela, mais ou menos
como o lisossomo).
BC&D - Por que o senhor achou que
dengue era um bom modelo para aplicar
a tecnologia LAMP?
Ernesto Marques - Por várias razões.
Uma é que, quando uma pessoa se
infecta com dengue, geralmente se cura
e não pega mais a dengue do mesmo
sorotipo, só de outro. O que significa
que a pessoa se torna imune. Isto não
acontece com outras doenças, como é
o caso de HIV. Outra razão, é que se
sabe quais são os mecanismos imunológicos
que tornam a pessoa resistente
ao vírus e se tem maneiras de testar a
vacina em animais e saber se ela dá
proteção ou não. No caso especifico do
uso de LAMP, a vantagem é que o
antígeno principal da dengue é uma
proteína de membrana como LAMP e o
tráfego celular funciona sem complicações.
BC&D - Como o sinal de tráfego celu-
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lar é colocado em outras proteínas?
Ernesto Marques - O sinal de tráfego
celular de LAMP se constitui em uma
seqüência específica de aminoácidos,
que determina o endereçamento celular.
Por técnicas de biologia molecular e
engenharia genética nós podemos construir
proteínas quiméricas, compostas
por partes de várias proteínas diferentes,
colocando nestas quimeras o sinal que
as endereça ao endossomo/lisossomo.
No caso da vacina contra a dengue
fizemos uma quimera com uma parte da
proteína do envelope do vírus da dengue
e uma outra parte com o sinal de tráfego
celular de LAMP, para direcionar ao
endosomo/lisossomo.
BC&D - O que significa “alterar o tráfego
do envelope da dengue”?
Ernesto Marques - A proteína “envelope”
normalmente não é levada ao lisossomo,
mas quando nós colocamos o
sinal LAMP ela passa a ser. E isto é que
leva a vacina envelope/LAMP quimera a
ser mais imunogênica.
BC&D - O que vem a ser o “envelope da
dengue”?
Ernesto Marques - Alguns vírus são
revestidos por uma membrana, como é o
vírus da dengue, e esta membrana, junto
com as proteínas que estão nela, é chamada
de envelope. Estes vírus, para
serem capazes de penetrar e infectar
outras células, geralmente precisam se
reconhecer e fundir-se a células especificas.
Isto é mediado através das proteínas
virais específicas que se localizam
no envelope. O vírus da dengue só tem
uma proteína (viral) no envelope (que é
conhecida como envelope, que contém
um fragmento chamado pré-membrana)
mas outros vírus possuem mais. A existência
destas glico-proteínas virais de
membrana foi inicialmente identificada
por Dr. Thomas August and Dra. Mette
Strand, que foram orientadores da minha
tese no doutorado.
BC&D - Sua vacina é o que se pode
chamar de “vacina gênica”?
Ernesto Marques - Sim, eu diria que o
uso de DNA ou RNA como vacina é o
que caracteriza uma vacina gênica. O
uso do DNA recombinante abre um
leque infinito de possibilidades. Neste
caso, nós usamos uma porção do LAMP
para alterar o tráfego do envelope da
dengue. Mas existem outras coisas que
podemos fazer.
BC&D - Por exemplo?
Ernesto Marques - Associar moléculas
que são estimuladoras do sistema imunológico
como, GM-CSF ou IL-2, epitopos
específicos, sinais do sistema imune
nativo etc.
BC&D - Há o risco desse DNA, usado
nas vacinas, incorporar-se ao genoma
das pessoas vacinadas e alterá-lo?
Ernesto Marques - Isto tem sido investigado
exaustivamente e até agora não se
conseguiu nenhuma evidência de que
isto esteja ocorrendo.
BC&D - Por que essa certeza?
Ernesto Marques - Vários testes de Vacinas
de DNA já foram feitos, em diversas
espécies de animais e também em
humanos, e após algumas semanas de
vacinação, o DNA da vacina não foi mais
encontrado nos tecidos do vacinados
por nenhuma das técnicas mais sensíveis
que conhecemos.
BC&D - A vacina que o senhor desenvolve
usa vírus atenuado ou vivo?
Ernesto Marques - Ela não usa vírus
atenuado ou vivo. Os vírus, são agentes
vivos, que infectam as células, se replicam
e infectam mais células. Os vírus
também tem o seu material genético
(RNA ou DNA) e suas próprias proteínas.
O plasmídeo, “Naked DNA”, não carrega
consigo nenhuma proteína e só tem uma
pequena fração do material genético do
vírus. Não é capaz de se reproduzir nas
células humanas ou transfectar novas
células.
BC&D - Quais são as etapas do desenvolvimento
dessa vacina?
Ernesto Marques - Desta e de quaisquer
outras vacinas, o processo se inicia com
um descoberta científica no laboratório.
Em seguida, faz-se uma série de testes
em animais, que se chamam estudos
pré-clínicos. Se tudo correr bem, começam
a ser feitos os estudos em pessoas.
Há basicamente quatro fases:
I – inicialmente, com poucas pessoas, se
quer saber, principalmente, a toxicidade
e qual a maior dose tolerada.
II - já com um grupo maior, tenta-se
saber os efeitos que a vacina causa,
quais os tipos de respostas imunes, etc.
Às vezes, fazem-se vários testes nesta
fase.
III – usa-se um grande grupo de pessoas.
A principal questão é se a vacina realmente
está funcionando ou não, e, também,
se é segura. Caso sejam bem sucedidas
todas as etapas, os órgãos reguladores
dão a autorização do uso da
vacina.
IV – é quando se fazem estudos clínicos,
para aperfeiçoar o uso da vacina.
Na minha opinião, a questão mais difícil
com relação à vacina de dengue é se a
vacina pode ou não aumentar o risco da
dengue hemorrágica e, caso isto realmente
ocorra, em que situações este
risco aumentado aparece.
BC&D - Quais os resultados obtidos até
agora?
Ernesto Marques - Nós ainda estamos
na fase pré-clínica. O que sabemos com
certeza, até agora, é que a nossa vacina
de DNA dengue/LAMP dá uma resposta
de anticorpos que neutraliza o vírus,
evitando que ele infecte as células, muito
maior do que qualquer outras vacinas de
DNA feitas contra dengue já existentes.
Além disso, essa produção de anticorpos
se mantém elevada por um longo
tempo.
BC&D - Quais as perspectivas da vacina?
Ernesto Marques - O que se espera de
uma vacina contra dengue é que ela seja
capaz de prevenir a infecção dos quatro
sorotipos dos vírus, não produza efeitos
colaterais, seja muito segura, não aumente
o risco da dengue hemorrágica e
tenha um baixo custo. Existem boas
candidatas para preencher esses requisitos.
A nossa é uma delas. Existem as de
vírus atenuados, entre as quais a mais
avançada é uma que foi desenvolvida na
Tailândia e hoje a empresa Aventis Pasteur
está desenvolvendo. A estratégia
dessa vacina apresenta algumas dificuldades,
no entanto. Uma delas é o nível
de reações adversas que esta vacina
apresenta. Algumas pessoas podem se
sentir mal por causa dela. Outra dificuldade
é fazer uma formulação que seja
eficaz para os quatro sorotipos, em todas
as pessoas de uma área endêmica. Existem
ainda, as quimeras virais, que combinam
o vírus atenuado da vacina de
febre amarela com o envelope da dengue.
Esta estratégia talvez não tenha o
primeiro problema da anterior, mas, pro-
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vavelmente, terá o segundo. Existem
outros tipos de quimeras virais. E entre as
vacinas de DNA, a maior dificuldade
delas é que elas não são fortes o suficiente
como as virais e também pelo fato
de ser uma tecnologia muito nova, com
a qual não se tem tanta experiência
quanto com os outros tipos de vacinas.
Nós achamos que melhoramos muito a
questão da potência com o uso do
LAMP. As vacinas de DNA são mais
estáveis e, potencialmente, mais seguras
do que as virais. Além de poderem ser
mais baratas e não precisarem de refrigeração.
BC&D - Quais são, enfim, as vacinas
para a dengue mais promissoras?
Ernesto Marques - Existem, como já
disse, várias vacinas candidatas que têm
boa chance de ser bem sucedidas. Nenhuma
delas comprovou ainda que são
seguras e eficazes em populações endêmicas.
As mais avançadas são as de vírus
atenuado, existem duas que eu conheço;
as quimeras virais, que são o vírus
vivo atenuado da febre amarela contendo
partes do vírus da dengue e também
a quimera do dengue-4 atenuado por
biologia molecular com partes dos outros
sorotipos de dengue, que já fez o
seu primeiro estudo em humanos no
ano passado aqui na Hopkins; e entre as
de DNA a nossa é a mais promissora.
Existem também as de proteína recombinante,
mas aparentemente os resultados
não estão sendo muito encorajadores
com estas candidatas.
BC&D - Em quanto tempo sua vacina
poderá estar disponível para ser usada
pela população?
Ernesto Marques - Eu não sei precisamente,
depende de muitos fatores como
a quantidade de recursos disponíveis,
dos problemas encontrados, etc. Eu posso
dar uma estimativa me baseando no
tempo que outros têm levado para passar
pelas etapas que ainda tenho que
passar, que seria em torno de 6 a 8 anos.
Porém, o que é mais importante é que a
vacina seja segura para as pessoas. Eu
sei que a dengue é um problema grave e
precisa de uma vacina o mais breve
possível, porém não valeria a pena colocar
a população em risco com uma
vacina sem ter certeza absoluta se ela é
segura. Por enquanto, o melhor método
para combater a dengue ainda é o controle
do mosquito, que precisa de muito
apoio da população e da direção do
governo. Também precisamos ser pacientes
e determinados pois mesmo com todo
apoio ainda vão ser levados alguns anos
para controlar o mosquito.
BC&D - Quem mais está envolvido nessa
pesquisa e quem a financia?
Ernesto Marques - A Marinha Americana
com o grupo do Dr. Curtis Hayes, diretor
da divisão de pesquisa de doenças infeciosas
do Naval Medical Research Center
(NMRC), e nós na JHU/SOM (Eu, Tom
August, Ihid C. Leão, Priya Chichlikar,
Luciana Arruda-Hinds e BJ Hart). O financiamento
no nosso lado vem do NIH e de
uma firma chamada Aarmedis. No lado da
Marinha, vem do departamento de defesa.
" As vacinas de DNA
são mais estáveis e,
potencialmente,
mais seguras do
que as virais."
BC&D - Por que a Marinha Americana
está financiando a pesquisa? Qual o
interesse dela numa vacina contra a
dengue?
Ernesto Marques - O departamento de
defesa tem vários papéis, e a segurança
nacional também depende da saúde da
população. A Marinha americana tem
uma grande tradição de desenvolvimento
de vacinas, entre outros, alguns exemplos
são a da hepatite A, a da malária e a da
dengue também; inclusive, os primeiros
isolados do vírus da dengue foram feitos
pela marinha americana. Recentemente,
houve alguns surtos de dengue na região
sudoeste dos Estados Unidos, no Texas, e
o mosquito vetor se distribui por toda a
região leste do país até o Maine, o que
possibilita que a doença se espalhe.Por
isto existe o interesse. Inclusive o vírus
West Nile, que apareceu em Nova York, é
um parente próximo da Dengue e também
é transmitido pelo mesmo mosquito.
BC&D - Porque o vírus West Nile pode
ser considerado um parente próximo
do vírus da dengue?
Ernesto Marques - O West Nile também
é um arbovírus e flavivírus. Possui as
mesmas características, como envelope,
+RNA, e codifica os mesmos tipos de
proteínas, ou muito parecidas.
BC&D - Quanto já foi e quanto será
investido nas pesquisas dessa vacina?
Ernesto Marques - No nosso grupo, algo
em torno de U$1.5 milhão, e eu acredito
que, após todas as etapas de estudos
clínicos, o total investido deve ser próximo
a U$ 15.0 milhões.
BC&D - Para deixar bem claro, e resumindo,
como funciona sua vacina?
Ernesto Marques - Para ser mais didático,
vou enumerar os passos:
a – Constrói-se, por engenharia genética,
um plasmídeo “DNA”, que carrega consigo
uma pequena fração do material genético
do vírus da dengue.
b – O DNA é quem codifica a proteína, ou
seja, é quem determina como a proteína
vai ser feita. Então, por engenharia genética,
nós criamos um código genético
com pedaços dos genes do envelope e do
sinal da LAMP, colados um no outro no
DNA. Este novo código de DNA produzirá
a proteína quimérica do envelope com
o sinal LAMP.
c – Esse plasmídeo “DNA” é capaz de
produzir, dentro das células humanas,
proteínas antigênicas do vírus da dengue
capazes, por sua vez, de provocar uma
reação imunológica do organismo humano
(quer dizer, provoca a produção de
anticorpos contra o vírus da dengue).
d – Para otimizar esse processo, usa-se a
“estratégia LAMP”.
e – Essa pequena porção do LAMP,
colada no envelope da dengue (Explicando:
o plasmídeo não se dirige ao lisossomo,
só a proteína codificada por ele) o
dirige para o compartimento especializado
para processamento de antígenos chamado
MIIC, que é uma espécie de lisossomo.
f – Dentro do compartimento MIIC, há a
produção de antígenos de classe II.
g – Essa maior produção de antígenos de
classe II gera, por sua vez, uma quantidade
muito maior de produção de anticorpos.
h – Com isso, aumenta-se a eficiência da
vacina. A pessoa torna-se imune à doença,
pois a dengue é semelhante ao sarampo:
só dá uma vez. Isto é verdade para um
mesmo sorotipo, por isto se faz a vacina
com os envelopes dos quatro sorotipos
da dengue para proteger contra todos os
quatro.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 7

IRIS
(Repete fotolito que saiu na pág. 08 , edição 24)

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(Repete fotolito que saiu na pág. 09 , edição 24)

Carta ao Leitor
BIOTECNOLOGIA Ciência & Desenvolvimento
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A cidade do Rio de Janeiro já tem em torno de 90.000 notificações
de casos de dengue, conforme os dados da Secretaria Municipal de
Saúde, e, no Estado de São Paulo, 46.124 já foram notificados desde
1º de janeiro.
De evolução benigna na forma clássica, e grave quando se
apresenta na forma hemorrágica, não há tratamento específico
para a dengue. Na verdade os pacientes tomam medicação para
atenuar os sintomas e, no caso da dengue hemorrágica, o paciente
precisa ser internado.
Portanto, hoje a dengue pode ser considerada um grande problema
de saúde pública, e uma vacina utilizando a tecnologia do DNA
Recombinante é também uma de nossas esperanças. Por isso
convidamos o Dr. Ernesto Marques Jr, pesquisador associado do
departamento de Farmacologia e Ciências Moleculares, da Johns
Hopkings University School of Medicine para falar do assunto.
Dr. Henrique da Silva Castro
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Desenvolvimento estão sendo indexadas para o AGRIS
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and Technology) da FAO e para a AGROBASE (Base de Dados da
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10 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002
ISSN 1414-4522

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Dr. Henrique da Silva Castro - Saúde;
Dr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia;
Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal;
Dr. Maçao Tadano - Agricultura;
Dr. Naftale Katz - Saúde;
Dr. Pedro Jurberg - Ciências;
Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;
Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos;
Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.
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Fundação Dalmo Catauli Giacometti
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Dra. Elba P. S. Bon - UFRJ
Colaboraram nesta edição:
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Ana Carla Oltramari;
Andréa Queiroz Maranhão;
Andréa R. Ramos Cruz;
Carla Ianssen;
Cáter Alexandre Neckel;
Daniel John Rigden;
Dionísio Bernardino Bach;
Diva Maria de Alencar Dusi;
Erasmo Tiepo;
Ernesto Marques;
Evanildo da Silveira;
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Maria Elisabete Sbrogio de Almeida;
Patrícia Sibila Araújo;
Paulo Fernando Dias;
Renata dos Passos Maraschim;
Rosa Maria Ribeiro-do-Valle;
Sidney L. Stürmer;
Vera Tavares de Campos Carneiro.
Entrevista
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Pesquisa
Fungos micorrízicos arbusculares pág. 12
Salmonella vacinais pág. 22
Novos moduladores da formação de vasos sanguíneos pág. 28
Apomixia pág. 36
Bases fisiológicas e genéticas da regeneração de plantas in vitro pág. 44
Biorreatores de imersão permanente pág. 50
Micropropagação de babosa (Aloe vera - Liliaceae) pág. 54
SUCAST pág. 58
Anotação funcional computacional de proteínas pág. 64
Bio Notícias pág. 49
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 11

PESQUISA
FUNGOS MICORRÍZICOS
ARBUSCULARES
Fotos e ilustrações cedidas pelos autores
Características, associação simbiótica e aplicação na agricultura
Figura 1. Segmento de raiz de gramínea, mostrando o aspecto
microscópico da penetração e colonização do córtex por fungo
micorrízico arbuscular
José Oswaldo Siqueira
Eng o Agr o Ph.D. Prof. Titular de
Microbiologia do Solo
Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG
bolsista do CNPq
siqueira@ufla.br
Márcio R. Lambais
Eng o Agr o Ph.D. Prof. Associado de
Microbiologia do Solo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de
Queiroz”, USP, Piracicaba, SP
bolsista do CNPq
mlambais@esalq.usp.br
Sidney L. Stürmer
Biólogo Ph.D. Prof. de Botânica na
Universidade Regional de Blumenau – FURB
Blumenau-SC
sturmer@furb.br
12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002
Origem e características dos fungos Glomaleanos
s plantas terrestres estabelecem simbioses mutualísticas ou parasíticas
com diversos microrganismos, os quais encontram ambientes favoráveis
nas partes aéreas ou subterrâneas dos vegetais. As micorrizas são as
relações mutualísticas mais comuns na natureza, sendo formadas por
certos fungos do solo e as raízes da grande maioria das plantas (Smith & Read, 1997).
Entre os sete tipos de micorrizas conhecidos, as micorrizas arbusculares (MAs),
formadas por fungos da Ordem Glomales, são as mais comuns nos ecossistemas
terrestres. Embora tradicionalmente classificados na Divisão Zygomycota, os fungos
micorrízicos arbusculares (FMAs) apresentam divergências suficientes, com base na
análise do RNA ribossômico 18S, para formarem uma
nova Divisão. Schußler et al. (2001) propuseram a Divisão
Glomeromycota para abrigar os organismos formadores
de MAs, colocando esse grupo de fungos no mesmo nível
da hierarquia taxonômica que os tradicionais grupos
basidiomicetos e ascomicetos. Existem fortes evidências
de que os FMAs desempenharam um papel crucial na
conquista do ambiente terrestre pelas plantas (Redecker et
al., 2000). Essa premissa é corroborada por evidências de
estudos de biologia molecular que confirmam que a
origem dos FMAs coincide com a origem das plantas
terrestres, há cerca de 353-462 milhões de anos (Simon et
al., 1993). A origem dos FMAs foi também confirmada por
análises em materiais fósseis do Devoniano, os quais
revelaram a presença de estruturas fúngicas similares
àquelas formadas pelos fungos Glomaleanos atuais (Pirozynski,
1981).
Os FMAs são simbiotróficos obrigatórios, pois completam
seu ciclo de vida apenas se estiverem associados a
uma planta hospedeira, a qual lhes fornece carboidratos
e outros fatores necessários ao seu desenvolvimento e
esporulação (Siqueira et al., 1985). Essa aparente desvantagem
da relação com a planta, no entanto, é compensada
pela ausência de especificidade existente entre os FMAs e os hospedeiros. Normalmente,
uma determinada espécie fúngica pode colonizar as raízes de vários
hospedeiros entre as Angiospermas, Gimnospermas e Pteridófitas. Apesar de apenas
3% das espécies vegetais terem sido examinadas para a presença de MAs, pode-se
afirmar que cerca de 95% das espécies vegetais atuais pertencem a famílias que são
caracteristicamente micorrízicas (Trappe, 1987). Assim, as MAs são a regra e não a
exceção na natureza. Famílias de plantas tipicamente não-micorrízicas incluem
Caryophylaceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae, Juncaceae, Polygonaceae, Cyperaceae,
que parecem ter perdido a capacidade de formar essa associação em tempos
mais recentes, evolutivamente. Os FMAs podem ser encontrados em plantas
herbáceas, arbustivas ou arbóreas que ocupam os mais diversos ecossistemas, como
florestas, desertos, dunas, savanas, campos e agrossistemas. O longo tempo de coevolução
entre os FMAs e as plantas pode explicar a presença ubíqua desses fungos
nos ecossistemas. Eles invariavelmente associam-se à maioria das plantas nativas dos
trópicos e a espécies de interesse econômico como café, soja, milho, sorgo, maçã,
citrus, feijão, entre outras. No Brasil, os estudos realizados pelos autores sobre a

ocorrência dos FMAs em
ecossistemas naturais e em
agrossistemas indicam que o
número de espécies pode
variar de 35 em dunas costeiras
até mais de 40 em cultivos
de café e no cerrado nativo.
Essa diversidade representa
aproximadamente 1/3 de todas
as espécies de Glomales
descritas até o momento. A
estrutura das comunidades
de FMAs nos diferentes sistemas
é bastante variável. Por
exemplo, três espécies de
Acaulospora (A. scrobiculata,
A. morrowiae e A. mellea)
são as mais freqüentemente
encontradas em solos com
cafeeiros, enquanto que no
cerrado, Scutellospora pellucida,
Gigaspora margarita e Paraglomus
diaphanum são geralmente as espécies
predominantes (Siqueira et al., 1989).
Estudos sobre a ecologia desses simbiontes
devem ser incentivados para obter-se
um inventário mais completo de
sua diversidade taxonômica, fisiológica
e genética. Essas informações poderiam
ser utilizadas para a seleção de isolados
eficientes para a aplicação em processos
biotecnológicos de interesse agrícola ou
ambiental.
Os FMAs não produzem alterações
morfológicas visíveis nas raízes das plantas,
e, desta forma, um processo de
coloração e observação ao microscópio
é necessário para a visualização das
estruturas fúngicas nas raízes colonizadas
(figura 1). As MAs possuem três
componentes, quais sejam: a raiz da
planta hospedeira, as estruturas formadas
no córtex radicular (arbúsculos e
vesículas) e o micélio e esporos extraradiculares
(figura 2). As vesículas, estruturas
globosas ou alongadas contendo
grânulos de glicogênio e lipídios, são
consideradas estruturas de estocagem
dos fungos e podem ser formadas dentro
ou fora das células do córtex. Os
arbúsculos são as estruturas características
das MAs. São formados pela intensa
Figura 2. Ilustração esquemática da anatomia de uma raiz com
micorriza arbuscular
ramificação de hifas intracelulares e são
responsáveis pela troca de nutrientes
entre os simbiontes. O desenvolvimento
de arbúsculos é acompanhado da invaginação
da membrana plasmática vegetal,
não comprometendo a integridade
das células radiculares. As hifas intra e
extra-radiculares são importantes como
propágulos para iniciar nova colonização,
para gerar novos esporos, para
aquisição de nutrientes e ainda podem
favorecer a agregação do solo. O micélio
extra-radicular pode atingir de 14 a 50 m
g -1 de solo, diferenciando-se em hifas
absortivas, as quais formam uma rede
dicotomicamente ramificada que se estende
solo adentro para absorção de
nutrientes e água.
Os esporos formados pelos FMAs
são assexuados e servem para sua disseminação
e sobrevivência (figura 3). Possuem
diâmetro que varia de 45 a 700 µm
(os maiores encontrados no Reino Fungi),
coloração hialina, amarelada, esverdeada,
amarronzada ou mesmo preta, e
forma globosa, alongada ou muitas vezes
irregular (Morton, 1988), podendo ter
parede lisa ou ornamentada. Os tipos de
esporos são distinguíveis em função de
sua ontogenia, que, juntamente com
características estruturais, formam a base
da taxonomia e sistemática
dos FMAs. Alguns
tipos de esporo e
aspectos da sua germinação
são ilustrados na
figura 3. A diversidade
estrutural nos esporos
permite reconhecer atualmente
cerca de 168
espécies de fungos Glomaleanos,
pertencentes
a sete gêneros distribuídos
em cinco famílias
(figura 4). Apesar
de germinarem facilmente
em meios de
cultura, o crescimento
continuado e a esporulação
dos FMAs não
ocorrem na ausência
de células vivas do hospedeiro.
As dificuldades de se cultivar os
FMAs in vitro representa um obstáculo
ainda não superado, o qual tem limitado
os estudos de sua biologia e desenvolvimento
biotecnológico.
Desenvolvimento da
associação simbiótica
Os mecanismos que regulam o desenvolvimento
e funcionamento das MAs
ainda não foram elucidados. Além do
crescimento intercelular, o processo de
colonização das raízes pelos FMAs é
caracterizado pelo crescimento intracelular
das hifas no tecido cortical e por
diferenciação de hifas intracelulares terminais
em arbúsculos (figura 2). Apesar
do crescimento intrarradicular extensivo,
normalmente observado nessa associação,
as reações de defesa da planta
são brandas e localizadas, sugerindo a
existência de um mecanismo de reconhecimento
mútuo entre os simbiontes,
o qual é controlado por genes do fungo
e da planta.
A sinalização molecular entre os simbiontes
deve ter início muito antes de seu
contato físico. Os esporos germinam
quando as condições de umidade, temperatura
e pressão parcial de CO 2
são
Figura 3. Esporos de fungos Glomaleanos. (a) detalhe de célula suspensora bulbosa em Gigaspora sp.; (b) Scutellospora spp
mostrando o escudo de germinação; (c) fotomicrografia de Gigaspora margarita mostrando tubo germinativo próximo à hifa
de sustentação, (d) detalhe da base do tubo na parede do esporo, (e) detalhe de uma célula auxiliar produzida in vitro e
(f) fotomicrografia de Glomus sp na rizosfera
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 13

Tabela 1 – As ações das micorrizas arbusculares no crescimento das plantas
Ação
Biofertilizadora
Biocontroladora
Biorreguladora
Mecanismos principais
Maior absorção e utilização de nutrientes do solo.
Favorecimento da nodulação e fixação de N 2
em leguminosas.
Amenização de estresses nutricionais e nutrição balanceada.
Acessos a nutrientes pouco disponíveis.
Ação de biocontrole sobre certos patógenos e pragas.
Redução de danos causados por pragas e doenças.
Amenização de estresses causados por fatores diversos como metais pesados e poluentes orgânicos.
Efeitos benéficos na agregação do solo, melhora a conservação da água e do solo.
Atua na produção/acúmulo de substâncias reguladoras do crescimento (desenvolvimento e floração).
Interfere favoravelmente na relação água-planta (aumenta tolerância a déficit hídrico);
Alterações bioquímicas e fisiológicas (acúmulo de certos metabólitos secundários).
favoráveis, e não há evidências de sinalização
nesse estádio de desenvolvimento.
No entanto, quando nas proximidades
das raízes de plantas hospedeiras, o
crescimento e a ramificação de hifas de
esporos germinados são altamente estimulados
(figura 5), sugerindo existência
de uma sinalização específica. De fato,
fatores presentes nos exsudatos de plantas
hospedeiras estimulam o crescimento
(figura 6) e a ramificação de hifas
(figura 5), e sua divisão nuclear (Buee et
al., 2000; Douds & Nagahashi, 2000). Ao
contrário do que ocorre com células de
hospedeiros, aquelas de não hospedeiros
não estimulam o crescimento do
fungo. A natureza dessas moléculas sinais
ainda não foi determinada. Embora
certos compostos fenólicos sintetizados
por plantas, como os flavonóides, flavononas
e isoflavonóides estimulem o crescimento
de hifas in vitro (Nair et al., 1991;
Bécard et al., 1992; Bécard et al., 1995) e
a colonização micorrízica (Siqueira et
al., 1991), a essencialidade desses compostos
para o desenvolvimento da simbiose,
como ocorre em interações leguminosas-rizóbios,
não foi demonstrada.
Estudos com mutantes de milho deficientes
em chalcona sintase, enzima chave
na síntese dos flavonóides, indicam
que esses compostos fenólicos não são
necessários para o desenvolvimento de
MAs (Bécard et al., 1995). Essenciais ou
não, flavonóides estimulam a colonização
micorrízica e apresentam grande
potencial de aplicação prática, como
abordado neste artigo.
A primeira e mais importante indicação
de reconhecimento de um hospedeiro
compatível é a diferenciação de
hifas fúngicas em apressórios (Staples &
Macko, 1980). A formação de um apressório
funcional, após um período de
proliferação e ramificação abundante
Figura 4. Classificação atual dos FMAs
mostrando as características que definem
as famílias e gêneros de Glomales.
Elaborada e atualizada conforme informações
do INVAM
(http://invam.caf.wvu.edu)
14 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

Tabela 2 – Exemplos de culturas, fungos eficientes e efeitos da inoculação no Brasil (Siqueira & Klauberg Filho, 2000)
Cultura
Abacaxi
Cafeeiro
Citros
Leguminosas
Milho
Mamão
Tomate
Plantas arbóreas:
reflorestamento e
frutíferas
Fungos eficientes
Glomus clarum, Gigaspora margarita e
Glomus intraradices
Glomus clarum, Gigaspora margarita,
Glomus etunicatum
Acaulospora morrowiae, Glomus clarum,
Gl. etunicatum, Glomus intraradices,
Glomus fasciculatum
Glomus etunicatum, Glomus clarum
Glomus clarum, Glomus etunicatum
Glomus etunicatum, Entrophospora
colombiana
Glomus clarum, Glomus etunicatum,
Gigaspora margarita
Glomus clarum, Glomus etunicatum,
Glomus fasciculatum
Efeitos da inoculação
Melhor desenvolvimento de mudas
micropropagadas.
Melhor desenvolvimento de mudas, melhor
sobrevivência no campo e maior produção.
Crescimento mais rápido de porta enxertos e de
mudas no campo.
Favorecimento da nodulação, do acúmulo de N,
da produção de grãos e da tolerância ao déficit
hídrico.
Nutrição favorecida, melhor ia do crescimento e
da produção.
Melhor desenvolvimento inicial e de nutrição de
mudas.
Crescimento estimulado e maior eficiência de uso
de fósforo.
Essencial para o desenvolvimento de mudas de
espécies de semente pequena e crescimento
rápido.
das hifas de FMAs na rizosfera do hospedeiro
e adesão à superfície da célula
vegetal, resulta em penetração e posterior
colonização do tecido cortical. A
formação de apressórios depende do
genoma da planta hospedeira, de modo
que o fungo não é capaz de formar
apressórios funcionais em raízes de plantas
não-hospedeiras, muito embora dilatações
de hifas semelhantes a apressórios
possam ser observadas quando o
fungo é colocado próximo às raízes
(figura 5). Esses resultados sugerem a
existência de fatores essenciais para a
completa diferenciação das hifas em
apressórios funcionais (Giovannetti et
al., 1993). Nagahashi & Douds (1997)
observaram que a diferenciação de hifas
em apressórios é dependente do reconhecimento
específico da parede de
células epidérmicas em plantas hospedeiras.
O processo de colonização, propriamente
dito, tem início na superfície da
raiz, com a penetração resultante da
combinação de pressão mecânica e degradação
enzimática parcial da parede
celular vegetal. A produção de enzimas
hidrolíticas como pectinases, celulases e
hemicelulases por FMAs tem sido documentada
e pode ser essencial para o
desenvolvimento da simbiose. A colonização
intrarradicular é limitada aos tecidos
externos à endoderme, e se dá pelo
crescimento inter- e intracelular das hifas.
O crescimento intracelular inicial é
caracterizado pela formação de enovelamentos
de hifas transcelulares e pela
Figura 5. Esporo germinado e crescendo na rizosfera de uma planta
hospedeira (a) e resposta induzida pela presença de componentes de
exsudatos da planta (b)
invaginação da membrana plasmática
vegetal, de modo que não existe comprometimento
da integridade das células
hospedeiras. Esse processo é acompanhado
também pela deposição de material
semelhante à parede celular vegetal
ao redor da hifa, criando uma região
apoplástica (interface) com características
bioquímicas específicas (figura 7).
Em algumas células corticais, hifas intracelulares
se diferenciam em arbúsculos.
Durante esse processo, a parede celular
fúngica se torna amorfa, desaparecendo
as cadeias de quitina cristalina. Adicionalmente,
intensa síntese de membrana
plasmática, fragmentação do vacúolo,
aumento do volume de citoplasma, decréscimo
no número de amiloplastos,
movimentação do núcleo, rearranjo do
citoesqueleto e aumento da atividade de
transcrição gênica são também alterações
observáveis durante o desenvolvimento
dos arbúsculos (Bonfante & Perotto,
1995).
Alterações bioquímicas no fungo e
no hospedeiro ocorrem não somente
durante o desenvolvimento de arbúsculos,
mas também durante o processo de
colonização intrarradicular. Evidências
de alterações do metabolismo do fungo
são dadas pelas observações da atividade
e localização de ATPases e da atividade
de fosfatase alcalina vacuolar (Saito,
1995). Durante o crescimento de hifas de
esporos germinados, ATPases ativas são
localizadas próximo à extremidade das
hifas, enquanto em hifas intercelulares e
nos arbúsculos elas se localizam ao
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 15

Figura 6. Efeito da presença de suspensão de células de plantas hospedeiras e
não hospedeiras (repolho) no crescimento micelial assimbiótico da Gigaspora
gigantea em meio de cultura (Dados de Paula & Siqueira, 1990)
longo de toda a membrana plasmática
fúngica. Já a atividade de fosfatase alcalina
vacuolar é maior durante o processo
de colonização das raízes, comparada à
atividade em hifas proveniente de esporos
germinados. No hospedeiro, a expressão
diferencial de vários genes envolvidos
na defesa vegetal contra o ataque
de patógenos, avaliada com base
em atividades enzimáticas, acúmulo de
proteínas e/ou de mRNAs, tem sido
observada durante o desenvolvimento
das MAs, podendo ter papel fundamental
no controle da colonização intrarradicular
(Lambais, 2000).
O crescimento de FMAs no interior
das raízes parece ser um processo “controlado”,
já que a colonização de tecidos
meristemáticos e/ou de vasos condutores
não é observada. Adicionalmente,
nem todas as células corticais são infectadas
e a diferenciação de hifas terminais
em arbúsculos ocorre somente em algumas
das células colonizadas. No entanto,
os fatores atuantes nesse controle são
desconhecidos. A regulação do desenvolvimento
e da funcionalidade das MAs
envolve uma complexa troca de sinais
entre os simbiontes, a qual pode ser
afetada também pelas condições ambientais.
O resultado dessa sinalização é a
síntese dos simbiossomos, representados
pelos arbúsculos, membrana periarbuscular
e interfaces características (figura
7).
Apesar da colonização extensiva das
raízes pelos FMAs, não há desenvolvimento
de sintomas evidentes de resposta
de hipersensibilidade (acúmulo de fitoalexinas
e morte das células microbianas
ou do hospedeiro) em MAs (Gianinazzi,
1991). O acúmulo de fitoalexinas ocorre
predominantemente nas fases mais tardias
do desenvolvimento da simbiose, e
atinge concentrações muito inferiores
àquelas observadas em interações com
fungos fitopatogênicos. A ausência de
reações de hipersensibilidade é, da mesma
forma, observada na simbiose entre
leguminosas e rizóbios. Aparentemente,
esses microssimbiontes são reconhecidos
pelos hospedeiros de modo a formarem
interações compatíveis de longa
duração (Lambais & Mehdy, 1995).
A utilização de modelos de sinalização
e regulação gênica que ocorrem nas
simbioses leguminosas-rizóbios tem contribuído
para melhor entendimento dos
processos atuantes em MAs. A existência
de fatores comuns entre os dois tipos de
simbiose tem sido sugerida pelo fato de
que mutantes de plantas de ervilha que
não são capazes de desenvolver micorriza
típica, e têm a colonização bloqueada
em um estádio imediatamente posterior
à formação do apressório (myc -
precoces), são também não-nodulantes,
i.e., nod - (Gianinazzi-Pearson et al., 1995).
Mutantes que formam nódulos não-fixadores,
i.e., nod + fix - , também não desenvolvem
micorriza típica. Nesse caso,
ocorre penetração e colonização intercelular,
mas não há formação de arbúsculos,
definindo os mutantes myc - tardios
(Lambais, 1996). Diferente dos mutantes
myc - precoces de ervilha, mutantes
de Lotus japonicus não-nodulantes têm o
desenvolvimento da micorriza bloqueado
na colonização do córtex, e foram
denominados Coi - (“cortex invasion”)
(Wegel et al., 1998). Raízes micorrizadas
sintetizam também proteínas imunologicamente
relacionadas com nodulinas,
proteínas específicas de nódulos de leguminosas
(Wyss et al., 1990; Perotto et
al., 1994), e fatores Nod sintetizados por
rizóbios são capazes de estimular a colonização
intrarradicular de fungos micorrízicos
(Xie et al., 1995).
Tem sido sugerido que a colonização
intrarradicular por FMAs depende da
capacidade do fungo em evitar a ativação
ou mesmo em suprimir o sistema de
defesa vegetal. A não ativação do sistema
de defesa vegetal pode estar associada à
maior atividade de enzimas anti-oxidantes
(catalase, por exemplo) em raízes
micorrizadas (Lambais, 2000). As atividades
de quitinases são induzidas nos
estádios iniciais do desenvolvimento da
simbiose, e suprimidas posteriormente a
níveis inferiores aos observados em plantas
sem micorrizas. Essa supressão é
atenuada em condições de alto P, onde
a colonização é inibida. Em condições
de alto P, o acúmulo de mRNAs codificando
uma isoforma ácida de quitinase
é induzido em células contendo arbúsculos
ou sua vizinhança (Lambais &
Mehdy, 1993). As atividades de β-1,3-
glucanases são também suprimidas em
certos estádios do desenvolvimento da
simbiose, e dependem da concentração
de P. Em condições de baixo P, tem sido
observado acúmulo de mRNAs codificando
uma isoforma de β-1,3-glucanase,
homóloga a uma isoforma básica de
soja, em células contendo arbúsculos e
suas imediações. Além da indução localizada,
uma supressão sistêmica, em condições
de alto P ou em raízes micorrizadas,
também tem sido observada (Lambais
& Mehdy, 1998). Os mecanismos
que controlam o sistema de defesa vegetal
podem envolver a regulação diferencial
de isoformas de quitinases e β-1,3-
glucanases, em conseqüência de alterações
hormonais e/ou síntese de moléculas
elicitoras/supressoras específicas (Lambais,
2000).
O desenvolvimento de novas técnicas
de análise de expressão gênica, como
hibridização em microarrays (arranjos
ordenados de milhares de genes em
lâminas de vidro especiais), análise sistemática
de ESTs (Expressed Sequence
Tags) e SAGE (Serial Analyses of Gene
Expression), bem como a análise de
proteomas de raízes micorrizadas por
eletroforese bi-dimensional e espectrometria
de massa, permitirá um melhor
entendimento dos mecanismos que con-
16 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

Figura 7. Enzimas e sinais moleculares de origem fúngica ou vegetal secretados
na interface apoplástica de micorrizas arbusculares
trolam a formação de MAs e poderá
contribuir para a efetiva aplicação em
larga escala dos FMAs na agricultura.
Efeitos no crescimento
das plantas
Embora as MAs sejam conhecidas
desde o início do século XIX, seus
efeitos benéficos para as plantas só
foram documentados no século passado,
quando verificou-se que certas espécies
vegetais apresentavam desenvolvimento
retardado e sintomas de distúrbios
(deficiências) nutricionais quando
cultivadas em solos esterilizados para
controle de patógenos. No
período de 1950-60, experimentos
confirmativos desenvolvidos
na Inglaterra e nos
Estados Unidos evidenciaram
que plantas inoculadas
com propágulos de fungos
extraídos do solo desenvolviam-se
melhor (figura 8),
por conterem teores mais
elevados de nutrientes minerais,
especialmente daqueles
pouco móveis no
solo, como fósforo, zinco e
cobre, cuja absorção é facilitada
pelas hifas externas
(figura 2). Sabe-se, no entanto,
que, devido a efeitos
secundários da micorrização,
outros nutrientes são
também absorvidos em maior
quantidade em plantas
micorrizadas. Embora os
efeitos das MAs sejam mais
consistentes para os nutrientes de baixa
mobilidade, os FMAs interferem direta
ou indiretamente na absorção de outros
elementos como Br, I, Cl, Al e Si e metais
pesados. Os efeitos nutricionais dependem
da disponibilidade relativa dos elementos
no meio de crescimento e da
exigência da planta a eles, sendo mais
acentuados em condições de deficiência,
especialmente de P. A absorção de
P tem relação direta com o crescimento
da planta, sendo que quando este atinge
concentrações próximas da adequada, a
colonização das raízes é inibida por
mecanismos auto-regulatórios da simbiose,
tornando as MAs desnecessárias e
Figura 8. Resposta do ipê: c - sem inoculação e m - inoculada (a)
e do citros (b) à inoculação com FMAs. Foto de citros cedida por
A. Colozzi-Filho-IAPAR- Londrina, correspondendo a plantas sem
e com inoculação em solo fumigado e não fumigado
incompatíveis com as condições de excesso
de nutrientes no solo.
A maior absorção de nutrientes resulta
de inúmeros mecanismos, como
aumento na superfície e capacidade de
absorção das raízes, maior acessibilidade
aos nutrientes, utilização de formas
não disponíveis a raízes não-colonizadas,
por solubilização e mineralização
de nutrientes na rizosfera, e amenização
de fatores adversos à absorção, como
metais, compostos orgânicos tóxicos e
patógenos que atacam o sistema radicular
(Siqueira, 1994). A contribuição das
micorrizas para a absorção de alguns
nutrientes tem sido estimada em 80%
para o P, 60% para o Cu e entre 10% a
25% para os demais nutrientes (Marschner
& Dell, 1994). Se a difusão química
no solo é limitante, as hifas podem
aumentar a área de absorção em até
1800% (Okeefe & Sylvia, 1991). Além da
alta capacidade e eficiência de absorção
de P, as hifas crescem a partir das raízes
solo adentro (figura 2), absorvendo este
e outros nutrientes fora da zona de
esgotamento que se desenvolve próximo
à superfície das raízes absorventes,
transferindo-os para o hospedeiro nos
arbúsculos.
Devido ao fato da disponibilidade de
N e P ser o principal fator limitante para
o crescimento e a produtividade das
plantas, os FMAS apresentam grande
potencial como insumo biológico para a
agricultura. A inoculação de milho e soja
com isolados fúngicos eficientes pode
reduzir em 34% e 56% o requerimento
externo de fertilizante fosfatado, respectivamente
(Siqueira, 1994). Essa redução
representa um efeito “biofertilizante
equivalente” estimado
de 30 e 60kg de P 2
O 5
aplicado
ao solo, respectivamente, para
essas culturas. Considerandose
a área plantada com soja e
milho no país, cerca de 28
milhões de ha, e o efeito das
MAs em condições de campo,
aproximadamente um terço do
que é observado em condições
controladas, pode-se estimar
que a contribuição dessa
simbiose para a economia com
fertilizantes fosfatados nestas
culturas seria da ordem de US$
250 milhões no Brasil. O efeito
biofertilizante varia para as diferentes
culturas em função
da exigência nutricional, eficiência
de absorção e de uso do
nutriente, assim como da capacidade
de formar uma simbiose
eficiente com o fungo e
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 17

Figura 9. Atividades de Pesquisa e Desenvolvimento visando à aplicação de
fungos micorrízicos arbusculares na agricultura
do nível de fertilidade ou manejo da
adubação. Em condições nutricionais
ótimas, a colonização intrarradicular é
reduzida, assim como os benefícios do
fungo. No caso do N, as plantas com
micorrizas absorvem mais o N disponível
no solo e evidências recentes indicam
que os FMAs são capazes de mineralizar
N orgânico no solo, facilitando
assim a nutrição nitrogenada das plantas.
É interessante também o sinergismo
que existe entre os FMAs e bactérias
diazotróficas. No caso do rizóbio, a
nodulação e a quantidade de N fixada
pelas leguminosas é favorecida em plantas
inoculadas com FMAs. Um dos mecanismos
envolvidos nessa relação é a
maior absorção de P do solo, nutriente
exigido em grande quantidade para a
fixação biológica de N 2
. Em solo de
cerrado adubado com metade da quantidade
de fosfato ótima, a inoculação
com FMAs dobrou a quantidade acumulada
de N na soja. Em sistema de sorgo
consorciado com soja, a inoculação
com FMAs favoreceu a transferência de
N da soja para o sorgo, de modo que a
produção de grãos deste aumentou em
67% e 157% na ausência ou presença de
fungo micorrízico, respectivamente (Bressan,
1996).
Além dos efeitos nutricionais, as micorrizas
exercem outros papéis sobre a
planta hospedeira, os quais são resumidos
na tabela 1. Plantas micorrizadas
são menos danificadas por danos causados
por diversos tipos de estresse do
solo ou ambientais, facilitando seu estabelecimento
e sobrevivência em locais
adversos. As MAs são componentes essenciais
em programas de recuperação
de áreas degradadas e solos poluídos
com metais pesados ou compostos orgânicos
poluentes.
Aplicação dos FMAs
na agricultura
Devido à sua natureza ubíqua, à
ausência de especificidade hospedeira e
à susceptibilidade generalizada das plantas
à micorrização, os FMAs apresentam
enorme potencial biotecnológico. Alguns
exemplos da aplicação desses fungos
na agricultura e no reflorestamento
são apresentados na tabela 2. Sua exploração
é viabilizada pelo aumento da taxa
de micorrização das plantas, que pode
ser conseguido: a) pela inoculação com
isolados fúngicos selecionados; b) por
práticas de manejo seletivo da população
fúngica indígena dos solos agrícolas
e; c) mais recentemente, pela aplicação
de compostos estimulantes da micorrização.
A inoculação garante efeitos benéficos,
podendo ser efetuada no solo durante
a semeadura de plantas anuais e de
pastagens, na repicagem de mudas de
plantas olerícolas, na formação de mudas
de espécies arbustivas ou arbóreas
(figura 9) com finalidades agronômica,
florestal, de recuperação ambiental e de
ornamentação. As respostas da inoculação
variam de 10% a 800% em aumento
da biomassa vegetal (Siqueira & Franco,
1988), e são maiores, mais consistentes e
promissoras em plantas que passam por
fase de formação de mudas. No entanto,
a aplicação desses fungos em larga escala
é ainda muito limitada, principalmente
pela falta de inoculante aceito comercialmente.
A principal razão para essa falta
de inoculante é o caráter biotrófico obrigatório
do fungo, que exige que sua
propagação seja feita em plantas multiplicadoras.
São conhecidos vários sistemas
para a multiplicação de propágulos,
em solo desinfestado, substratos inertes,
sistemas hidropônicos e aeropônicos, e
produção de inoculantes. Em condições
favoráveis apropriadas, pode-se obter
até 200.000 esporos de FMAs por litro de
substrato em 4 meses, o que seria suficiente
para inocular de 2.000 a 3.000
mudas. O estabelecimento de padrões
de qualidade de inoculantes, considerando-se
aspectos de pureza e sanidade,
é essencial para o desenvolvimento comercial
desses fungos. Pacotes tecnológicos
para aplicações diversas já foram
desenvolvidos, como é o caso da inoculação
do cafeeiro (Saggin Júnior & Siqueira,
1996), cuja viabilidade técnica já
foi demonstrada no Brasil e sua aplicação
é concretizada na Colômbia, onde
existem várias empresas produtoras de
inoculantes. Mudas inoculadas com esporos
de fungos selecionados (figura
10) desenvolvem-se mais rapidamente
no viveiro, sobrevivem melhor quando
transplantadas para o campo e produzem
mais. Aumentos de produção no
primeiro ano variam de 30% a 800%,
enquanto que, nos anos seguintes, esses
efeitos são muito inconsistentes. Valores
médios para aumento de produção nos
cinco primeiros anos, em diversos experimentos
realizados em Lavras e Patrocínio
(MG), são da ordem de 50% em
relação às mudas sem inoculação na
formação. Isso representa um aumento
de produtividade acumulada de 35 sacas
de café beneficiado por ha no período.
Esses estudos revelaram efeitos complementares
entre a aplicação de P com a
18 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

Figura 10. Suspensão de esporos obtida de vasos de multiplicação pronta para
uso em inoculações (a) e mudas de cafeeiro micorrizadas preparadas para o
plantio no campo (b)
resposta do cafeeiro à micorrização.
Sem P não há resposta à inoculação e a
dose de P necessária para atingir a
produção máxima foi de 207 e 100 g de
P 2
O 5
por planta, sem e com inoculação
na formação, respectivamente. Portanto,
em solos de cerrado, a micorriza pode
reduzir a necessidade de P do cafeeiro à
metade (Siqueira et al 1998).
Nos cultivos anuais extensivos, a
inoculação com FMAs não é viável,
devido ao grande volume de inoculante
que seria necessário. Nesse caso, uma
alternativa seria o manejo da população
de fungos indígenas que, embora presentes
em todos os solos, não se encontram
em quantidades suficientes para
atingir, em tempo, taxas de colonização
necessárias para garantir benefícios às
culturas de ciclo curto como milho, soja,
feijão. Conhecendo os fatores edáficos e
culturais que influenciam os FMAs, suas
populações podem ser manejadas. É
relativamente fácil aumentar a densidade
de propágulos no solo, porém difícil
promover alterações qualitativas específicas.
Em geral, o cultivo mínimo do solo,
o uso reduzido de agroquímicos e o
Figura 11. Representação esquemática das etapas da descoberta de substâncias
vegetais bioativas e desenvolvimento de produtos estimulantes da
micorrização
cultivo com leguminosas favorecem os
FMAs. Já, o cultivo com espécies não
micotróficas, como crucíferas e membros
da Chenopodiaceae, e monoculturas
de gramíneas de uso prolongado
reduzem a densidade de propágulos no
solo.
A identificação de compostos orgânicos
ativos sobre os FMAs em exsudatos
de plantas sob estresse nutricional
(Nair et al., 1990, Paula e Siqueira, 1990)
possibilitou o desenvolvimento de uma
nova estratégia para estimular os propágulos
desses fungos em solos agrícolas
(figura 11). Compostos naturais de alta
atividade sobre os FMAs in vitro e na
micorrização foram encontrados e serviram
de base para o desenvolvimento de
produtos estimulantes da micorrização
(US patent no. 5.002.603, de 03/1991).
Durante a década de 90, estudos de P &
D conduzidos por pesquisadores da
Michigan State University (MSU), nos
EUA, e da Universidade Federal de Lavras
(MG) permitiram o desenvolvimento
de formulações comerciais à base de
formononetina sintética (figura 12) como
o Myconate TM , atualmente produzido
pela VAMTech (L.C.C.,EUA), sob licença
da MSU. Em experimentos realizados em
Lavras (MG), a aplicação de 60 a 100 g de
Myconate no solo ou na semente aumentou
a produtividade do milho de 8,0
t ha -1 no controle para 10,4 t ha -1 no
melhor tratamento, correspondendo a
37 sacas ha -1 (figura 13). Respostas semelhantes
foram encontradas para a
soja no Brasil (figura 12) e para esta e
outras culturas em outros países (Nair et
al 1999). Devido à predominância de
solos pobres e à alta exigência de P das
culturas, o Brasil apresenta enorme potencial
para essa tecnologia, a qual já foi
licenciada para uma empresa nacional
do ramo de insumos biológicos. Testes
finais de campo estão sendo realizados
visando ao registro e à comercialização
do Myconate. Para obter-se sucesso com
o emprego de produtos à base de isoflavonóides
é importante considerar: a) a
cultura deve ser micotrófica e apresentar
alta compatibilidade com os fungos indígenas;
b) deve haver propágulos viáveis
no solo, porém em densidade abaixo da
necessária para atingir máxima colonização;
c) as condições nutricionais ou
ambientais devem impor algum grau de
estresse para garantir os benefícios da
melhor micorrização; d) a viabilidade
tecnológica depende de benefícios consistentes
na produtividade e/ou redução
no uso de insumos, como os fertilizantes
fosfatados.
A aplicação dos FMAs em larga esca-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 19

Figura 12. Formononetina pura e incorporada em veículo para aplicação (a), lavoura experimental de milho tratada
com Myconate (b), produção de soja em Lavras-MG (c), estrutura da Formononetina (7-hidroxi, 4´-metoxi-isoflavona) (d)
la poderá contribuir para redução no
uso de agroquímicos, diminuir as perdas
das culturas causadas por estresses diversos
e aumentar a produção, e, ao
mesmo tempo, favorecer a conservação
ambiental. Portanto, os FMAs são importantes
componentes da produção agrícola
e, se manejados adequadamente,
podem contribuir substancialmente para
a sustentabilidade dos agrossistemas. Nos
trópicos também são componentes importantes
na recuperação de áreas degradadas,
especialmente quando se emprega
a fitorremediação. Sua aplicação
como insumo biológico dependerá de
vários aspectos:
a) exploração comercial em larga
escala: está condicionada a avanços
reais para produção de inoculantes, manipulação
da população indígena através
de manejo específico ou do emprego
de produtos estimulantes da micorrização;
b) é necessário ampliar a experimentação,
em campo para obter-se resultados
experimentais conclusivos e realizar
análise da consistência, longevidade e
custo/benefício da inoculação;
c) o mercado de fertilizantes, no que
diz respeito ao preço relativo do produto,
disponibilidade dos adubos para os
produtores e esgotamento de matériasprimas
industriais, é de grande importância.
Preços altos ou relações de troca
com produtos desfavoráveis facilitarão a
aplicação dos FMAs na agricultura;
d) o enfoque ecológico da produção
agrícola visando sustentabilidade, implicará
na redução da mecanização e do
uso de agroquímicos, facilitando o emprego
dos FMAs. A maior conscientização
dos agricultores e da sociedade
sobre a necessidade de preservação ambiental
e conservação de recursos naturais
amplia as oportunidades para tecnologias
biológicas seguras, como os FMAs,
que são aliados ancestrais das plantas no
ambiente terrestre.
Figura 13. Efeitos de formulações de formononetina aplicadas na semente
(sem) ou no solo na produção do milho (Romero, 2000, dissertação de
mestrado-UFLA). Tukey a 5%
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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 21

Pesquisa
Salmonella
vacinais
Foto cedida pelos autores
Uma estratégia promissora para o desenvolvimento de vacinas orais multivalentes
Maria Elisabete Sbrogio de Almeida
Pesquisadora do Instituto Butantan,
Centro de Biotecnologia,
bsbrogio@usp.br
Liliana Moura Massis
Estagiária de Iniciação Científica,
Departamento de Microbiologia da USP
Luís Carlos de Souza Ferreira
Prof. Titular, Departamento de Microbiologia da
Universidade de São Paulo,
lcsf@usp.br
Figura 1: Micrografia eletrônica de
flagelo híbrido de linhagem atenuada
de S. Dublin fusionado a peptídeo
heterólogo. Um peptídeo com 15
aminoácidos, derivado do antígeno
CFA/I de E. coli enterotoxigênica
(ETEC) foi fusionado geneticamente
com a flagelina de S. Muenchen
expressa em linhagem vacinal de
Salmonella. A presença do epitopo
heterólogo fusionado com a flagelina
é revelada pela marcação com
anticorpos específicos para o CFA/I
de ETEC, que são revelados pela
presença de um segundo anticorpo
marcado com ouro coloidal visto
como pequenas partículas negras
aderidas ao flagelo. A barra à esquerda
mede o equivalente a 20 nm
actérias do gênero Salmonella,
em particular linhagens da
espécie S. enterica, podem
causar doenças como diarréia
e gastroenterite, ou ainda infecções
sistêmicas, muitas vezes letais, em diversas
espécies de mamíferos. No homem,
os principais sorovares, isto é,
grupos de linhagens que compartilham
antígenos de superfície reconhecidos
por anticorpos específicos, responsáveis
por infecções sistêmicas são
representados pela S. enterica sorovar
Typhi (ou S. Typhi), agente causador
da febre tifóide – doença comum em
muitos países em desenvolvimento e
com elevados índices de mortalidade –
e a S. enterica sorovar Paratyphi (ou S.
Paratyphi), causadora da febre entérica
ou paratifóide. Outros sorovares
como S. Typhimurium, S. Dublin e S.
Enteritidis causam distúrbios gastrointestinais
em diversas espécies de mamíferos,
aves e répteis. Em camundongos,
linhagens de S. Typhimurium e
S. Dublin, ao contrário do
que se observa no homem
ou em bovinos, provocam
infecções sistêmicas semelhantes
à febre tifóide no
homem.
O tratamento de infecções
por Salmonella emprega,
em geral, antibióticos,
mas o problema da
multirresistência bacteriana
aos quimioterápicos e
o elevado custo reduziram
drasticamente a eficácia
dessa estratégia terapêutica.
Vacinas contra as
salmoneloses são uma alternativa
profilática com
excelente relação custobenefício
para regiões
onde a bactéria é endêmica
e prevalecem condições
precárias de saneamento e higiene.
A pesquisa de vacinas contra as
salmoneloses humanas iniciou-se com
a busca de uma formulação que conferisse
proteção à febre tifóide, uma
doença que preocupava os militares,
em função do grande número de soldados
infectados durante operações
de guerra. A primeira vacina contra a
febre tifóide foi desenvolvida no final
do século 19 e consistia em bactérias
mortas pelo calor, e preservadas em
22 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

fenol, administradas por via parenteral.
Essa vacina foi utilizada durante
décadas e embora razoavelmente eficaz
(60% a 70% de proteção por
períodos de até 7 anos) causava fortes
reações adversas como febre e convulsões
em uma parcela dos indivíduos
vacinados. Por causa desse problema,
a partir da década de 70, a vacina
contra a febre tifóide foi substituída
por uma nova formulação baseada em
bactérias vivas atenuadas, isto é, cepas
que perderam a capacidade de
causar doença, mas mantiveram o
potencial de conferir proteção (Levine
& Sztein, 1996).
Nos últimos anos, o emprego de
linhagens atenuadas de Salmonella
como abordagem vacinal expandiuse
rapidamente e extrapolou o problema
das salmoneloses. A relativa
facilidade na obtenção de linhagens
atenuadas e a possibilidade de transformá-las
em veículos para a expressão
de antígenos heterólogos (antígenos
codificados por genes oriundos de
outros patógenos) transformou o uso
dessas bactérias em uma promissora
estratégia para o desenvolvimento de
novas vacinas (Chatfield & Dougan,
1997). Neste artigo discutimos aspectos
relacionados com os processos de
obtenção de linhagens atenuadas de
Salmonella e a utilização dessas bactérias
como formulações vacinais bivalentes.
Vantagens das vacinas
baseadas em Salmonella
As vacinas baseadas em linhagens
atenuadas de Salmonella podem e
devem ser administradas por via oral,
para diminuir os custos operacionais
de sua produção e administração. Essas
linhagens também são capazes de
estimular uma ampla gama de respostas
imunológicas, como a produção de
anticorpos no sangue e na luz intestinal
(IgA secretado ou sIgA) e ativação
de macrófagos, linfócitos T e células
citotóxicas. A produção de sIgA em
superfície de mucosa, como o epitélio
intestinal, mostra-se de particular importância,
já que, em geral, essa produção
não pode ser induzida por vacinas
administradas por via parenteral.
Por sua vez, a produção de sIgA em
superfície de mucosa confere uma
barreira à entrada de microrganismos
pelo trato intestinal, respiratório ou
genito-urinário (Lásaro & Ferreira,
2000).
Estratégias empregadas
na atenuação de linhagens
de Salmonella
As salmonelas são caracteristicamente
patogênicas aos seus hospedeiros
e seus derivados naturalmente atenuados
não são encontrados na natureza.
A administração de 100 a 500
bactérias vivas é suficiente para causar
doenças como a febre tifóide e as
gastroenterites, tanto em humanos
como em animais. Acredita-se que cerca
de 200 a 500 genes sejam necessários
para que salmonelas causem doença a
seus respectivos hospedeiros. Mutações
nas Salmonella que levam à sua
atenuação reduzem, de forma drástica,
a patogenicidade da linhagem e, em
geral, doses superiores a 10 9 bactérias
vivas, administradas por via oral, não
resultam em qualquer sintoma ou reação
adversa nos indivíduos vacinados.
Os genes responsáveis pela atenuação
de bactérias patogênicas, em particular
Salmonella, são divididos em três
grandes grupos: genes envolvidos com
a síntese de fatores relacionados com a
virulência, genes envolvidos com o
metabolismo biossintético e genes que
participam de processos de regulação
gênica (Tabela 1).
A primeira linhagem vacinal de
Salmonella, utilizada como vacina oral
contra a febre tifóide, foi a cepa Ty21a
de S. Typhi (Germanier & Furer, 1975).
Essa linhagem foi selecionada no começo
da década de 70, após ser submetida
a um processo de mutagênese
química. A natureza genética da atenuação
dessa linhagem é desconhecida,
mas foi inicialmente atribuída a uma
mutação no gene galE, que codifica
para uma enzima envolvida com síntese
de lipopolissacarídeos, necessários
à virulência da bactéria. Essa linhagem
também se mostra incapaz de produzir
o antígeno capsular Vi, material de
natureza polissacarídica, também envolvido
com a virulência. Três ou quatro
doses da vacina, constituída de
bactérias vivas liofilizadas, ingeridas na
forma de cápsulas ou suspensas em
líquido, resultaram em proteção de
60% a 80% dos indivíduos vacinados
por períodos de até 7 anos e sem
ocorrência de qualquer efeito adverso.
O loci genético SPI2 define uma das
duas ilhas de patogenicidade encontradas
em S.Typhimurium. Mutações
em vários genes presentes nessa região
reduzem a capacidade de infecção
sistêmica e sobrevivência da bactéria
no interior de fagócitos (Medina
et al., 1999).
Mutações em genes envolvidos na
biossíntese de compostos aromáticos
(aro) são freqüentemente empregadas
na obtenção de linhagens atenuadas,
tanto para Salmonella como para
outras espécies de bactérias gram-negativas.
A via de biossíntese de compostos
aromáticos em bactérias é responsável
pela produção dos aminoácidos
aromáticos (tirosina, fenilalanina e
triptofano), enteroquelina (um composto
quelante de ferro), folato, ubiquinona
e vitamina K. A maior parte
desses compostos está disponível em
meios ricos ou nos tecidos do hospedeiro,
entretanto, o folato e a enteroquelina
precisam ser sintetizados de
novo a partir do ácido 2.3 dihidroxibenzóico,
precursor não encontrado
em tecidos de mamíferos. O folato, por
sua vez, é necessário para a síntese de
bases nitrogenadas e da formil-metionina,
aminoácido usado exclusivamente
pelas bactérias para iniciar a síntese
protéica. Curiosamente, o folato está
disponível em quantidades razoáveis
em células de mamífero, mas as salmonelas,
assim como outras bactérias, não
dispõem de um sistema de transporte
específico que permita a sua utilização.
Após serem ingeridas, linhagens
de Salmonella deficientes em genes
aro permanecem nos tecidos do hospedeiro
por alguns dias, mas, sem
causarem qualquer sintoma ao hospedeiro,
terminam por serem eliminadas
pelos mecanismos de defesa imunológica.
As principais mutações utilizadas
para obtenção de linhagens atenuadas
de Salmonella deficientes na via de
síntese de compostos aromáticos incidem
sobre os genes aroA, aroC e o
aroD. Entre as Salmonella vacinais
aro - destacam-se as linhagens SL3261
de S. Typhimurium, SL5928 de S.
Dublin e CVD908 de S. Typhi. Outros
genes capazes de causar a atenuação
de Salmonella por bloqueio de vias
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 23

Tabela 1: Genes empregados na atenuação de linhagens vacinais de Salmonella
Genes ligados à virulência
Genes ligados à biossíntese
Genes relacionados com
funções reguladoras
GENES NOS QUAIS MUTAÇÕES LEVAM À ATENUACÃO
galE
SPI2
aroA, C, D
purA, B, E, H
guaBA (operon)
asd
cya
crp
dam
phoP/phoQ
ompR
hns
htrA
UDP 4-galactose epimerase (síntese de lipopolissacarídeos)
Loci genético composto por diversos genes necessários à
infecção sistêmica e sobrevivência no interior de fagócitos
Enzimas envolvidas na via de síntese do ácido corísmico
(biossíntese de compostos aromáticos)
Enzimas envolvidas na síntese de purinas (síntese de DNA)
Interfere na biossíntese de guanina
Aspartato semi-aldeído desidrogenase (síntese da parede
celular)
Adenilato ciclase
Proteína receptora de cAMP (regulação gênica)
DNA metilase (reparo do DNA)
Fosfatase (regulação da expressão gênica)
Proteína ligadora ao DNA (regulação da expressão gênica0
Proteína ligadora ao DNA (regulação da expressão gênica)
Proteína ligada a estresse (serina protease)
metabólicas estão envolvidos com a
biossíntese de purinas (pur), guaninas
(gua) e parede celular (asd) (Tabela
1).
A inativação de genes envolvidos
com a regulação da expressão gênica
pode levar à atenuação de Salmonella
e de outras bactérias gram-negativas.
Esses genes, na sua maioria, são responsáveis
pela síntese de proteínas
com características de repressores e/
ou ativadores transcricionais ou podem
participar na síntese de moléculas
sinalizadoras, como o gene (cya), que
codifica para a adenilato ciclase, responsável
pela produção de AMP cíclido
(cAMP) e o gene (crp), que codifica
para proteína ligadora de cAMP. Outros
reguladores como OmpR, PhoP,
HNS e a DAM também levam à atenuação
de bactérias quando inativos (Tabela
1).
Estratégias para a expressão
de antígenos heterólogos
em linhagens vacinais
de Salmonella
Linhagens vacinais bivalentes de
Salmonella podem expressar antígenos
heterólogos após receberem genes,
sob controle de promotores bacterianos,
clonados em plasmídeos ou
inseridos no cromossoma. A grande
proximidade filogenética permite que
as técnicas de manipulação genética
desenvolvidas para a E. coli K12 possam
ser facilmente adaptadas a Salmonella.
Diversos plasmídeos de expressão,
originalmente desenvolvidos em
E. coli, são utilizados para promover a
expressão de antígenos heterólogos
em linhagens atenuadas de Salmonella.
No entanto, a expressão de antígenos
a partir de plasmídeos pode levar
à instabilidade da expressão gênica na
linhagem vacinal, com a conseqüente
perda da imunogenicidade. Uma alternativa
para minimizar esse problema
baseia-se na utilização de antibióticos
que exerça pressão seletiva para a
manutenção do plasmídeo recombinante
durante a propagação da bactéria
in vitro. Outra alternativa para controlar
a estabilidade da expressão de
antígenos por linhagens vacinais de
Salmonella emprega um sistema letal
balanceado (Curtiss III et al., 1989).
Linhagens atenuadas de Salmonella
são modificadas pela inativação do
gene asd, necessário à síntese de ácido
diaminopimélico, um componente
essencial para a formação da parede
celular bacteriana. Na ausência desse
precursor, não disponível nos tecidos
de mamíferos, a Salmonella não é
capaz de manter a integridade de seu
envoltório celular. Dessa forma, linhagens
asd- de Salmonella são transformadas
com plasmídeos que transportam
uma cópia intacta do gene asd
além do gene responsável pela síntese
do antígeno vacinal. Quando esse sistema
é combinado a linhagens atenuadas
por mutação em genes crp/cya
ou aro, a expressão do antígeno heterólogo
é estabilizada e sua imunogenicidade
no mamífero aumenta.
Uma segunda alternativa para a
estabilização da expressão gênica em
linhagens vacinais de Salmonella consiste
na inserção do gene heterólogo
no DNA cromossômico. Diferentes sistemas
genéticos permitem a inserção
de genes em sítios específicos do cromossoma
de Salmonella. Para isso,
empregam-se os chamados plasmídeos
suicidas, isto é, plasmídeos incapazes
de se replicarem na linhagem vacinal.
Quando introduzidos na Salmonella,
esses plasmídeos segregam-se e
são perdidos ou integram-se ao DNA
cromossômico da bactéria através de
um processo de recombinação por
homologia. Esses recombinantes expressam,
de forma mais estável, o
antígeno heterólogo, mas a redução na
quantidade do antígeno produzido
pode reduzir sua imunogenicidade em
relação ao sistema epissomal, isto é,
aqueles que empregam plasmídeos,
pela diminuição do número de cópias
do gene presente em cada bactéria.
Entretanto, o emprego de promotores
bacterianos ativados em condições
encontradas durante o trajeto da bactéria
pelo organismo do hospedeiro pode
aumentar muito a expressão e, conseqüentemente,
a imunogenicidade do
antígeno. O promotor do gene nirB,
ativado em condições de anaerobiose,
representa um exemplo de sistema de
expressão capaz de aumentar a estabilidade
sem o comprometimento da
24 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

Tabela 2: Alguns exemplos de vacinas bivalentes baseadas em linhagens atenuadas de Salmonella e suas propriedades
imunológicas
Antígeno heterólogo ó Doença Salmonella vacinal ® Imunogenicidade ¡ Proteção ö
I . Antígenos de natureza bacteriana
Toxina tetânica (Clostridium tetani) Tétano S. Typhimurium aro - + +
P.69/FHA/PTX-S (Bordetella pertussis) Coqueluche S. Typhimurium aro - + +
LTB/K1/K88/CFA-I (Escherichia coli) Diarréia S. Typhimurium aro - + +
28 kDa OMP (Neisseria meningitidis) Meningite S. Typhimurium aro - + ND
CTB (Vibrio cholerae) Cólera S. Typhimurium aro - + ND
S. Dublin aro - + ND
F1 (Yersinia pestis) Peste S. Typhimurium aro - + +
Proteína M (Streptococcus pyogenes) Choque Tóxico S. Typhimurium aro - + +
SpaA (S. mutans, S. sobrinus) Cárie S. Typhimurium cya - crp - + ND
Invasina (Yersinia pseudotuberculosis) Gastroenterite S. Typhimurium aro - + +
Diversos (Treponema pallidum) Sífilis S. Typhimurium aro - + ND
Diversos (Mycobacterium leprae) Lepra S. Typhimurium cya - crp - + ND
Pneumolisina (Streptococcus pneumonia) Pneumonia S. Typhimurium aro - + ND
LTB/CFA-I/CS3 (Escherichia coli) Diarréia S. Typhi aro - + ND
Antígeno O (Shigella flexneri) * Diarréia S. Typhi aro - + +
Antígeno O (Vibrio cholerae)* Cólera S. Typhi aro - + ++
II. Antígenos de natureza viral
NP (vírus influenza) Gripe S. Typhimurium aro - + +
HA (vírus influenza) Gripe S. Dublin aro - + ND
S1/S2/NP (vírus da hepatite B) Hepatite S. Typhimurium aro - + ND
S. Typhimurium cya - crp + ND
S. Dublin aro - + ND
gp120 (HIV) AIDS S. Typhimurium aro - + ND
gB1 (vírus herpes simplex) Herpes S. Typhimurium aro - + ND
Proteína G (vírus respiratório sincicial) Pneumonia S. Typhimurium aro - ND ND
III. Antígenos de natureza parasitária
SREHP (Entamoeba histolytica) Amebíase S.Typhimurium cya - crp - + +
gp63 (Leishmania major) Leishmaniose S. Typhimurium aro - + +
CSP /MSP-1 (Plasmodium berghei ,
Plasmodium yoelii) Malária murina S.Typhimurium cya - crp - + +
S. Dublin aro - + +
CSP (P.falciparum)* Malária humana S. Typhi aro - + ND
ó – Antígenos derivados de diferentes patógenos expressos em linhagens atenuadas de Salmonella;
® – Linhagem atenuada empregada nos ensaios in vivo: aro - , linhagens deficientes na síntese de compostos
aromáticos; cya - crp - , linhagens deficiente na síntese de cAMP e proteína ligadora de cAMP;
¡ – Detecção de resposta imune induzida (produção de anticorpos, atividade citotóxica, produção de citocinas,
etc.) contra os antígenos heterólogos nos animais imunizados com as linhagens vacinais de Salmonella. Ensaios
baseados em modelo murino, exceto naqueles indicados (*) nos quais foram feitos ensaios em voluntários
humanos;
ö – Animais imunizados com a linhagem vacinal foram total ou parcialmente protegidos contra desafio com o
patógeno que forneceu o antígeno heterólogo
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 25

imunogenicidade de antígenos.
A disponibilidade de técnicas de
clonagem e expressão de genes heterólogos
em Salmonella atenuada permitiu
a construção de diversas vacinas
baseadas em linhagens bivalentes que
expressam antígenos de vírus, bactérias
ou parasitos (Tabela 2). Essas vacinas
foram testadas em sua grande
maioria em modelos animais, mas, em
alguns casos, mostraram resultados
promissores também em voluntários
humanos. Embora ainda não se disponha
de uma vacina bivalente baseada
em Salmonella atenuada, tais resultados
indicam que no futuro essa abordagem
possa ser efetivamente utilizada
como alternativa profilática para várias
doenças infecciosas do homem e animais
domésticos.
Um desdobramento técnico relacionado
com a expressão de antígenos
heterólogos por linhagens atenuadas
de Salmonella envolve a fusão de
peptídeos heterólogos com proteínas
bacterianas. A utilização de peptídeos
evita que reações de auto-imunidade,
como a febre reumática, desencadeadas
por alguns antígenos de natureza
microbiana possam ser eliminadas sem
o comprometimento da capacidade
de indução de resposta imunológica
protetora. A fusão genética de peptídeos,
com 10 a 20 aminoácidos, com
proteínas bacterianas representa uma
alternativa simples e econômica para
as vacinas baseadas em peptídeos sintéticos.
O acoplamento genético do
peptídeo heterólogo com uma proteína
de Salmonella também pode atuar
como um adjuvante natural e permite
a administração pela via oral. Entre as
proteínas de Salmonella mais utilizadas
para a expressão de peptídeos
heterólogos destaca-se a flagelina, subunidade
estrutural do flagelo bacteriano
(Figura 1). Esse modelo, inicialmente
desenvolvido pela pesquisadora
brasileira Salete Newton, permite
que milhares de cópias do peptídeo de
interesse sejam expressas na superfície
da Salmonella em forma de flagelos,
que permanecem, em geral, funcionais
(Newton & Stocker, 1989).
Linhagens atenuadas de Salmonella
também podem ser utilizadas como
veículos para vacinas de DNA. Nesse
sistema, a Salmonella atenuada não se
encarrega de expressar o antígeno
codificado, mas transporta a mensagem
genética que irá transfectar as células de
defesa do hospedeiro (Lásaro e Ferreira,
2000).
A pesquisa de linhagens vacinais
de Salmonella no Brasil
A contribuição brasileira para a pesquisa
de vacinas baseadas em Salmonella
é significativa. Além do modelo de
expressão de peptídeos fusionados à
flagelina de Salmonella, outros grupos
em universidades e institutos de pesquisa
testam linhagens atenuadas como
estratégia vacinal bivalente. Nosso grupo
desenvolve pesquisas voltadas para
a construção de vacinas bivalentes baseadas
em S. Typhimurium aroA, capazes
de expressar uma proteína envolvida na
colonização do epitélio intestinal pela
Escherichia coli enterotoxigênica
(ETEC), o principal agente etiológico da
diarréia dos viajantes. Os resultados obtidos
até o momento atestam o potencial
dessa abordagem e abrem perspectivas
para o desenvolvimento de novas
vacinas orais para controle de patógenos
entéricos (Guillobel et al., 2000;
Lásaro e Ferreira, 2000; Simões e Ferreira,
2001).
Conclusões e perspectivas
Nos últimos anos, presenciamos um
significativo progresso no uso experimental
de linhagens vacinais de Salmonella
como estratégia vacinal bivalente.
Atualmente o conhecimento sobre a
patogênese bacteriana e o aprimoramento
de técnicas relacionadas com a
manipulação genética de microrganismos
permite que se criem, em curto
espaço de tempo, linhagens vacinais
seguras e eficazes. Além disso, as facilidades
de produção, armazenamento e
administração tornam essa estratégia uma
alternativa vacinal interessante, sobretudo
para países em desenvolvimento.
Acreditamos que a formação de competência
técnica e científica para geração
e uso de linhagens vacinais de Salmonella
poderá contribuir para a melhoria das
condições de saúde de nossa população.
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26 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

UNISCIENSE
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 27

Pesquisa
Novos moduladores da formação de
VASOS SANGUÍNEOS
Fotos e ilustrações cedidas pelos autores
Na regulação de processos de angiogênese, novas abordagens em patologia e terapêutica
Paulo Fernando Dias
Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, CCB
Professor do Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética - CCB
Universidade Federal de Santa Catarina.
paulus@mbox1.ufsc.br
Rosa Maria Ribeiro-do-Valle
Prof. Dra. do Departamento de Farmacologia - CCB
Universidade Federal de Santa Catarina.
Renata dos Passos Maraschim
Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, CCA
Universidade Federal de Santa Catarina.
Marcelo Maraschim
Prof, Dr. do Departamento de Fitotecnia - CCA
Universidade Federal de Santa Catarina.
28 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002
o organismo humano, os vasos sangüíneos integram
uma rede de 50 km de tubos responsáveis
pelo fluxo do sangue e pela perfusão tecidual nos
diversos sistemas (Fig. 1). Os vasos estão organizados
em uma monocamada de células endoteliais,
revestidos por moléculas de colágeno, elastina, glicoproteínas
e proteoglicanas - matriz extracelular - e células com
função de suporte (Koch,1998).
Novos vasos sanguíneos são formados quando as células
endoteliais e as células musculares lisas - que formam o
revestimento interno e externo dos vasos - crescem em
resposta a fatores ou sinais específicos. Esse processo fisiológico,
conhecido como angiogênese, pode sofrer alterações e
desencadear muitas doenças, como a
psoríase, a cegueira na diabetes, a artrite
e o câncer.
O entendimento dos mecanismos celulares
envolvidos na vascularização lança
perspectivas sobre a promoção do
crescimento vascular no restabelecimento
do tecido isquêmico, e o bloqueio do
crescimento de vasos para conter o avanço
de patologias, como o câncer (Jain e
Carmeliet, 2001).
Em condições normais, as células endoteliais
proliferam em um ritmo muito
lento, apresentando longevidade acentuada.
No organismo adulto somente
0,01% das células endoteliais encontramse
normalmente em processo de divisão,
um valor bastante diferente daquele observado
no epitélio intestinal, onde, aproximadamente,
14% das células encontram-se em processo
mitótico (Hanahan e Folkman, 1996).
Nem sempre as células endoteliais mostram um percentual
de divisão celular tão reduzido. No decorrer do
período embrionário, entre 3,5 e 8 semanas do desenvolvimento
humano, o sistema cardiovascular é um dos
primeiros sistemas a se estabelecer. Nessa fase, as células
são mobilizadas em intensos movimentos morfogenéticos
integrados no tempo e no espaço para criar progressivamente
a forma do corpo. A migração celular nesse período
assemelha-se muito mais ao intenso tráfego nas autopistas
de uma metrópole, que ao trânsito pacato e organizado de
uma cidadezinha de interior. Durante aqueles eventos, que
Figura 1 - Esquema mostrando a estrutura da parede vascular, onde a
monocamada de células endoteliais limita internamente o vaso sanguíneo,
separando o leito vascular da estrutura externa de suporte

Figura 2 - A remodelagem dos vasos sanguíneos possibilita a transição da
rede de vasos primordiais típica do período de vasculogênese para a estrutura
vascular definitiva resultante do processo de angiogênese; A- Estabilização
das células endoteliais; B- Perda da adesão celular e desestabilização
do vaso; C- Crescimento ou regressão vascular (Adaptado de Yancopoulos
e col., 2000)
envolvem diversos níveis de comunicação
célula - célula, incluindo as interações
entre diferentes linhagens celulares,
o endotélio constitui o arcabouço
em torno do qual o coração, as artérias,
veias e capilares organizam-se para
levar oxigênio e nutrientes a tecidos
cada vez mais complexos e menos
acessíveis (Carlson, 1996).
O processo de desenvolvimento
tissular implica concomitante o aumento
na demanda de oxigênio. Em
resposta à ocorrência de regiões de
hipóxia, os tecidos secretam sinais que
estimulam os mecanismos de proliferação,
migração e diferenciação de
células endoteliais, o que resulta no
surgimento de vasos sanguíneos, ou
no rápido crescimento dos vasos préexistentes,
processos denominados de
vasculogênese e angiogênese, respectivamente
(Tobelem, 1990).
Na vasculogênese, precursores das
células endoteliais, denominados angioblastos,
surgem no mesoderma da
vesícula vitelínica. Os angioblastos organizam-se
em agregados celulares ou
ilhotas sanguíneas, diferenciando-se em
uma rede vascular primordial, onde os
canais endoteliais apresentam tamanho
relativamente uniforme. Posteriormente,
durante a angiogênese, ocorre
uma remodelagem da vascularização
primária e novos capilares surgem
a partir dos vasos primordiais, organizando
uma rede vascular estável e
complexa, com vasos sanguíneos de
tamanhos diferentes. A remodelagem
vascular envolve tanto o crescimento
como a regressão de vasos, eventos
fisiológicos importantes principalmente
na infância, durante o crescimento
de tecidos e órgãos dos diferentes
sistemas orgânicos. A remodelagem
seguida do crescimento vascular também
está presente no adulto, por exemplo,
no crescimento dos cabelos, no
reparo do tecido lesionado (cicatrização)
e no ciclo reprodutivo feminino -
vascularização nos ovários, vias genitais,
glândulas mamárias e na organização
da placenta (Jones e col., 2001).
No organismo do adulto, a vascularização
normalmente estável pode ser
reativada por diversos fatores angiogênicos
e desencadear a formação de
vasos sanguíneos (neovascularização).
Perturbações no delicado equilíbrio
entre o crescimento e a regressão dos
vasos existentes no organismo adulto
podem contribuir para o desenvolvimento
de diversos processos patológicos.
O crescimento de tumores, por
exemplo, depende da neovascularização,
induzida direta ou indiretamente
pelas próprias células tumorais, durante
a transição entre os estágios de
hiperplasia para neoplasia, a exemplo
dos hemangiomas - tumores vasculares
comuns e incapacitantes (Carmeliet
e Jain, 2000).
A angiogênese prolongada e acentuada
também está relacionada com
muitas outras patologias, entre as quais,
desordens inflamatórias, a endometriose
- crescimento do tecido endometrial
na cavidade peritonial, as retinopatias
- neovascularização do olho e
cegueira em quadros de diabetes, a
artrite reumatóide - condição inflamatória
na qual capilares sanguíneos invadem
e destroem a cartilagem das articulações
e a psoríase - doença inflamatória
da pele, onde as lesões são caracterizadas
pelo aumento do calibre e do
comprimento de vasos presentes na
derme (Solimene e col., 1999).
Modelo emergente de formação
de vasos sanguíneos
A ocorrência de eventuais falhas ou
interferências na sinalização responsável
pela estabilização das células endoteliais
normalmente sujeita-as a uma
terceira alternativa: a morte celular
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 29

Figura 3 - Representação da migração celular - evento dependente da
atividade do citoesqueleto, do reconhecimento de sinais quimiotáticos e
da adesão ao substrato - uma jornada das células no tempo e no espaço
de sua própria diferenciação
(apoptose) com a conseqüente regressão
dos vasos sanguíneos. As moléculas
sinalizadoras, de natureza pró e anti
angiogênica, viabilizam um equilíbrio
dinâmico necessário à manutenção do
sistema biológico. Esse equilíbrio está
baseado na coexistência desses sinais
angiogênicos e angiostáticos em concentrações
estritamente controladas,
interagindo por sua vez com mediadores
e receptores membranais e intracelulares,
através dos quais, as células
interagem em seu microcosmo (Melino,
2001).
Independência e morte
O processo de remodelagem angiogênica
é um evento decisivo na vascularização,
pois a interação entre os fatores
angiogênicos e angiostáticos presentes
pode determinar a estabilização
da rede vascular, ou acarretar a regressão
de vasos sanguíneos (Jones e col.,
2001).
A estabilização dos vasos sanguíneos
é uma condição em que células
suporte periendoteliais são recrutadas
para a parede do vaso e a matriz extracelular
endotelial é reconstituída. Na
ausência de contato com as células
suporte e a matriz extracelular, os vasos
sanguíneos tornam-se desprotegidos e
sujeitos à regressão (Fig. 2A). Para as
células endoteliais a regressão implica
uma forma de apoptose ou anoikis -
indução de morte celular programada,
ocasionada pelo desligamento das células
de seu suporte na matriz extracelular
(Lockshin e Zakeri, 2001).
A redução na adesão celular, durante
o processo de remodelagem, também
é imprescindível na fase de crescimento
dos vasos - a ramificação angiogênica
-, pois as células se tornam mais
acessíveis aos fatores de crescimento
vascular (Fig. 2B). Paradoxalmente, as
células têm sua susceptibilidade à morte
- a regressão dos vasos sanguíneos
aumentada.
Durante o crescimento dos vasos,
as células endoteliais encontram-se diante
de duas opções normalmente
incompatíveis - a divisão celular (mitose)
ou a migração e diferenciação celular.
No transcorrer do processo de
migração celular, as reações químicas
entre as moléculas presentes na membrana
citoplasmática viabilizam contatos
pontuais e transitórios das células
com moléculas de adesão e de reconhecimento
presentes no ambiente
(Yamada, 1991). Ao mover-se, a célula
endotelial entra em contato com “uma
nova vizinhança”, onde as moléculas
de adesão celular desempenham um
papel comparável a um código vital de
endereçamento postal, sem o qual a
célula estaria literalmente perdida
(Fig.3). Essa sinalização orienta as células
endoteliais de modo que se reúnam
para formarem vasos.
Morfogênese de vasos
sanguíneos: Destruir
para construir?
Se eventuais falhas na sinalização
responsável pela estabilização das células
endoteliais podem sujeitá-las à
morte (apoptose) e desencadear a
regressão dos vasos sanguíneos), esse
processo constitui uma alternativa à
divisão (mitose) e à especialização
celular (diferenciação) (Fig. 2C).
Emerge a perspectiva de que a
estabilidade dos vasos é mantida às
expensas de sinais voltados não só
para a sobrevivência, como também
para a morte das células endoteliais.
Tal fato implica que, para sobreviver,
tanto as células, individualmente como
os vasos sanguíneos, devem estar aptos
a resistir constantemente a inúmeros
sinais de morte.
É possível considerar que a morte
faça parte da vida desde cedo. Evidência
disso é que se as mitoses ocorressem
sem a intervenção de processos
de apoptose, uma pessoa de 80 anos
de idade poderia acumular até duas
toneladas de medula óssea e linfonodos,
ou desenvolver um intestino com
mais de 15 km de comprimento (Melino,
2001).
O desenvolvimento de vasos sanguíneos,
sob o controle de fatores pró
e anti angiogênicos em equilíbrio dinâmico,
depende essencialmente de
adesões focais. Esses processos de
adesão celular mediados por integrinas
possibilitam uma comunicação bidirecional
entre a matriz extracelular e o
citoesqueleto, durante os eventos de
proliferação, migração, diferenciação e
morte celular (Geiger e col., 2001).
Célula vascular endotelial -
"Megalópole" de sinais e
receptores
Parte integrante da matriz extracelular,
moléculas de proteoglicanas,
como o sulfato de heparana, têm participação
relevante nos processos de
morfogênese e de organogênese. Essas
macromoléculas podem atuar como
um “reservatório” para fatores de crescimento
pró-angiogênicos, como o
bFGF (fator de crescimento de fibroblastos
básico), os quais, quando “resgatados”
da matriz, podem estimular o
processo de diferenciação das células
endoteliais (Katz e Yamada, 1997).
O fator de crescimento de fibroblastos
básico (bFGF ou FGF-2; PM =
18 KDa), embora não possua especificidade
para o endotélio, atua efetivamente
no crescimento endotelial in
vitro e é capaz de induzir, em quantidade
nanograma, a angiogênese in
vivo (Tobelem, 1990).
Estudos sugerem que o bFGF estimula
mitoses nas células vasculares
endoteliais através de um mecanismo
que envolve a formação intracelular de
ácido araquidônico e a formação de
eicosanóides (Fafeur e col.,1991; Friesel
e Maciag, 1995).
Até recentemente o fator de crescimento
vascular endotelial (VEGF) era
considerado o único fator específico
para a formação de vasos sanguíneos,
mas novos fatores de crescimento polipeptídicos
vêm sendo identificados.
Além de cinco membros da família
30 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

Figura 4 - Sinalização na célula endotelial - tipos de sinais e receptores; adesão célula
- célula mediada por cálcio; adesão focal ao citoesqueleto e à matriz extracelular; bloqueio
à proliferação e à apoptose - estímulos para a sobrevivência e a migração celular
(Baseado em Jones e col., 2001)
VEGF - VEGF-A, VEGF-B,
VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E
e PLGF (fator de crescimento
placentário), estão incluídos
entre os fatores angiogênicos
quatro membros da
família Ang - angiopoietinas
1, 2, 3 e 4 - e ao menos um
membro da família Eph -
efrinas A1, B1 e B2. A exemplo
da família FGF, outros
fatores não específicos para
o sistema vascular estão envolvidos
nos processos de
vascularização, como membros
das famílias PDGF -
fator de crescimento derivado
de plaquetas e de fatores
de transcrição (Yancopoulos,
2000).
No complexo jogo de
processos celulares que resultam
na formação de vasos
sanguíneos funcionais, o
time de fatores angiogênicos
atua de modo integrado,
sendo controlado a partir
de receptores de membrana.
Os receptores dos
fatores de crescimento vascular
endotelial - VEGF (VE-
GFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-
3) e de angiopoietinas - Ang
(Tie1, Tie2, Tie3 e Tie4) compreendem
uma classe de moléculas relacionadas
com a enzima quinase de tirosina,
cuja ativação elicita uma resposta
de transdução do sinal angiogênico,
através de sucessivas reações de fosforilação.
Nesses dois casos, a ligação de
um sinal ao seu sítio de ativação faz
com que os receptores organizem-se
em dímeros (Gale e Yancopoulos,
1999)
Embora existam 4 subtipos de receptores
Tie, todas as angiopoietinas
ligam-se primariamente ao receptor
Tie2, permanecendo sem identificação
qualquer ligante para Tie1. Ang1 e
Ang4 são agonistas de Tie2, enquanto
ang2 e ang3 comportam-se como seus
antagonistas competitivos (Fig. 4.1).
O VEGF foi inicialmente chamado
de fator de permeabilidade vascular,
em face da sua habilidade em promover
o aumento da permeabilidade e da
proliferação entre as células endoteliais
(Jones e col., 2001). Atualmente, o
VEGF é considerado um fator preponderante
na formação de vasos, tanto no
período de vasculogênese como no de
angiogênese, quando também são requeridos
os sinais Ang1 ou Ang4 e Eph-
B2, na tarefa de remodelagem e estabilização
da vascularização imatura inicial
(Fig. 2A).
O receptor VEGFR-2 parece mediar
a maior parte das respostas angiogênicas
- inicialização, alongamento e
permeabilidade de vasos sanguíneos -
do VEGF-A, enquanto o VEGFR-1 exerceria
apenas uma função moduladora
no processo, principalmente seqüestrando
o sinal ligante (VEGF) sem,
efetivar uma resposta positiva na vascularização.
Na remodelagem vascular, as ligações
entre Ang1 e o receptor Tie2
maximizam as interações entre células
endoteliais, matriz extracelular e células
suporte sendo fundamentais para o
redimensionamento do tamanho dos
vasos e a manutenção de sua estabilidade.
A discriminação no desenvolvimento
de artérias e veias é mediada
pela sinalização de efrina-B2, que está
diretamente relacionada com a diferenciação
de vasos arteriais primordiais,
e de efrina-B4, que sinaliza para a
formação de vasos venosos (Witzenbichler
e col., 1998; Thurston e Yancopoulos,
2001).
Estudos utilizando embriões de ratos
demonstram a crítica relação existente
entre a sinalização mediada pelos
receptores VEGFR-2 e Tie2. Mutação
envolvendo um único alelo do
gene VEGF é suficiente para causar
mortalidade embrionária, devido a severas
anormalidades vasculares (Yancopoulos,
e col., 2000). Na ausência da
ligação entre Ang1 e o receptor Tie2,
as células endoteliais falham em associar-se
com as células suporte, sendo
que embriões destituídos da via de
sinalização do receptor Tie2, por exemplo,
morrem entre o 9 º e 13 º dias do
período embrionário como conseqüência
da falta, tanto de expansão como
de estabilidade do plexo vascular primário.
Esses embriões mutantes também
apresentam graves anomalias
cardíacas (Miquerol e col., 2000).
No adulto, falhas na sinalização exercida
por Ang1, devido à ação de antagonistas
competitivos de Ang1, tal como
a Ang 2, coincidem com o reinício da
remodelagem vascular periódica verificada
no ciclo reprodutivo feminino e
também em processos de vasculariza-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 31

Figura 5 - Aspecto geral dos vasos sanguíneos na vasculogênese (A) e na
angiogênese (B), característicos das membranas vitelínica e corioalantóica
(corioalantoic membrane - CAM) de embriões de galinha (em). Enquanto a
membrana vitelínica organiza-se já no primeiro dia de incubação do ovo, a
CAM, formada na fusão de dois outros anexos - cório e alantóide (al), sofre
intensa vascularização entre o 4º e o 8º dia do desenvolvimento embrionário
da espécie
ção anormal (neovascularização).
Durante o processo de remodelagem
vascular, o destino dos vasos
depende fundamentalmente da disponibilidade
de VEGF. Na presença
desse fator, os vasos iniciam processo
de crescimento, recapitulando a atividade
angiogênica em taxa similar à do
desenvolvimento embrionário, enquanto
na ausência de VEGF, as células,
destituídas de adesão, entram em apoptose
e os vasos conseqüentemente
regridem - Fig. 2C (Bergers e col.,
1998).
Promovendo a formação de
vasos: Estímulo contínuo
para a sobrevivência
A adesão celular envolve a participação
de moléculas, tais como as caderinas,
integrinas e selectinas (Wagener
e Ergün, 2000).
Caderinas vasculares endoteliais, localizadas
em junções aderentes, constituem
uma barreira entre células endoteliais
vizinhas, que é mediada por
interações dependentes do cálcio (Fig.
4.2). As caderinas estão conectadas a
um complexo de proteínas ligadas ao
citoesqueleto e também comunicamse
com o receptor VEGFR-2 (Fig. 4.3).
A sinalização, a partir do VEGFR-2, é
uma das principais responsáveis pela
sobrevivência da célula endotelial, através
das reações de fosforilação envolvendo
a proteína quinase B - PKB ou
Akt - e a quinase lipídica fosfatidilinositol-3-hidroxi
quinase - PI-3-K (Fig.
4.4).
As integrinas são proteínas diméricas
que atravessam a membrana e
emergem na superfície celular, onde
atuam em contatos célula-célula, através
de interações com a matriz extracelular
ou com a lâmina basal - malha
de colágeno tipo IV, glicoproteínas e
proteoglicanas. A ligação entre integrinas
e matriz extracelular ou lâmina
basal, leva à ativação de moléculas
localizadas no meio intracelular denominadas
quinases de adesão focal -
FAK (Fig. 4.5). Essas proteínas quinases,
situadas nas proximidades da membrana,
compõem a estrutura interna da
adesão ao substrato (Koch e col., 1995).
Sobrevivência
dependente da adesão
Uma vez ativadas, as FAK reagem
recrutando outras proteínas quinases
citoplasmáticas, como as tirosinas quinases
citoplasmáticas, referidas como
“SRC” - que sinergisticamente reagem
fosforilando outros sítios de FAK. Esse
tipo de ativação e reação recíproca
entre FAK e SRC leva ao recrutamento
de outras moléculas acopladoras. Algumas
das moléculas recrutadas nesse
processo são a Sos, a PI-3-K, a CAS e as
paxilinas. O acoplamento dessas móleculas
incrementa a adesão focal à medida
em que se reflete em ativação ainda mais
efetiva das FAK, otimizando o estímulo
de sobrevivência da célula por meio da
fosforilação e ativação de Akt (Fig. 4.6).
A subunidade regulatória p85 da PI-3-
K associa-se com os receptores fosforilados
Tie2 e VEGFR-2, provavelmente
através de um resíduo da proteína tirosina
quinase 1100, resultando também em
ativação de Akt. Por sua vez, a ativação
de Akt leva à fosforilação da NO sintase
endotelial. Como um antídoto para a
morte celular, o óxido nítrico (NO) inativa
proteínas pró-apoptóticas como Bad
e Caspase-9 e pode ativar, nas células
endoteliais, proteínas que inibem a apoptose,
como a survivina - Fig. 4.7 (Blume-
Jensen e Hunter, 2001).
A migração das células
endoteliais
Durante a ramificação angiogênica, o
estímulo à migração desencadeado pelos
fatores angiogênicos implica alterações
marcantes na arquitetura da células
endoteliais. O citoesqueleto é mobilizado
e ocorre secreção de enzimas proteolíticas,
metaloproteinases que degradam
a matriz extracelular permitindo
assim, mobilidade celular para efetivação
do processo morfogenético de tubulogênese
(Fig. 4.8) (Brentani, 1992).
Na migração celular, além dos receptores
Tie2 e das proteínas FAK, um
número significativo de moléculas acopladoras,
tais como Nck e Dok-R, são
implicadas na transdução de sinais para
as proteínas contráteis do citoesqueleto
(Fig. 4.9). Atuando de modo integrado,
essas moléculas são responsáveis por
uma economia de energia. O recrutamento
de proteínas Dok-R para o receptor
Tie2, dessensibiliza proteínas quinases
- mitógeno ativadas, bloqueando as
mitoses durante o processo de migração
celular (Fig. 4.10). Para as células endoteliais,
reproduzir-se e, concomitantemente,
viajar parecem ser atividades
incompatíveis (Jones e Dumont, 1999).
Bloqueando a formação
de vasos: Regulação de
receptores por fosfatases
As enzimas fosfatases anulam o trabalho
de proteínas quinases e podem assim
modular a atividade de receptores angiogênicos
como VEGFR-2 e Tie2. Uma
32 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

classe de receptores com atividade fosfatase
específica de célula endotelial,
denominada fosfatase de proteína tirosina
vascular endotelial (VE-PTP) associase
à Tie2, e exibe igual nível de afinidade
por Ang1. Desse modo, angiopoietinas
poderiam ligar-se simultaneamente
à Tie2 e VE-PTP, promovendo a formação
de heterodímeros - compostos pelos
dois receptores atípicos - na superfície
da célula endotelial. Conseqüentemente,
VE-PTP bloquearia a formação
dos dímeros de Tie2 e a sua subseqüente
fosforilação, tornando-os funcionalmente
inativos (Fachinger e col., 1999).
O texto bíblico provê uma interessante
metáfora sobre a realidade da
regulação de receptores vasculares endoteliais.
Dalila ao cortar os cabelos de
Sansão, destituiu-o da fonte de sua força
sobre-humana. Então, traído pela ação
da amante, Sansão é subjugado e preso
pelos inimigos. Tal como ocorreu com
Sansão, o receptor Tie1 é proteoliticamente
clivado, em resposta à “ação de
Dalila” por parte do VEGF sobre o seu
receptor. Os “longos cabelos” em questão
- um domínio protéico extracelular
Tie1 - são removidos e o fragmento
Tie1 remanescente - composto dos
domínios transmembranais e intracelulares
- permanece assim por várias horas,
sendo quimicamente seqüestrado
na associação com outras proteínas, a
exemplo de outra fosfatase denominada
Shp2 (Marron e col., 2000).
Fronteiras entre a formação e a
regressão de vasos sanguíneos
O fator de crescimento vascular endotelial
estimula o crescimento de vasos
sanguíneos em diversos tecidos e órgãos,
como a retina, ovários, articulações
e os neurônios motores na medula
espinhal. Assim, a inibição terapêutica
de VEGF poderia bloquear o crescimento
de tumores no ovário, mas também
elevaria o risco de doenças cardíacas e
de degeneração de neurônios motores
no sistema nervoso central. Por outro
lado, a liberação de um fator angiogênico
inespecífico quanto ao tecido, como
o VEGF, com o objetivo de estimular a
formação de novos vasos no coração
isquêmico, incrementaria o risco de ocorrência
de câncer e de cegueira (Carmeliet,
2001).
As células dependem basicamente
de oxigênio e nutrientes, entretanto,
existem outras necessidades, consideradas
tecido-específicas. No sistema vascular,
além dos sinais inespecíficos que
modulam a formação de vasos nos
tecidos de um modo geral, moléculas
angiogênicas tecido-específicas começam
a ser identificadas e isoladas, a
exemplo do fator de crescimento vascular
endotelial derivado de glândula
endócrina (Endocrine gland-vascular
endothelial growth factor - EG-VEGF).
Enquanto nas glândulas endócrinas os
vasos sanguíneos possuem paredes
finas e poros - fenestrações - através
das quais os hormônios produzidos
podem entrar na corrente sanguínea,
uma condição oposta tem lugar no
cérebro, onde as células endoteliais
diferem por não apresentarem fenestrações,
sendo revestidas por uma camada
espessa de células de suporte,
que impede a entrada de moléculas
potencialmente tóxicas no sistema
nervoso central (LeCouter e col., 2001).
Tal como o FGF e o VEGF, inúmeros
fatores de crescimento podem regular
fisiologicamente os processos de
formação de vasos sanguíneos. Numerosas
substâncias antiangiogênicas endógenas
e exógenas têm sido reportadas
na literatura, entre as quais, corticosteróides,
fatores derivados de cartilagem,
fator plaquetário 4 (PF- 4),
angiostatina - um fragmento de plasminogênio,
inibidores de metaloproteinases,
talidomida - analgésico e inibidor
de fator de necrose tumoral (TNFα)
e antagonistas de hormônios estrogênios,
tais como tamoxifeno, clomifeno
e raloxifeno (Woltering e col., 1991;
Gagliardi e col., 1996; Gagliardi e Collins,
1993; Jordan, 1998).
Produtos naturais vêm contribuindo
sobremaneira para a descoberta de
novas drogas de interesse para a saúde
humana (Calixto e col., 1997). Paper e
col. (1997) reportaram que um complexo
de peptideoglicana-polissacarídeo
sulfatado, extraído de bactérias do
gênero Arthrobacter, denominado tecogalan-sódio,
inibiu a angiogênese.
Igual efeito foi obtido a partir de oligossacarídeos,
polipeptídeos e peptideoglicanas
extraídos de parede celular de
vegetais, como o Rhodococus sp (Nocardiaceae),
de derivados de fungos
(fumagilinas), como o TNP-470, metabólitos
secundários de plantas, como o
diterpenóide taxol e de compostos
presentes em vinhos tintos (Dordunoo
e col., 1995; Nicolaou e col., 1996; Jang
e col., 1997; Frémont, 2000; Qiu e col.,
2000).
Polissacarídeos obtidos de algas marinhas,
como o gênero Sargassum (Duarte
et col., 2001), estão sendo avaliados
quanto à estrutura química e a ação
biológica sobre o sistema vascular
(Noda, 1989; De Vries e Beant, 1995;
König e Wright, 1995; Maraschin e col.,
2000; Dias e col., 2001). Resultados
preliminares indicam que embriões de
galinha expostos a polissacarídeos de
alto peso molecular daquela espécie
sofreram inibição nos processos de
vasculogênese e angiogênese no período
de 2 a 8 dias do desenvolvimento
(Fig. 5).
O entendimento dos processos de
formação de vasos sanguíneos e o
reconhecimento de particularidades de
sua estrutura nos diversos sistemas do
organismo conferem suporte à abordagem
das patologias relacionadas com o
bloqueio ou com o estímulo da formação
de vasos. Os resultados sobre a
ação moduladora da angiogênese, obtidos
a partir de princípios naturais,
ampliam os horizontes dos tratamentos
e as perspectivas biotectnológicas
sobre a atividade e a estrutura química
de novos compostos.
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UNISCIENSE
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 35

APOMIXIA
Pesquisa
Vera Tavares de Campos Carneiro
Doutora em Biologia Celular e Molecular Vegetais – Universidade de Paris XI
Pesquisadora da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Bolsista de Produtividade em Pesquisa - CNPq
vera@cenargen.embrapa.br
Diva Maria de Alencar Dusi
Doutora em Biologia Celular e Molecular Vegetais – Universidade de Wageningen
Pesquisadora da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
diva@cenargen.embrapa.br
Fotos cedidas pelas autoras
Em busca de tecnologias de clonagem de plantas por sementes
Figura 1. Ovários de flores de Brachiaria
decumbens. A, parte interna do óvulo de planta
sexual observada por microscopia de varredura.
Nota-se que existe apenas uma cavidade que
corresponde a um único saco embrionário meiótico.
B, ovário clarificado por metil salicilato, mostrando
um único saco embrionário meiótico. Note a
presença de antípodas (an). C, microscopia de
varredura da parte interna do óvulo de planta
apomítica, mostrando 4 sacos embrionários (1-4).
D, ovário clarificado por metil salicilato, mostrando
4 sacos embrionários apospóricos (1-4). Barra = 100
µm para todas as figuras
célebre trabalho de pesquisa
de Gregor Mendel
(1822-1884) com plantas de
Pisum é considerado o fundamento
da Genética. Utilizando
uma metodologia experimental
rigorosa na realização de cruzamentos e
observando as características das plantas
na progênie como altura, cor e formato
das sementes, cor das flores etc., ele
enunciou os princípios da hereditariedade.
Mendel concluiu que as características
genéticas estão contidas em unidades
que existem aos pares nos indivíduos;
quando duas delas, responsáveis por
uma única característica, estão presentes
em um indivíduo, uma é dominante
sobre a outra e, na formação dos gametas,
as unidades pareadas
se separam e se
segregam individualmente
de maneira aleatória,
de modo que
cada gameta recebe
uma delas. Na busca
de mais material para
dar suporte às suas deduções,
Mendel executou
cruzamentos no
gênero Hieracium. No
entanto, encontrou
muita dificuldade em
repetir os resultados
obtidos com Pisum. Na
progênie dos cruzamentos,
muitas plantas
pareciam oriundas de
auto-fecundação, sem
haver transmissão das
características paternas,
fato esse intrigante, pois
seus métodos criteriosos
envolviam emasculações.
Este trabalho
fez com que ele mesmo
duvidasse da validade
de seus resultados
com Pisum. Mendel
não sabia que estava
diante de plantas
que se reproduzem por apomixia (Asker
e Jerling, 1992; Nogler, 1994).
Apomixia é o modo de reprodução
assexual através de sementes, que
ocorre em mais de 300 espécies de 35
famílias de angiospermas (Hanna and
Bashaw, 1987). É um processo que acontece
apenas na parte feminina da flor, o
ovário, mais especificamente no óvulo,
e, portanto, tem uma forte conexão com
a via de reprodução sexual. Na reprodução
sexual, as divisões meióticas promovem
uma redução no número de cromossomos
para formar um gametófito
reduzido. Os embriões são formados
após a fertilização com a fusão dos
gametas masculino e feminino e, portanto,
carregam uma cópia do conjunto de
cromossomos de cada progenitor. No
desenvolvimento apomítico, a meiose,
característica da reprodução sexual, não
ocorre ou não é funcional. Desse modo,
a oosfera contém o mesmo número de
cromossomos somáticos maternos, não
ocorre fusão de gametas durante a fertilização
e o desenvolvimento do embrião
é autônomo, gerando, portanto, uma
planta idêntica à planta-mãe.
Importância da apomixia
na agricultura
Embora, em geral, as plantas apomíticas
não sejam cultivadas, algumas espécies
têm alto valor econômico e agronômico
como é o caso das gramíneas.
Essas plantas só podem ser usadas na
fecundação de plantas sexuais, ou seja,
como doadoras de pólen. Além disso, a
diferença de ploidia existente entre plantas
sexuais e apomíticas impede os cru-
36 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

Tabela1: Métodos utilizados para detecção de apomixia
Indicadores de Apomixia
Método de detecção
Referências
- Alto nível de polimorfismo
morfológico em populações
selvagens.
-Progênie uniforme obtida de
sementes de uma única planta.
-Ausência de variabilidade genética
em F1 e F2.
-Alto grau de poliploidia.
-Produção de múltiplos embriões.
-Ausência em diplospóricos ou
distúrbio em apospóricos na
deposição de calose em paredes
de células-mãe do megásporo,
díades, tétrades.
- Distúrbios na meiose
- Grau variável de aborto e
esterilidade do grão de pólen.
-Ausência de antípodas e presença
de múltiplos sacos embrionários
apospóricos.
- Observação em locais de ocorrência
natural das espécies.
- Teste de progênie com sementes de
plantas de polinização aberta.
- Cruzamentos entre plantas com
características distintas.
- Análise citogenética com contagem de
cromossomos de ponta de raiz ou
citometria de fluxo.
- Observações citológicas com técnicas de
clareamento ou secção de ovários.
- Análises citológicas de ovários frescos ou
fixados e corados com azul de anilina e
observação com o uso de microscópio de
fluorescência.
-Análise citogenética da divisão meiótica.
-Análise histoquímica e teste de
germinação do grão de pólen.
- Análises citológicas de pistilos e ovários
por clareamento ou por secções
histológicas.
Berthaud, 2001.
Miles e Valle, 1996.
Miles e Valle, 1991.
Carman, 1997; Penteado et al., 2000.
Lakshmanan e Ambegaokar, 1984;
Vielle et al,. 1995.
Naumova et al., 1993; Naumova e
Willemse, 1995; Peel et al. 1997; Dusi
e Willemse 1999.
Quarin, 1980; Valle, 1986.
Asker e Jerling, 1992; Dusi e Willemse,
1999.
Young et al., 1979.
zamentos. Apesar disso, sendo a apomixia
uma característica controlada por um
só fator genético (Savidan 2000), existe a
possibilidade de ela ser manipulada tanto
por técnicas convencionais de melhoramento
quanto por técnicas de engenharia
genética.
Com o avanço da biotecnologia e a
possibilidade de se transferirem genes
entre plantas, independentemente da
compatibilidade sexual, o interesse nesse
modo de reprodução foi despertado.
A combinação da apomixia com a reprodução
sexual terá aplicação direta na
produção de sementes.
De fato, as vantagens do uso de
sementes apomíticas em culturas onde a
apomixia não ocorre são inúmeras e já
foram discutidas por muitos autores (Hanna
e Bashaw, 1987; Asker e Jerling, 1992).
O uso controlado da apomixia na agricultura
permitirá fixar genótipos de elite
e híbridos de qualidade e propagá-los
por sementes. Essa característica poderá
trazer muitos benefícios como:
- possibilidade de propagar e
armazenar por sementes culturas
que são propagadas por
tubérculos, rizomas ou estacas.
- produção de sementes por pequenos
produtores por um
número infinito de gerações;
- simplificação da produção comercial
de sementes híbridas
com conseqüente queda no
custo total de produção de
sementes;
- simplificação dos programas
de melhoramento com conseqüente
aumento no número
de cultivares adaptados em
cada local.
A amplitude do potencial de aplicação
da apomixia em qualquer tipo de
cultura, desde herbáceas até lenhosas,
de anuais a perenes, aumentou o interesse
mundial em entender como ocorre
esse processo. Análises celulares e
moleculares da apomixia vêm sendo
realizadas em diferentes espécies e com
uso de diferentes técnicas, com vistas a
conhecer seu mecanismo.
A apomixia é resultado de um dos
três mecanismos: embrionia adventícia,
diplosporia ou aposporia.
Na embrionia adventícia, células
somáticas, portanto, não reduzidas, do
nucelo ou do tegumento interno do
óvulo originam um embrião diretamente
(Nogler 1984). A formação do embrião
adventício ocorre lado a lado
com a formação do embrião pela via
sexual. Esse processo é conhecido no
gênero Citrus, porém pouco se conhece
da sua genética que, parece, ser muito
complexa.
Os dois outros mecanismos de apomixia
são: diplosporia e aposporia. Ambos
envolvem a formação de uma estrutura
de um gametófito ou saco embrionário
e, portanto, são considerados como
apomixia gametofítica. Essa é caracterizada
pela apomeiose (Nogler, 1984), ou
seja, pela formação de um saco embrionário
sem completar a redução meiótica.
Na diplosporia, a célula mãe do megásporo
inicia, mas não completa, a meiose
e entra na mitose, e os núcleos do saco
embrionário não são reduzidos. Os sacos
embrionários formados possuem 8
núcleos e são morfologicamente semelhantes
ao saco meiótico. Nesse caso, o
processo sexual é completamente comprometido,
e, num mesmo óvulo, apenas
pode ocorrer um modo de reprodução.
Na aposporia, células do nucelo,
denominadas células iniciais apospóricas
ou apósporos, entram em mitose
diretamente e formam sacos embrionários
não reduzidos. Estes possuem oito
núcleos como em Hieracium ou 4 núcleos
como em Panicum (Asker e Jerling,
1992). Geralmente o processo sexual
é interrompido, mas, nem sempre, o
que possibilita a ocorrência de sexuali-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 37

dade e apomixia em um mesmo óvulo.
É comum também a ocorrência de vários
sacos embrionários apospóricos em um
só óvulo em decorrência do aparecimento
de diversos apósporos (Fig. 1).
O desenvolvimento do endosperma
pode ser autônomo, sem a ocorrência de
fertilização do núcleo polar pelo núcleo
espermático, ou necessitar de fertilização
do núcleo polar, caracterizando,
então, a pseudogamia.
Indicadores da apomixia
Existem muitas características que
podem ser observadas em plantas que
indicam uma possível ocorrência de
reprodução apomítica (Czapik, 1994).
Entretanto, é sempre necessária a caracterização
morfológica e citológica para
confirmar a ocorrência da apomixia nas
espécies. Os principais indicadores usados
para identificação de apomixia em
um determinado taxon e respectivos
modos de detecção estão apresentados
na tabela1. As referências indicam trabalhos
onde se pode encontrar a descrição
e o uso dos métodos ou de revisão.
Marcadores moleculares ligados à
apomixia vêm sendo procurados em
diferentes espécies. Eles facilitarão a
detecção precoce e em larga escala da
apomixia em análises de híbridos. Alguns
marcadores moleculares já foram
identificados em populações de plantas
de Pennisetum (Ozias-Akins et al., 1998)
e Brachiaria (Pessino et al., 1999), porém
ainda não foram encontrados marcadores
universais para a apomixia.
A possibilidade de se transferir a
apomixia entre as plantas usando técnicas
de Biologia Molecular requer, antes
de tudo, conhecimento da natureza dos
genes envolvidos. Diferentes linhas de
pesquisa estão sendo desenvolvidas para
o conhecimento básico da reprodução,
principalmente dos eventos de desenvolvimento
do gametófito feminino e da
fecundação.
Estratégias utilizadas para
estudo da apomixia
Embora a ocorrência natural da apomixia
tenha sido descrita para muitas
espécies, seu mecanismo ainda é pouco
estudado. As abordagens utilizadas na
identificação e na clonagem de genes
vão desde a identificação de marcadores
moleculares até a construção de bancos
de cDNA e estratégias de mutagênese e
técnicas de “differential display” (revisto
em Pessino et al., 1999 e Savidan, 2000).
Figura 2. A, Inflorescência de braquiária em antese. B, Detalhe do racemo
durante a antese, mostrando as espiguetas em duas fileiras; C, Espigueta; D,
Espigueta aberta, mostrando a flor hermafrodita (h) e a flor masculina (m); E, Flor
hermafrodita dissecada, mostrando três anteras (an), o pistilo com o ovário (ov)
e o estigma (es)
Análises de populações segregantes
em algumas culturas, derivadas de cruzamentos
entre apomíticos e sexuais têm
ajudado a desvendar a transmissão genética
da apomixia e a produzir mapas
do locus apomítico (Ozias-Akins et al.,
1993,1998), baseado em marcadores
moleculares. No entanto, a clonagem a
partir desses mapeamentos ainda não foi
obtida. A herança da apomixia foi estudada
em poucas espécies devido às
dificuldades desse tipo de estudo. Normalmente,
as plantas apomíticas são
poliplóides, a maioria é tetraplóide, enquanto
as sexuais são diplóides (Carman,
1997), o que inviabiliza os cruzamentos.
Em Brachiaria por exemplo,
alguns sexuais poliplóides foram obtidos
artificialmente e vêm sendo usados
em cruzamentos com apomíticos (Gobbe
et al., 1981; Lutts et al., 1984; Pinheiro
et al., 2000).
Em Arabidopsis thaliana, uma planta
modelo em biologia, na qual não ocorre
apomixia, os genes responsáveis pelo
desenvolvimento têm sido procurados
através de mutações que alteram o desenvolvimento
do gametófito feminino e
da semente. Já foram isolados genes
relacionados com a formação do embrião,
incluindo aqueles capazes de produzir
endosperma ou iniciar a formação
do embrião, independentemente de haver
fertilização. Os mutantes fis (fertilisation
independent seeds) (Chaudhury et
al., 1997), fie (fertilisation independent
endosperm) (Ohad et al., 1996) e mea
(medea) (Grossniklaus et al., 1998) apresentam
diferentes estágios de desenvolvimento
da semente sem fertilização.
Porém, nenhuma dessas sementes
mutantes maturam e desenvolvem
plantas. Até hoje não existe ainda
relato de mutantes que controlem todo
o processo apomítico e produzam
clones através de sementes.
Resultados como esses revelam aspectos
dos principais momentos de
desenvolvimento de sementes e contribuem
para o conhecimento da apomixia.
Estudando-se a biologia de plantas
naturalmente apomíticas, busca-se
encontrar os genes responsáveis por
esse modo de reprodução. Os apomíticos
naturais são considerados difíceis
experimentalmente, no entanto,
suas características completas ainda
não foram obtidas em mutantes. Em
apomíticos, o gametófito feminino se
desenvolve independentemente da
meiose e o embrião se desenvolve sem
ocorrer fecundação. As sementes resultantes
do processo são viáveis.
Utilização de plantas do gênero
Brachiaria como sistema de
estudo da apomixia
O gênero Brachiaria (Trin.) Griseb.
possui espécies que se reprodu-
38 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

Figura 3. Esquema da reprodução sexual e apomítica (apospórica), que ocorre no gênero Brachiaria. Note que na
reprodução apomítica, uma célula não reduzida do nucelo se desenvolve em um saco embrionário apospórico do tipo
Panicum e que a formação do embrião ocorre sem a fertilização da oosfera. CMM, célula-mãe do megásporo, CMP, célulamãe
do grão de pólen
zem tanto por sexualidade quanto por
apomixia, permitindo o estudo comparativo
dos dois modos de reprodução. A
inflorescência de braquiária é uma panícula
com 2 ou até 5 racemos (Fig. 2A)
que sustentam as espiguetas dispostas
em duas fileiras (Fig. 2B). Cada espigueta
(Fig. 2C) desenvolve duas flores, uma
masculina e uma hermafrodita (Fig. 2D).
A flor masculina tem 3 anteras e parece
desenvolver grãos de pólen normais. A
flor hermafrodita possui 3 anteras e um
pistilo que contém um ovário e um só
óvulo (Fig. 2E).
O desenvolvimento do gametófito
masculino e feminino e o do embrião de
plantas apomíticas e sexuais de espécies
de braquiária está esquematizado na
figura 3. Na reprodução sexual, como
acontece na maioria das angiospermas,
uma célula do nucelo se diferencia da
célula-mãe do megásporo (CMM) e passa
por redução na meiose, formando 4
megásporos reduzidos. Apenas um deles
é funcional e se desenvolve após 3
mitoses sucessivas no saco embrionário
do tipo Polygonum, que contém 8 núcleos
reduzidos, distribuídos em 7 células:
2 sinérgides, uma oosfera, 3 antípodas e
uma célula central, com 2 núcleos polares
reduzidos. Próximo à antese, os 2
núcleos polares se fundem para formar
um núcleo diplóide. Após a antese,
ocorre então a dupla fertilização, que
consiste na fecundação da oosfera por
uma das células espermáticas do grãode-pólen,
formando o zigoto diplóide
que se desenvolverá em embrião, e a
fecundação do núcleo diplóide da célula
central pela outra célula espermática,
para formação do endosperma triplóide.
As sementes formadas, por serem resultado
de fertilização, darão origem a
plantas genética e morfologicamente diferentes.
A reprodução apomítica em braquiária
segue o mecanismo de aposporia.
Nos óvulos das plantas apomíticas, a
CMM se diferencia e pode ou não completar
a meiose, dependendo da espécie.
Entretanto, durante a meiose ou ao final
dela, a CMM ou os megásporos se degeneram.
Nesse momento, células do nucelo
(2n) se diferenciam e entram diretamente
em 2 mitoses, formando sacos
embrionários de 4 núcleos não-reduzidos
do tipo Panicum. Esses sacos embrionários
apresentam 2 sinérgides, uma
oosfera e um núcleo polar. Podem ocorrer
variações no número de núcleos,
principalmente em óvulos que contenham
muitos sacos embrionários. O desenvolvimento
do embrião é autônomo
e ocorre antes ou após a antese. Após a
antese, apenas o núcleo da célula central
é fertilizado para a formação do endosperma
(3n). Eventualmente, e dependendo
de cada espécie, a CMM completa
a meiose, originando um saco embrionário
meiótico, que pode ser visualizado
sozinho ou acompanhado de sacos
apospóricos, num mesmo óvulo (Valle,
1990; Dusi e Willemse, 1999; Araújo et al.,
2000).
Na formação do gametófito masculi-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 39

Figura 4. Esquema representativo da técnica de DDRT-PCR em duas amostras de RNA de ovários de plantas sexual e
apomítica. A. cDNA é sintetizado das subpopulações de RNAs poly(A + ), com um dos diferentes primers de ancoragem
T 11
XY, no exemplo T 11
GG. B. Amplificação dos cDNAs com T 11
GG e um dos primers aleatórios, em presença de dATP
marcado radioativamente. C. Separação dos fragmentos provenientes de ovários de plantas sexuais (S) e apomíticas
(A) em gel de seqüenciamento e detecção por autoradiografia. As setas indicam os fragmentos diferenciais
no, tanto na sexualidade quanto na
apomixia, ocorre redução meiótica, com
formação de micrósporos reduzidos que,
por sua vez, se desenvolvem em grãosde-pólen
que contém três células reduzidas,
uma vegetativa e duas células
espermáticas. Dependendo da espécie,
plantas apomíticas podem apresentar
níveis maiores de esterilidade do grãode-pólen
quando comparadas com as
plantas sexuais (Asker e Jerling, 1992).
Para compreender o mecanismo da
apomixia e poder levá-lo a outras espécies,
utilizando ferramentas da biotecnologia,
a Embrapa desenvolve estudos e
trabalhos sobre a formação do embrião
apomítico (Alves, 2001), sobre o desenvolvimento
morfológico dos sacos embrionários
das plantas apomíticas e sexuais
de Brachiaria (Dusi, 1999, Araújo,
2000), a identificação de marcadores
moleculares e a duplicação de cromossomos
de plantas sexuais por colchicina
(Pinheiro, 2000) além da transformação
direta de plantas através de
biobalística (Lentini, 1999). Análises
em progênie de cruzamentos interespecíficos
sugerem que a herança da
apomixia é dominante e ligada a um
único locus genético (Valle et al., 1994),
o que fundamenta a procura de genes
envolvidos no processo (Rodrigues,
2001).
40 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

Utilização da técnica de
Differential display reverse transcriptase
PCR (DDRT-PCR)
O método “differential display reverse
transcriptase PCR” (DDRT-PCR),
descrito por Liang e Pardee (1992), é
uma técnica que vem sendo utilizada
com sucesso na detecção do perfil de
expressão gênica em tecidos ou células
eucarióticas. Essa técnica está sendo
empregada em análises do desenvolvimento
vegetal, como o isolamento do
gene NAP de A thaliana; genes expressos
durante o ciclo celular, embriogênese,
amadurecimento do fruto e desenvolvimento
de sementes, entre outros
(revisado por Kuhn, 2001). Também
em apomíticos, algumas seqüências
relacionadas com a reprodução sexual
ou com a apomítica foram obtidas
a partir de ovários maduros de Pennisetum
ciliare (Vielle-Calzada et al., 1996).
Estudo semelhante foi conduzido usando
ovários maduros de híbridos interespecíficos
de Brachiaria ruziziensis e B.
brizantha (Leblanc et al. 1997). cDNA
diferencialmente expresso foi isolado
de flores de plantas apomíticas e sexuais
de Paspalum notatum (Pessino et al.,
2001). Em espécies apomítica e sexual
de B. decumbens foram isoladas seqüências
de dois estágios de desenvolvimento
do óvulo com apenas quatro
combinações de primers (Dusi 2001).
Embora apresente limitações, como
amplificação de regiões 3’ não-codantes
e uma tendência de amplificar genes
mais abundantes (McClelland et al. 1995),
essa técnica tem sido bastante usada,
pois é sensível o suficiente para identificar
mudanças nos níveis de RNA (Wan
et al., 1996) necessitando apenas de
pequena quantidade para as análises,
fator determinante em plantas cujos
ovários são pequenos e de difícil acesso,
como em Brachiaria (Fig. 2).
DDRT-PCR baseia-se na produção
de uma população de fragmentos de
cDNAs de diferentes tamanhos pela
amplificação de subpopulações específicas
de mRNAs com a utilização de
transcriptase reversa e PCR (Fig. 4). Em
resumo, a partir de uma pequena quantidade
de RNA total, é sintetizada a
primeira fita de cDNA em uma reação
de transcrição reversa da população
total de mRNA em subgrupos com um
dos 12 primers de ancoragem, T 11
XY,
que reconhecem diferentes frações da
população de mRNA. O cDNA resultante
é então amplificado por PCR, utilizando-se
o mesmo primer de ancoragem
T 11
XY e um pequeno primer aleatório
na presença de dATP marcado. Os
produtos marcados são separados num
gel desnaturante de seqüenciamento
de DNA e visualizados por autoradiografia.
O procedimento é igual e simultâneo
para os RNAs das amostras que
serão comparadas. Assim, num mesmo
gel, é possível visualizar as bandas
contendo fragmentos de cDNA presentes
em uma amostra e ausentes na
outra. Esses fragmentos podem ser isolados,
reamplificados, clonados e caracterizados.
Para identificar os genes envolvidos
na reprodução apomítica de Brachiaria
brizantha, a comparação do perfil
de expressão gênica, utilizando-se a
técnica de DDRT-PCR, de ovários de
plantas apomíticas e sexuais em diferentes
estágios de desenvolvimento do
óvulo está sendo realizada.
Considerações Finais
O potencial da engenharia genética
vegetal vai muito além da produção de
plantas com tolerância a herbicidas ou
com resistência a insetos, já existentes
atualmente no mercado internacional.
Novos genes estão sendo procurados
para aumentar a qualidade de alimentos,
reduzir custos e aumentar a produção
agrícola. A apomixia vem ao encontro
dessa perspectiva, contando com
ferramentas resultantes da pesquisa em
biologia molecular e celular.
Os pesquisadores na área têm manifestado
preocupação com as restrições
ao acesso à biotecnologia para os
agricultores, principalmente por questões
econômicas. No caso da apomixia,
os pequenos produtores serão diretamente
beneficiados pela possibilidade
de replantar as sementes produzidas de
híbridos, ou de desenvolver variedades
adaptadas a condições locais particulares
e produzir sementes. Com essa
preocupação, foi elaborado um documento
de intenção, endossado por diversos
pesquisadores em apomixia,
(http:// billie. btny. purdue. edu /
apomixis/) para que o acesso a ela seja
amplo e igualitário. Investimento considerável
vem sendo feito pelas empresas
privadas, apoiando e desenvolvendo
pesquisa de ponta em apomixia nos
Estados Unidos e Europa. No Brasil, a
Embrapa estuda apomixia em Brachiaria.
Contamos com um programa de
melhoramento, onde existe uma coleção
de mais de 300 acessos já caracterizados,
e desenvolvemos pesquisa relacionada
com a sua biologia celular e
molecular, enfocando aspectos da reprodução.
Consideramos de crucial importância
que as instituições públicas,
principalmente de países em desenvolvimento
como o nosso, assegurem o
acesso a essa tecnologia, desenvolvendo
novos enfoques de pesquisa para
conhecimento dos mecanismos da apomixia.
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42 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

FUNDAÇÃO GIACOMETTI
(Repete fotolito que saiu na pág. 21 , edição 24)
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 43

Bases Fisiológicas e Genéticas da
Pesquisa
REGENERAÇÃO DE PLANTAS IN VITRO
Fotos e ilustrações cedidas pelo autor
Um conhecimento útil para o desenvolvimento de protocolos biotecnológicos
Lázaro E. P. Peres
Prof. Dr. – Fisiologia Vegetal – Esalq/USP
Depto. de Ciencias Biológicas - LCB
lazaropp@esalq.usp.br
http://www.ciagri.usp.br/~lazaropp
Introdução
Apesar da extensa utilização da
regeneração de plantas in vitro em
Figura 1. Adaptação do modelo de Tran Thanh Van (1973) para o
entendimento da determinação celular. Explantes retirados de regiões
reprodutivas estão “induzidos” e “determinados” para originar botões
florais, e explantes retirados de regiões vegetativas originam gemas
caulinares quando cultivados in vitro
processos biotecnológicos, pouco se
conhece, até o momento, sobre os
mecanismos envolvidos na aquisição
de competência para regeneração.
Pode-se dizer que, virtualmente, todos
os processos tecnológicos são derivações
de conhecimentos básicos adquiridos
nos mais variados campos da
ciência. A Biotecnologia Vegetal tem
seu corpo de conhecimentos amplamente
apoiado em estudos de Fisiologia
e Genética Vegetal, e, mais especificamente,
em uma de suas importantes
subáreas – o Desenvolvimento.
O termo desenvolvimento referese
ao crescimento integrado das várias
partes de um ser pluricelular envolvendo
basicamente, os processos de
divisão, expansão e diferenciação celular
e a conseqüente formação de
tecidos, órgãos e sistemas. Plantas e
animais possuem notáveis diferenças
quanto ao tipo de desenvolvimento.
Enquanto praticamente todo o desenvolvimento
dos animais se processa
durante uma etapa denominada embriogênese,
nas plantas essa etapa se
limita à formação de um eixo contendo
os meristemas caulinar e radicular em
pólos opostos. Por meio das atividades
desses meristemas, as plantas realizam
um desenvolvimento pós-embrionário,
ou seja, continuam formando órgãos
(caules, raízes, folhas, flores e
frutos) ao longo de todo o seu ciclo de
vida. Esse tipo de desenvolvimento
constitui uma estratégia para que os
vegetais possam se adaptar às variações
no ambiente, já que são organismos
sésseis e, portanto, não podem
utilizar a locomoção para buscar ambientes
favoráveis. Assim, quando um
vegetal encontra uma condição desfavorável
(p. ex: falta de luz) ele pode
lançar mão de seu desenvolvimento
flexível para formar novos órgãos (p.
ex: ramos e folhas) na direção em que
sua sobrevivência e reprodução fiquem
garantidas.
Uma das principais características
do desenvolvimento pós-embrionário
dos vegetais é justamente a separação
temporal entre os processos de embriogênese
e organogênese. Como se
44 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

Figura 2. Exemplo de mutação homeótica em vegetais. A rosa da direita é o
resultado de uma mutação homeótica (transformação de um órgão em outro),
onde os estames se converteram em pétalas. As diferenças na coloração
representam mutações em genes relacionados com a síntese de pigmentos
verá adiante, a separação temporal
entre embriogênese e organogênese
torna-se relevante quando se procura
regenerar plantas in vitro, pois o que
se faz nada mais é do que tentar
reproduzir essas duas etapas em condições
artificiais. Sendo assim, como o
meristema caulinar pode dar origem a
um novo ramo e, nesse, novas raízes
podem ser induzidas, é relativamente
fácil obter uma multiplicação clonal
em plantas. Já nos animais, a propagação
clonal é muito rara e em condições
artificiais só é possível através de um
controle estrito da embriogênese. Como
conseqüência, enquanto as plantas são
clonadas, desde tempos imemoriais,
por processos muitos simples como a
estaquia e a enxertia, a clonagem de
animais é extremamente difícil e, no
caso de mamíferos, só foi obtida recentemente
por ocasião do nascimento da
ovelha Dolly (Wilnut et al., 1997).
O controle hormonal do
desenvolvimento de
caules e raízes
Assim como nos animais, o desenvolvimento
das plantas é fundamentalmente
controlado por substâncias
reguladoras de crescimento ou hormônios.
Desse modo, apesar de as descobertas
feitas até a década de 30, principalmente
no campo da nutrição mineral,
terem possibilitado o crescimento
de órgãos isolados in vitro (White,
1934), a indução deles em condições
artificiais só foi possível a partir de um
conhecimento mais aprofundado acerca
da natureza dos hormônios vegetais.
Durante a década de 50, a equipe
do Dr. Folk Skoog fez descobertas que
foram fundamentais para a indução e
manutenção da organogênese in vitro.
Naquela época já se conhecia o
ácido indolil-3-acético (AIA), uma auxina
isolada em 1934. O AIA era utilizado
em meios nutritivos juntamente
com constituintes complexos, como
extrato de levedura e água de coco, os
quais pareciam conter algo também
essencial à organogênese. Essa substância
essencial para a divisão celular
foi finalmente isolada por Carlos Miller
em 1955 e denominada citocinina. A
chamada citocinina, assim denominada
por promover, juntamente com a
auxina, a citocinese, propiciou, finalmente,
as bases da organogênese in
vitro. Desse modo, em 1957, Carlos
Miller e Skoog demonstraram que a
formação de dois órgãos in vitro, caules
e raízes, era controlada pelas concentrações
relativas entre auxina e
citocinina. Meios de cultura contendo
um balanço auxina/ citocinina favorável
à auxina promoveram a formação
de raízes em calo (um aglomerado de
células) de tabaco (Nicotiana tabacum).
De modo inverso, balanços hormonais
favoráveis à citocinina fizeram
com que fossem formadas gemas caulinares.
Finalmente, balanços hormonais
intermediários não levaram a uma
diferenciação das células e sim a uma
maior multiplicação delas e conseqüente
crescimento do calo (Skoog & Miller,
1957). Apesar desses resultados terem
sido obtidos ainda na década de 50,
eles são plenamente corroborados em
trabalhos mais recentes, onde se altera
o conteúdo endógeno de auxina e
citocininas em plantas transgênicas expressando
genes bacterianos para produção
desses hormônios. A exemplo
disso, plantas de tabaco expressando o
gene ipt de Agrobacterium tumefaciens
possuem elevado nível endógeno
de citocininas e a conseqüente intensa
formação de gemas caulinares ex vitro
e in vitro. De modo inverso, a expressão
dos genes bacterianos iaaH e iaaM,
envolvidos na biossíntese de auxina,
provoca ampla formação de raízes em
plantas transgênicas. Surpreendentemente,
quando se cruzam os dois tipos
de transgênicos, o híbrido F1 tende a
apresentar fenótipo igual ao tipo não
transgênico. Esses estudos confirmam
os resultados de Skoog e Miller (1957),
os quais postularam que as concentrações
absolutas de auxina e citocininas
são menos importantes que suas concentrações
relativas na indução de organogênese.
Diferenças entre organogênese
e embriogênese in vitro e tipos
de organogênese
Como dito anteriormente, o desenvolvimento
das plantas é dividido entre
organogênese e embriogênese,
sendo que essa característica se reflete
no processo de regeneração in vitro.
A princípio, a formação de embriões
a partir de tecidos somáticos in
vitro imita a embriogênese zigótica,
que ocorre nos órgãos reprodutivos
das plantas. Desse modo, tanto a embriogênese
somática quanto a zigótica
culminam na formação de uma planta
inteira a partir de uma única célula.
Contudo, em certos explantes, os
embriões somáticos formam-se a partir
da diferenciação conjunta de grupos
de células embriogênicas (Williams &
Maheswaran, 1986). Como a organogênese
normalmente envolve a regeneração
de gemas a partir de grupos
de células meristemáticas, há casos em
que é difícil determinar se o processo
de regeneração envolve organogênese
ou embriogênese. Alguns critérios
para a determinação do tipo de regeneração
são apresentados a seguir:
I. os embriões somáticos possuem
sistema vascular fechado
sem conexão com o
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 45

sistema vascular do explante
inicial, como ocorre na
organogênese;
II.a estrutura formada na embriogênese
é bipolar (eixo
com os meristemas caulinares
e radiculares). Na organogênese
são formadas gemas
caulinares que, mais
tarde, darão origem a raízes
adventícias.
Nos dois processos de regeneração,
há necessidade do estabelecimento
de células competentes no explante
inicial. Tanto as células meristemáticas,
que darão origem às gemas caulinares,
quanto as células embriogênicas
podem se formar posteriormente ou
podem estar preexistentes no explante.
No caso do explante já possuir
células meristemáticas ou embriogênicas,
ocorrerá organogênese direta e
embriogênese direta, respectivamente.
Quando há necessidade de desdiferenciação
do explante, com a conseqüente
formação de calo prévia ao
estabelecimento das células competentes,
ocorrerá organogênese ou embriogênese
indireta. Por simplificação,
a seguir iremos considerar somente o
processo de organogênese in vitro
(Consultar a Revista Biotecnologia Ed.
7 para mais informações sobre embriogênese
somática).
O processo de indução e manutenção
da organogênese in vitro
A obtenção de organogênese in
vitro é atualmente um processo empírico
onde são testados para cada espécie,
ou mesmo para cada variedade
dentro de uma espécie, as seguintes
condições: I) fonte de explante; II)
composição mineral do meio de cultura
(e também suas vitaminas e fontes
de carbono); III) balanço hormonal e
IV) condições ambientais.
Embora seja um processo empírico,
o desenvolvimento de um protocolo
para organogênese in vitro será
facilitado, e, inclusive, o número de
variáveis a serem testadas diminuirá,
se forem seguidos alguns princípios e
conhecimentos fisiológicos. Desse
modo, quanto à fonte de explante,
Figura 3. Diferenças genéticas quanto à capacidade de regeneração em
espécies de Lycopersicon. A – raiz gemífera de L. hirsutum. A capacidade de
formar gemas caulinares em raízes ex vitro se reflete na competência para
regeneração in vitro a partir desse tipo de explante (Peres et al., 2001). B –
Elevada capacidade de regeneração de L. pimpinellifolium WV700 a partir
de explantes caulinares, a qual é controlada por dois genes principais (Faria
& Illg, 1996)
normalmente haverá maior sucesso se
forem utilizados tecidos jovens, os quais
possuem maior competência organogenética.
Explantes que contém tecidos
meristemáticos são preferidos e
eles são encontrados em gemas caulinares
apicais e axilares. Uma ampla
fonte de tecidos meristemáticos, normalmente
negligenciada, são as raízes,
as quais possuem tecidos meristemáticos
nos ápices, além de o próprio
periciclo ser um tecido meristemático.
O fato de as raízes estarem em contato
com o solo torna impraticável sua desinfestação,
sendo elas utilizadas somente
a partir de plantas preestabelecidas
in vitro. Outro fator limitante é
que algumas espécies parece ter raízes
com extrema determinação para
continuarem se desenvolvendo como
raízes, sendo difícil nelas a formação de
gemas caulinares.
Diferenças significativas na capacidade
organogenética in vitro são encontradas
ao se variar a composição
mineral, as vitaminas e as fontes de
açúcares dos meios de cultura. Contudo,
os componentes mais críticos adicionados
ao meio de cultura são os
hormônios vegetais. Como foi visto
anteriormente, os principais hormônios
utilizados na organogênese são as
auxinas e as citocininas. Outras classes
de hormônios vegetais, como as giberelinas,
o etileno e o ácido abscísico ou
mesmo substâncias que não sejam propriamente
hormônios, como poliaminas,
ácido salicílico e jasmonatos também
são, muitas vezes, utilizados em
processos de regeneração por organogênese.
Existe considerável número
de evidências de que o efeito dessas
substâncias é indireto, através da alteração
do balanço auxina/citocinina
endógeno. O próprio efeito das auxinas
e das citocininas aplicadas ao meio
de cultura parece ser, na verdade, o
reflexo dessas substâncias alterando os
balanços endógenos de auxina/citocininas
nas células vegetais (Peres et al.,
1999). Esse efeito indireto é, inclusive,
muito comum quando se utilizam auxinas
sintéticas, como o 2,4 D (ácido 2,4
diclorofenoxiacético), o ANA (ácido
naftaleno acético), ou citocininas sintéticas
como a benzilaminopurina (BAP),
a cinetina e, sobretudo o thidiazuron.
Essa última “citocinina” não possui a
estrutura comum das citocininas, sendo
um difeniluréia ao invés de possuir
um anel purínico característico do BAP,
da cinetina, da isopentenil adenina (iP)
e da zeatina (Z). Trabalhos realizados
por Van Staden e também por David
Letham fornecem evidências de que o
thidiazuron pode atuar inibindo a enzima
citocinina oxidase, a principal enzima
envolvida na degradação de citocininas
endógenas como Z, iP e seus
derivados.
Finalmente, as condições ambientais
influenciam notavelmente a organogênese
in vitro. Normalmente as
salas de cultivo são mantidas em temperatura
ambiente (25° C), sendo a luz
o fator ambiental que parece mais
afetar a organogênese. Muitos protocolos
de regeneração são conduzidos
no escuro, sobretudo para evitar a
oxidação do explante na fase de estabelecimento.
Esse procedimento se
baseia no fato de a enzima chave da
46 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

produção de compostos fenólicos, a
fenilalaninamonioliase, ser dependente
da luz. A luz afeta a morfogênese de
modo mediado por fotoreceptores
como o fitocromo. Um experimento
que evidencia a relevância da fotomorfogênese
na organogênese in vitro é a
constatação de que o mutante aurea
de tomateiro, o qual é defectivo para o
gene que codifica uma enzima na
formação do cromóforo do fitocromo,
praticamente não forma gemas in vitro
(Lercari et al., 1999).
Apesar de serem seguidos princípios
básicos e de se testarem empiricamente
diversos parâmetros, muitas vezes
não se consegue a organogênese
in vitro. Os fatores associados a esse
insucesso serão discutidos a seguir.
Fatores associados à falha na
indução de organogênese
in vitro
Christianson & Warnick dividiram o
processo de organogênese in vitro nas
seguintes etapas: 1) desdiferenciação;
2) aquisição de competência; 3) indução;
4) determinação; 5) diferenciação
e 6) formação do órgão (Christianson &
Warnick, 1988). Essa divisão do processo
em etapas permitiu a esses autores
postularem que, quando um explante
falha em desenvolver organogênese
in vitro, essa falha se dá normalmente
na etapa de aquisição de
competência. Contudo, pouco se conhece,
até o momento, sobre os mecanismos
envolvidos na aquisição de
competência para organogênese (Kerbauy,
1999).
A aquisição de competência para
organogênese
No processo de organogênese, a
competência seria entendida como a
capacidade de responder ao estímulo
hormonal necessário à indução da formação
do órgão. A falha de competência
de um tecido poderia refletir, portanto,
a falta de receptores para a
classe hormonal que irá induzir o processo
organogenético (Carry et al.,
2001). Os recentes estudos relacionados
com o isolamento de genes correspondentes
a receptores, principalmente
de citocininas (Inoue et al., 2000),
certamente contribuirão para um melhor
entendimento do processo de
aquisição de competência organogenética.
Um outro fator associado
à falta de competência
organogenética seria o próprio
metabolismo hormonal
do explante, pois é ele que
determinará, em última análise,
o balanço hormonal endógeno
para indução da organogênese
(Peres & Kerbauy,
1999). Desse modo,
explantes com alta atividade
de citocinina oxidase,
enzima que degrada citocininas,
podem não chegar a
um balanço auxina/citocinina
endógeno indutor da formação
de gemas, mesmo
que sejam adicionadas elevadas
concentrações de citocininas
ao meio de cultura.
De modo semelhante,
explantes com elevada atividade
de degradação oxidativa
ou de inativação de
auxina por conjugação com
açúcares e aminoácidos podem
falhar na indução de
raízes adventícias. O efeito
diferencial dos vários tipos
de auxinas e citocininas
quando aplicados ao meio
de cultura pode ser também
correlacionado com o fato
de cada um deles interferir
de modo particular no metabolismo
hormonal endógeno.
Finalmente, explantes
comprometidos para vias
particulares de desenvolvimento
(elevada determinação
para formar um órgão
específico) podem falhar na alteração
dessa via para assumir uma outra. Um
estudo clássico sobre determinação
celular foi apresentado por Mary Tran
Thanh Van ao demonstrar que explantes
epidérmicos de pedúnculo floral
de tabaco tendem a formar novas flores
in vitro (Tran Thanh Van, 1973;
Fig. 1). De modo geral, pode-se dizer
que, quanto maior for a determinação
de um explante para uma via de desenvolvimento
(por exemplo, a formação
de raízes) menor será a competência
para formar outro tipo de órgão
(por exemplo, gemas caulinares). Um
exemplo de tecido com baixa determinação
e elevada competência tanto
para formação de raízes quanto de
Figura 4. Reinterpretação da hipótese
proposta por Christianson & Warnick (1988)
para o entendimento da competência
organogenética. Os possíveis estágios onde
atuariam diferentes genes que influenciam a
regeneração são indicados em vermelho. Os
“genes de sensibilidade” seriam aqueles
envolvidos na percepção (codificação de
receptores) e transdução do sinal para auxinas
(AIA, 2,4D) e citocininas (Cks). Os genes de
metabolismo hormonal (que codificam enzimas
de biossíntese e/ou degradação de hormônios)
são os responsáveis pelo estabelecimento de
um balanço hormonal endógeno necessário
para a regeneração. Genes homeóticos
controlam a formação de órgãos e, portanto,
podem estar associados à regeneração de
novas gemas caulinares ou raízes. A expressão
desfavorável de qualquer uma dessas classes
de genes seria suficiente para impedir a
regeneração de um determinado explante
gemas caulinares é o calo. O calo é
considerado um tecido indiferenciado,
ou pouco diferenciado, podendo ser
induzido, tornando-se determinado e,
finalmente sofrer diferenciação para
formar gemas caulinares ou raízes, conforme
o balanço hormonal aplicado
(Skoog & Miller, 1957). Tanto a aquisição
de “competência” quanto a “determinação”
são reflexos da expressão
diferencial de genes envolvidos nos
processos de desenvolvimento. Resta
saber, portanto, que tipo de genes
seriam esses.
Genes envolvidos na capacidade
de regeneração in vitro
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 47

Como visto acima, a regeneração
de um explante depende tanto da
sensibilidade quanto do metabolismo
para uma determinada classe hormonal.
Desse modo, genes associados à
capacidade de regeneração poderiam
ser os próprios genes que codificam
componentes da via de transdução
de sinal ou as enzimas do metabolismo
hormonal. Além disso, para que
um tecido se diferencie em um determinado
órgão, faz-se necessário que
ele possua a capacidade de expressão
dos chamados “genes mestres”,
que coordenam a expressão dos vários
genes que serão requeridos durante
a organogênese. Nesse sentido,
explantes que falham em formar um
determinado órgão in vitro, por estarem
“determinados”, podem ter perdido
a capacidade de expressão de
“genes mestres” durante um processo
intenso de diferenciação sofrido
anteriormente. Um exemplo de gene
mestre que pode estar relacionado
com a capacidade de regeneração é
KNOTTED1 (Smith et. al., 1995), o
qual se expressa em caules, mas não
em explantes radiculares. O gene
KNOTTED1 é considerado um gene
homeótico, uma classe de genes que,
ao sofrerem mutação, podem provocar
a formação de órgãos em locais
não convencionais. O primeiro gene
homeótico descoberto foi ANTENNA-
PEDIA, um gene da mosca Drosophila,
cuja mutação provoca formação de
pernas na cabeça no lugar das antenas.
Em plantas, uma mutação equivalente
é a transformação de estames
em pétalas, produzindo as conhecidas
rosas dobradas (Fig 2).
É interessante notar que em certas
espécies existem diferenças na capacidade
de regeneração in vitro que
são controladas por poucos genes.
Um modelo promissor é o tomateiro
(Lycopersicon esculentum), cuja alta
capacidade de regeneração de algumas
espécies selvagens (Fig. 3) parece
ser controlada por um ou dois
genes dominantes (Koornnef et al.,
1993; Faria & Ilgg, 1996; Peres et al.,
2001). Infelizmente, ainda não temos
informações acerca da função de tais
genes. Contudo, diante do exposto
acima, é razoável especular que esses
“genes de regeneração” podem ser
“genes mestres” ou mesmo estar relacionados
com a presença de receptores
para hormônios vegetais e/ou
podem codificar alguma enzima chave
no metabolismo hormonal. Os
possíveis locais onde os genes relacionados
com a regeneração in vitro
poderiam atuar são apresentados na
Figura 4, adaptando-se o esquema
proposto originalmente por Christianson
& Warnick (1988). No futuro, o
conhecimento aprofundado sobre a
sensibilidade, o metabolismo hormonal
e seu efeito na indução e/ou
repressão de genes mestres que controlam
a formação de gemas caulinares
e raízes facilitará o entendimento
da organogênese in vitro e suas aplicações
biotecnológicas.
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48 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

Vitor
A produção de animais transgênicos em série da Unifesp já começou. Além de Vitor, o
primeiro camundongo transgênico brasileiro criado a partir da técnica de injeção pronuclear,
quatro outros camundongos alterados geneticamente foram criados para atender pedidos
de pesquisadores de outras instituições nacionais e até do exterior.
Vitor é pai de sete filhotes, que nasceram no dia 27 de março. Os pequenos camundongos
mantêm duplicado o gene receptor B2 da bradicinina, uma substância associada a processos
inflamatórios e hipertensivos. “Todos os filhotes mantém as alterações genéticas”, afirma
o diretor técnico do Laboratório de Animais Transgênicos do Centro de Desenvolvimento
de Modelos Experimentais em Medicina e Biologia (Cedeme), João Bosco Pesquero.
Outras duas camundongas, Helena e Satiko, nasceram no dia 25 e 27 de fevereiro com
alterações genéticas diferentes das de Vitor, mas com o mesmo objetivo de servir a estudo
sobre problemas cardíacos e hipertensão. “Elas têm duplicada a enzima tonina, reponsável A mãe e seus filhotes
pela produção de substâncias que aumentam a pressão arterial”, explica Pesquero. A
alteração foi feita a pedido de pesquisadores da Universidade Federal de Minas Gerais.
Outro animal com alterações genéticas foi encomendado por pesquisadores da Instituto Max Delbruck, de Berlim, na
Alemanha. Segundo Pesquero, estão adiantados os contatos para um trabalho em conjunto com a Embrapa para produzir
novo animal trasngênicos. “Temos condição para atender novos pedidos e já estamos adiantados no contato com
pesquisadores do Brasil e de outros países.”
Na universidade, Pesquero e a pesquisadora Beatriz Castilho, do departamento de Microbiologia, têm colaborado para
produzir novas cópias de material genético exógeno a ser acrescentando à cadeia do DNA de novos camundongos. “É
fundamental conquistarmos a possibilidade de criar novas alterações que possam ajudar no estudo de doenças”, afirmou
Beatriz.
A técnica de microinjeção pronuclear empregada pelos pesquisadores do Cedeme foi adotada por ser a mais simples e
com melhores resultados, afirma Pesquero.
Com essa técnica, um fragmento de DNA inserido no genoma do animal que passa a apresentar, então, um ‘ganho de
função’. Esse processo permite um controle mais apurado que o da técnica de agrupamento, além de permitir uma produção
em série de animais transgênicos.
A constatação de que os filhotes são ou não transgênicos é feita três semanas após o nascimento. Um pequeno pedaço
de tecido do animal é submetido a uma análise genética para avaliar a presença dos genes modificados.
O projeto Vitor, o camundongo transgênico, vai permitir uma economia de 90% na compra de novas cobaias, cotadas no
mercado por até US$ 50 mil o casal. (JGN)
José Gonçalves / Imprensa Unifesp
Foto: Stella Murgel / Unifesp
Agradecimentos à Jussara Mangine / Unifesp
II Simpósio sobre Alimentos Transgênicos
17 e 18 de Outubro de 2002 - Viçosa - MG
Após o sucesso do I Simpósio Nacional sobre Alimentos Transgênicos realizado na UFV em 2000 e estimulados pelo
público participante deste evento, a UFV sente-se honrada em sediar este II Simpósio, com a presença de renomados
pesquisadores nacionais e internacionais.
Segurança alimentar, nutracêuticos, vacinas comestíveis, rotulagem e outros assuntos atuais referentes a biotecnologia
e especificamente aos alimentos transgênicos serão discutidos
Informações:http://www.agro.agri.umn.edu/~luborem/II%20Simposio%20Al.%20Transgenicos/
www.protocol-online.net Protocol Online disponibiliza protocolos de biologia molecular, biologia celular e imunologia,
fórum e lista de e-mail para discussão de métodos.
www.denniskunkel.com Na página do Dennis Kunkel Microscopy a galeria de imagens exibe centenas de micrografias
eletrônicas de bactérias, algas, insetos, plantas e células eucarióticas.
molbio.cbs.umn.edu/asirc Actinomycete-Streptomyces Internet Resource Center dispõe de informações de congressos,
posições de trabalho, micrografias, métodos, estruturas químicas de metabólitos secundários e vias biossintéticas.
Não se esqueça! O uso educacional de imagens e animações é permitido, mas não se esqueça dos direitos autorais e
pedidos de permissão.
BioDicas é uma colaboração de Marcio O. Lásaro marciolasaro@hotmail.com
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 49

Pesquisa
Biorreatores de
IMERSÃO PERMANENTE
Fotos e ilustrações cedidas pelos autores
Um outro enfoque na problemática da micropropagação de plantas
Antecedentes históricos.
Os biorreatores são sistemas usados para micropropagar plantas, visando a
otimizar, bem como a reduzir os custos da operação.
Historicamente, os biorreatores foram mais conhecidos por fermentadores e
estavam direcionado para o cultivo de células ou microrganismos, com vistas a
produzir metabólicos secundários, alcalóides, antibióticos, entre outros.
O nome fermentador está relacionado etimologicamente com fermentação que,
na sua raiz latina, deriva de fermentare, cujo significado é ferver, isto é, produzir
bolhas de ar, numa alusão ao fato de os fermentadores serem destinados a
processos fermentativos como, por exemplo, a produção de álcool, onde as
leveduras regeneram NAD a partir de sua forma reduzida NADH, com produção
de etanol e C0 2
, na qual este último, pela aparição de bolhas, dá a idéia de fazer
ferver o meio líquido nutritivo (Leveau & Bouix,1985).
1. Esquema de um biorreator de
imersão permanente BIPER, que
apresenta o recipiente e o
microcompressor, conformando
um todo, como descrito no texto
L. Pedro Barrueto Cid
Biólogo (M.Sc. - Ph.D.)
Pesquisador Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia. Brasília - DF
lpedro@cenargen.embrapa.br
Andréa R. Ramos Cruz
Eng. Agrônomo, bolsista, (M.Sc.)
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.
Brasília - DF
Jairo Moráis Teixeira
Graduando - Biologia, bolsista, Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia .
Brasília - DF
s biorreatores não apenas têm estado relacionados com processos
anaeróbios, como também com os aeróbicos. Neste caso um elenco
de outros microrganismos também têm sido utilizados, como, por
exemplo: Bacillus thuringensis, Penicillium roquefortii, Pseudomonas
syringae, Escherichia coli etc., objetivando sua exploração
comercial e industrial (Primrose, 1987).
Inicialmente, e pelo fato de serem destinados a usos industriais, esses
fermentadores foram de grande capacidade: de 20 a 4.000 mil litros de meio
líquido nutritivo. Em decorrência disso, esses fermentadores devem ter acurados
sistemas de oxigenação, agitação mecânica do meio líquido, monitoramento do
pH, da temperatura e da formação de espuma, tudo o que os converte em
verdadeiras obras da engenharia e da automatização, que asseguram à parte
biótica (microrganismos) sobreviverem nesse ambiente abiótico artificial, visando
aumentar seus rendimentos( biomassa, metabólicos secundários, antibióticos,
etc.), porém com altos custos de instalação.
Paralelamente à biotecnologia da fermentação, a cultura de tecidos vegetais
vinha desenvolvendo seu trabalho biotecnológico de manipulação de células,
tecido e órgãos com vistas a propagar material clonal para uso comercial.
Entretanto, muitas vezes, os custos de produção de mudas provenientes do
cultivo in vitro, a partir de meios sólidos, não compensam sua produção, por
causa do melhor preço obtido pelas mudas oriundas de sementes ou de partes
vegetativas devido aos altos custos de mão-obra no laboratório que chegam a
40%-60 % das despesas. Portanto, estratégias inovativas para reduzir custos de
mão-de-obra na produção em grande escala, tem enxergado aos biorreatores
como razoável aproximação (Preil & Beck, 1991; Ziv, 1992).
A propagação de plantas por meio de fermentadores para trabalhos de
microrganismos, com fins industriais, são impensáveis, devido ao seu alto custo
50 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

Tabela 1. Resultados preliminares com BIPER visando a induzir multiplicação em diferentes culturas de interesse
econômico (inóculo por biorreator)
Espécie
Mamão
Café
Abacaxi
Morango
Álamo
Orquídea
Quantidade de explante inicial:
brotos* ou gr**
7 *
8*
8 *
10*
10*
4**
Quantidade de brotos
finais
51
65
256
45
60
43
Período de cultivo (dias)
30
45
45
20
30
30
Coeficiente de
multiplicação
7.0
8.0
32.0
4.5
6.0
10.0
*Com depósito de patente no INPI
de modo que, foram feitas modificações
para sua extrapolação em plantas.
Os primeiros biorreatores adaptados
para plantas datam de, aproximadamente,
20 anos atrás (Levin et al.,
1988) De lá para cá, muitos tipos têm
sido propostos, isso porque um biorreator
é concebido em função do tipo de
processo que se deseja obter. Assim,
para embriogênese somática, se requer
um tipo de biorreator, mas, para
micropropagar através de organogenêse,
gemas, o desenho mais eficiente
pode ser outro (Merchuk, 1990).
Em geral, os biorreatores utilizados
para a micropropagação de plantas são
de pequena capacidade (1 a 5 litros),
e, no caso de serem desenhados para
multiplicação de células ou embriões
somáticos, devem possuir um sistema
de oxigenação, um outro de agitação
mecânica, por meio de pás giratórias
ou um sistema vibratório para produzir
a turbulência necessária à homogenização
e homeostase no interior do
biorreator, e ainda, sensores de pH,
temperatura, 0 2
e espuma (Preil et al.
1988; Takayama & Akita, 1994)
No tocante à propagação de plantas
através de gemas, existem os biorreatores
de imersão temporária (Alvard
et al.,1993) e os de borbulhamento
contínuo ou imersão permanente
(BIPER) tipo air-lift (George, 1993-
96)
Nos de imersão temporária, as gemas
a serem multiplicadas ficam expostas
a ciclos de imersão, evitando a
presença de dispositivos de agitação e
arejamento e, portanto, simplificando
o desenho do biorreator.
Nos BIPER, Fig.1., o desenho não
requer um sistema específico de agitação
e turbulência do meio, sendo que
esta é realizada através do sistema de
arejamento, que, dentro do biorreator,
libera bolhas de ar, tudo que permite
uma renovada e contínua interação
entre os componentes bióticos e abióticos
no interior do biorreator.
No presente trabalho, será descrito
apenas o BIPER e alguns resultados
experimentais serão apresentados para
demonstrar seu potencial no campo da
micropropagação.
Descrição do aparelho*
O aparelho, Fig. 1, basicamente é
um sistema de engenharia simples e
barata. Consta de um recipiente de
vidro com capacidade de 500 a 1000
ml, cuja tampa apresenta dois furos,
um para a entrada do ar (A) e outro
para saída (B), sendo que, em ambos
os casos, esses orifícios estão providos
de dutos de aço inox com filtro Millipore
(0,2 µm de poro) a fim de evitar a
contaminação interna.
O ar é provido através de um microcompressor
(aproximadamente 3
litros/ minuto), e conduzido ao fundo
do recipiente através de uma mangueira
de silicone, de onde sai, através
de um tubo poroso, formando bolhas
que agitarão o meio líquido. Com exceção
da borracha que liga o filtro de
entrada ao compressor, todos os componentes
do sistema são autoclaváveis
(120 °C e 20 minutos).
Inoculação dos explantes
Depois de passar pela autoclavagem,
o BIPER, já contendo o meio
2. Brotos de abacaxi, após 45 dias no BIPER em presença de MS + 5 µM de
BAP. Em MS + 0 BAP a quantidade de brotos foi significativamente inferior
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 51

3. Broto de abacaxi isolado de uma
touceira oriunda de BIPER após 45
dias, pronto para ser transferido para
vermiculita, em casa de vegetação
nutritivo, é aberto na câmara de fluxo
laminar para a inoculação de brotos,
por exemplo, 10 a 20, ou, touceiras de
5 a 10 por frasco, ou ainda, alguns
poucos gramas de orquídeas. O meio
líquido normalmente é constituído do
meio SP (Barrueto Cid et al., 1999)
complementado com diferentes concentrações
de BAP (6-benzilamino
purina) segundo se trate de orquídeas
(Ionopsis ochlereuca), abacaxi (Ananas
comosus L. cv. Perola) café (Coffea
arabica cv Catuaí vermelho 81.),
mamão (Carica papaya L. cv Tainug),
álamo (Populus tremula x P. alba). As
touceiras contendo um número variado
de brotos são previamente obtidas
em meio sólido e é uma precondição
ter seu protocolo de multiplicação estabelecido,
antes de iniciar os trabalhos
com o biorreator.
Como medida preventiva, os explantes
ficaram em erlenmeyer, em
presença de Benlate e Cefotaxima
sódica 100 mg/l por 72 h, em agitador
com 100 rpm, antes de ser inoculados.
Uma vez inoculado o material, os biorreatores
ficaram a uma temperatura de
27 ± 2 °C e fotoperíodo de 16 h luz,
sendo que, depois de 30 a 40 dias, o
material é avaliado.
Resultados
4. Brotos de café Catuaí Vermelho 81, 45 dias em BIPER. À esquerda,
BIPER com SP + 0 BAP. À direita, BIPER com 24 µM de BAP
Os resultados referentes às diferentes
espécies testadas demonstraram
altos rendimentos em relação à quantidade
de explantes originais, Tabela 1.
Isso não deixa de animar ,considerando
que o arejamento contínuo poderia
afetar a produção de biomassa, já que
acarretaria problemas de ordem fisiológica,
como fotorespiração, produção
de ácido glicólico, isto porque a 1-
5 bifosfato carboxilase também é uma
oxigenase, porém a baixa solubilidade
do oxigênio na água a 25 °C e 760
mm Hg ( aproximadamente, 7 mg 0 2
/l ) e a resistência do tecido à difusão
de um gás tornariam esse problema
menos significativo (Desjardins,
1995). Por outro lado, não foi necessário
adicionar antiespumantes (Taticek,
et al. 1991) porque a formação
de espuma não constituiu um problema.
Entretanto, houve em reiteradas
ocasiões problemas de contaminação,
mas essa, em geral, foi contornada
com a utilização de um pré-tratamento
com fungicida e antibiótico,
como já mencionado .
Conforme a Tabela 1, o abacaxi
(cv. Pérola) teve a mais notória resposta
com respeito ao número de
brotos induzidos, na verdade foi tão
exuberante a proliferação do material
que o frasco ficou completamente
cheio aos 45 dias, Fig. 2-3. O que
demonstra que a espécie pode ser
micropropagada não apenas pelo biorreator
de imersão temporária como
era já conhecido (Escalona et al., 1999),
mas também pelo sistema de imersão
permanente ou de borbulhamento,
como no presente caso. No que se
refere ao cafeeiro, os resultados obtidos
foram bastante significativos (Fig.
4). Foi observada uma alta taxa de
multiplicação, a qual é um estimulante,
porque esse tipo de resultado
ainda não havia sido reportado na
literatura, embora já sejam conhecidos
protocolos a partir de embriogênese
somática em biorreator, (Noriega
& Söndahl, 1993). Entretanto, o
risco de plantas anormais (Alemanno
et al. 1997) ou a alta porcentagem de
embriões que não atingem o nível de
planta em casa de vegetação (Boxtel
& Berthouly, 1996) torna válido explorar
outras formas de micropropagação.
Contudo, convém ressaltar que
nem todos os genótipos de cafeeiro
poderão reagir satisfatoriamente às
condições do BIPER.
Para as outras espécies, Fig.5, não
dispomos de registros de micropropagação
via biorreator; por isso, esse
tipo de informação encoraja novos
trabalhos nessa direção, especialmente,
considerando que a vitrificação
52 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

5. Plântula de Ionopsis ochlereuca no centro da placa, após ter passado
30 dias em BIPER. Lateralmente, a mesma espécie com a mesma
idade, porém, crescendo em meio sólido e apresentando touceira
(glassy shoot) não foi um problema em
nosso trabalho.
Em geral, o material multiplicado
proveniente do BIPER, era transferido
para meio sólido SP, (Fig.6), com vistas
ao seu enraizamento e crescimento,
porém, no caso de abacaxizeiro , o
6. Ionopsis ochlereuca após ter
passado pelo biorreator e cultivada
por 90 dias em meio sólido SP
material foi transferido diretamente para
a casa de vegetação , (Fig.2), colocado
em vermiculita e irrigado periodicamente.
Nesse caso particular, ao final
de 30 dias de cultivo nesse tipo de
substrato, foi verificada uma percentagem
de sobrevivência próxima a 100
%. Observou-se também, aos 60 dias,
um percentual de 90 % de enraizamento.
Agradecimentos
Os autores agradecem o suporte
financeiro ao Consórcio Brasileiro de
Pesquisa e Desenvolvimento do Café.
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319:119-124, 1992.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 53

Pesquisa
MICROPROPAGAÇÃO DE BABOSA
(Aloe vera - Liliaceae)
Fotos cedidas pelos autores
Biotecnologia de plantas medicinais
Patrícia Sibila Araújo
M.Sc., Bióloga - Laboratório de Morfogênese e
Bioquímica Vegetal - CCA/UFSC
Josiane M.Oliveira Duarte da
Silva
Acadêmica do curso de Agronomia - Bolsista
Pibic/CNPq
Laboratório de Morfogênese e Bioquímica
Vegetal - CCA/UFSC
Cáter Alexandre Neckel
Acadêmico do curso de Agronomia - Bolsista
PRAExUFSC
Laboratório de Morfogênese e Bioquímica
Vegetal - CCA/UFSC
Carla Ianssen
Acadêmica do curso de Agronomia - Bolsista
Pibic/CNPq
Laboratório de Morfogênese e Bioquímica
Vegetal - CCA/UFSC
Ana Carla Oltramari
M.Sc., Engenheira Agrônoma – Laboratório de
Morfogênese e Bioquímica Vegetal – CCA/
UFSC
Renata dos Passos
B.Sc., Farmacêutica - Mestranda em
Biotecnologia - CCB/UFSC
Laboratório de Morfogênese e Bioquímica
Vegetal - CCA/UFSC
Introdução
Evidências históricas indicam a origem
africana da babosa, uma espécie
cultivada no Egito há milhares de anos,
com registros de sua utilização pelo
povos do Mediterrâneo que remontam
ao ano de 400 a.C. Seu nome científico,
Aloe vera, foi dado por Carl Von Linne,
em 1720, sendo, posteriormente, também
referida como Aloe barbadensis
Miller. Ao longo dos séculos, centenas
de artigos de cunho científico ou não
têm sido publicados descrevendo essa
espécie como fonte de compostos
bioativos. Nesse contexto, o primeiro
Erasmo Tiepo
B.Sc., Engenheiro Agrônomo - Laboratório de
Morfogênese e Bioquímica Vegetal - CCA/UFSC
Dionísio Bernardino Bach
B.Sc., Engenheiro Agrônomo - Naturama Sucos
Integrais do Brasil Ltda
Marcelo Maraschin
Ph.D., Prof. Adjunto III - Laboratório de
Morfogênese e Bioquímica Vegetal - CCA/UFSC
m2@cca.ufsc.br
Figura 1. (a) Planta matriz de Aloe vera oriunda do Paraguai
apresentando brotações laterais (î) com, aproximadamente, 45 dias de
idade. Os meristemas apicais dos brotos laterais contendo um primórdio
foliar foram utilizados como explantes. (b) Microplântulas de babosa
com 30 dias de cultivo em meio MSBA. (c) Aclimatização de plântulas,
21 dias após a transferência para câmara de crescimento, em
recipientes plásticos contendo uma mistura de substrato comercial e
solo - 1:1
54 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

egistro de utilização terapêutica de
A. vera no continente americano
data de 1697; todavia, sua inclusão
na farmacopéia dos EUA (United
States Pharmacopoeia-USP) ocorreu
somente em 1820, como purgativo
e cicatrizante (1).
Embora existam mais de 250
espécies do gênero Aloe, somente
três ou quatro dessas apresentam
propriedades medicinais, sendo a
Aloe vera a de maior interesse, possuindo
também valor nutricional. As
folhas dessa espécie possuem uma
aparência suculenta, sendo que o
mesófilo foliar contém reservas de
água que podem suprir a necessidade
da planta durante longos períodos
de seca, favorecendo sua sobrevivência
em lugares de clima árido.
Estudos fitoquímicos têm demonstrado
a presença de uma série de
compostos de interesse farmacológico
oriundos dos metabolismos primário
e secundário da A. vera, utilizados
em formulações (géis e sucos,
e.g.) preparadas a partir desta planta.
Como exemplos de compostos
mencionam-se: enzimas (lipases,
bradiquinases e proteases), mono e
polissacarídeos (glucomananas),
aminoácidos, vitaminas (A, B 12
, C e
D), antraquinonas (aloína e emodina),
saponinas, ácido salicílico, lignina
e esteróides (lupeol e campesterol).
A esses compostos têm sido
atribuídas diversas atividades biológicas,
tais como antisséptica [saponinas
e antraquinonas], antitumoral [mucopolissacarídeos],
antiinflamatória
[esteróides e ácido salicílico], antioxidante
[vitaminas], imuno-reguladora
e detoxificante [glucomananas]
- (2).
Devido ao amplo espectro de
aplicações na área de saúde humana,
os produtos à base de babosa
vêm apresentando forte expansão
no mercado nacional e internacional.
Esse fato determina uma maior
demanda por matéria-prima de alta
qualidade, sendo esse aspecto uma
restrição à expansão dessa atividade,
devido à pequena disponibilidade
de biomassa de babosa no nosso
mercado interno. O aumento da oferta
de biomassa pressupõe a existência
de incrementos de produtividade
dos cultivos e/ou a expansão da área
desses. Em último caso, a implantação
de cultivos com altos rendimentos tem
como premissa básica a utilização de
material de plantio de alta qualidade
genética e sanitária, além de coloca-lo
disponível no comércio.
A propagação de Aloe vera é realizada
por meio da remoção de brotações
laterais emitidas pela planta-mãe
(Fig. 1a), principalmente ao longo da
estação de crescimento. O número e a
freqüência de brotos laterais emitidos
é bastante variável, fato que dificulta o
planejamento de um sistema produtivo
de mudas no que concerne ao seu
rendimento. Em geral, três ou quatro
brotos laterais são emitidos/ano/planta-mãe.
Esta condição gera um sistema
de produção com baixo rendimento,
sendo um processo moroso e caro,
principalmente quando se considera o
tempo necessário para a obtenção de
um número de mudas que permita a
implantação de 1 hectare, por exemplo,
com valores de densidade de
plantio de 12.000 a 16.000 plantas por
hectare, como usualmente é observado
em plantios comerciais dessa espécie.
Adicionalmente, esse sistema clássico
de produção de mudas apresenta
como característica uma maior probabilidade
de ocorrência de moléstias no
material de plantio, em função das
lesões que são feitas à planta-mãe e às
mudas (brotos laterais), no momento
de sua coleta.
O quadro acima descrito tem gerado
uma situação de limitação da disponibilidade
de material de plantio com
qualidade genética e sanitária superiores,
dificultando a instalação de novas
áreas de cultivo de babosa. Conseqüentemente,
a disponibilidade de
matéria-prima para a elaboração de
produtos nas indústrias de cosméticos
(estéticos e dermatológicos), de fitoterápicos
(purgativos e cicatrizantes) e
alimentícia (complementos nutricionais
e energéticos) é reduzida, e caracteriza
um ponto de estrangulamento
no processo produtivo. Esse fato vem
contribuindo significativamente para a
elevação de preços do(s) produto(s)
final(is) e dificultando a expansão da
atividade, tanto no mercado interno
quanto no externo.
Como solução tecnológica viável
para a resolução desse problema, a
produção de mudas com qualidade
superior e em larga escala pode ser
feita através de técnicas biotecnológicas.
Nesse caso, a cultura de células
e tecidos vegetais vem, desde o início
da década de 70, constituindo
uma estratégia de interesse, em função
de suas potencialidades e de
resultados apresentados para um grande
número de espécies vegetais. Tal
abordagem tem permitido a clonagem
e a multiplicação em larga escala
de espécies vegetais e de germoplasmas
selecionados, os quais, quando
multiplicados por processos convencionais
(estaquia, enxertia, sementes,
alporquia, e.g.), apresentam baixos
valores de rendimento. Nos últimos
anos, a superação dessa dificuldade
tem sido conseguida, em diversos
casos, com a utilização de técnicas
de produção de mudas in vitro (3).
Essa abordagem biotecnológica foi
utilizada pelo Laboratório de Morfogênese
e Bioquímica Vegetal (LMBV),
da Universidade Federal de Santa
Catarina (UFSC) – Departamento de
Fitotecnia-CCA, em parceria com a
empresa Naturama Sucos Integrais
do Brasil Ltda. e o SEBRAE/SC, com o
intuito de desenvolver um protocolo
para acelerar o processo de multiplicação
dessa espécie, de modo que
ele permita formar mudas em larga
escala e em curto espaço de tempo.
Metodologia
O processo de multiplicação foi
iniciado com plantas matrizes de A.
vera de 16 genótipos de procedências
distintas (Florianópolis/SC, Araquari/SC,
Pato Branco/PR, Rolândia/PR,
Colombo/PR e Paraguai - Fig. 1a).
Meristemas apicais contendo um primórdio
foliar (0,5 a 1,5 cm altura)
foram utilizados como explantes para
a micropropagação das plantas matrizes
selecionadas. Os meristemas foram
submetidos ao processo de assepsia
em câmara de fluxo laminar
por meio de imersão seqüencial em
soluções de hipoclorito de sódio 40%
(10 min), etanol 70% (2 min), hipo-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 55

clorito de sódio 40%, (5 min), seguido
de 3 lavagens com água destilada/deionizada/esterilizada.
Os explantes
foram inoculados em 30 mL
de meio de cultura MS (4) suplementado
com sacarose (3g%), ágar
(0,7g%) e reguladores de crescimento:
4,03 µM ácido naftaleno acético
e 6,67 µM 6- benzilaminopurina
(Meio MSBA). Os cultivos (Fig. 1b)
foram mantidos em sala de crescimento
a 24 ± 1°C, 85% U.R., 14 horas
de fotoperíodo e 100 ± 5 µM (RFA),
com um tempo de residência de 35
dias. Ao longo dos experimentos,
foram coletadas plântulas com altura
de parte aérea superior a 3 cm,
transferidas para bandejas alveoladas
contendo substrato comercial
Plantmax® e mantidas em ambiente
de câmara de nebulização por 7 dias.
Subseqüentemente, as plantas foram
transferidas para embalagens
plásticas contendo uma mistura de
solo e substrato comercial Plantmax®
(1:1 – Fig. 1c) e mantidas em
estufa de crescimento, com controle
de irrigação (3 dias) e adubação
foliar (15 e 21 dias - verão e inverno,
respectivamente).
Resultados
O processo de multiplicação massal
de babosa em sistema de cultivo
in vitro teve, inicialmente, necessidade
de desenvolver um protocolo
de isolamento e multiplicação. A
consecução da etapa de isolamento
mostrou-se possível em um período
de 3 meses, sendo que, de forma
preliminar, observou-se que alguns
dos genótipos estudados apresentaram
maiores taxas de sobrevivência
e multiplicação in vitro, sugerindo a
ocorrência de potenciais de propagação
distintos.
Os estudos de multiplicação demonstraram
que as condições utilizadas
induziram uma taxa de proliferação
de gemas laterais na razão de
1:2, em média. Essa taxa de multiplicação
mostrou-se dependente do
componente genotípico (planta
matriz), uma vez que valores de 1:8
foram também observados. De fato,
esses resultados comprovaram os
dados indicadores da existência de
Figura 2. (a) Rizogênese in vitro de Aloe vera: (1) 20 dias de cultivo
(ausência de primórdios radiculares), (2) 30-35 dias de cultivo - 1 raiz,
(3) 45 dias de cultivo - 3 raízes e (4) 60 dias - 4 raízes. (b) Plântulas
desprovidas de sistema radicular devido à sua degeneração em
momentos iniciais (~ 20 dias) da fase de aclimatização. (c) Plântula de
babosa com sistema radicular regenerado durante a fase de
aclimatização (~ 60 dias após a transferência para câmara de
crescimento). Nessa fase, foi observada a emissão de raízes
secundárias. (d) Mudas com, aproximadamente, 180 dias de idade
destinadas ao plantio no campo
clones com expressão morfogenética
in vitro distinta. De forma específica,
os germoplasmas oriundos do Paraguai
evidenciaram maiores taxas de multiplicação,
com valores de 1:6 a 1:8.
Índices de multiplicação in vitro semelhantes
foram encontrados na literatura,
onde a técnica de micropropagação
tem propiciado sucessos como alternativa
de produção de mudas em larga
escala de diversas espécies medicinais
exploradas comercialmente, tais como
Coleus forskohlii, Camptotheca acuminata
e Valeriana edulis sp. procera
(5).
O protocolo descrito viabilizou o
início do processo de rizogênese in
vitro (Fig. 2a), porém tal aspecto mostrou-se
dependente do tempo de cultivo.
Períodos superiores a 35 dias
viabilizaram as maiores taxas de enraizamento
e, em função disso, o tempo
56 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

médio de residência dos cultivos foi
alterado para 45 dias. Esses dados
sugerem que a indução à rizogênese
de babosa in vitro parece estar associada
ao esgotamento gradativo dos
nutrientes no meio de cultura. Essa
metodologia tem permitido a obtenção
de mudas com sistemas aéreo e
radicular, sem necessidade de formulação
de meio de cultura para enraizamento.
Adicionalmente, foi observado
que o enraizamento in vitro
exerceu marcada influência sobre a
sobrevivência das plântulas na fase
de aclimatização. De fato, ao longo
dessa fase, as plântulas enraizadas in
vitro apresentaram valores elevados
de taxas de sobrevivência, que se
situaram entre 80% a 95%, enquanto
taxas de sobrevivência inferiores a
30% e crescimento lento foram observadas
para as plântulas desprovidas
de sistema radicular. De forma
interessante, logo após o transplante,
as plântulas enraizadas in vitro apresentam
degeneração do sistema radicular
(Fig. 2b), seguida da imediata
emissão de novas raízes primárias e
secundárias (Fig. 2c).
A ocorrência de indivíduos que
expressam variações fenotípicas in
vitro ou ex vitro não foi detectada ao
longo de um período de 16 meses,
com exceção de duas plantas que
evidenciaram a ocorrência de albinismo
e variegação em tecido foliar. Tal
fato provavelmente advém da ocorrência
de variação somaclonal (6),
um fenômeno comum e de ocorrência
aleatória em culturas de tecidos e
células vegetais, caracterizado pelo
surgimento de variantes fenotípicos,
cuja origem poderá ser de natureza
genética e/ou epigenética (7, 8, 9,
10). Como exemplos disso, somaclones
de centeio regenerados a partir
do cultivo de embriões imaturos apresentaram
variações freqüentes no
padrão de acúmulo e distribuição de
clorofila em tecidos foliares (11). De
forma semelhante, plantas jovens de
Picea mariana e P. glauca, regeneradas
por embriogênese somática,
expressaram padrões variegados em
tecido foliar com freqüências de 0,1%
e 0,3%, respectivamente (12). O surgimento
de variantes em processos
de micropropagação tem sido observado
em freqüências distintas, segundo
a fonte de explante (planta matriz),
tipo e idade do explante, via morfogenética
de regeneração (organogênese
ou embriogênese), condições e tempo
de cultivo in vitro, podendo ser um
fenômeno de interesse, quando se
busca variabilidade em programas de
melhoramento genético. No entanto,
quando a uniformidade genética/fenotípica
de indivíduos (true-to-type) na
população micropropagada é a característica
buscada, tal fenômeno é indesejável,
devendo ser monitorado de
forma constante (7, 10, 12). Os resultados
observados nesse estudo indicam
que o fenômeno de variação somaclonal
não apresenta significância
com a utilização do protocolo proposto
(Fig. 2d).
Conclusão
Os resultados obtidos indicam que
a metodologia descrita apresenta viabilidade
do ponto de vista tecnológico,
como sistema de multiplicação clonal
de babosa em larga escala, gerando
mudas de alto valor genético e sanitário.
Ao longo de um período de 8
meses, aproximadamente 2.000 mudas
foram produzidas, a partir de 20
explantes obtidos de germoplasmas
de procedências diversas. O protocolo
inicialmente utilizado é passível de
otimização, porém, comparativamente
ao processo usual de multiplicação
de babosa, os resultados indicam que a
micropropagação clonal de Aloe vera
oferece vantagens significativas no que
concerne à rapidez de obtenção de um
grande número de mudas, cujo interesse
econômico é crescente, em função
de suas propriedades medicinais e
nutricionais.
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spruce (Picea mariana, Pinaceae)
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instability. American Journal
of Botany, 86: 1373-1381, 1999.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 57

SUCAST
Pesquisa
Ilustrações cedidas pelas autoras
Desvendando as vias de transdução de sinal da cana-de-açúcar
Gláucia Mendes Souza
Profª, Drª do Departamento de Bioquímica,
Instituto de Química, USP.
glmsouza@iq.usp.br
Aline Maria da Silva
Professora Associada do Departamento de
Bioquímica, Instituto de Química, USP.
almsilva@iq.usp.br
A cana-de-açúcar na
era da genômica
esde os tempos do Brasil
colônia até os dias de
hoje, a cultura de canade-açúcar
tem sido uma
grande fonte de riquezas
para a economia brasileira. O Brasil é o
maior produtor de cana-de-açúcar do
mundo, com uma safra de 338 milhões
de toneladas em 2001, o que equivale
a 27% da produção mundial 1 . Aproximadamente,
60% da colheita destinase
à produção de álcool e o restante
à produção de açúcar, mas existe a
perspectiva de utilizar-se a cana-deaçúcar
como biorreator na geração de
energia elétrica, na produção de plásticos
biodegradáveis, açúcares não
calóricos e compostos químicos de
interesse farmacêutico. A cana-deaçúcar
é cultivada em 5 milhões de
hectares distribuídos por todos os
Figura 1 – Classes de proteínas de transdução de sinal catalogadas pelo SUCAST
58 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

Figura 2 - Síntese de hormônios em resposta a fatores ambientais
estados brasileiros, mas é no estado
de São Paulo que se concentra a
maioria das lavouras, que representa
metade da produção nacional. Alagoas,
Pernambuco, Minas Gerais e Rio
de Janeiro são também importantes
produtores contribuindo juntos com
quase 30% da safra brasileira.
O sucesso do cultivo da cana-deaçúcar
se deve à utilização de variedades
obtidas através de melhoramento
genético clássico desenvolvido
pelos centros de pesquisa e estações
experimentais como o Centro
de Ciências Agrárias da UFSCar, em
Araras, o Instituto Agronômico de
Campinas e a Copersucar. A cana-deaçúcar
atualmente cultivada é originária
de um cruzamento entre Saccharum
officinarum e Saccharum
spontaneous, que aumentou a produtividade
e a resistência a doenças
dos clones cultivados. O mapeamento
genético dos cultivares mais utilizados
está sendo realizado (Grivet e
Arruda, 2001) porém, a seleção de
variedades mais produtivas, resistentes
a pragas e doenças e adaptadas a
ambientes diversos por intercruzamentos
é um processo demorado, que leva
de 12 a 15 anos. Como podemos
encurtar esse prazo? A genômica aponta
o caminho. O seqüenciamento do genoma
de várias plantas tem facilitado e
acelerado a identificação de genes responsáveis
por qualidades desejáveis,
possibilitando a manipulação subseqüente
de genes de interesse através
de técnicas de genética molecular. Na
era da genômica as manipulações genéticas
serão dirigidas, aumentando a
eficiência de obtenção de variedades
bem sucedidas. Essa nova revolução
verde anuncia a obtenção de variedades
resistentes a múltiplas doenças,
mais adaptadas e produtivas o que
deve diminuir dramaticamente as perdas
na agricultura além de permitir o
aproveitamento de solos até então não
utilizáveis.
Em um futuro não muito distante,
as culturas de cana-de-açúcar também
serão beneficiadas por essa revolução,
pois a cana-de-açúcar acaba
de entrar na era genômica com um
grande trunfo, representado pelas
250.000 ESTs geradas por 22 laboratórios
que fazem parte do projeto
SUCEST (http: // sucest. lad. ic. unicamp.
br; Fioravanti, 2000). ESTs
(Expressed Sequence Tags ou Etiquetas
de Seqüências Expressas) são
seqüências de DNA que representam
trechos de mRNAs (RNAs mensageiros
que serão traduzidos em
proteínas), revelando quais são os
genes expressos em um tecido ou
órgão, em uma dada situação fisiológica
ou patológica. As ESTs da canade-açúcar
não deixam por menos e
representam milhares de genes expressos
em seus diferentes órgãos,
como raiz, colmo, folhas, flores e
sementes, obtidos em vários estágios
de desenvolvimento e submetidos a
variações ambientais diversas incluindo
interações com bactérias (Vettore
et al., 2001). Essa informação
preciosa está sendo cuidadosamente
examinada por 48 laboratórios que
se dedicam à mineração ou prospecção
de dados, o chamado data mining.
É dessa forma que os genes
expressos revelados pelo projeto SU-
CEST estão sendo associados a uma
função no crescimento, desenvolvimento,
respostas a estresses e metabolismo
da planta. A partir dessa
análise, essas prováveis funções poderão
ser associadas a características
desejáveis na cana, que, eventualmente,
possam ser manipuladas para
a geração de novas variedades.
Como é feito o data mining
No data mining pesquisamos semelhanças
entre genes da cana-deaçúcar
e genes identificados em outras
plantas ou em outros organismos,
para designarmos uma provável
função a esses genes, pois estima-se
que 50% dos genes das plantas
superiores tenham uma função
semelhante à encontrada em outros
organismos. A garimpagem é feita
sobre as 250.000 ESTs da cana-de-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 59

Figura 3 - Ativação da resposta de defesa através da cascata da MAP quinase (MAPK)
açúcar que foram previamente separadas,
por semelhança entre suas
seqüências, em 43.000 grupos de
transcritos ou clusters (Pimentel &
da Silva, 2001). Durante a análise
também observamos quantas ESTs
compõem o cluster, pois, em geral,
o número de ESTs de um certo
cluster indica, com boa confiança, o
quanto aquele gene é expresso. Além
disso, se um dado cluster é composto
por ESTs provenientes de um
tecido ou orgão em particular, temos
uma boa indicação da prevalência
de um certo transcrito em um tecido
ou em determinada situação fisiológica
ou patológica.
A tabela I relaciona as ferramentas
de bioinformática utilizadas para
inferência da função gênica a partir
da análise de seqüências de genes e,
naturalmente, das proteínas por eles
codificadas. Invariavelmente, como
primeiro passo, pesquisamos genes
de outros organismos que sejam similares
as ESTs que estamos analisando.
Alta similaridade com um gene de
função conhecida indica uma boa
probabilidade da EST corresponder a
um gene de mesma função na canade-açúcar.
A busca é realizada em
bancos de dados públicos, em geral,
com a ferramenta conhecida como
BLAST. Essa busca pode ser automatizada
e com o resultado obtido é
possível gerar um banco de dados
onde cada EST passa a ter uma provável
função associada. Na prática, no
entanto, a associação de uma função
a um gene ou EST não é um processo
trivial. No caso de famílias gênicas
com um grande número de membros
(genes parálogos), pequenas diferenças
na sequência das proteínas,
que, codificadas por cada um dos
parálogos, podem resultar em funções
distintas e somente uma análise
detalhada dessas seqüências consegue
distinguir membros de subcategorias.
Nesses casos, além dos dados
gerados pelo BLAST, também é
inspecionado o alinhamento da seqüência
de todos os membros da
família, o que possibilita a indexação
das ESTs ou dos clusters de ESTs
a subfamílias e categorias gênicas
específicas. Uma das ferramentas
de alinhamentos mais utilizadas é o
CLUSTAL. É desejável que domínios
protéicos conservados sejam também
pesquisados na seqüência de
aminoácidos deduzida a partir da
seqüência de nucleotídeos de cada
um dos clusters de ESTs analisados.
Nesse caso, as buscas são feitas em
bancos de dados de domínios de
proteínas como Pfam, PROSITE ou
InterPro. Os resultados obtidos pelo
conjunto dessas análises embasam a
atribuição de uma provável função
atribuída a um gene a partir apenas
de dados do seqüenciamento.
60 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

Tabela I
Ferramentas de data-mining
Referência
BLAST - algoritmo que pesquisa similaridade entre seqüências Altschul et al., 1997
CLUSTAL - algoritmo de alinhamento de seqüências Jeanmougin et al., 1998
PROSITE - banco de dados de famílias e domínios Hofmann et al., 1999
Pfam - banco de dados de famílias e domínios Bateman et al., 1999
INTERPRO - banco de dados de famílias e domínios Apweiler et al., 2001
SUCAST: Minerando a Transdução
de Sinal da Cana de Açúcar
O projeto SUCAST (do inglês Sugar
Cane Signal Transduction) tem
como uma de suas propostas a identificação
e catalogação de ESTs da
cana-de-açúcar que estão envolvidos
em vias de transdução de sinal. Durante
o seu ciclo de vida, as plantas
são constantemente bombardeadas
por sinais ambientais e uma resposta
adequada a cada um desses sinais é
determinante para sua sobrevivência
e para sua produtividade máxima. A
compreensão das redes genéticas que
orquestram tais respostas, que podem
ser fisiológicas, bioquímicas, morfológicas
ou de desenvolvimento é o
foco de estudos recentes sobre transdução
de sinal. Nesse contexto, a
investigação dos mecanismos de integração
de todos os sinais levou a
identificação de vários hormônios que
agem na planta de uma maneira
tanto local quanto sistêmica, alterando
o padrão de expressão de genes
responsáveis por efetuar as mudanças
necessárias em resposta aos sinais
ambientais. Em muitos casos, o melhoramento
genético de uma planta
implica a manipulação de componentes
que mediam a transdução de
sinais, de modo que se explorem as
redes de comunicação que detectam
alterações do meio ambiente e que
desencadeiam mudanças no padrão
da expressão gênica.
A partir da análise de genomas
completos que foram recentemente
seqüenciados como o da levedura
Saccharomyces cerevisae, da mosca
de fruta Drosophila melanogaster,
do verme Caenorhabditis elegans e
da planta Arabidopsis thaliana foi
calculado que de 7% a 15% dos genes
de um organismo codificam para proteínas
envolvidas na transdução de
sinal. Se assumirmos que os 43.000
clusters ESTs da cana-de-açúcar representam,
aproximadamente, o número
de genes dessa planta, é razoável inferir
que, pelo menos 4.000 de seus
transcritos se encontrem na categoria
de genes relacionados com a transdução
de sinal (Souza et al., 2001). Utilizando-se
as ferramentas delineadas na
Tabela I, cerca de 900 clusters de ESTs
já foram relacionados com diferentes
vias de transdução de sinal da cana-deaçúcar
e constam do catálogo do projeto
SUCAST que está disponível no
website http://sucest.lad.ic.unicamp.br/
private/mining-reports/QG/QGmining.htm.
A figura 1 ilustra as diferentes classes
de proteínas relacionadas com a
transdução de sinal da cana-de-açúcar
codificadas pelos clusters de ESTs que
foram analisados até o momento. Essas
classes estão relacionadas com o complexo
sistema de sinalização que as
plantas desenvolveram ao longo da
sua evolução e que permite a sua
adaptação a uma vasta gama de condições
ambientais através, principalmente,
da sinalização hormonal (para uma
revisão sobre vias de transdução de
sinal em plantas, ver Trewavas, 2000).
Sinais, receptores e mensageiros
secundários da cana-de-açúcar
A ferramenta mais poderosa para
identificar o papel dos hormônios na
transdução de sinais foi a identificação
de mutantes em suas vias biossintéticas.
Através da utilização de técnicas
de genética molecular e complementação
de mutantes, muitas das enzimas
de síntese e degradação de hormônios
foram associadas a processos de crescimento,
envelhecimento, desenvolvimento,
diferenciação, amadurecimento,
dormência, resposta a ferimentos
e defesa contra doenças. Entre
os hormônios vegetais encontramos
o gás etileno, as giberelinas, o
ácido jasmônico, o ácido abscíssico e
as auxinas. Como esperado, a maioria
das enzimas que participa na biossíntese
desses hormônios está representada
no conjunto de ESTs da cana-deaçúcar.
Acredita-se que a integração dos
sinais ambientais durante as várias
fases do ciclo de vida da planta se dê
pela ação coordenada e simultânea
de vários hormônios, uma vez que as
mutações na via de síntese de um
hormônio alteram, em muitos casos, a
síntese de outro. A obtenção de plantas
transgênicas alteradas nas vias de
síntese de hormônios é de interesse
econômico e tem sido alvo de intensa
pesquisa. Como esquematizado na
figura 2, os sinais ambientais podem
ser ferimentos, peptídeos, produtos
derivados de microorganismos e patógenos,
além de outros agentes do
meio ambiente como luz, gravidade,
temperatura, vento, água, nutrientes
e minerais do solo.
A maioria da recepção de sinais
ocorre na da membrana celular, mas
existem alguns exemplos de receptores
intracelulares como os fotoreceptores
que regulam o ritmo circadiano.
Os receptores comumente encontrados
são receptores ligados a
proteínas G, ligados a canais de íons e
os que possuem atividade enzimática.
Essa última categoria é a mais
freqüente na cana-de-açúcar, sendo
principalmente representada pelos
receptores com atividade de proteína
quinase (atividade enzimática responsável
pela fosforilação de certos resí-
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 61

duos de aminoácidos em substratos
protéicos). O catálogo SUCAST relaciona
clusters de ESTs de, pelo
menos, 200 receptores, sendo, aproximadamente,
10% do tipo histidina
quinase (fosforilam resíduos de histidina)
e 50% do tipo serina/treonina
quinase (fosforilam resíduos de serina
ou treonina). Uma análise mais
detalhada dos domínios das proteínas
codificadas por essas ESTs revelou,
nesse segundo grupo, uma subfamília
numerosa que contem domínios
ricos em leucina chamados LRR
(do inglês, Leucine Rich Repeat).
Essa classe de receptores constitui a
base molecular do reconhecimento
de patógenos pelos genes R de
resistência a doenças onde o domínio
LRR seria responsável pela mediação
de interações entre proteínas.
Domínios LRR também são encontrados
em receptores do tipo
CLAVATA1 e ERECTA, que regulam
o crescimento do meristema.
As informações recebidas pelos
receptores extracelulares são transmitidas
para alvos intracelulares através
dos chamados mensageiros secundários,
que, em geral, são moléculas
difusíveis. Mensageiros secundários
da família do fosfatidilinositol
estão presentes na cana, uma vez
que as ESTs que codificam as enzimas
da via de síntese dessas moléculas
foram detectadas. Também
identificamos ESTs relacionadas com
o metabolismo do íon cálcio, como
canais de cálcio, calmodulina, calreticulina
e calnexina, sugerindo que
esse importante mensageiro secundário
é ativo na transmissão de sinais
na cana-de-açúcar. Nas plantas, o
cálcio é um sinal proeminente e as
interações intracelulares reguladas
por esse cátion são bastante complexas.
Mudanças nos níveis de cálcio
mediadas por canais de cálcio
estão associadas com o início de
algumas respostas, como o fechamento
de estômatos, re-orientação
do crescimento do tubo do pólen e
aumento da espessura da parede
em resposta ao vento.
Por outro lado, mensageiros secundários
relevantes para outros organismos,
como cAMP, cGMP e cA-
DPr, parecem não estar presentes
em plantas e tampouco na cana-deaçúcar,
pois não verificamos a presença
de ESTs que codificam proteínas
relacionadas ao metabolismo destes
nucleotídeos entre o conjunto de ESTs
seqüenciados no projeto SUCEST.
A síntese de mensageiros secundários
após a ativação de certos tipos
de receptores é mediada por um trio
de subunidades protéicas (α, β e γ)
conhecido como proteína G (porque
se associa ao nucleotídeo GTP), e
também por proteínas capazes de
hidrolizar esse nucleotídeo, as chamadas
GTPases pequenas. O processo de
acoplamento e ativação dessas últimas
é finamente regulado por proteínas
acessórias, chamadas de GAPs, GEFs e
GDIs, que funcionam como ativadores,
dissociadores e inibidores da atividade
GTPásica. Todos esses elementos
estão codificados por ESTs da canade-açúcar
e foram catalogados no projeto
SUCAST, incluindo exemplos das
três subunidades das proteínas G (α, β
e γ) e todas as classes de uma enorme
família de GTPases pequenas, além
dos seus respectivos GAPs e GDIs
Proteínas quinases, fosfatases
e fatores de transcrição
A grande maioria das vias de transdução
de sinal engloba uma cascata de
eventos de fosforilação e desfosforilação
de proteínas catalisadas pelas proteínas
quinases e proteínas fosfatases,
respectivamente. A ativação dessas
cascatas de fosforilação media respostas
a estímulos distintos, como luz,
agressão por patógenos, reguladores
de crescimento, estresses variados e
deprivação de nutrientes, que são percebidos
por receptores, como descrito
anteriormente. Centenas de proteínas
quinases e dezenas de proteínas fosfatases
distintas estão representadas entre
os clusters de ESTs da cana-deaçúcar,
demonstrando que a fosforilação
reversível de proteínas é um mecanismo
de regulação importante também
nessa planta. Entre as cascatas de
fosforilação que ocorrem na cana-deaçúcar,
destacamos a via da MAP quinase,
que é uma das mais conhecidas
em plantas e representa um exemplo
clássico de cascata de fosforilação. O
módulo básico da cascata é constituído
de três quinases chamadas MAPK,
MAPKK (ou MEK) e MAPKKK (ou
MEKK). Ao menos oito MAPKs foram
identificadas entre os clusters de
ESTs da cana-de-açúcar. Está postulado
que sinais extracelulares, como
os indicados na Figura 3, são captados
por receptores, na sua maioria
ainda desconhecidos, levando a ativação
da MAPKKK, que, fosforila a
MAPKK, que, por sua vez, fosforila a
MAPK. Esta última proteína quinase
provoca ativação da transcrição de
genes de defesa e proteção a estresses,
por exemplo. Além da ativação
verificada diretamente sobre a atividade
de proteína quinase dessas
enzimas, foi verificado que os genes
que as codificam tem a transcrição
ativada em resposta a vários sinais e
patógenos, conferindo resistência sistêmica
a doenças.
A transdução do sinal extracelular
culmina com mudanças no padrão
de expressão de genes que codificam
proteínas executoras da ação
final que, em última instância, são as
responsáveis pelas mudanças fisiológicas
necessárias para os processos
de adaptação, defesa, crescimento
ou desenvolvimento em resposta
aos distintos estímulos. A transcrição
gênica é regulada por fatores de
transcrição divididos em famílias, de
acordo com os domínios protéicos
característicos. Os mais comuns são
os fatores de transcrição do tipo
hélice-volta-hélice, com zíperes básicos
de leucina, com dedos de zinco
e com motivos HMG (do inglês,
high-mobility group). Duzentos e
cinqüenta fatores de transcrição foram
identificados até o momento
entre os clusters de ESTs da cana-deaçúcar,
incluindo um grande número
de genes homeóticos que codificam
fatores do tipo hélice-volta-hélice e
atuam como mestres na regulação
do desenvolvimento.
Como a genômica pode
contribuir para o melhoramento
da cana-de-açúcar?
A quantidade de informação gerada
por um projeto da magnitude
do SUCEST é imensa e projetos de
prospecção de dados, como o SU-
62 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

CAST, são essenciais para que as
informações relevantes para a pesquisa
básica e para o melhoramento
da cana-de-açúcar possam ser extraídas.
O SUCAST tem como uma
de suas metas a organização de
todas as informações da estrutura e
da função de genes e proteínas que
compõem e regulam as vias de
transdução de sinal da cana-de-açúcar,
em um banco de dados que
facilite futuras análises funcionais.
Para essas análises, o projeto pretende
incluir dados sobre a expressão
dessa categoria de genes e que
serão obtidos através da tecnologia
de microarrays de DNA em lâminas
de vidro (chips de DNA). Utilizando
essa tecnologia, será possível
investigar o perfil da expressão
dos genes relacionados com a transdução
de sinal em resposta a sinais
ambientais variados, tais como estresses
bióticos ou abióticos, além
da comparação da expressão desse
conjunto de genes entre variedades
de cana-açúcar de interesse
agrícola.
Além dos genes descritos neste
artigo, outros projetos de data mining,
que são parte do projeto
SUCEST, já identificaram genes envolvidos
na resistência a pragas,
estresses diversos, metabolismo de
açúcares, absorção de nutrientes,
regulação do ciclo celular, assimilação
de nitrogênio, tolerância ao alumínio
e desenvolvimento da planta.
A comparação do padrão de
expressão desses genes com aqueles
relacionados com a transdução
de sinal, e que relatamos aqui, fornecerá
pistas diretas sobre quais os
módulos de sinalização é que regulam
os processos fisiológicos e patológicos
relevantes para a biologia
da cana-de-açúcar. Ademais, aproximadamente,
46% das ESTs da
cana-de-açúcar geradas pelo SU-
CEST não estão descritas em bases
de dados públicas. Essas seqüências
são inéditas e correspondem a genes
ainda completamente desconhecidos!
A engenharia genética da
cana-de-açúcar e de outras gramíneas
tem, portanto, um futuro garantido
e promissor. As informações
derivadas da análise das 250.000 ESTs
da cana-de-açúcar somadas aos dados
de seqüenciamento de ESTs e genoma
do arroz e do milho, que estão
sendo gradualmente disponibilizados,
compõem uma base sólida para a
elucidação dos mecanismos de defesa,
de adaptação a solos e de crescimento
dessas plantas em regiões de
cultivo diferenciadas.
Informações adicionais
Detalhes sobre o trabalho de data
mining do projeto SUCAST podem
ser encontrados em Souza et al., 2001
e nos seguintes endereços:
SUCAST: http://sucest .lad.ic.
unicamp.br / private/mining-reports/
QG/QG-mining.htm
SUCEST: http://sucest. lad. ic. unicamp.
br
Informações sobre as autoras
Gláucia Mendes Souza é doutora
em Bioquímica pela Universidade de
São Paulo, fez pós-doutorado no La
Jolla Cancer Research Foundation, em
San Diego e no Baylor College of
Medicine, em Houston, EUA. Atualmente
é professora doutora no Departamento
de Bioquímica do Instituto
de Química da USP, São Paulo. E-
mail: glmsouza@iq.usp.br
Aline Maria da Silva é doutora em
Bioquímica pela Universidade de São
Paulo, fez pós-doutorado na Saint Louis
University, em Saint Louis, EUA. É
livre-docente em Bioquímica pela USP
e professora associada no Departamento
de Bioquímica do Instituto de
Química da USP, São Paulo. E-mail:
almsilva@iq.usp.br
Referências
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Mol. Biol. no prelo.
1
(Ministério da Agricultura e Abastecimento
e Food and Agriculture
Organization for the United Nations)
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 63

Pesquisa
Anotação Funcional
Computacional de Proteínas
Fotos e ilustrações cedidas pelos autores
Novos métodos computacionais poderão preencher lacunas do sistema de anotação atual
Daniel John Rigden
Pesquisador na Área de Bioinformática
Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia – Cenargen/Embrapa
Brasília, DF
daniel@cenargen.embrapa.br
Luciane Vieira de Mello
Pesquisadora na Área de Bioinformática
Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia – Cenargen/Embrapa
Brasília, DF
mello@cenargen.embrapa.br
Introdução
característica mais importante de
uma proteína é sua função. Pode
até mesmo se dizer que a existência
de uma proteína depende da
sua função; enquanto que o DNA nãocodificante
de um organismo pode incluir
copias não-transcritas de genes. Sendo assim,
o custo energético de sintetizar uma
proteína assegura que somente proteínas
com funções necessárias para um organismo
sejam produzidas. A função de uma
proteína pode ser descrita em vários níveis
de detalhes, do fisiológico – proteína X está
envolvida no processo de replicação de
células –, até o químico –proteína X catalisa
a hidrólise de um certo substrato. Para se
determinar experimentalmente a função molecular
de uma proteína, é necessário purificá-la
(às vezes com a ajuda de técnicas
modernas de biologia molecular), e, em
seguida, testar sua atividade biológica. Os
resultados podem ou não fornecer dados
sobre as funções in vivo da proteína. Alternativamente,
pode-se utilizar novas metodologias,
como microarranjo (microarrays) ou
análise proteômica, quando o objetivo é
focalizar diretamente nos níveis de expressão
de determinadas proteínas, ou na expressão
dos genes que as codificam, sob
diferentes condições ambientais, ou em diferentes
etapas do desenvolvimento. Esses
métodos fornecem indicações da função in
vivo da proteína, mas, ao contrário dos
ensaios, dizem pouco sobre a função em
termos químicos e bioquímicos. Todas essas
técnicas exigem um investimento significativo
em equipamento e tempo, tanto que não
podemos pensar em estudar diretamente
mais do que uma minúscula fração de
proteínas de interesse.
Ao contrário, seqüências biológicas são
atualmente obtidas a um custo relativamente
baixo. Isso reflete no crescimento exponencial
do tamanho dos bancos de dados de
seqüências. Porém, essa vasta quantidade
de dados é de pouco valor científico ou
aplicado, sem a sua adequada anotação
funcional. Como experimentos laboratoriais
dificilmente vão ser capazes de tratar
essa grande quantidade de dados, o caminho
alternativo é através da análise computacional.
Embora já existam sistemas
computacionais capazes de anotar, até
certo ponto, todas as novas seqüências
que vêem sendo determinadas, estes ainda
apresentam graves falhas. Além de
produzir uma anotação significativamente
incompleta, erros estão sendo introduzidos
na anotação de algumas seqüências
que, pela natureza do sistema, podem
rapidamente ser propagados a outras seqüências
a serem analisadas.
Essa revisão é dividida em três partes.
Na primeira, descreve-se brevemente o
modo atual de anotação funcional computacional,
destacando suas falhas. Na
segunda parte, são discutidas as novas
possibilidades para a anotação funcional
computacional, cujo desenvolvimento foi
estimulado pelos projetos genoma. E finalmente,
as novas idéias que buscam
informações sobre função através de análises
de estruturas são avaliadas. Um resumo
do fluxo de dados durante o processo
de anotação funcional está ilustrado na
Figura 1.
O sistema atual de anotação
funcional computacional
Atualmente, novas seqüências biológicas
são anotadas funcionalmente simplesmente
através da comparação com
seqüências existentes, que são armazenadas
em bancos de dados como, por
exemplo, o GenBank (http://www.ncbi.
nlm. nih. gov/ entrez/query. fcgi?db =
Protein). BLAST (Altschul et al, 1990) é o
programa padrão para essa comparação,
devido à sua extrema eficiência. Esse
programa possibilita a comparação das
milhares de novas seqüências geradas
diariamente, com as depositadas em bancos
de dados, que vêem crescendo expo-
64 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

nencialmente. Assim, a nova
seqüência é comparada com
outra já existente e bem caracterizada,
e que apresentou o
maior grau de similaridade com
a nova seqüência, sendo sua
função transferida para esta.
Dependendo do grau de similaridade,
a anotação pode ser
modificada de ´Proteína X´
para ´Proteína X-provável´ ou
´Semelhante à proteína X´, refletindo
assim uma incerteza
na transferência de função,
em casos onde a similaridade
entre as duas seqüências seja
considerada baixa.
A principal vantagem do
sistema atual encontra-se na
sua eficiência, que, mesmo
em face da avalanche de seqüências
novas, possibilita a
anotação rápida de todas as
novas seqüências. Porém, está
ficando cada vez mais claro
que o sistema atual tem sérias
falhas. Uma falha não muito
grave é a incapacidade do
sistema em anotar novas seqüências
que não apresentam
similaridade significativa com
seqüências existentes. Os resultados
de projetos de genoma
mostram que, em cerca de
40% dos casos, uma seqüência
não mostra similaridade
significativa com uma proteína já caracterizada
(Gerlt and Babbitt, 2000). Nesses
casos, o sistema atual é incapaz de
fornecer uma anotação útil.
Uma falha mais grave, é uma série de
problemas capazes de introduzir erros
nas anotações funcionais dos bancos de
dados. Uma vez que não existem dados
experimentais sobre a grande maioria
das proteínas, o sistema computacional
transfere anotações de funções para
novas seqüências com uma freqüência
muito maior do que a transferência proveniente
de dados laboratoriais. Assim,
fica claro que qualquer erro que seja
introduzido na anotação computacional,
será rapidamente transmitido a múltiplas
novas seqüências (Karp, 1998).
Uma fonte rica de erros de interpretação
de seqüências encontra-se na interpretação
errônea, ou superinterpretação
dos resultados do BLAST (Pertsemlidis
e Fondon, 2001). O BLAST mede
similaridade local de duas seqüências.
Entre as propriedades não medidas pelo
programa estão a similaridade global, a
similaridade funcional, a similaridade
Fig 1: Fluxo de dados durante o processo de
anotação funcional. Linhas interrompidas indicam
tradução (DNA → Proteína)
estrutural e a homologia (ancestral em
comum). O mau entendimento do algoritmo
do programa e, portanto, das limitações
associadas aos seus resultados,
pode levar usuários leigos a conclusões
erradas (Pertsemlidis e Fondon, 2001).
Um artigo publicado na revista Nature
(Ichikawa et al., 1997), e subseqüentemente
retratado, é um exemplo importante
(e famoso) de como erros de
interpretação podem levar a conclusões
errôneas do estudo. Problemas adicionais
podem haver nos sistemas automatizados,
nos quais a anotação é feita sem
intervenção humana (Doerks et al., 1998).
Por exemplo, a maior similaridade local
entre uma nova seqüência e seqüências
existentes pode ficar fora das regiões
responsáveis pela atividade da proteína.
Assim, a anotação da nova proteína
ficará, pelo menos, incompleta e, algumas
vezes, incorreta. Também são comuns
os casos nos quais a seqüência
mais parecida com a nova proteína não
possui uma função anotada, ou é anotada
com uma função secundária da proteína.
Dessa forma, a anotação mais
adequada é ignorada pelos sistemas
automatizados, uma vez
que o grau de similaridade da
nova proteína é menor com
tais proteínas. A comparação
das anotações automatizadas
realizadas por três diferentes
grupos do genoma de Mycoplasma
genitalium mostrou que
as anotações possuíam, pelo
menos, 8% de erro (Brenner,
1999).
Embora os erros de interpretação
claramente contribuam
para uma anotação errônea,
um outro fator ainda mais
problemático é a anotação por
comparação, ou seja, a relação
complicada entre o grau de
similaridade existente entre
duas seqüências, e a similaridade
funcional entre elas. Resumindo,
com alta identidade
entre as seqüências (>80%),
pode-se assumir que as suas
funções sejam idênticas. Porém,
na faixa de baixa identidade
(

derações teriam pouca importância
se, na maioria dos
casos, houvesse um alto grau
de identidade entre a nova
proteína e a mais semelhante
presente no banco de dados.
Isso porque, dessa forma,
poderíamos ter alta confiança
na identidade de função
entre as duas proteínas.
No entanto, infelizmente,
como mostra um estudo recente
(Devos e Valencia,
2001; Figura 2b) isso está
longe de ser verdade. Analisando
o grau de identidade
entre proteínas anotadas para
três genomas e as seqüências
mais parecidas disponíveis,
foi observado que, num
caso típico (50% dos casos),
somente 25%-35% de identidade
de seqüência (Figura
2b). Porém, como explicado
acima, é justamente nessa
faixas de identidade de seqüência
que a relação entre
identidade de seqüência e
similaridade de função permitem
a transferência confiável
de função. Resumindo,
na faixa de identidade de
seqüência na qual uma anotação
funcional é tipica, uma
fração significativa das anotações
vai ser provavelmente
realizada erroneamente.
Grandes erros, por exemplo
no primeiro dígito do código
EC, vão ser menos comuns
do que erros considerados
menores, ou seja, no último
dígito do código, por exemplo.
Nas anotações dos três
genomas analisados, foi estimado
que o primeiro dígito
estava errado em 2% dos
casos, enquanto que, para o último
dígito, mais de 30% das anotações estavam
incorretas.
Assim, tendo-se conhecimento das
limitações dos métodos de anotação
atualmente disponíveis e utilizados, seja
pela anotação equivocada, seja pela
incapacidade de anotar cerca de 40%
das proteínas, novos métodos computacionais
para anotação funcional vêem
sendo buscados. Hoje, após alguns anos
de progresso notável, existem novas metodologias
complementares ao sistema
tradicional de comparação de seqüências.
Na sua maioria, elas podem ser
divididas em duas categorias. Primeiro,
66 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002
Fig 2: O problema fundamental da transferência de anotação
funcional. a) Aos níveis mais baixos de identidade de seqüência,
a porcentagem dos casos nos quais a função é
idêntica (4 dígitos do código EC são iguais) é baixa (linhas
continuas); e os pares com funções não-relacionadas (nenhum
digito do código EC em comum) alta (linhas interrompidas).
b) Tipicamente, durante o processo de anotação funcional
computacional, a porcentagem de identidade entre a
proteína a ser anotada e a seqüência encontrada no banco
de dados é baixa - entre 20% e 40%. (Dados de Devos e Valencia,
2001)
as metodologias em decorrência dos
projetos genoma (Marcotte, 2000). Isso
porque esses projetos geraram informações,
que são a base das novas técnicas,
tais como a posição de determinados
genes, ou, simplesmente, devido à grande
quantidade de seqüências atualmente
disponíveis. A segunda categoria contém
metodologias que utilizam o aspecto
estrutural (Thornton et al., 2000). Esses
aspectos estruturais são provenientes,
tanto de modelos protéicos, como de
estruturas tridimensionais determinadas
experimentalmente. Ao contrário da situação
atual, na qual a maioria das estruturas
determinadas experimentalmente
são de proteínas de funções
conhecidas, os projetos de
genoma estrutural (Thornton,
2001) vão ter como resultado
muitas proteínas com estruturas
determinadas, porém com
funções desconhecidas.
Genômica computacional
Entre os cinco diferentes
métodos que podem ser agrupados
sob esse título, três são
estreitamente dependentes das
seqüências provenientes dos
projetos de genomas completos
1 , assim não se aplicando
às seqüências derivadas de
outras fontes, como genomas
expressos (funcionais) e proteomas.
Esses métodos são
denominados perfis filogenéticos
(filogenetic profile), contexto
genômico (genome context)
e genoma diferencial (subtraction
of genome).
O mais simples, porém o
menos eficiente, desses métodos
é o genoma diferencial
(Huynen et al., 1997). Esse
método procura localizar genes
envolvidos em aspetos
fisiológicos importantes de um
organismo pela comparação
do seu genoma com o de um
organismo parecido, mas com
características diferentes. Por
exemplo, pode-se comparar
os genomas de duas bactérias,
filogeneticamente próximas,
sendo que uma possui
patogenicidade e a outra não.
Assim, espera-se que os genes
associados com a patogenicidade
estejam presentes somente
no genoma da bactéria
patogênica. Embora resultados
interessantes venham sendo obtidos,
a desvantagem do método é que os
genes associados com a propriedade de
interesse sempre farão parte de uma
grande lista de genes, incluindo muitos
que estão presentes no organismo patogênico,
mas que não estão associados
com a doença.
A técnica de perfil filogenético (Pelligrini
et al., 1999) é baseada numa proposta
muito simples - que componentes
de complexos macromoleculares ou
enzimas de uma certa via metabólica vão
ser herdados concomitantemente. Assim,
os componentes isolados dos complexos
ou vias, que, quando presentes

isoladamente nas células, são incapazes
de exercer suas funções, não são encontrados
separadamente. Na primeira etapa,
um perfil de uma proteína é construído,
composto de dados de presença ou
ausência da proteína em vários genomas.
Depois, faz-se uma busca por outras
proteínas com o mesmo perfil de
presença ou ausência, ou um perfil
pouco diferente. Essas são indicadas
como proteínas possivelmente relacionadas
funcionalmente com a proteína
utilizada para a construção do perfil. No
trabalho original, perfis construídos para
proteínas do ribossomo, do flagelo (complexos
macromoleculares) e da via biosintética
de histidina (via metabólica)
produziram resultados que estavam de
acordo com os dados experimentais,
demonstrando a validade desse método
(Pelligrini et al., 1999). A dependência do
método de perfis filogenéticos dos genomas
completos é devida aos estudos de
genes ou de proteínas expressas não
fornecerem dados definitivos sobre a
presença ou ausência de um particular
gene no genoma relevante.
Métodos de contexto genômico usam
a existência de agrupamento (clusters) de
genes nos genomas de procariotos (Overbeek
et al., 1999a). Embora as razões e os
mecanismos responsáveis pela manutenção
desses agrupamentos sejam desconhecidos,
sua característica mais marcante
é a composição de genes funcionalmente
relacionados. Assim, podemos
inferir uma relação funcional entre os
genes presentes em novos agrupamentos
descobertos. Dois aspectos distintos,
mas complementares, dos agrupamentos,
têm poder para preverem a relação
de função – a conservação de uma
distância pequena entre um par de genes
(Overbeek et al., 1999b) e a conservação
da ordem dos genes no DNA (Overbeek
et al., 1999a). Assim, podemos comparar
genomas (e não seqüências individuais,
como é tradicionalmente feito) buscando
agrupamentos de genes em genomas
filogeneticamente distantes, e inferir uma
relação funcional entre os genes componentes.
Observa-se que proteínas que se
interagem fisicamente apresentam uma
tendência particular de serem codificadas
por genes de ordem conservada.
Dessa forma, há uma dependência entre
os métodos de contexto genômico pelas
seqüências oriundas dos projetos de
genoma completo. Isso ocorre, uma vez
que projetos de genoma expresso e
Fig 3: A grande cavidade entre os domínios 1 e 2 da estrutura experimental
de uma proteína de proteção de plantas contém uma região com vários
resíduos conservados (vermelho). Esse padrão está presente em toda a sua
família protéica. Assim, é altamente indicada como um sítio de ligação
proteoma não fornecem informações
sobre posicionamento dos genes no
DNA do organismo.
Existem outros métodos, recentemente
desenvolvidos, que podem ser aplicados
a qualquer seqüência, independente
da sua origem. Assim, são igualmente
aplicáveis aos resultados de projetos de
genoma completo, genoma expresso e
proteoma, bem como às seqüências
determinadas individualmente por experimentos
tradicionais. Porém, vale notar
que foi a quantidade de dados de seqüência
provenientes, principalmente,
dos projetos genoma que incentivaram o
desenvolvimento dessas novas técnicas.
A primeira dessas técnicas baseia-se nas
conseqüências de eventos de fusão de
genes (Marcotte et al., 1999). Foi observado
que proteínas presentes separadamente
num genoma estão, às vezes,
presentes como uma única proteína, do
tamanho igual à soma dos dois componentes,
em outros genomas. Essa observação
necessariamente implica uma relação
funcional entre os dois componentes,
pois seria uma desvantagem para
o organismo a expressão de duas proteínas
não relacionadas funcionalmente,
em conjunção. A observação de um
caso dessa natureza é uma forte indicação
de que as proteínas, quando presentes
individualmente num organismo,
podem interagir. Faz-se essa inferência
porque o motivo mais forte que levaria a
fusão de duas proteínas seria a proximidade
das duas numa via metabólica.
Assim, depois da fusão, a transferência
do substrato de um componente ao
outro seria facilitada. Porém, a fusão
pode também ser tolerada, ou até favorecida,
em termos evolucionários, em
caso de duas proteínas com funções
relacionadas. Outras análises adicionais
mostraram-se capazes de apontar casos
de interação entre dois componentes
protéicos, quando existentes separadamente
em um determinado organismo
(Marcotte et al., 1999).
Enquanto as análises de contexto
genômico e fusão de genes, principalmente
orientadas para a identificação de
1
O termo genoma completo se refere-se aos projetos genoma que sequüenciam todo o conteúdo genético (DNA) de um
organismo. O termo genoma estrutural foi utilizado como no Inglês, structural genome, que se refere à estrutura protéica.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 67

Fig 4: Similaridade em características eletrostáticas é correlacionada com similaridade de função. a) diferenças em
características eletrostáticas entre Phosphoglycerate mutase (esquerda) e YhfR (direita) indicam funções diferentes, mesmo
que as duas proteínas exibam cerca de 30% de identidade de seqüência (Rigden et al., 2001). b) mesmo exibindo
somente 16% de identidade de seqüência, similaridades eletrostáticas sugerem que as proteína rolA (direita) e papillomavirus
(esquerda), são capazes de se ligarem ao DNA (Rigden e Carneiro, 1999)
proteínas funcionalmente relacionadas
podem indicar pares de proteínas que
interagem entre si, o último novo método
dessa categoria – similaridade de árvores
filogenéticas (Pazos e Valencia, 2001) -
funciona no sentido contrário. Ou seja,
este busca por pares de proteínas que
interagem e que, portanto, têm funções
relacionadas. Esse método fundamentase
na observação de que a evolução
coordenada de proteínas que se interagem
leva as suas árvores filogenéticas a
serem mais parecidas do que seria esperado.
Assim, analisando a correlação
entre árvores construídas por duas proteínas
(ou mais precisamente, a correlação
entre suas distâncias evolucionárias),
quando achamos uma correlação
significativa, há indicação de interação
entre as proteínas. Dados experimentais
já comprovaram a lógica utilizada nesse
método, onde interações de proteínas já
conhecidas foram destacadas pelos altos
coeficientes de correlação entre suas
árvores.
A questão que ainda existe é o quanto
esse conjunto de novos métodos
pode ajudar a preencher as lacunas no
sistema atual de anotação funcional computacional.
Uma resposta parcial encontra-se
na avaliação quantitativa das técnicas
descritas acima aplicadas ao genoma
de Mycoplasma genitalium (Huynen et
al., 2000). Observou-se que a conservação
de ordem de genes é a mais poderosa
técnica, uma vez que pôde ser
aplicada a 37% dos genes, seguida pela
análise de perfil filogenético (11% dos
genes), aparência de genes em agrupamentos
sem ordem conservada (8%),e,
finalmente, pela técnica de fusão de
genes (6%). No total, foram obtidas informações
sobre 50% do complemento
genético de M. genitalium através desses
métodos. Essa figura é uma subestimativa
da sua utilidade, uma vez que nem a
técnica de genoma diferencial (não aplicável
a somente um genoma), nem a de
similaridade de árvores filogenéticas (recentemente
publicada) foram aplicadas.
Também é importante lembrar que o
crescimento do uso dessas técnicas depende
do crescimento dos bancos de
dados de seqüências e, em particular, da
disponibilidade de um número ainda
maior de genomas completos. Em alguns
casos, pode-se esperar que o poder
da técnica cresça de acordo com o
quadrado do número de genomas completos
disponíveis. Para finalizar, é importante
lembrar que essas técnicas, às
vezes, podem produzir resultados vagos
como, por exemplo, “proteínas A e B têm
funções relacionadas”. No entanto, por
apresentarem grande eficiência, está ficando
claro que a combinação delas
com os métodos tradicionais de buscas
por homólogas nos bancos de dados
levarão a um conhecimento bem mais
profundo das novas seqüências.
Bioinformática estrutural
Embora métodos tradicionais de anotação
funcional trabalhem somente com
as seqüências protéicas, sabe-se que é a
estrutura tridimensional de uma proteína,
não simplesmente a sua seqüência,
que determina a sua atividade. Quando
a proteína se dobra, os resíduos importantes
são orientados em suas corretas
posições para a formação das regiões
funcionais – proteínas desnaturadas, em
geral, não exibem atividade. Essas regiões
funcionais são, na sua maioria, interfaces
para a ligação da proteína a outras
moléculas. Os métodos tradicionais funcionam
devido às bem conhecidas relações
entre seqüência, estrutura e função
de proteínas. Em geral, proteínas de uma
mesma família, embora não apresentando
grande similaridade de seqüência,
conservam a mesma estrutura tridimensional;
estrutura esta que é mais conservada
do que seqüência. Sabe-se também
que mais importante do que a porcentagem
total de identidade entre duas
seqüências,é a identidade de resíduos
chaves, responsáveis pela sua função.
Assim, asumindo que a estrutura conservou
a orientação tri-dimensional relativa
desses resíduos, as proteínas possuirão a
mesma função. Com essas relações estabelecidas,
justifica-se, até um certo ponto
(veja acima), a suposição da conservação
de função quando se observa
conservação de seqüência.
Mas o que acontece quando os resíduos
importantes não são conservados,
mesmo com grande conservação da
seqüência em geral? Ou se outras mudanças
na seqüência afetarem a região
funcional, bloqueando o acesso ao sítio
catalítico, por exemplo. Nesses casos, e
em muitos outros (Gerlt e Babbitt, 2000),
a análise pura de seqüência levará a
conclusões erradas sobre a função, gerando
os erros que, como vimos anteriormente,
podem-se perpetuar rapidamente
nos bancos de dados. Pode-se
evitar alguns desses problemas através
de uma extrapolação da seqüência em
estrutura – a modelagem protéica. A
grande conservação da estrutura tridimensional,
mesmo após mutações em
muitos resíduos, possibilita a construção
de um modelo de uma proteína, em
casos em que um molde adequado
encontra-se disponível. Com o modelo
68 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002

construído, fica disponível uma outra bateria
de análises para determinar a probabilidade
da conservação de função entre
duas proteínas.
A seguir, serão descritas técnicas que
podem ser utilizadas na busca da determinação
da função de proteínas de estrutura
conhecida. Como mencionado anteriormente,
essas serão principalmente geradas
pelos projetos de genoma estrutural (Thornton,
2001). Existem duas categorias de
ferramentas de bioinformática estrutural
disponíveis para a inferência de função a
partir de estrutura protéica (um modelo ou
uma estrutura experimental). A primeira
busca por possíveis sítios de ligação (a
presença dos quais pode-se esperar em
quase todas as proteínas); e a segunda
procura localizar possíveis sítios de catálise
(só aplicáveis às enzimas).
Uma vez que a ligação de uma determinada
molécula a uma proteína acontece
na sua superfície, é nessa região que a
busca por possíveis sítios de ligação ocorre.
Uma análise bastante simples, mas
surpreendentemente eficiente, é a da geometria
(Laskowski et al., 1996). A necessidade
freqüente de uma proteína em se
ligar com alta afinidade e alta especificidade,
exige a formação de múltiplas interações
entre a proteína e o ligante. Em
particular, nos casos de ligantes pequenos,
a alta afinidade e a especificidade são
adquiridas pela acomodação do ligante
numa região de depressão na superfície da
estrutura protéica. Seguindo essa lógica,
uma análise demonstrou que sítios de
ligação são, muitas vezes, encontrados na
maior depressão da superfície de uma
proteína. Por exemplo, em casos de enzimas
monoméricas, o sítio catalítico encontrou-se
presente na maior depressão da
superfície em 83% dos casos. Quando a
maior depressão também contém uma alta
concentração de resíduos conservados
(ex. Figura 3), a probabilidade de o sítio de
ligação encontrar-se nessa região aumenta
ainda mais.
Uma outra característica importante da
superfície da proteína é o seu campo
eletrostático. Algumas proteínas empregam
interações eletrostáticas para atração
do ligante (ex., proteínas de ligação ao
DNA) ou para localização subcelular à
membrana (ex., citocroma C). Essas proteínas
exploram a carga inata do ligante ou
da membrana e a força, a longa distância,
das interações eletrostáticas. Diferenças
em campo eletrostático podem ser indicativas
de diferenças em função, como foi
visto para a enzima phosphoglycerate mutase
(fosfoglicerato) e uma proteína homóloga
que exibe atividade catalítica muito
diferente (Rigden et al., 2001; Figura 4a).
Pela mesma lógica, similaridades em
características eletrostáticas podem reforçar
a noção de similaridade funcional
entre duas proteínas. Um outro exemplo
é o modelo construído da proteína rolA,
a base de uma proteína que liga a DNA,
mas que compartilha somente 16% de
identidade de seqüência. Enquanto 16%
de identidade de seqüência não assegura
similaridade em função (Figura 2a), o
modelo também exibe uma região altamente
positiva (Figura 4b), em acordo
com dados experimentais mostrando a
ligação entre rolA e DNA.
Recentemente, as propriedades eletrostáticas
e hidrofóbicas de superfícies
de proteínas foram sujeitas a um outro
modo de análise – mapas de superfícies
de proteínas (Pawlowski e Godzik, 2001).
Aproximando as formas das proteínas
como esferas, resíduos carregados e
hidrofóbicos são marcados, construindo-se
um mapa. Demonstrou-se que a
similaridade dos mapas de proteínas
possui maior relação com sua similaridade
de função do que com a similaridade
de seqüência. Dois outros métodos procuram
possíveis sítios catalíticos e, portanto,
só se aplicam às enzimas.
Duas outras técnicas relacionadas
buscam sítios de ligação. A primeira, que
se aplica somente às interfaces proteínaproteína,
utiliza redes neurais em conjunção
com o conhecimento sobre os
resíduos mais comumente encontrados
em tais interfaces (Zhou e Shan, 2001).
Cerca de 70% dos resíduos localizados
nas interfaces analisadas foram identificados
corretamente. A segunda técnica
trabalha com informações de conservação
de seqüência junto com uma estrutura
protéica, buscando agrupamentos
ao nível tri-dimensional de resíduos altamente
conservados em um alinhamento
múltiplo de seqüências homólogas (Aloy
et al., 2001). Esses agrupamentos representam
previsões de sítios de ligação ao
substrato ou a outras proteínas. O papel
fundamental de conservação de seqüência
nesse método reflete-se na dependência
do sucesso obtido da variação
presente no alinhamento de seqüências;
somente nos casos de alinhamentos
contendo seqüências mais diversas foram
obtidos bons resultados. Felizmente,
com a alta e crescente produção de
seqüências esta limitação vai pesar cada
vez menos.
Dois outros métodos procuram possíveis
sítios catalíticos e, portanto, são
aplicáveis somente às enzimas. O primeiro
baseia-se na observação de evolução
convergente. Com o número crescente
de estruturas protéicas determinadas, ficou
claro que várias classes de enzimas,
mesmo não tendo uma relação evolucionária,
usam conjuntos estruturalmente semelhantes
de resíduos catalíticos para efetuar
as suas reações químicas. O mais bem
conhecido desses exemplos é a tríade
catalítica Asp-His-Ser, visto pela primeira
vez em serino proteases e, desde então, em
várias outras classes de proteinases e lípases
(Wallace et al., 1996). Através de uma
análise das características geométricas dessas
tríades de origens independentes, podese
formular regras para a identificação de
futuros novos casos de evolução convergente
(ex. Aghajari et al., 1998; Hakansson
et al., 2000). É claro que a obtenção do
conhecimento do mecanismo químico de
uma nova enzima, possivelmente obtido
através desse método, representa um grande
passo para o bom entendimento da sua
função.
Um método que identifica resíduos
possivelmente catalíticos através do cálculo
de curvas de titulação teórica foi recentemente
publicado (Ondrechen et al., 2001).
Esse método se fundamenta na observação
de que resíduos catalíticos acídicos ou
básicos estão freqüentemente situados em
microambientes que perturbam os seus
valores pK a
. Essas mudanças otimizam as
características do sítio catalítico para o
químico ácido-base envolvido na catálise,
melhorando assim a eficiência da enzima.
Através de cálculos teóricos com várias
estruturas de enzimas, observou-se que
resíduos com curvas de titulação perturbadas
estavam situados principalmente nos
seus sítios catalíticos respectivos.
A idéia de usar modelos derivados de
seqüências a serem anotadas funcionalmente
pressupõe que as estruturas resultantes
são de qualidade adequada. Nesse
aspecto, dois fatores positivos podem ser
identificados. Primeiro, a modelagem em
si é uma área muito ativa de pesquisa, na
qual avanços significativos (fora do âmbito
deste artigo) estão sendo realizados
continuamente. Segundo, para vários desses
métodos mencionados, já foi vista uma
relativa insensibilidade a erros presente
nas estruturas (Zhou e Shan, 2001; Pawlowski
e Goszik, 2001; Aloy et al., 2001).
Conclusão
A determinação da função de um
proteína é uma tarefa árdua, e deve ser
realizada por especialistas. Como se mostrou
ao longo deste artigo, a interpretação
direta/simples de resultados, especialmente
provenientes do BLAST (método mais
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 25- março/abril 2002 69

utilizado na anotação funcional de uma
nova proteína), pode levar a resultados/
conclusões errôneos. Para se afirmar com
segurança a função de uma nova proteína,
muitas vezes faz-se necessária a utilização
de mais de uma das técnicas aqui
descritas, visto que é a associação de
vários resultados que indicará a função
protéica tão procurada. A diminuição das
falhas que levam a uma interpretação
errada do genoma refletirá diretamente na
diminuição da perda de todo um investimento
nas primeiras etapas de um projeto
genoma. Isso é, sabendo-se que a anotação
é o processo de interpretação da
seqüência crua, e que fornece informações
biológicas, a melhoria das técnicas
de anotação visa a um melhor aproveitamento
prático/aplicado dos genomas que
vêm sendo determinados em campos
como a agricultura (ex: melhor entendimento
de mecanismos de defesa das
plantas), e na medicina (ex: produção de
vacinas e desenvolvimento de novos fármacos).
É verdade que não possuímos (ainda)
muitos especialistas nessa área, que ainda
se encontra em fase de crescimento, e,
como dito anteriormente, mesmo sendo a
anotação de genoma um foco de intensa
pesquisa, os sistemas atuais estão longe de
ser infalíveis. Porém, esforços vêem sendo
realizados por diferentes Instituições de
Pesquisas e Órgãos Financiadores, que
visam à formação de novos pesquisadores,
e vêm financiando projetos de pesquisa
em bioinformática. Os projetos genoma
vêm crescendo exponencialmente em todo
o mundo, e a bioinformática é uma área
que deverá crescer para que a demanda
gerada por esses projetos possa ser atendida.
No entando, cabe ressaltar que a
anotação de genoma é simplesmente uma
das diferentes frentes da bioinformática,
que abrange aplicações de computação
em biologia molecular, através de uma
série de outras técnicas (Luscombe et al.,
2001).
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