Bio pdf - Biotecnologia

A Produção na 

Far-Manguinhos 

ENTREVISTA 

Entrevista concedida a 

Edmilson Silva 

A Indústria Farmacêutica no Setor Público 

Carioca da Penha, Eloan dos Santos Pinheiro, 56 anos, é um dos casos raros 

em que uma profissional bem-sucedida na iniciativa privada multinacional 

decide dar uma guinada na carreira e se entregar de corpo e alma ao setor 

público. E ela fez isso, há 11 anos, por acreditar que, na área em que decidiu 

trabalhar, a dos medicamentos, a função social devia sempre prevalecer sobre 

a ânsia por lucratividade a todo custo. 

Eloan já colhe, há algum tempo, os louros da troca acertada que fez ao deixar 

uma empresa multinacional pelo Instituto de Tecnologia de Fármacos, mais 

conhecido por Far-Manguinhos, um complexo que conjuga pesquisa básica, 

indústria e desenvolvimento tecnológico no campus de Manguinhos, Zona 

Norte do Rio de Janeiro, onde funciona a Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz). 

Nesta entrevista que ela deu a Biotecnologia, entre uma reunião com um 

executivo indiano e um outro compromisso tão importante quanto este em sua 

agenda sempre apertada, Eloan demonstra estar feliz com as vitórias obtidas 

pelo Brasil na última reunião da Organização Mundial do Comércio (OMC), em 

Doha, capital do Catar, na Arábia Saudita, mas faz questão de chamar atenção 

para a necessidade de serem criados instrumentos de regulamentação para o 

setor farmacêutico. “Seria necessário vincular uma cota do lucro da indústria 

farmacêutica para investimento em saneamento básico, por exemplo”, diz ela, 

ao citar proposta que já encaminhou ao Congresso Nacional com essa intenção. 

Embora comande uma das unidades da Fiocruz que tem funcionado como 

holofote para os sonhos do Ministro da Saúde, José Serra, Eloan reclama das 

amarras e dificuldades que tem de enfrentar no setor público para administrar 

por resultados, razão pela qual defende “flexibilidade com responsabilidade”, 

única forma de avançar mais do que já conquistou na administração de iniciativa 

pública no setor de medicamentos. 

Neste momento, Far-Manguinhos, cuja carteira de produção envolve 68 

medicamentos e último faturamento foi de R$ 140 milhões, desenvolverá sete 

produtos contra a Aids dos 12 que estão no mercado. No final de 2002, a Far- 

Manguinhos perderá Eloan para a área de consultoria. 

Biotecnologia – Você tem pautado a 

sua administração em padrões privados. 

Porque o faz dessa forma? Isso é 

bom para o Brasil? 

Eloan – É bom para o Brasil porque, na 

verdade, não é uma visão empresarial 

que busca transformar Far-Manguinhos 

em uma indústria de alta lucratividade. 

É bom para a saúde pública porque o 

setor público tem obrigação de trabalhar 

pela promoção da saúde do povo 

brasileiro porque está sendo financiado 

por essa mesma população. Tenho que 

buscar resultados benéficos para essa 

população que nos paga. 

Biotecnologia – Resultados benéficos 

em que? 

Eloan – O setor público tem responsabilidade 

de fazer drogas novas, medicamentos 

com qualidade e a preços 

absolutamente acessíveis, que possam 

ser bancados pelo que se recolhe de 

imposto da população, e que tenham 

altíssima eficácia. Isto pressupõe responsabilidade 

de missão, visão de futuro, 

foco nas doenças que atingem a 

maior parte da população brasileira, 

decorrentes da pobreza que afeta o 

nosso povo; tais como malária, tuberculose, 

Aids. Temos que dar uma solução 

de qualidade, mesmo estando em 

uma instituição pública. 

Biotecnologia – Mas pautar-se dessa 

forma não é fácil, já que sabemos que 

existem muitas dificuldades no setor 

público. 

Eloan – Sim, há as amarras e elas não 

são poucas. Mas, apesar das amarras 

existentes que o tornam altamente atrasado 

em seus processos licitatórios, por 

exemplo, temos que estar atentos para 

o que precisa ser mudado. 

Biotecnologia – Apesar dessas amarras, 

você tem obtido um sucesso atrás 

do outro. Qual deles você destacaria ? 

Eloan – Os sucessos fundamentais foram: 

haver criado um grupo de pesquisa 

em Far-Manguinhos, altamente qualificado; 

haver conseguido trazer para 

cá profissionais com conhecimento tecnológico 

muito bom. Também haver 

conseguido que todo o conjunto de 

PHDs que trabalha aqui dentro esteja 

mais intencionado em produzir qualidade 

para a sociedade muito mais do 

que desenvolver papers e, dessa forma, 

estar mais centrado em sua projeção 

nacional e internacional nesse mercado 

competitivo; haver conseguido organizar 

uma produção direcionada a 

doenças endêmicas e a medicamentos 

de uso contínuo e trabalhar em formulação 

que aumentem a adesão dos 

pacientes aos medicamentos de uso 

contínuo. Enfim, haver conseguido projetar 

a Fiocruz internacionalmente, a 

qual atualmente está participando de 

dois comitês internacionais, a Global 

Alliance, para o desenvolvimento de 

novas drogas que reduzam de seis 

meses para quatro meses o tratamento 

da tuberculose – área em que há 40 

4 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - - nº nº 23 23 - novembro/dezembro - 2001 2001

anos não se desenvolve uma droga 

nova porque não é uma área lucrativa 

– e em outro comitê, este em conjunto 

com os Médicos Sem Fronteira e também 

para o desenvolvimento de novas 

drogas contra malária, Leishmaniose e 

Trypanossoma Bergei, que atinge mais 

a população africana e provoca a doença 

do sono. 

Além disso, o que considero uma grande 

vitória foi a sensibilização em torno 

da Aids e o fato de mostrarmos que, 

mesmo em um país considerado em 

desenvolvimento, de Terceiro Mundo, 

podem-se fazer medicamentos eficazes, 

monitorar o processo de produção 

e revelar que os preços cobrados pelos 

medicamentos anti-retrovirais estavam 

muito altos se já se tem patente para 

novas drogas. 

Biotecnologia – São quantas essas 

patentes? 

Eloan – É uma família de patentes: a 

dos medicamentos que compõem o 

chamado coquetel anti-Aids. O melhor 

disso é não sermos acusados de copiadores 

simplesmente, uma vez que tivemos 

que reengenheirar para chegar às 

drogas, visto que não havia monografias, 

e isto teve que ser feito por nós, 

assim como o desenvolvimento dos 

padrões com esses inibidores de protease. 

Algumas dessas drogas chegarão 

ao mercado com a grife de desenvolvimento 

de pesquisadores genuinamente 

brasileiros. Nesse trabalho, contamos 

com a parceria com um grupo de 

químicos da Universidade Federal do 

Rio de Janeiro (UFRJ). 

Biotecnologia – O caminho para o 

desenvolvimento de novos produtos 

de biotecnologia é esse da aproximação 

de lideranças, ou é possível fazer 

tudo sozinho? 

Eloan – Tudo o que você tenha que 

fazer, tem que seguir um esquema 

matricial, multidisciplinar. Para você 

chegar ao produto final, partindo de 

uma pesquisa básica, você, necessariamente, 

precisará passar por etapas que 

serão multidisciplinares. É indispensável 

conhecer bem o seu inimigo, seja 

ele o vírus HIV, da Aids, seja a micobactéria, 

da Tuberculose, ou o Plasmódio, 

da Malária, para, daí, escolher a melhor 

forma de ataque; uma molécula que 

pode ser obtida de uma planta, ou 

desenvolvida através de processos de 

biotecnologia, de DNA recombinante 

ou pelo método de análise combinatória 

de modelagem molecular, processos 

que a Far-Manguinhos faz, para que 

você tenha eficácia, atinja o seu alvo e 

o elimine. Essa molécula terá que ser 

criada de tal forma a penetrar dentro de 

uma célula Esse é o desenvolvimento 

tecnológico; compreende você trabalhar 

dentro dos guidlines internacionais, 

tendo em vista a reprodução da 

eficácia em ensaios repetitivos, mas 

necessários. Só assim, você determina 

os parâmetros. Depois disso, temos 

que ir para a parte da Farmacologia, 

estágio em que precisa também ficar 

demonstrado, de forma inequívoca, que 

a sua molécula consegue atingir o seu 

alvo, seja vírus, bactéria ou protozoário, 

etc. Temos Farmacologia aqui, mas 

nos sentimos na obrigação de submeter 

nossas experiências a outros grupos 

bons nessa ciência. O que nós não 

estamos bem é na área dos testes toxicológicos, 

em que temos um gap profundo, 

uma vez que não dispomos, no 

Brasil, de áreas de desenvolvimento de 

ensaios com animais roedores e nãoroedores. 

E esse é um definidor para a 

continuidade da pesquisa. Depois de 

ficar descartada a toxicidade, a carcinogenicidade, 

é que você pode patentear 

e partir para estabelecer uma parceria 

com o setor privado, de forma que 

produza a droga em larga escala. O 

passo seguinte é o screening clínico. 

Trabalha-se com interações, acordos, 

sigilo, investimento, para se chegar a 

um produto inovador. 

Biotecnologia – O gap que você aponta 

na área dos testes de toxicidade aqui no 

Brasil seria um dos principais problemas 

contra o desenvolvimento de novas 

drogas? 

Eloan – Esse gap é crucial, porque só 

temos um laboratório certificado, credenciado, 

para trabalhar com guidelines, 

que é o Unitox, de São Paulo. 

Temos outros laboratórios no País, mas 

esses estão capacitados apenas para 

fazer ensaios de toxicologia sub-aguda 

e aguda. Você não consegue chegar a 

um produto novo sem necessariamente 

passar por essas análises, que chegam 

a durar um ano. Enquanto tivermos 

esse gap, seremos obrigados a 

fazer interações com laboratórios internacionais, 

como os da Malásia, todos 

credenciados pela Organização Mundial 

de Saúde (OMS). Contamos também 

com o apoio de um ex-presidente da 

Fiocruz, Carlos Morel, atual presidente 

do TDR, um comitê voltado para as 

doenças infecto-contagiosas. 

Biotecnologia – E o apoio interno, por 

parte do Governo Federal, como está 

especificamente nessa área da toxicologia? 

Eloan – Estamos batalhando junto ao 

Ministério da Ciência e Tecnologia a 

fim de fazer ver ao Ministério da Saúde 

a necessidade de que seja criada uma 

área de serviços que seja ágil, competente, 

que forme mais toxicólogos para 

o ensaio de drogas, e que tenha flexibilidade, 

porque não pode ser uma coisa 

muito amarrada a processos. Só assim, 

se chegará lá. Do contrário, não dá. 

Particularmente, estou muito feliz com 

a proposta da Lei de Empresas de 

Inovação Tecnológica, que pressupõe 

a criação de empresas com toda a 

flexibilidade possível. Também devo 

lembrar que, pelo fato de o Brasil ser 

um país continental, será fundamental 

criar, ao mínimo, um laboratório desses 

em cada região. 

E a criação desses laboratórios será 

indispensável para que o Brasil pare de 

enviar essa quantidade absurda de dinheiro 

para o exterior com a compra de 

insumos farmacêuticos. 

Biotecnologia – Quanto é que o Brasil 

gasta com a compra desses insumos? 

Eloan – Mais de US$ 2 bilhões. 

Biotecnologia – Soma esta que poderia 

ser destinada para a pesquisa, para 

a formação de recursos humanos para 

o setor de toxicologia, por exemplo ? 

Eloan – Sim, mas é óbvio que perdemos 

muito tempo e agora teremos que 

eleger prioridades dentro do orçamento 

do Ministério da Ciência e da Tecnologia 

e precisamos estar atentos a isso. 

O que ainda me surpreende até a 

década de 80, é o fato de que as 

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - - nº nº 23 23 - novembro/dezembro - 2001 2001 5

multinacionais ainda fabricavam os insumos 

aqui no país, mas quando entramos 

na década de 90, com a abertura 

total da globalização, elas simplesmente 

retiraram daqui a produção de antibiótico. 

Biotecnologia – Então, quer dizer que 

a globalização foi ruim para o Brasil na 

área da indústria farmacêutica? 

Eloan – A globalização na área de 

medicamentos foi extremamente maléfica 

para os países que não tinham 

nenhum mecanismo de produção local, 

fossem essas fábricas próprias ou 

multinacionais. E isso fez com que 

tivéssemos que nos organizar em um 

comitê para traçar e propor ao Conselho 

Nacional de Saúde a necessidade 

de criar uma política para reverter esse 

quadro. Mas se isso vai acontecer ou 

não... 

Biotecnologia – Vai depender dos 

atores envolvidos no processo e que 

compreendam a necessidade estratégica 

proposta por vocês do comitê. 

Eloan – Isso. Dos atores governamentais, 

mais precisamente do Congresso 

Nacional, porque é lá que as definições 

de tarifa, de política, enfim, se decidem. 

A nossa proposta abrange todas as 

áreas, com atenção para a necessidade 

de definição de uma estratégia tecnológica 

para o setor. 

Biotecnologia – Quais são as principais 

dificuldade para se levar em frente 

um trabalho sério como o que você e 

sua equipe desenvolvem em Far-Manguinhos? 

Eloan – A dificuldade que considero 

maior é a ausência de flexibilidade, que 

não tem possibilitado resultados mais 

rápidos. Disponho apenas de 50 funcionários 

públicos e tenho 600 pessoas 

trabalhando diretamente aqui dentro 

porque não posso contratar diretamente 

pela CLT (Consolidação das Leis 

Trabalhistas). 

Eu considero que quando um instituto 

como o nosso consegue propiciar uma 

economia de mais de R$ 400 milhões 

em internações para o Ministério da 

Saúde é incompreensível que você tenha 

que trabalhar com um orçamento 

por rubricas, algo incrivelmente entravador. 

Outro grande problema é uma unidade 

como esta não dispor de uma Procuradoria 

que possa julgar, com agilidade, 

os seus processos, o que faz perder 

tempo. O Governo teria que estudar 

como flexibilizar estruturas produtoras 

como a Far-Manguinhos e Bio-Manguinhos 

(unidade produtora de vacinas). 

Falo em flexibilidade com responsabilidade, 

mesmo que tenha que se colocar 

para fora gerentes que não correspondam, 

mas que se possa contratar e 

pagar salários dignos aos bons profissionais. 

Biotecnologia – Não há como falar em 

dificuldades, sem se pensar nas prioridades 

para setor tão estratégico quanto 

o de medicamentos. Quais devem ser 

essas prioridades neste momento mundial? 

“...a criação desses laboratórios 

será indispensável para que o 

Brasil pare de enviar essa quantidade 

absurda de dinheiro para 

o exterior com a compra de 

insumos farmacêuticos” 

Eloan – Produção de antibióticos, porque 

não tê-los significa estar em uma 

situação de gargalo estratégico. Sempre. 

É só olhar para a situação dos 

Estados Unidos com a questão do antraz, 

e o que teve que ser feito? A 

quebra de patente, porque apenas os 

alemães da Bayer é que a detinham. 

Quando eu comecei na indústria, a 

Beecham fabricava no Brasil amoxilina, 

outros faziam ampicilina, outros 

ainda penicilina G, mas hoje quem é 

que está fabricando, aqui no Brasil, os 

antibióticos de uso em larga escala ? 

Não me pergunte que eu não sei. 

Praticamente, ninguém. 

Eu também daria prioridade aos insumos 

para os medicamentos de uso 

contínuo (hipertensão, diabetes, etc). 

Temos que ter a produção aqui no 

Brasil porque não se pode deixar uma 

população à mercê da falta desses 

produtos. Ainda falando em fármacos, 

trabalharia para garantir a oferta de 

medicamentos das chamadas doenças 

negligenciadas (malária, tuberculose, 

as hepatites) e os anti-retrovirais, que, 

graças à nova lei de patentes, são 

obrigados a produzir aqui, após três 

anos da concessão. 

Biotecnologia – Já seria possível pensar 

em produção com vistas ao mercado 

externo? 

Eloan – O forte do mercado farmacêutico, 

ou seja 82% do faturamento, está 

nas mãos de Europa, Japão, Estados 

Unidos e Canadá. Mas temos 18% desse 

faturamento, o que representa US$ 400 

bilhões, em que o Brasil é o líder de 

faturamento e é um país cujo mercado 

interno é capaz de movimentar US$ 10 

bilhões. América Latina, Caribe e África 

não é um mercado para um grande 

produtor, mas, para uma empresa tecnológica 

como a Far-Manguinhos, é 

desenvolver e transferir a fim de que 

eles possam fazer a mesma coisa que 

conseguimos aqui. Para o empresário 

social, o foco é o do acesso à população 

e ser referência para outros países com 

características sócio-econômicas semelhantes 

às nossas. 

Biotecnologia – Os grandes laboratórios 

estão se fundindo. Qual é a sua 

opinião sobre esse processo? 

Eloan – Isso é péssimo para a democratização 

do acesso aos medicamentos. 

A indústria farmacêutica tem por 

característica a excessiva concentração 

por especialidades. Há grandes fabricantes 

por classes terapêuticas. Hoje, 

todos os derivados das penicilinas V e 

G estão concentrados nas mãos de uma 

única empresa em todo o mundo. Quem 

tem a maior força potencial no campo 

dos beta-lactâmicos é um outro conglomerado. 

O que isso significa? Um domínio 

absoluto sobre a disponibilização 

do conhecimento, porque se eles decidirem 

não fornecer e se não forem 

obrigados por uma ONU (Organização 

das Nações Unidas), eles deixam morrer 

quem eles quiserem. Nós tínhamos 

oligopólios e hoje são grandiosíssimos 

monopólios por classe terapêutica. 

Biotecnologia – A ONU teria um instrumento 

com poder suficiente para 

rearrumar essa concentração de empresas 

para o bem da saúde pública ou 

seria necessária a criação dessa instância? 

Eloan – Eu não sei. A ONU, pela 

primeira vez, fez algo fundamental que 

foi a reunião sobre os medicamentos da 

Aids. Acho que o caminho é criar, em 

contraponto ao G7, um G dos outros 

países em favor dos excluídos, para 

promoção de direitos a uma vida digna. 

A ONU está começando a ter uma 

reflexão maior sobre isso e espero que 

aumente, que avance. Em termos mun- 

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diais, a cidadania precisa ser mais e 

mais difundida, mas a tomada de consciência 

mundial nessa área de democratização 

aos medicamentos só vai se 

ampliar com o trabalho direcionado 

das organizações não-governamentais. 

Elas têm liberdade para falar o que 

pensam e de fazer movimentos. 

Biotecnologia – É caro desenvolver 

um medicamento? Quanto tempo leva 

esse processo? 

Eloan – Uma formulação que obedeça 

a todos os critérios, tais como estudo de 

estabilidade, biodisponibilidade e bioequivalência 

leva um ano. O desenvolvimento 

da formulação não é cara, 

chega a custar em torno de R$ 400 mil 

reais, dependendo do valor do insumo 

empregado. O princípio ativo é que é 

responsável por cerca de 50% a 80% da 

formulação e depende da concentração 

em que ele entra no produto. 

Biotecnologia – E o desenvolvimento 

tecnológico completo, indo da pesquisa 

básica até o produto final, quanto 

custa? 

Eloan – Aqui no Brasil, estimamos que 

ele custe em torno de US$ 20 milhões 

a US$ 25 milhões; e temos um parâmetro 

para chegar a esse valor: um economista 

de uma organização não-governamental 

americana, James Lowe, calculou 

em US$ 58 milhões, para os 

países da OECD (Organização para 

Cooperação do Desenvolvimento Econômico), 

versus aqueles US$ 580 milhões 

apregoados pela indústria farmacêutica 

. Outro economista, um italiano, 

Dimasi, calcula que essa soma seja 

de US$ 100 milhões, isso já incluídos os 

salários, as perdas e as falhas. 

Biotecnologia – Você é uma personalidade 

brasileira do setor farmacêutico, 

uma mulher realizada, reconhecida. 

Mesmo assim, você acalenta algum 

sonho para esse setor, algo que você 

ainda gostaria de realizar? 

Eloan – Meu grande sonho para a 

indústria farmacêutica, aqui no Brasil, é 

o de que ela produzisse, pelo menos, 

aquilo que fosse absolutamente necessário 

e fundamental para a saúde das 

pessoas e agisse naquelas patologias 

que são absolutamente crônicas. Ela 

precisa refletir para abdicar desse faturamento 

astronômico, da indústria mais 

lucrativa de todo o mundo. Isso é 

resultado de que se consomem medicamentos 

em demasia, sinal de que não 

há prevenção. É preciso lembrar que 

medicamentos são drogas que curam, 

mas também que trazem efeitos colaterais. 

“...e a criação desses laboratórios 

será indispensável 

para que o Brasil pare de 

enviar essa quantidade 

absurda de dinheiro para 

o exterior com a compra 

de insumos farmacêuticos” 

Biotecnologia – A tecnologia aponta 

para fórmulas criadas em computador. 

E sobre isso o que temos de novo? 

Eloan – A ponta é a pessoa conseguir 

ter uma boa prospecção computacional, 

conhecer bem o DNA do agente 

causador da doença, e então utilizar as 

possibilidades de DNA recombinante. 

É o biofármaco, tecnologia em que se 

usa uma quantidade pequena de fármaco, 

mas que vai atingir diretamente o 

vírus ou bactéria ou protozoário. Caminhamos 

para o uso da dose única e não 

mais obrigar o paciente a ficar tomando 

várias pílulas durante o dia. 

“...o setor público tem obrigação 

de trabalhar pela promoção da 

saúde do povo brasileiro porque 

está sendo financiado por essa 

mesma população” 

Biotecnologia – Alguns anti-retrovirais 

já se incorporam em apenas uma 

pílula. As associações prometem aumentar? 

Eloan – Sim. Na área de tuberculose, 

por exemplo, isso já vem sendo feito 

também com a associação das drogas 

existentes em apenas um comprimido 

para aumentar a adesão. Em malária, 

também há iniciativas nesse sentido, 

com realização de estudos cinéticos e 

screening clínico, de forma que se 

avalie se estamos no caminho certo. As 

pessoas costumam abandonar o tratamento 

se são obrigadas a tomar várias 

pílulas por dia. Outra tendência é a do 

microencapsulamento das drogas quase 

de forma nanométrica, para otimizar 

a absorção das substâncias, o que 

pode significar, em futuro próximo, 

menor teor de dosagem. 

Biotecnologia – Medicamento ou vacina? 

Eloan – Sou mais as vacinas, que são 

pouco desenvolvidas porque isso não 

interessa à indústria farmacêutica. Eles 

retardam o quanto podem o desenvolvimento 

das vacinas. A prevenção é a 

coisa mais fundamental, se bem que 

depois de uma certa idade, os medicamentos 

passem a ser indispensáveis. E 

alguns desses medicamentos são extremamente 

eficazes no crescimento 

do bem-estar e no prolongamento da 

vida das pessoas, uma benesse que 

temos que reconhecer na indústria 

farmacêutica. O problema é que essa 

mesma indústria vê medicamento como 

comércio e não como um bem social, 

razão pela qual ela precisa ser regulada, 

uma vez que medicamento não é 

algo da livre escolha do cidadão, mas 

sim da necessidade dele. O que tem 

que ser feito é saneamento, um programa 

alimentar para as crianças e nutrizes, 

com incentivo ao aleitamento, 

com vistas ao fortalecimento imunológico 

da população. Não consigo dissociar 

saúde de educação, de alimentação 

e de saneamento, enfim de condições 

dignas de vida, o que é obrigação 

do Estado. 

Biotecnologia – Que benefícios poderiam 

ser obtidos com a regulação da 

indústria farmacêutica? 

Eloan – Sou da opinião de que, para 

conceder patente a uma empresa que 

desenvolveu um medicamento, o que 

significa a exploração daquele direito 

comercial durante 20 anos, deveria ser 

pré-requisito que essa indústria ficasse 

obrigada a aplicar um percentual daquele 

lucro em um fundo de investimento 

para desenvolvimento. Hoje o 

que acontece, apesar de algumas políticas 

equivocadas na área tributária, é 

que o Estado acaba sendo mais benéfico 

aos empresários, à medida que 

perdoa dívidas, renegocia. A indústria 

precisa ter responsabilidade social e 

não apenas ganhar mais e mais dinheiro. 

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - - nº nº 23 23 - novembro/dezembro - 2001 2001 7 7

Carta ao Leitor 

BIOTECNOLOGIA Ciência & Desenvolvimento 

KL3 Publicações 

Fundador 

Henrique da Silva Castro 

Direção Geral e Edição 

Ana Lúcia de Almeida 

Diretor de Arte 

Henrique S. Castro Fº 

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Luiz Dourado Bezerra 

Secretária 

Vilma da Silva Duarte 

E-mail 

biotecnologia@biotecnologia.com.br 

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A Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 

traz nesta edição, importante entrevista com a Dra. Eloan dos 

Santos Pinheiro, do Instituto de Tecnologia de Fármacos, mais 

conhecido por Far-Manguinhos, um complexo que conjuga 

pesquisa básica, indústria e desenvolvimento tecnológico. 

Nesta oportunidade a Dra. Eloan Pinheiro chama a nossa 

atenção para a necessidade de serem criados instrumentos de 

regulamentação para o setor farmacêutico. 

Acreditamos que essa é a melhor forma para alcançarmos 

auto suficiência para a produção dos principais fármacos, 

notadamente os mais imprescindíveis para a população. 

Dr. Henrique da Silva Castro 

Departamento Comercial, 

Redação e Edição: 

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Ed. Palácio do Rádio II 

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Brasília - DF 

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10 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 23 - novembro/dezembro 2001 

ISSN 1414-4522

Conselho Científico 

Dr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento Vegetal 

Dr. Henrique da Silva Castro - Saúde; 

Dr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia; 

Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal; 

Dr. Maçao Tadano - Agricultura; 

Dr. Naftale Katz - Saúde; 

Dr. Pedro Jurberg - Ciências; 

Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas; 

Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos; 

Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental. 

Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi 

Dr. Luís Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia 

Fundação Dalmo Catauli Giacometti 

Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética; 

Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico; 

Dra. Marisa de Goes - Recursos Genéticos 

Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN 

Dr. José Roberto Rogero 

Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotec 

Dr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPA 

Dr. Diógenes Santiago Santos - UFRGS 

Dr. José Luiz Lima Filho - UFPE 

Dra. Elba P. S. Bon - UFRJ 

Colaboraram nesta edição: 

Adilson Kenji Kobayashi, Alessandra Machado, 

Alexandre Lima Nepomuceno, Ana Paula Frazzon, 

Ana Paula Guimarães, Andréa Almeida Carneiro, 

Andréa C. Fogaça, Andréa Queiroz Maranhão, 

Antônio Álvaro Corsetti Purcino, Antônio Miranda, 

Augusto Schrank, Beatriz Dolabela de Lima, Carolina 

Tereza Cequalini Rohr, César Milton Baratto, Claudia 

Teixeira Guimarães, Daniel M. Lorenzini, Edmilson 

Silva, Edilson Paiva, Elaina Daher, Eliane Esteves, 

Eloan dos Santos Pinheiro, Geraldo M. A. Cançado, 

Isabel Regina Prazeres de Souza, Janete A. Desidério 

Sena, João Carlos Bespalhok Filho, João Sarkis 

Yunes, José Renato Bouças Farias, Lourivaldo S. 

Pereira, Lucélia Santi, Luciano Nakazoto, Luís Carlos 

de Souza Ferreira, Luiz Filipe Protásio Pereira, Luiz 

Gonzaga Esteves Vieira, Luiza Castro, M. Teresa M. 

Miranda, Marcelo de Macedo Brígido, Marcelo R. 

Burgierman, Márcia Vanusa da Silva, Marcio de 

Oliveira Lásaro, Marcio O. Lasaro, Marcos A. Fázio, 

Maria do Carmo Bittencourt-Oliveira, Maria Helena S. 

Goldman, Mariana Cabral de Oliveira, Marilene 

Henning Vainstein, Melissa Camassola, Melissa 

Franceschini, Newton Portilho Carneiro, Norman 

Neumaier, Pedro I. da Silva Jr., Philippe Bulet, Sidney 

Netto Parentoni, Sirlei Daffre, Tetsuji Oya, Valéria 

Dutra, Vera Maria Carvalho Alves, Viviane Kogler. 

Entrevista 

Eloan dos Santos Pinheiro pág. 04 

Pesquisa 

Tolerância à seca em plantas pág 12 

Plantas produtoras de anticorpos pág 20 

A produção de insulina humana por engenharia genética pág 28 

Biotecnologia aplicada ao controle biológico pág 32 

Anticorpos humanizados pág 38 

Cianobactérias tóxicas pág 44 

Peptídeos antibióticos pág 48 

Novas perspectivas para adaptação de culturas ao Cerrado pág 56 

Laranja transgênica pág 62 

Vacinas de DNA multivalentes pág 68 

Bio Notícias pág. 72 

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 23 - novembro/dezembro 2001 11

PESQUISA 

TOLERÂNCIA À SECA EM 

PLANTAS 

Mecanismos fisiológicos e moleculares 

Alexandre Lima 

Nepomuceno 

Pesquisador da Embrapa Soja 

Ph.D. pela University of Arkansas 

em Biologia Molecular e Fisiologia 

Vegetal 

anepo@cnpso.embrapa.br 

Norman Neumaier 


Ph.D., pela University of Missouri em 

Fisiologia Vegetal 

José Renato Bouças Farias 


Doutorado Pela Universidade Federal 

do Rio Grande do Sul em 

Agrometeorologia 

Tetsuji Oya 

Pesquisador do Jircas (Japan 

International Research Center for 

Agricultural Sciences) 

Doutorado pela University of Tokyo 

em Agronomy 

stresses abióticos, como a 

seca, podem reduzir significativamente 

os rendimentos 

das lavouras e restringir as 

latitudes e os solos onde 

espécies comercialmente importantes 

podem ser cultivadas. 

As implicações são enormes, uma 

vez que não somente produtores mas 

toda a sociedade é afetada. Desemprego, 

aumento no preço de alimentos e 

instabilidade no mercado financeiro são 

somente algumas das conseqüências. 

Previsões ambientais sinalizam para o 

aumento do aquecimento global nas 

próximas décadas. Um aumento dos 

períodos de seca certamente acompanharão 

esse fenômeno. O desenvolvimento 

de cultivares mais tolerantes a 

períodos de déficit hídrico, bem como 

o desenvolvimento de tecnologias que 

auxiliem as plantas a tolerar períodos 

prolongados de estiagem, serão essenciais 

na manutenção da produção agrícola 

brasileira e mundial em níveis que 

possam alimentar uma população em 

constante crescimento. 

A fisiologia das plantas e a biologia 

molecular desempenharão um papel 

chave nesse processo. Portanto, entender 

a tolerância das plantas à seca e 

como explorá-las, devem ser julgados 

não só como problemas de ordem agronômica, 

fisiológica ou ecológica, mas 

também como importante meta internacional 

de significância humanitária, econômica 

e política (van Rensburg, 1994). 

A identificação e a compreensão 

dos mecanismos de tolerância à seca 

são fundamentais no desenvolvimento 

de novas cultivares comerciais mais 

tolerantes ao déficit hídrico. A expressão 

de genes (ainda não caracterizados) 

em genótipos tolerantes a esse fator 

pode ser usada no estudo de mecanismos 

de tolerância à seca e para identificar 

outros genótipos com características 

similares. Tolerância das plantas à 

seca, claramente, não é uma característica 

simples, mas uma característica onde 

mecanismos trabalham isoladamente ou 

em conjunto para evitar ou tolerar períodos 

de déficit hídrico. Todas as mudanças 

fisiológicas, morfológicas e de 

desenvolvimento em plantas têm uma 

base molecular/genética. Portanto, genótipos 

que diferem em tolerância ao 

déficit hídrico devem apresentar diferenças 

qualitativas e quantitativas em 

expressão gênica. Uma resposta fisiológica 

específica ao déficit hídrico representa, 

na realidade, a combinação de 

eventos moleculares prévios, que foram 

ativados pela percepção do sinal de 

estresse. Compreender como esses eventos 

são ativados/desativados e como 

interagem entre si será essencial no 

desenvolvimento de novas variedades 

mais tolerantes a períodos de seca. 

Evolução: da água para a terra 

No início da sua evolução, há cerca 

de 1,5 bilhão de anos (Lehninger et al., 

1993), as plantas passaram por inúmeras 

mudanças na sua estrutura e no 

processo fisiológico, que as capacitaram 

para sobreviver em ambientes relativamente 

secos. Essas mudanças resultaram 

de mutações genéticas e recombinações, 

que, através da seleção natural, 

permitiram às plantas sobreviverem 

e a se reproduzirem em ambientes com 

limitação de água. Evidências baseadas 

em microfósseis mostram que plantas 

adaptadas à terra originaram-se no início 

da era Paleozóica, possivelmente 

cerca de 450 a 470 milhões de anos 

(Pearson, 1995). É interessante mencionar 

que, das primeiras plantas terrestres 

às primeiras plantas com flores, transcorreram 

mais de 450 milhões de anos 

(Ingrouille, 1992). Isso é um exemplo 

dos imensos intervalos de tempo que 

separam os grandes passos de diferenciação. 

Esses intervalos possibilitaram a 

atuação conjunta das mutações genômicas 

e da seleção natural na constru- 

12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 23 - novembro/dezembro 2001

ção da atual diversidade da flora. 

Modificações drásticas no clima da 

terra dirigiram a seleção de plantas para 

uma maior tolerância à deficiência hídrica. 

Com o clima da terra tornando-se 

mais severo à medida que os continentes 

se moviam e que grandes massas de 

terra se tornavam expostas, desenvolveram-se 

adaptações estruturais e funcionais 

entre as plantas. Essas adaptações 

incluíram raízes, que permitiam a 

absorção de água e de minerais a partir 

de grandes volumes de solo; um sistema 

vascular, que permitia um rápido 

transporte da água e de produtos da 

fotossíntese; e uma cutícula bem desenvolvida, 

com estômatos, que permitia a 

entrada de dióxido de carbono, mas 

controlava a perda de água dos tecidos 

(Kramer e Boyer, 1995). O desenvolvimento 

de folhas, raízes e de outras 

estruturas adaptadas ajudou a aumentar 

a diversidade florística em diferentes 

ambientes terrestres. Plantas que mostram 

crescimento continuado ou melhorado 

sob condições hídricas limitadas 

são consideradas tolerantes à seca. 

Algumas espécies podem evitar a seca 

amadurecendo rapidamente antes que 

ela se inicie ou reproduzindo-se somente 

após a chuva (Alvim, 1985). Outras 

plantas toleram a desidratação, adiando-a 

através do desenvolvimento de 

raízes profundas ou fechando-se fortemente 

contra a transpiração ou acumulando 

grandes reservas de água em 

tecidos carnosos (Ingrouille, 1992). Ainda, 

outras espécies permitem a desidratação 

dos tecidos e toleram a falta de 

água, apresentando crescimento continuado 

mesmo quando desidratadas ou 

sobrevivendo a desidratações severas. 

Durante períodos de déficit hídrico, 

muitas mudanças ocorrem na planta. 

Essas mudanças dependem da severidade 

e da duração do estresse, do 

genótipo, do estádio de desenvolvimento 

e da natureza do estresse (Kramer, 

1983). A maioria dessas modificações 

visa a manter o crescimento e a 

reprodução da planta em ambientes 

com limitações na disponibilidade de 

água. 

Melhoramento Genético 

Do ponto de vista prático é muito 

difícil a imposição de estresse de seca, 

de forma controlada e reproduzível, às 

grandes populações de plantas normalmente 

usadas em programas de melhoramento. 

Monitoramentos abrangentes 

Figura 1. A perda de água pela célula altera o potencial de pressão 

(tensão física; turgor) e o potencial osmótico (concentração) dessas 

células. Isso provoca alterações na membrana celular e em vários de 

seus componentes assim como na concentração celular de 

metabólitos. Alterações na conformação da membrana celular 

provocam mudanças em canais de transporte ativados por pressão, 

modificam a conformação ou a justaposição de proteínas sensoriais 

críticas embebidas nas membranas celulares, e alteram a continuidade 

entre a parede celular e membrana celular. Estas modificações ativam 

complexos enzimáticos, que iniciam uma cascata de eventos 

moleculares que levam à indução da expressão de várias categorias de 

genes 

do crescimento e de parâmetros fisiológicos 

raramente têm sido usados para 

selecionar plantas mais produtivas em 

ambientes com déficit hídrico (Basnayake 

et al., 1995). Melhoristas de 

plantas têm tentado selecionar plantas 

com tolerância à seca a partir de grandes 

populações, entretanto, altos rendimentos 

e resistência a doenças têm sido 

os alvos finais das análises. Esse enfoque 

experimental na seleção de plantas 

para tolerância ao estresse hídrico tem 

sido o método escolhido na quase totalidade 

dos casos (Simpson, 1981). A 

maioria dos enfoques, meramente identifica 

plantas com altos ou baixos rendimentos, 

porque o critério final de seleção 

é um simples índice, tal como 

rendimento de grãos ou produção de 

biomassa na época da colheita. 

Tais enfoques geralmente têm falhado 

em revelar as características genéticas 

individuais que afetam a tolerância 

à seca e que poderiam ser seletivamente 

orientadas para recombinação 

adicional. Características genômicas de 

uma planta que apresenta, por exemplo, 

tolerância ao estresse de seca na 

antese, ou escape ao estresse de seca no 

enchimento dos grãos, combinado com 

tolerância a períodos curtos de estresse 

de pequena magnitude, podem ser perdidas 

(Simpson, 1981). Um enfoque 

reducionista terá sucesso limitado porque 

o balanço ótimo da conservação de 

água e a absorção de carbono são 

alcançados, não pela variação de uma 

única resposta, mas pela combinação 

de diversas respostas diferentes a um 

nível que equivale à severidade e à 

duração do déficit hídrico (McCree e 

Fernandez, 1989). A maior limitação 

para o melhoramento genético da tolerância 

ao déficit hídrico em plantas é o 

conhecimento insuficiente sobre as bases 

fisiológicas, moleculares e genéticas 

das respostas das plantas ao déficit. 

Essas considerações reforçam a necessidade 

de um enfoque sistemático nos 

estudos de estresse hídrico, com maior 

ênfase nas diferenças genéticas entre os 

genótipos (van Rensburg, 1994). 

Respostas Moleculares 

As plantas contêm cerca de 10 10 a 


10 11 pares de bases de nucleotídeos nas 

suas moléculas de ADN, os quais podem 

representar de 50.000 a 100.000 

genes (Lehninger et al., 1993). Entretanto, 

assim como em outros organismos 

superiores, somente uma pequena porção 

desses genes é expressa, num dado 

momento, pelas células da planta. É a 

escolha de quais genes serão expressos 

que determina todos os processos vitais. 

A comparação da expressão gênica 

em diferentes células e organismos poderia 

fornecer a informação básica necessária 

para a análise dos processos 

biológicos que controlam a maneira 

como os organismos respondem a diferentes 

situações (Liang e Pardee, 1992). 

O déficit hídrico em plantas inicia 

um complexo de respostas, começando 

com a percepção do estresse, o qual 

desencadeia uma cascata de eventos 

moleculares que é finalizada em vários 

níveis de respostas fisiológicas, metabólicas 

e de desenvolvimento (Bray, 

1993). As rotas de transmissão dos sinais 

moleculares de percepção do estresse 

(signal-transduction pathways) em plantas 

não têm sido muito estudadas. Entretanto, 

os modelos propostos para 

animais, leveduras e bactérias assemelham-se 

entre si, sugerindo que, provavelmente, 

os sistemas vegetais de percepção 

de estresse também sejam semelhantes 

aos da maioria dos seres 

vivos (Shinozaki e Yamaguchi-Shinozaki, 

1999). 

Os modelos de percepção do estresse 

sendo estabelecidos para vegetais 

superiores mostram que a mudança no 

volume de células individuais de uma 

raiz ou outro órgão submetido à desidratação 

altera o potencial de pressão 

(tensão física; turgor) e o potencial 

osmótico (concentração) dessas células. 

Isso provoca alterações na membrana 

celular e em vários de seus componentes, 

assim como na concentração 

celular de metabólitos. Alterações na 

conformação da membrana celular provoca 

mudanças em canais de transporte 

ativados por pressão, modifica a conformação 

ou a justaposição de proteínas 

sensoriais críticas embebidas nas 

membranas celulares, e altera a continuidade 

entre a parede celular e a 

membrana celular. Essas modificações 

ativam complexos enzimáticos, que iniciam 

uma cascata de eventos moleculares 

e que levam à indução da expressão 

de várias categorias de genes (Hare et 

al., 1996; Shinozaki e Yamaguchi-Shinozaki, 

1996, 1997, 1999). Alguns dos 

mecanismos de percepção que estão 

sendo estudados hoje em plantas são: a 

atividade de kinases de histidina, envolvendo 

a proteína sensora EnvZ e o fator 

de transcrição OmpR (Shinozaki e Yamaguchi-Shinozaki, 

1999); as kinases 

ativadas por Mitogen, MAPK – Mitogen- 

Activated Protein Kinase (Jonak et al., 

1996); as kinases dependentes de cálcio 

(Urao et al., 1994); a Fosfolipase C, 

atuando no metabolismo de produção 

de Inositol di e tri-fosfato e sua função 

nas liberações de cálcio no citoplasma, 

onde cálcio e calmodulin funcionariam 

como uma chave molecular na rota de 

transmissão do sinal de estresse (Munnik, 

et al., 1998); as proteínas DREB, 

que aderem a seqüências de ADN presentes 

em regiões promotoras de genes 

expressos durante a desidratação, as 

Dehydration Responsive Elements Binding 

proteins – DREB proteins (Kasuga 

et al., 1999); as seqüências promotoras 

responsivas ao ácido abscísico (Abscisic 

Acid - ABA)(Abe et al., 1997); etc. 

Genes induzidos pelo déficit hídrico 

promovem: tolerância da célula à desidratação; 

funções de proteção no citoplasma; 

alterações no potencial osmótico 

celular para aumentar a absorção de 

água; controle da acumulação de íons; 

regulação adicional de expressão gênica; 

metabolização de compostos degradados 

pelo estresse; etc (Bray, 1993; 

Bray, 1997; Nepomuceno et al., 2000). 

Acredita-se que muitos dos produtos de 

genes induzidos pelo déficit hídrico 

possam proteger as estruturas celulares 

dos efeitos da perda de água (Boyer, 

1996; Alvin et al., 2001). Entretanto, a 

expressão dos genes durante o estresse 

não garante que um produto gênico 

promova a habilidade da planta em 

sobreviver ao estresse (Bray, 1993). A 

expressão de alguns genes pode resultar 

de ferimento ou dano que tenha 

ocorrido durante o estresse. No entanto, 

alguns genes são necessários para a 

tolerância ao estresse, e a acumulação 

dos produtos da expressão desses genes 

pode tornar-se uma resposta adaptativa 

(Bray, 1993; Bray, 1997), assim 

como a desativação da expressão de um 

gene pode também estar ligada ao aumento 

da tolerância ao estresse (Nepomuceno 

et al., 2000). 

Ajuste Osmótico 

Uma das mais bem documentadas 

respostas fisiológicas/moleculares ao déficit 

hídrico em plantas é a habilidade de 

algumas espécies de ajustar osmoticamente 

suas células. Durante a seca, 

plantas superiores ativamente acumulam 

açúcares, ácidos orgânicos e íons 

no citosol para diminuir o potencial 

osmótico e, conseqüentemente, manter 

o potencial hídrico e o turgor de suas 

células próximo do nível ótimo (Bray, 

1993, 1997). Quando o turgor é mantido, 

processos como condutância estomática, 

taxa de assimilação de CO 2 

e 

expansão dos tecidos são total ou parcialmente 

mantidos (Ludlow, 1987; Nepomuceno 

et al., 1998). 

Mudanças no potencial osmótico 

causado pela concentração de solutos, 

resultante da perda de água e aquelas 

causadas pela acumulação ativa de solutos 

são distintas. Na ausência de acumulação 

de solutos o potencial osmótico 

é inversamente relacionado com o 

volume osmótico. Reduções no potencial 

osmótico ocorrem pelo aumento na 

concentração de solutos presentes na 

célula túrgida. O ajuste osmótico, portanto, 

ocorrerá somente se ocorrer a 

acumulação ativa de solutos, propiciando, 

em várias espécies (Guo e Oosterhuis, 

1997), o aumento na capacidade 

de tolerar períodos curtos de seca. 

Existe considerável variação, entre diferentes 

culturas, na capacidade de ajuste 

osmótico e isso deve ser considerado ao 

se medir a habilidade da cultura em 

suportar a seca. Tem sido observada 

alta capacidade de ajuste osmótico em 

espécies como o sorgo e o algodão; 

ajustes mais moderados são observados 

em girassol, enquanto o trigo e a soja 

normalmente apresentam baixa capacidade 

de ajuste (Oosterhuis e Wullschleger, 

1988). 

A capacidade de aumentar a tolerância 

à seca ocasionada pelo ajuste 

osmótico em algumas espécies tem sido 

relacionada com a diminuição do potencial 

osmótico e com a retenção de 

água dela decorrente (Jamaux et al., 

1997). Entretanto, a geração de moléculas 

que buscam e destroem (scavenging) 

radicais livres pode, também, ser 

uma das causas da redução do potencial. 

O estresse hídrico quebra o equilíbrio 

oxidativo/redutivo (redox) em várias 

organelas celulares, como os cloroplastos. 

O declínio na funcionalidade 

dos cloroplastos, inevitavelmente, leva 

à geração de espécies com radicais de 

oxigênio altamente reativos (Hare et al., 

1996). Assim, a real função do ajuste 

osmótico poderia estar potencialmente 

ligada à eliminação de radicais livres, 


mas gerando, como função adicional, a 

retenção de água (Hare e Cress, 1997). 

Proteínas Lea 

(Late embryogenesis abundant) 

Um grupo de genes que têm sido 

considerados como adaptativo à seca e 

que tem sido identificado em vários 

trabalhos que analisam respostas de 

plantas à falta de água, codifica as 

proteínas Lea. Essas proteínas foram 

identificadas, pela primeira vez, como 

genes expressos durante as fases de 

maturação e dessecação do desenvolvimento 

de sementes (Bray, 1993; Bohnert 

et al., 1995; Zhu et al., 1997). A 

maioria dos produtos dos genes Lea é 

predominantemente hidrofílica, básica 

na composição de aminoácidos, sem 

Cys e Trp e com localização no citoplasma 

(Dure, 1993). Proteínas Lea podem 

ser categorizadas em, no mínimo, seis 

subgrupos, baseados na seqüência de 

aminoácidos e na sua cinética da expressão 

(Dure, 1993). Muitos estudos 

sobre Lea e outras proteínas relacionadas 

com a desidratação mostram que 

proteínas similares se acumulam quando 

o sinal do ambiente é déficit hídrico, 

baixas temperaturas, pressão osmótica 

externa aumentada, dessecação do 

embrião ou aplicação do hormônio 

vegetal ABA (Shinozaki e Yamaguishi- 

Shinozaki, 1996). As prováveis funções 

dos genes Lea são relacionadas com 

seqüestro de íons, proteção de membranas 

e naturação de proteínas (chaperonas) 

e retenção de água (Bray, 

1993; Dure, 1993; Zhu et al., 1997). 

Possivelmente, esse grupo diverso de 

proteínas serve a mais de uma simples 

função (Zhu et al., 1997). Entretanto, a 

extrema hidrofilia apresentada por quase 

todas as proteínas Lea e sua expressão 

abundante durante a maturação e o 

estresse de dessecação celular (Dure, 

1993), certamente implica na função de 

proteção das estruturas celulares. 

Proteínas de Choque Térmico 

Proteínas de choque térmico (Heat- 

Shock Proteins – HSP) são outro grupo 

de produtos de genes usualmente encontrados 

em plantas submetidas ao 

déficit hídrico (Joshi e Nguyen, 1996). 

Como o nome sugere, HSP foram identificadas 

pela primeira vez como respostas 

ao estresse de calor. Entretanto, 

a habilidade de responder ao choque 

de temperatura moderada pela síntese 

de HSP, dentro de duas horas do choque, 

é uma resposta geral que tem sido 

também observada em micróbios, em 

animais e em plantas submetidas ao 

déficit hídrico (Harborne, 1997). O tratamento 

de plantas de soja por duas 

horas a 40 0 C faz com que tolerem 

temperaturas de 45 0 C por outras duas 

horas. Tipicamente, sem esse pré-tratamento, 

plantas de soja não sobrevivem 

a uma exposição direta a 45 0 C (Harborne, 

1997). 

As HSP são altamente conservadas e 

diversas classes têm sido descritas em 

eucariotos, inclusive em plantas. Elas 

são designadas pelos seus pesos moleculares 

aproximados em KDa (e.g., 

HSP110, HSP90, HSP70, HSP60) (Cooper, 

1997). As famílias de HSP70 e 

HSP60 parecem ser particularmente 

importantes nas rotas gerais de dobramento 

(naturação) de proteínas em células 

de eucariotos e procariotos. Ambas 

as famílias funcionam ligando-se às 

regiões não dobradas das cadeias peptídicas, 

sugerindo que sua função possa 

estar relacionada com a manutenção da 

correta estrutura terciária de certas proteínas 

(Cooper, 1997). 

A maior parte das HSP provavelmente 

funcione como chaperones, que 

ajudam no correto dobramento ou na 

prevenção da desnaturação das proteínas 

(Zhu et al., 1993). Apesar de algumas 

HSP ser normalmente produzidas 

pela célula, durante situações de estresse 

há um aumento na produção de HSP. 

Como o estresse promove a desnaturação 

e a agregação de proteínas, uma 

maior síntese de HSP ajudaria a proteger 

essas proteínas durante o estresse 

osmótico que ocorre após a desidratação 

da célula (Zhu et al., 1997). 

Prolina 

Uma das mais bem estudadas respostas 

das plantas ao déficit hídrico é a 

acumulação de prolina nas células. A 

acumulação desse aminoácido é resultado 

do aumento no fluxo de glutamato, 

que é metabolizado pela Pirrolina-5- 

Carboxilato Sintetase (P5CS), enzima 

que regula a taxa de biossíntese de 

prolina (Hare e Cress, 1997), bem como 

de um decréscimo no catabolismo da 

prolina (Stewart et al., 1977). A enzima 

Pirrolina-5-Carboxilato Redutase (P5CR), 

responsável pela transformação da Pirrolina-5-Carboxilato 

(P5C) em prolina, 

tem sua expressão regulada por mudanças 

no potencial osmótico do citoplasma 

(Williamson e Slocum 1992). 

Um decréscimo no potencial osmótico 

da célula leva a um aumento na síntese 

de P5C e, conseqüentemente, a um 

aumento na síntese de prolina. A acumulação 

de prolina em células vegetais 

submetidas a estresse hídrico tem sido 

sugerida como um mecanismo de ajuste 

osmótico (Delauney e Verma, 1993). 

Entretanto, alguns autores sugerem 

outras funções para o acúmulo de prolina, 

como: estabilizador de estruturas 

sub-celulares (Schobert e Tschesche, 

1978); scavenger de radicais livres (Saradhi 

et al., 1995); depósito de energia 

(Hare e Cress, 1997); componente da 

cascata de sinalização molecular do 

estresse (Werner e Finkelstein, 1995); e 

constituinte principal de proteínas da 

parede celular de plantas (Nanjo et al., 

1999). Enquanto vários trabalhos indicam 

uma alta correlação entre o acúmulo 

de prolina e o aumento da tolerância 

à seca, outros sugerem que o acúmulo 

é simplesmente um efeito do estresse 

(Delauney e Verma, 1993; Madan et al. 

1995). 

Assim como o acúmulo de prolina, 

o acúmulo de polióis, tais como manitol, 

sorbitol, inositol, mio-inositol e pinitol 

(e seus derivados), também tem sido 

correlacionado com a tolerância à seca 

e/ou à salinidade (Bohnert et al., 1995; 

Guo e Oosterhuis, 1997). 

Aquaporinas 

(Water Channel proteins) 

A regulação do potencial osmótico e 

a compartimentalização de íons ocorre 

à custa do gradiente eletroquímico de 

H+ e do controle integrado de diferentes 

ATPases e de outros transportadores 

associados com membranas celulares 

(Bray, 1993). Alguns desses transportadores 

são proteínas de estrutura semelhante 

à tubular, que atravessam as 

membranas celulares. Membros dessa 

família de proteínas, também chamadas 

de Aquaporinas, formam canais águaespecíficos 

para íons ou solutos (Bray, 

1993), como observado com a proteína 

y-TIP (Tonoplast Intrinsic Protein), que 

forma canais água-específicos quando 

expressa em células modelo de Xenopus 

oocytes. À medida que as proteínas 

canal acumulam-se no tonoplasto (membrana 

do vacúolo) durante o estresse, o 

movimento da água e dos solutos do 

vacúolo para o citoplasma é promovido 

alterando tanto o teor de água quanto o 

potencial osmótico do citoplasma (Mau- 


el et al., 1993). Yamada et al. (1995) 

identificaram transcritos (ARNm) de proteínas, 

major intrinsic proteínas (MIP), 

cuja abundância muda sob estresse de 

salinidade em plantas de gelo (Mesembryanthemum 

crystallinum) que são 

adaptadas ao crescimento em altos níveis 

de sódio, sob seca e baixas temperaturas. 

Essas MIP’s mostram homologia 

com aquaporinas de plantas que 

foram encontradas, principalmente, em 

células envolvidas no fluxo hídrico, tais 

como as da epiderme da raiz, as de 

pontas de raiz, e as de áreas circundantes 

às células do xilema em raízes (Bohnert 

et al., 1995). Canais de água 

facilitam o fluxo hídrico ao longo do 

gradiente osmótico existente. A expressão 

de aquaporinas do tonoplasto e da 

membrana celular (plasmalema) tem 

sido correlacionada também com a elongação 

celular (Yamaguchi-Shinozaki et 

al., 1992; Daniels et al., 1994). 

Ácido Abscísico 

Os genes induzidos pela deficiência 

hídrica estudados até hoje, na sua maioria, 

são também induzidos pelo fitohormônio 

ácido abscísico (Abscisic Acid 

- ABA) (Bray, 1993; Wu et al., 1997). 

Com base nessa informação, ABA é o 

melhor candidato a ser visto como um 

segundo mensageiro na mediação entre 

o sinal ambiental indutivo e a resposta 

molecular, fisiológica e/ou morfológica 

(Bray, 1993). Além das evidências 

de que o ABA afeta as respostas à seca, 

à salinidade e ao estresse de frio, também 

foi demonstrado que está envolvido 

na embriogênese, na indução de 

proteínas de reserva da semente, na 

dormência, na abscisão, na germinação 

das sementes, no crescimento, no controle 

da abertura estomática e no geotropismo 

(Arteca, 1996). 

Muitas as mudanças nos níveis de 

ARNm observadas durante a seca refletem 

ativação transcripcional (Ingram e 

Bartels, 1996). Tratamento com ABA 

pode, também, induzir essas mudanças. 

Assim, seqüências de ADN atuando em 

cis ou trans (cis- / trans-acting elements) 

envolvidos na expressão gênica 

induzida pelo ABA podem agora ser 

estudadas (Ingram e Bartels, 1996). O 

elemento cis- mais bem caracterizado 

no contexto de resposta à aplicação de 

ABA é o elemento ABRE (ABA Responsive 

Element), que contém a seqüência 

palindrômica conservada ACGTGGC 

(Abe et al., 1997). Essa seqüência tem 

sido encontrada na região promotora 

de genes induzidos pelo ABA (Ingram e 

Bartels, 1996). Shinozaki e Yamaguchi- 

Shinozaki (1999) sugerem que genes 

induzidos por deficiência hídrica são 

ativados por duas rotas de percepção e 

transmissão do sinal de estresse: uma 

ABA-dependente e outra ABA-independente. 

Açúcares 

Açúcares solúveis têm sido também 

relatados como agentes protetores durante 

a desidratação celular (Leprince et 

al., 1993; Boyer, 1996). A trehalose é um 

dos mais efetivos osmoprotetores, em 

termos de concentração mínima requerida. 

É um disacarídio que, por várias 

décadas, tem sido relatado em bactérias, 

fungos e leveduras como um dos 

responsáveis pela capacidade desses 

organismos de tolerar altos níveis de 

desidratação (Müller et al., 1995). Somente 

no final da década passada foi 

identificado em plantas superiores (Goddijn 

et al., 1997). A dificuldade na 

identificação de trehalose, provavelmente, 

foi devido à alta atividade da 

enzima trehalase em plantas superiores. 

Trehalose liga-se às membranas celulares 

e diminui sua temperatura de fusão, 

mantendo-as, assim, na sua fase líquido-cristalina. 

(Crowe et al., 1993). Além 

disso, age como estabilizador de enzimas 

(Carpenter et al., 1987) e vesículas 

(Crowe et al., 1983) durante a desidratação, 

o que permite que a célula mantenha 

suas funções por períodos maiores. 

Durante déficit hídrico moderado, o 

potencial hídrico pode ser mantido pelo 

ajuste osmótico e os açúcares podem 

servir como solutos compatíveis baixando 

o potencial. Exemplos disso estão 

em plantas ressurectas, como Craterostigma 

plantagineum e plantas sensíveis 

à seca, como espinafre (Spinacea 

oleracea), que aumentam a síntese de 

sacarose durante o déficit hídrico (Ingram 

e Bartels, 1996). 

Outra interessante forma dos açúcares 

protegerem as células durante a 

desidratação é pela formação de estruturas 

vítreas. Ao invés da cristalização 

de solutos, através da presença de açúcares, 

um líquido supersaturado é produzido 

com propriedades mecânicas 

de um sólido (Koster, 1991). Esse tipo 

de estrutura tem sido associado com a 

manutenção da viabilidade de sementes 

de milho (Williams e Leopold, 1989). 

Outros Genes Expressos 

Durante o Déficit Hídrico 

Ubiquitina é um polipeptídio com 

76 aminoácidos e tem sido encontrado 

em todos os eucariotos. Sua seqüência 

de aminoácido é uma das mais bem 

conservadas na natureza. O seu papel 

é o de “etiquetar” proteínas que estão 

destinadas a ser rapidamente proteolizadas 

no citosol (Lam, 1997). Assim, 

sua expressão é usualmente observada 

durante o déficit hídrico (Bray, 1993; 

Zhu et al., 1997). 

Como a degradação de proteínas é 

geralmente alta durante a desidratação 

celular, seria de se esperar que sistemas 

de reparo sejam normalmente expressos 

durante situações de estresse. Um 

exemplo que ilustra essa situação é a 

observação de que a produção da enzima 

L-Isoaspartil metiltransferase é induzida 

durante a desidratação celular. 

Essa enzima converte resíduos modificados 

de L-isoaspartil em proteínas 

danificadas, transformando-os novamente 

em resíduos de L-aspartil e, 

assim, restabelecendo a atividade da 

proteína que estava danificada (Mudgett 

e Clarke, 1994). 

Considerações Finais 

Previsões ambientais sinalizam para 

um recrudescimento do aquecimento 

global nas próximas décadas e situações 

de secas, muito provavelmente, 

acompanharão esse evento. O desenvolvimento 

de novos genótipos de plantas, 

mais tolerantes a períodos prolongados 

de déficit hídrico, será essencial 

para que a agricultura continue alimentando 

e vestindo a crescente população 

mundial, assim como, gerando empregos 

e movimentando a economia mundial. 

O uso de técnicas agronômicas 

novas e tradicionais, que reduzam as 

perdas na agricultura e aumentem a 

produtividade deverá ter prioridade 

entre as estratégias governamentais das 

nações. Nesse contexto, a biotecnologia, 

em especial a biologia molecular, 

terá papel fundamental no futuro da 

agricultura mundial. O conhecimento 

nessa área ainda é incipiente. A evolução 

do conhecimento sobre os mecanismos 

de tolerância à seca em várias 

espécies, através do estudo de genomas 

funcionais e proteomas, fornecerá 

informações preciosas para o desenvolvimento 

de genótipos capazes de 

tolerar períodos de déficit hídrico sem 


que a produtividade seja prejudicada substancialmente. 

A difusão de novas técnicas 

moleculares, como os microarranjos de 

ADN (DNA Microarrays), está permitindo 

a identificação de rotas metabólicas ativadas 

ou desativadas, assim como, a visualização 

das centenas de interações que 

ocorrem, em âmbito transcripcional e proteômico, 

em resposta a eventos de estresse. 

Com isso, está sendo possível delinear 

estratégias que visem a aumentar a tolerância 

às condições de estresse ambiental. 

Essas estratégias vêm através de métodos 

tradicionais de melhoramento genético, 

facilitadas pelo uso de marcadores moleculares 

ligados a genes individuais ou 

ligados a lócus de características quantitativas 

(QTL) de importância, ou através do 

uso da engenharia genética. Genes identificados 

em mecanismos de tolerância 

têm mostrado potencial para ser usados 

em estudos de transformação de plantas. 

As primeiras plantas geneticamente modificadas 

para tolerância à seca já estão 

sendo desenvolvidas com sucesso em 

laboratório. Estratégias como o uso de 

moléculas chaperonas, que protegem 

componentes celulares durante a desidratação 

(Alvin et al., 2001), ou estratégias 

que amplificam o sinal molecular da percepção 

do estresse hídrico, permitindo a 

planta antecipar e acelerar os mecanismos 

de defesa (Kasuga et al, 1999), já são uma 

realidade. Entretanto, ainda devem ser 

testados quanto à produtividade nos campos 

de produção agrícola. Alcançar esse 

tipo de resultado e obter plantas cada vez 

mais eficientes na tolerância aos estresses 

do ambiente somente está sendo possível 

devido à compreensão dos mecanismos 

moleculares de tolerância discutidos nesta 

revisão e dos mecanismos que serão 

desvendados nas próximas décadas. 

REFERÊNCIAS 

ABE, H., YAMAGUCHI-SHINOZAKI, K., 

URAO, T., IWASAKI, T., HOSOKAWA, 

D., SHINOZAKI, K. 1997. Role of Arabidopsis 

MYC and Homologs Drought 

- and Abscisic Acid - Regulated Gene 

Expression. The Plant Cell, 9:1859- 

1868. 

ALVIM, P. T. 1985. Theobroma cacao. In 

A. H. Halevy (ed.) Handbook of flowering. 

CRC Press, Boca Raton, FL. 

ALVIN, F. C., CAROLINO, S. M. B., CAS- 

CARDO, J. C. M., NUNES, C. C., MAR- 

TINEZ, C. A., OTONI, W. C., FONTES, 

E. P. B. 2001. Enhanced Accumulation 

of BiP in Transgenic Plants Confers 

Tolerance to Water Stress. Plant Physiology, 

126:1042-1054. 

ARTECA, R. N. 1996. Plant growth substances: 

Principles and applications. 

Chapman & Hall, New York, NY. 

BASNAYAKE, J., COOPER, M., LU- 

DLOW, M. M., HENZELL, R. G., 

SNELL, P. J. 1995. Inheritance of 

osmotic adjustment to water stress 

in three grain sorghum crosses. TAG 

90:675-682. 

BOHNERT, H. J., D. E. NELSON, R. G. 

JENSEN. 1995. Adaptations to environmental 

stresses. Plant Cell. 7:1099- 

1111. 

BOYER, J. S. 1996. Advances in drought 

tolerance in plants. Adv. Agron. 

56:187-218. 

BRAY, E. A. 1993. Molecular responses 

to water deficit. Plant Physiol. 

103:1035-1040. 

BRAY, E. A. 1997. Plant responses to 

water deficit. Trends in Plant Science. 

2:48-54. 

CARPENTER, J. F., CROWE, L. M., CRO- 

WE, J. H. 1987. Stabilization of phosphofructokinase 

with sugars during 

freeze-drying: Characterization of 

enhanced protection in the presence 

of divalent cations. Biochim. Biophys. 

Acta. 923:109-15. 

COOPER, G. M. 1997. The cell: A molecular 

approach. ASM Press, Washington, 

D.C. 673pp. 

CROWE, J. H., CROWE, L. M., JACK- 

SON, S. A. 1983. Preservation of 

functional activity in lyophilized sarcoplasmic 

reticulum. Arch. Biochem. 

Biophys. 220:477-84. 

CROWE, J. H., CROWE, L. M., LESLIE, S. 

B., FISK, E. 1993. Mechanisms of 

stabilization of dry biomolecules in 

anhydrobiotic organisms. p. 11-20. 

In T. J. Close, and E. A. Bray (eds.) 

Plant Responses to Cellular Dehydration 

During Environmental Stress. 

Amer. Soc. Plant Physiol., Rockville, 

MD. 

DANIELS, M. J., MIRKOV, T. E., CHRIS- 

PEELS, M. J. 1994. The plasma membrane 

of Arabidopsis thaliana contains 

a mercury-insensitive aquaporin 

that is a homolog of the tonoplast 

water channel protein TIP. Plant 

Physiol. 106:1325-1333. 

DELAUNEY, A., VERMA, D. 1993. Proline 

biosynthesis and osmoregulation 

in plants. Plant J. 4:215-223. 

DURE, L. I. 1993. Structural motifs in Lea 

proteins. p. 91-103. In T. J. Close, 

and E. A. Bray (eds.) Plant Responses 

to Cellular Dehydration during 

Environmental Stress. Amer. Soc. 

Plant Physiol., Rockville, MD. 

GODDIJN, O. J. M., VERWOERD, T. C., 

VOOGD, E., KRUTWAGEN, R. W. 

H. H., GRAAF, P. T. H. M., POELS, J., 

van DUN, K., PONSTEIN, A. S., 

DAMM, B., PEN, J. 1997. Inhibition 

of Trehalase Activity Enhances Trehalose 

Accumulation in Transgenic 

Plants. Plant Physiol. 113:181-190. 

GUO, C., OOSTERHUIS, D. M. 1997. 

Effect of water-deficit stress and 

genotypes on pinitol occurrence in 

soybean plants. Environ. Exp. Bot. 

Environ. Exp. Bot. 37:2-5. 

HARBORNE, J. B. 1997. Biochemical 

plant ecology. p. 501-516. In P. M. 

Dey, and J. B. Harborne (eds.) Plant 

Biochemistry. Academic Press, San 

Diego, CA. 

HARE, P., PLESSIS, S. D., CRESS, W., 

STADEN, J. V. 1996. Stress-induced 

changes in plant gene expression. S. 

Afr. J. Sci. 92:431-439. 

HARE, P. D., CRESS, W. A. 1997. Metabolic 

implications of stress-induced 

proline accumulation in plants. Plant 

Growth Regulation 21:79-102. 

INGRAM, J., BARTELS, D. 1996. The 

molecular basis of dehydration tolerance 

in plants. Annu. Rev. Plant 

Physiol. Plant Mol. Biol. 47:377-403. 

INGROUILLE, M. 1992. Diversity and 

evolution of land plants. Chapman 

& Hall, London, UK. 

JAMAUX, I., STEINMETZ, A., BELHAS- 

SEN, E. 1997. Looking for molecular 

and physiological markers of osmotic 

adjustment in sunflower. New 

Phytol. 137:117-127. 

JONAK, C., KIEGERL, M., LIGTERINK, 

W., BARKER, P. J., HUSKISSON, N. 

S., HIRT, H. USA 1996. Stress signaling 

in plants: a MAP kinase pathway 

is activated by cold and drought. 

Proc. Acad. Sci. 93:11274-11279. 

JOSHI, C. P., NGUYEN, H. T. 1996. 

Differential display-mediated rapid 

identification of different members 

of a multigene family, HSP16.9 in 

wheat. Plant Mol. Biol. 31:575-584. 

KASUGA, M., LIU, Q., MIURA, S., YA- 

MAGUCHI-SHINOZAKI, K., SHINO- 

ZAKI, K. 1999. Improving plant drought, 

salt, and freezing tolerance by 

gene transfer of a single stress-inducible 

transcription factor. Nature biotechnology. 

17:287-291. 

KOSTER, K. L. 1991. Glass formation 

and desiccation tolerance in seeds. 

Plant Physiol. 96: 302-4. 

KRAMER, P. J. 1983. Water relations of 

plants. Academic Press, Orlando, FL. 


KRAMER, P. J., BOYER, J. S. 1995. Water 

relations of plants and soils. Academic 

Press, Inc., San Diego, CA. 

LAM, E. 1997. Nucleic acids and proteins. 

p. 315-352. In P. M. Dey and J. 

B. Harborne (eds.) Plant Biochemistry. 

Academic Press, San Diego, CA. 

LEHNINGER, A. L., NELSON, D. L., 

COX, M. M. 1993. Cell. p. 21-55. In 

A. L. Lehninger, D. L. Nelson and M. 

M. Cox (eds.) Principles of Biochemistry. 

Worth Publishers, New York, 

NY. 

LEPRINCE, O., HENDRY, G. A., F., 

MCKERSIE, B. D. 1993. The mechanisms 

of desiccation tolerance in 

developing seeds. Seed Sci. Res. 

3:231-46. 

LIANG, P., PARDEE, A. 1992. Differential 

display of eukaryotic messenger 

RNA by means of the polymerase 

chain reaction. Science. 257:967-971. 

LUDLOW, M. 1987. Contribution of osmotic 

adjustment to the maintenance 

of photosynthesis during water 

stress. p. 161-168. In J. Biggens (ed.) 

Progress in Photosynthesis Research. 

Martinus Nijhoff Publishers, Netherlands. 

MADAN, S., NAINAWATEE, H.S.,JAIN, 

R.K., CHOWDHURY, J.B. 1995. Proline 

and proline metabolizing enzymes 

in in-vitro selected NaCl-tolerant 

Brassica juncea L. under salt 

stress. Ann. Bot. 76:51-57. 

MAUREL, C., REIZER, J., SCHROEDER, 

J. I., CHRISPEELS, M. J. 1993. The 

vacuolar membrane protein - TIP 

creates water specific channels in 

Xenopus oocytes. EMBO J. 12:2241- 

2247. 

MCCREE, K., FERNANDEZ, C.J. 1989. 

Simulation model for studying physiological 

water stress responses of 

whole plants. Crop Sci. 29:353-360. 

MUDGETT, M. B., CLARKE, S. 1994. 

Hormonal and environmental responsiveness 

of a developmentally 

regulated protein repair L-isoaspartyl 

methyltransferase in wheat. J. 

Biol. Chem. 269:25605-12. 

MÜLLER, J., BOLLER, T., WIEMKEN, A. 

1995. Trehalose and trealase in 

plants: recent developments. Plant 

Science 112: 1-9. 

MUNNIK, T., IRVINE, R.F., MUSGRAVE, 

A. 1998. Phospholipid signaling in 

plants. Biochem Biophys Acta 1389: 

222-272. 

NANJO, T., KOBAYASHI, M., YOSHI- 

BA, Y. SANADA, Y., WADA, K., 

TSUKAYA, H., KAKUBARI, Y., YA- 

MAGUCHI-SHINOZAKI, K., SHINO- 

ZAKI, K. 1999. Biological functions 

of proline in morphogenesis and 

osmotolerance revealed in antisense 

transgenic Arabidopsis thaliana. 

The Plant Journal 18:(2)185-193. 

NEPOMUCENO, A. L., OOSTERHUIS, 

D. M., STEWART, J. M. 1998. Physiological 

responses of cotton leaves 

and roots to water deficit induced 

by polyethylene glycol. Environmental 

and Experimental Botany, 40:29- 

41. 

NEPOMUCENO A.L., STEWART J.M., 

OOSTEHUIS D.M., TURLEY R., NEU- 

MAIER N., FARIAS J.R.B. 2000. Isolation 

of a cotton NADP(H) oxidase 

homologue induced by drought 

stress. Pesquisa Agropecuária Brasileira. 

35(7):1407-1416. 

OOSTERHUIS, D., WULLSCHLEGER, 

S.D. 1988. Drought tolerance and 

osmotic adjustment of various crops 

in response to water stress. Arkansas 

Farm Research, Jan-Feb, p. 12 

PEARSON, L. C. 1995. The diversity and 

evolution of plants. CRC Press, Boca 

Raton, FL. 

van RENSBURG, L. 1994. Adaptive significance 

of photosynthetic and metabolic 

regulation in Nicotiana tabacum 

L. plants during drought 

stress. Ph.D. Diss., Potchefstroom 

University for Christian Higher Education, 

Potchefstroom, South Africa. 

SARADHI, P.P, ALIA, ARORA, S., PRA- 

SAD, K.V.S.K. 1995. Proline accumulates 

in plants exposed to UV 

radiation and protects them against 

UV induced peroxidation. 

Biochem.Biophys. Res. Commun. 

209:1-5. 

SCHOBERT, B., TSCHESCHE, H. 1978. 

Unusual solution properties of proline 

and its interactions with proteins. 

Biochem. Biophys. Acta. 

541:270-277. 

SHINOZAKI, K., YAMAGUCHI-SHINO- 

ZAKI, K. 1996. Molecular responses 

to drought and cold stress. Current 

Opinion in Biotechnology 7:161- 

167. 


ZAKI, K.. 1997. Gene expression 

and signal transduction in waterstress 

response. Plant Physiol. 

115:327-334. 


ZAKI, K. 1999. Molecular responses 

to drought stress. In: Cold, Drought, 

Heat and Salt Stress in Higher Plants. 

Biotechnology Intelligence Unit, R.G. 

Landes Company, Austin, Texas, 

USA. 

SIMPSON, G. M. 1981. Water Stress on 

Plants. Praeger Publishers, New 

York, NY. 

STEWART, C. R., S. F. BOGGESS, D. 

ASPINALL, L. G. PAleg. 1977. Inhibition 

of proline oxidation by water 

stress. Plant Physiol. 59:930-932. 

URAO, T., KATAGIRI, T., MIZOGUCHI, 

T., YAMAGUCHI-SHINOZAKI, K., 

HAYASHIDA, N., SHINOZAKI, K. 

1994. Two genes that encode Ca 2+ - 

depentent protein kinase are induced 

by drought and high-salt stresses 

in Arabidopsis thaliana. Mol 

Gen Genet 224: 331-340. 

WERNER, J.E., FINKELSTEIN, R.R 1995. 

Arabidopsis mutants with reduced 

response to NaCl and osmotic stress. 

Physiol. Plant Mol. Biol. 34:913-922. 

WILLIAMS, R. J., LEOPOLD, D A. C. 

1989. The glassy state in corn embryos. 

Plant Physiol. 89:977-81. 

WILLIAMSON, C. L., SLOCUM, R. D. 

1992. Molecular cloning and evidence 

for osmoregulation of the )- 

pyrroline-5-carboxylate reductase 

(proC) gene in Pea (Pisum sativum 

L.). Plant Physiol. 100:1464-1470. 

WU, Y., KUZMA, J., MARÉCHAL, E., 

GRAEFF, R., LEE, H. C., FOSTER, R., 

CHUA, N. 1997. Abscisic acid signaling 

through cyclic ADP-ribose in 

plants. Science 278:2126-2130. 

YAMADA, S., KATSUHARA, M., KELLY, 

W., MICHALOWSKI, C. B., BOH- 

NERT, H. 1995. A family of transcripts 

encoding water channels proteins: 

Tissue-specific expression in 

the common ice plant. Plant Cell 

7:1107-1112. 

YAMAGUCHI-SHINOZAKI, K., KOIZU- 

MI, M., URAO, S., SHINOZAKI, K. 

1992. Molecular cloning and characterization 

of 9 cDNAs genes that are 

responsive to desiccation in Arabidopsis 

thaliana: sequence analysis 

of one cDNA clone that encodes a 

putative transmembrane channel 

protein. Plant Cell Physiol. 33:217- 

224. 

ZHU, J. K., SHI, J., BRESSAN, R. A., 

HASEGAWA, P. M. 1993. Expression 

of an Atriplex nummularia gene 

encoding a protein homologous to 

the bacterial molecular chaperone 

Dna. J. Plant Cell 5:341-349. 

ZHU, J., HASEGAWA, P. M., BRESSAN, 

R. A. 1997. Molecular aspects of 

osmotic stress in plants. Crit. Rev. 

Plant Sci. 16:253-277. 


PESQUISA 

Plantas produtoras de 

ANTICORPOS 

Anticorpos produzidos por plantas de fumo para a detecção de poluentes ambientais 

Janete A. Desidério Sena 

Professora Doutora do Departamento de 

Biologia Aplicada à Agropecuária da 

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias 

UNESP - Campus de Jaboticabal, SP. 

janete@fcav.unesp.br 

Maria Helena S. Goldman 

Professora Doutora do Departamento de 

Biologia da Faculdade de Filosofia, 

Ciências e Letras de Ribeirão Preto 

Universidade de São Paulo 

mgoldman@rge.fmrp.usp.br 

Fotos cedidas pelas autoras 

s plantas transgênicas 

podem ser exploradas 

como uma alternativa 

atrativa e de custo reduzido 

em relação aos sistemas 

microbianos e animais para a 

produção de biomoléculas. Tal sistema 

de produção possui várias vantagens 

em potencial sobre aqueles baseados 

em fermentação microbiológica, 

células animais e animais transgênicos. 

Os sistemas microbianos têm 

uma capacidade limitada para realizar, 

de forma acurada, as modificações 

pós-traducionais de proteínas 

eucarióticas. A fermentação bacteriana 

freqüentemente resulta na produção 

de agregados insolúveis, e custos 

substanciais estão envolvidos em solubilizar 

e remontar estes agregados 

em proteínas nativas. As culturas de 

células animais necessitam de meios 

de cultura caros, e o uso de animais 

transgênicos levanta muitas preocupações 

públicas e éticas. Por outro 

lado, plantas transgênicas são facilmente 

produzidas; linhagens homozigotas 

podem ser rapidamente obtidas, 

estocadas como sementes, e posteriormente, 

propagadas. As plantas são 

simples e baratas de cultivar, não 

requerendo recurso especializado ou 

meio de cultura elaborado. 

A produção de anticorpos em plantas 

transgênicas, publicada pela primeira 

vez em 1989, demonstrou o 

princípio da coexpressão de dois produtos 

gênicos recombinantes, que foram 

corretamente montados em uma 

molécula que era funcionalmente idêntica 

àquela originada do mamífero 

(Hiatt et al., 1989). Desde então, muitos 

grupos têm procurado expressar 

outras moléculas de anticorpos em 

plantas, desde moléculas de cadeia 

única até anticorpos secretórios multiméricos 

(Ma et al., 1995). 

Anticorpos monoclonais 

e suas aplicações 

Figura 1. Modelo da estrutura de uma molécula de anticorpo típico, 

composta de duas cadeias polipeptídicas leves e duas cadeias pesadas. 

Pontes dissulfeto inter-cadeias estão indicadas. Dois sítios ativos idênticos 

de ligação ao antígeno estão localizados nos braços da molécula, 

formados pelas regiões variáveis 

A resposta imune é um sistema de 

defesa dos vertebrados, altamente sofisticado, 

capaz de reconhecer substâncias 

estranhas ao organismo. Essas 

substâncias estranhas capazes de induzir 

uma resposta imune são chamadas 

de antígenos. As proteínas circulantes 

produzidas pelo sistema imune, 

e capazes de reconhecer o antígeno 

de forma específica são as imunoglobulinas 

(Ig), também denominadas 

anticorpos. Durante as últimas duas 

décadas, as pesquisas realizadas revelaram 

a estrutura das moléculas de 

anticorpos, os mecanismos complexos 

pelos quais essas proteínas são 

sintetizadas e a maneira pela qual elas 

se ligam aos materiais estranhos, rea- 


Figura 2. (A) Esquema do vetor de expressão em plantas pGA748 

contendo o cDNA de interesse (cadeia leve ou pesada). BD e BE - 

bordas direita e esquerda do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens; 

P35S - promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor; seta preta 

- terminador reconhecido em células vegetais; nptII - gene que 

confere resistência à canamicina; Tc - gene que confere resistência 

à tetraciclina. 

(B) cDNAs para as cadeias pesada (A) e leve (B) do anticorpo antidioxinas 

subclonados no sítio Eco RI do vetor de expressão pGA748, 

evidenciando as enzimas envolvidas na determinação da orientação 

de subclonagem. BD- Borda direita. BE- Borda esquerda da região 

do T-DNA. R- Gene de resistência para a Canamicina. P- Promotor 

35S do vírus do mosaico da couve-flor. S- Seqüência sinal de 

camundongo. IG- Seqüência da imunoglobulina. T- Terminador. 

VH e VL- Domínio variável das cadeias pesada e leve. CH e CL- 

Domínio constante das cadeias pesada e leve 

lizando a defesa bioquímica do organismo. 

Os anticorpos possuem um núcleo 

estrutural comum, um tetrâmero composto 

de quatro cadeias polipeptídicas, 

duas cadeias leves idênticas e 

duas cadeias pesadas idênticas. Uma 

cadeia leve é ligada a uma cadeia 

pesada por uma ligação covalente S-S 

(dissulfeto). Pontes dissulfeto também 

existem entre as duas cadeias pesadas, 

originando a estrutura esquematizada 

na Figura 1. 

Cada cadeia leve tem, aproximadamente, 

220 aminoácidos, e cada 

cadeia pesada possui, aproximadamente, 

440 aminoácidos. Essas cadeias 

possuem, na sua extremidade amino-terminal, 

uma região variável, composta 

de aproximadamente 110 aminoácidos, 

na qual a seqüência de 

aminoácidos varia bastante entre anticorpos 

específicos para diferentes antígenos. 

As regiões variáveis contêm 

regiões de variabilidade ainda maior - 

as regiões hipervariáveis - que correspondem 

ao sítio de ligação ao antígeno. 

A extremidade carboxi-terminal 

de cada cadeia é referida como região 

constante, visto que a seqüência de 

aminoácidos é bastante conservada 

em todos os anticorpos de uma determinada 

classe de imunoglobulinas. 

Além disso, as cadeias pesadas das 

imunoglobulinas contêm adições de 

carboidratos; portanto, os anticorpos 

são moléculas de glicoproteínas. 

Baseado na seqüência de aminoácidos 

da região constante, as cadeias 

leves podem ser classificadas em dois 

tipos distintos: kappa (κ) ou lambda 

(λ).As regiões constantes kappa e lambda 

possuem ao redor de 30 a 40 por 

cento de homologia. Existem cinco 

tipos principais de cadeias pesadas (α, 

δ, ε, γ, µ), que correspondem às cinco 

classes de anticorpos (IgA, IgD, IgE, 

IgG, e IgM). Essa classificação é baseada 

na seqüência de aminoácidos da 

região constante das cadeias pesadas. 

As seqüências de aminoácidos das 

diferentes classes possuem aproximadamente 

40 por cento de homologia. 

Os anticorpos de diferentes classes 

diferem em tamanho, carga e conteúdo 

de carboidratos, sendo que anticorpos 

de algumas classes são compostos 

de mais de um tetrâmero (Abbas 

et al., 1994). 

O uso de anticorpos como reagentes 

específicos na identificação de 

antígenos de interesse biológico e/ou 

médico, é uma prática indiscutivelmente 

essencial nos laboratórios modernos. 

Atualmente, talvez seja difícil 

apontarmos alguma linha de estudos 

biológicos voltada para diagnósticos 

que não tenha necessitado ou que 

necessitará do uso de anticorpos em 

alguma de suas fases. A própria clínica 

médica moderna tem planejado esquemas 

de tratamento oncológico en- 


volvendo anticorpos, como é o caso 

das imunotoxinas, ou seja, moléculas 

híbridas anticorpo-toxinas voltadas 

para reconhecerem células tumorais e 

exercerem um efeito letal específico 

sobre essas células (Olnes et al., 1989). 

Poderíamos comentar também sobre 

o uso de anticorpos ligados a isótopos 

radioativos que permitiriam, após a 

associação com o tumor, sua localização 

por meio de imagens radiográficas. 

Além disso, anticorpos monoclonais 

são usados como vacinas para 

imunização passiva e são também 

empregados fora da clínica médica 

em uma ampla área de separações por 

afinidade e em numerosos kits de 

diagnóstico. 

Portanto, devido ao alto grau de 

especificidade dessas moléculas, elas 

podem ser utilizadas como “detectoras”, 

tanto para ensaios qualitativos 

quanto quantitativos, e o campo de 

aplicação para tais ensaios é quase 

que irrestrito, dada a grande quantidade 

de compostos sintéticos que podem 

ser usados para imunizar os animais, 

resultando na produção de anticorpos 

contra muitos compostos de 

interesse para a medicina e outras 

áreas da ciência. 

A maioria dos anticorpos, tais como 

aqueles usados em imunoensaios, são 

produzidos em animais e isolados a 

partir do soro ou fluído ascítico, ou 

são produzidos em cultura por células 

especializadas, denominadas células 

do hibridoma. Para isso, faz-se necessária 

a fusão de uma célula de mieloma 

de camundongo (célula tumoral 

de plasmócitos B) com um linfócito B 

normal, oriundo de um camundongo 

imunizado com o antígeno de interesse. 

A célula híbrida formada é um 

hibridoma, que conserva a capacidade 

de divisão exacerbada do mieloma 

juntamente com a informação para a 

síntese do anticorpo específico desejado. 

Como esse anticorpo é originário 

de um único clone de linfócito B, 

ficou sendo chamado de anticorpo 

monoclonal (Milstein, 1986). Vários 

problemas existem nessa tecnologia. 

Os hibridomas não são facilmente 

cultiváveis. É preciso manter toda a 

tecnologia de cultura de células de 

mamífero, onde os meios de cultura 

são caros, o pessoal técnico e o laboratório 

têm que ser altamente especializados. 

Mesmo assim, os hibridomas 

Figura 3. Processo de cotransformação evidenciando o co-cultivo 

dos discos foliares de N. tabacum com ambas as linhagens de A. 

tumefaciens, contendo os cDNAS para as cadeias leve e pesada do 

anticorpo 

por vezes cessam de crescer em culturas, 

ou as mesmas são contaminadas 

por micoplasma, comprometendo toda 

uma linha de produção. 

O desenvolvimento de técnicas 

recombinantes para a rápida clonagem 

de cDNAs, codificando as proteínas 

dos anticorpos tornou possível a 

expressão e a caracterização destas 

moléculas em sistemas heterólogos: 

bactérias, fungos filamentosos, leveduras, 

células de insetos, células de 

mamíferos e de plantas, com vistas à 

sua produção em larga escala. Esses 

sistemas heterólogos representam organismos 

muito mais fáceis de ser 

manipulados, e com um rendimento 

em termos de anticorpos funcionais, 

igual ou muito maior do que o dos 

clássicos hibridomas. 

Ao expandir a escolha dos sistemas 

de produção, as plantas oferecem 

alternativas únicas para os usuários de 

anticorpos, não só pela produção em 

Figura 4. (A) Calos somáticos de N. tabacum obtidos nos experimentos 

de transformação mediada por A. tumefaciens 

(B) Calos em meio de cultura para indução de parte aérea, obtidos nos 

três experimentos de transformação: cadeia leve, cadeia pesada e 

cotransformação (cadeia leve + cadeia pesada), mantidos em meio 

seletivo com canamicina 


larga escala, mas também pela capacidade 

de montar anticorpos multiméricos 

complexos completos. Apesar de 

o investimento inicial de tempo e 

esforço ser grande se comparado com 

outros sistemas de expressão, a produção 

de anticorpos em escala agrícola 

ou de fermentadores pode ser visualizada, 

e a economia dessas abordagens 

abre muitas novas áreas para a 

aplicação potencial de anticorpos. 

Aplicações dos anticorpos 

produzidos em plantas 

Figura 5. Plantas transformadas de N. tabacum com desenvolvimento de 

parte aérea e raízes 

Dos compostos bioativos expressos 

em plantas transgênicas, os anticorpos 

muito provavelmente são os 

que apresentam a maior variedade de 

aplicações. Plantas transgênicas têm 

sido geradas para produzir anticorpos 

monoclonais de uso terapêutico, como 

reagentes farmacêuticos ou para diagnósticos, 

ou ainda, visando a modificação 

de características das próprias 

plantas. 

Quanto ao uso terapêutico dos 

anticorpos, a similaridade entre a maquinaria 

da célula animal e vegetal 

permite que as plantas apresentem 

habilidade em montar cadeias leves e 

pesadas, formando um anticorpo completo 

e funcional (Ma & Hein, 1995), 

que as torna excelente escolha como 

biorreatores para a produção desses 

anticorpos. Esses apresentam um particular 

benefício na área de imunoterapia 

tópica. A maioria das infecções 

entram pelo corpo através das mucosas: 

gastrointestinal, respiratória ou 

urogenital. Portanto, a imunização passiva 

dessas mucosas seria uma medida 

profilática efetiva para um número de 

doenças virais, bacterianas e fúngicas. 

Um exemplo bastante interessante 

de anticorpo produzido em plantas e 

que apresenta aplicabilidade na imunização 

passiva é a imunoglobulina 

multimérica complexa SIgA, que é 

secretada nas superfícies das mucosas 

para fornecer proteção local contra 

toxinas e patógenos. Esse anticorpo é 

mais efetivo que a classe de anticorpos 

monoclonais IgG na defesa contra 

infecções bacterianas, em virtude de 

ligar-se polivalentemente ao antígeno 

e, portanto, ser mais eficiente na agregação, 

na avidez de ligação, e na 

resistência à proteólise (Ma & Hein, 

1996). A SIgA consiste de duas moléculas 

monoméricas de IgA unidas por 

um pequeno polipeptídeo J e complexada 

com um polipeptídeo maior, o 

componente secretório. Todos esses 

componentes foram expressados individualmente 

em plantas de fumo e, 

por sucessivos cruzamentos das plantas 

transgênicas e seus recombinantes 

filiais, houve produção de plantas nas 

quais todas as quatro cadeias de proteínas 

foram expressadas simultaneamente, 

resultando em uma molécula 

de SIgA corretamente montada e extremamente 

funcional (Ma et al., 1995), 

mostrando a flexibilidade das células 

vegetais na montagem de moléculas 

complexas. 

A disponibilidade de grandes quantidades 

de IgA secretória abre um 

número de novas oportunidades terapêuticas 

para desordens do sistema 

imune das mucosas, tais como terapias 

para patógenos intestinais (E. coli 

enterotoxigênica, cólera, etc.), patógenos 

respiratórios (rinovírus e influenza) 

e doenças sexualmente transmissíveis 

(Larrick et al., 1998). 

No caso de modificações causadas 

na própria planta, as aplicações incluem 

a resistência de plantas a doenças 

(Tavladoraki et al., 1993; van Engelen 

et al., 1994; Fecker et al., 1996; Voss et 

al., 1994; Yuan et al., 2000) e a modulação 

das vias metabólicas da planta 

para produzir novas características nutricionais 

e de desenvolvimento (Firek 

et al., 1993; Artsaenko et al., 1995). 

Segundo De Jaeger et al. (2000) e 

Conrad & Manteuffel (2001), a imunomodulação 

pode ser definida como 

uma técnica molecular que permite 

interferir no metabolismo celular da 

planta, ou na infectividade do patógeno, 

por meio da expressão ectópica de 

genes codificando anticorpos recombinantes. 

Além dessas aplicações, as plantas 

produtoras de anticorpos poderão ser 

empregadas em uma potencial estratégia 

que apresenta um significante 

impacto: a biorremediação. O seqüestro 

de poluentes ambientais por plantas 

expressando anticorpos recombinantes 

poderia formar a base de um 

sistema de biorremediação natural. 

Tal estratégia envolve a expressão de 

anticorpos recombinantes nas células 

vegetais e o uso dessas plantas para 

seqüestrar poluentes presentes no ambiente. 

Esse seqüestro seria específico 

para um poluente em particular, e 

poderia envolver interações de alta 

afinidade, de maneira que níveis muito 

baixos do poluente poderiam ser 

detectados (Hiatt & Mostov, 1993, 

Owen et al., 1996). A praticabilidade 

de tal estratégia é apoiada pela demonstração 

de que anticorpos recombinantes 

podem ser dirigidos para o 

apoplasto da planta, e que eles são 

estáveis e funcionais nesse local (Firek 

et al., 1993). O diâmetro dos poros na 

parede celular impõe uma restrição 

sobre o tamanho das moléculas que 

podem permeá-la livremente. Esse limite 

de exclusão corresponde a um 

peso molecular de 20 kDa para uma 

proteína globular. Anticorpos são moléculas 

muito grandes para permearem 

livremente a parede celular vegetal 

(Carpita et al., 1979). Consequentemente, 

a expressão de um anticorpo 

em uma célula vegetal equivale a 

produzir uma capacidade de retenção 

e de ligação dentro de uma membrana 

semi-permeável. Qualquer antígeno 

com um peso molecular menor que 20 

kDa (como alguns poluentes ambien- 


tais, bioprodutos industriais, pesticidas, 

herbicidas) poderia ser coletado e 

retido por uma planta expressando 

um anticorpo que é funcional “in situ” 

e localizado no apoplasto (Firek et al., 

1993). 

Os anticorpos produzidos pelas 

plantas, após purificação, poderão ainda 

ser utilizados na preparação de 

colunas de afinidade, bem como na 

confecção de kits de diagnósticos, 

tanto para uso clínico, quanto para a 

detecção de diversos poluentes ambientais, 

de forma rápida e menos onerosa. 

Dioxinas: Perigosos 

Poluentes Ambientais 

Figura 6. Plantas transgênicas de N. tabacum obtidas nos três experimentos 

independentes de transformação, com os cDNAs para o anticorpo antidioxina, 

mantidas em casa de vegetação 

Há uma extensiva poluição de nossos 

ambientes por pesticidas orgânicos 

e outros químicos industriais. Áreas 

afetadas incluem lagos, rios, água 

potável, solo, etc. A fabricação de 

pesticidas, a incineração de químicos 

contendo halógenos, a fabricação de 

papel e plásticos, entre outros processos 

de produção de clorinas, podem 

resultar na produção não intencional 

de compostos químicos que são potenciais 

poluentes ambientais Dentre 

estes poluentes ambientais destacamse 

as dioxinas. As dioxinas são hidrocarbonetos 

aromáticos clorados, que 

incluem o 2,3,7,8 tetraclorodibenzop-dioxina 

(TCDD), um dos mais potentes 

agentes tóxicos. São contaminantes 

do ecossistema, que, mesmo 

em baixas doses, são altamente teratogênicos 

e carcinogênicos (Poland & 

Knutson, 1982; Stanker et al., 1987, 

Zober et al., 1990). O fato mais impressionante 

sobre a TCDD, além da sua 

teratogenicidade, é a sua potência 

letal. Em cobaia, a sua LD 50 

, por via 

oral, é de, aproximadamente, 1x10 -9 

mol/Kg (Poland & Kende, 1976). 

A dioxina existia como contaminante 

no Agente Laranja, um desfoliante 

amplamente usado na guerra do 

Vietnã, nos anos 60, constituído da 

mistura de dois químicos conhecidos 

convencionalmente como 2,4,D e 

2,4,5,T. Ela é que foi apontada como 

o agente causal dos vários sintomas 

descritos pelos veteranos expostos ao 

desfoliante. A dioxina não é solúvel 

no ar ou na água, mas é atraída por 

óleos e gorduras, acumulando-se em 

níveis altíssimos nos corpos das espécies 

que estão no topo da cadeia 

alimentar, causando efeitos tóxicos 

que incluem anorexia, severa perda 

de peso, hepatotoxicidade, hepatoporfiria, 

lesões vasculares, atrofia do 

timo e supressão imune, toxicidade 

reprodutiva e do desenvolvimento, 

úlceras gástricas, teratogenicidade e 

morte (Langer et al., 1973). 

A contaminação pela dioxina tem 

sido um fato que ultimamente tem 

alarmado o mundo todo. No Brasil, 

por exemplo, houve o relato de que a 

Alemanha, Holanda e Bélgica proibiram 

a entrada naqueles países de 

farelo de casca de laranja, usado como 

matéria-prima na produção de alimentação 

animal, devido à contaminação 

por dioxina em dois carregamentos 

brasileiros destinados à Europa 

(Folha de São Paulo de 21/4/98). 

No Japão, um nível recorde de dioxinas 

foi detectado nas cinzas eliminadas 

pelo incinerador de lixos do Hospital 

Kasori, na cidade de Chiba. A 

quantidade de agentes químicos cancerígenos 

encontrados totalizaram 19 

mil picogramas/grama, o maior nível 

já encontrado em cinzas liberadas por 

incineradores (Jornal do Nikkey de 

15/5/98). Na Bélgica, mais de 1.100 

produtos alimentícios foram retirados 

das prateleiras por suspeita de contaminação 

por dioxina (Folha de São 

Paulo de 9/6/99). Portanto, há necessidade 

de se adotar um procedimento 

que seja específico para os congêneres 

mais tóxicos da dioxina e que seja 

relativamente simples e rápido na 

detecção do sítio de contaminação, 

dados os prejuízos que esses compostos 

causam ao ecossistema e à saúde 

humana e animal (Stanker et al., 1987). 

As técnicas analíticas sofisticadas 

usadas atualmente, tais como a cromatografia 

gasosa e a espectroscopia 

de massa (Crummett, 1983), são de 

alto custo, e requerem laboratórios 

dedicados, equipamentos especializados, 

pessoal altamente treinado e 

não são disponíveis para a aplicação 

“in situ”. O que se faz necessário, 

portanto, é o desenvolvimento de procedimentos 

alternativos que possam 

ser específicos, bastante sensíveis, 

adaptáveis para a análise de múltiplas 

amostras e simples de serem manipulados, 

para a rápida aplicação no sítio 

de contaminação, quantificação e retirada 

desses poluentes do ambiente. 

Os imunoensaios preenchem esses 

critérios e fornecem provas efetivas 

na detecção de compostos importantes. 

Stanker et al. (1987) selecionaram 

29 hibridomas originados de camundongos 

imunizados com 1-N-(adipamino)-2, 

3, 7-triCDD- ligado à proteína 

carreadora BSA. Desses anticorpos 

monoclonais, cinco clones (DD-1, 

-3, -4, -5 e -6) reconheceram o 2,3,7,8- 

TCDD e apresentaram-se como reagentes 

comprovados na detecção de 

cerca de até 0,5 ng de 2,3,7,8-TCDD e 

outros congêneres, utilizando-se o teste 


de competição por ELISA. Portanto, 

podem ser úteis para estudos de contaminação 

ambiental. Os genes para 

os anticorpos DD1 e DD3 tiveram suas 

regiões variáveis seqüenciadas por 

Recinos et al. (1994) e foram licenciados 

com o objetivo de detectar e 

quantificar a exposição à dioxina em 

populações humanas. 

Pelos motivos expostos acima, 

pode-se constatar que a produção em 

larga escala de anticorpos contra dioxina 

é altamente desejável, visto que o 

uso de kits de detecção produzidos 

com esses anticorpos purificados, a 

partir das plantas transgênicas, bem 

como o potencial uso dessas próprias 

plantas em um sistema de biorremediação, 

parecem ser estratégias bastante 

promissoras na tentativa de eliminar 

do ambiente esse perigoso poluente. 

Expressão de anticorpos antidioxinas 

em plantas de fumo 

Com o objetivo de expressar o 

anticorpo anti-dioxina completo, em 

plantas de fumo, desenvolveu-se, em 

nosso laboratório, uma estratégia de 

clonagem envolvendo os cDNAs para 

as cadeias leve e pesada do anticorpo 

IgG1a que reconhece o TCDD. O 

clone pHC2 (Hibridoma DD-3) contém 

um cDNA de 1600 pb, apresenta 

a seqüência líder completa e as regiões 

variável e constante da cadeia 

pesada γ (gamma) de camundongo, 

clonado como um fragmento EcoRI 

em pUC18 (Recinos et al., 1994). O 

clone pLCE (Hibridoma DD-1) contém 

um cDNA de 920 pb, contendo a 

seqüência líder completa e as regiões 

variável e constante da cadeia leve κ 

(kappa) de camundongo, clonado 

como um fragmento EcoRI em pUC18 

(Recinos et al., 1994). Ambos os clones 

foram gentilmente cedidos pelo 

Dr. Adrian Recinos III (Dept. of Internal 

Medicine, Univ. of TX Medical 

Branch, Galveston, TX.). 

Os cDNAs denominados DD1 e 

DD3, com suas seqüências sinal nativas, 

(Figura 2A) foram subclonados, 

separadamente, sob o controle do 

promotor constitutivo 35S do vírus do 

mosaico da couve-flor (P35SCaMV) 

no vetor de expressão em planta 

pGA748, cedido gentilmente pelo Dr. 

Alexandre S. Conceição (Figura 2B). 

O conhecimento das seqüências 

das regiões variáveis de ambos os 

cDNAs (Recinos et al., 1994) e a análise 

dos tamanhos dos fragmentos nos 

ensaios de restrição permitiram a seleção 

de clones com a orientação correta 

de subclonagem para ambas as 

cadeias. As construções resultantes 

foram introduzidas em plantas de fumo 

(Nicotiana tabacum Petit Havana SR- 

1), cultivadas “in vitro”, via transformação 

mediada por Agrobacterium 

tumefaciens. 

Primeiramente, o gene de interesse 

é clonado em um cassete de expressão 

flanqueado pelas bordas do T- 

DNA. Em seguida, essa montagem é 

introduzida em células de Agrobacterium 

tumefaciens, por eletroporação. 

As células de Agrobacterium contendo 

esse vetor de expressão transferem 

Figura 7. Vista geral das plantas transgênicas de N. tabacum mantidas 

em casa de vegetação 

o T-DNA para as células vegetais durante 

a co-cultivação. Três experimentos 

independentes de transformação 

foram realizados em nosso laboratório: 

discos foliares transformados com 

o vetor contendo somente o gene 

híbrido para a cadeia leve; discos 

foliares transformados com o vetor 

contendo o gene híbrido para a cadeia 

pesada; e discos foliares transformados 

com ambas as construções, ou 

seja, dupla transformação simultânea 

ou cotransformação, conforme esquematizada 

na Figura 3. 

Os discos foliares de todos os três 

experimentos foram colocados em 

meio de cultura contendo canamicina 

até o surgimento dos calos somáticos 

(Figura 4A), os quais foram, posteriormente, 

individualizados e colocados 

em meio de cultura contendo hormônios 

para indução de parte aérea (Figura 

4B). As plantas resistentes à canamicina 

foram individualizdas e transferidas 

para caixas Magenta, em meio 

apropriado para a indução de raízes 

(Figura 5). Finalmente, as plantas foram 

levadas para vasos com terra, 

mantidos em casa de vegetação (Figura 

6 e 7), em condições adequadas de 

luz, temperatura e umidade, até o 

momento da colheita das folhas para 

as análises moleculares e a extração 

de proteínas. 

A análise do DNA genômico por 

Southern blot confirmou a presença 

dos genes esperados, e a detecção do 

anticorpo nas plantas transgênicas cotransformadas, 

através da análise imunológica 

por “slot blot”, revelou claramente 

a presença da IgG anti-dioxina 

em quatro plantas testadas. A revelação 

foi feita por quimioluminescência, 

usando-se um anticorpo biotinilado 

específico para IgG completa de camundongo. 

Nos extratos da planta 

controle não houve reação, mostrando 

a ausência do anticorpo. Esse imunoensaio 

mostrou que as plantas transgênicas 

de fumo foram capazes de 

produzir o anticorpo anti-dioxina. Em 

nosso laboratório, no momento, estão 

sendo realizadas pesquisas para verificar 

os níveis de expressão do anticorpo 

nas diferentes plantas cotransformadas 

obtidas, bem como a segregação 

dos genes na geração T 1 

das 

mesmas. 

O anticorpo anti-dioxina produzido 

pelas plantas de fumo poderia, 


então, ser utilizado na fabricação de 

um imunoensaio para a detecção da 

contaminação por dioxina, após sua 

purificação. Uma outra intrigante possibilidade 

para o uso dessas plantas 

transgênicas, seria a biorremediação 

das áreas poluídas pela dioxina. 

Referências Bibliográficas 

Abbas, A.K.; Lichitman, A.H.; Pober, 

J.S. Cellular and Molecular Immunology. 

2nd edition, edited by 

W.B. Saunders Company, 457 p, 

1994. 

Artsaenko, O; Peisker, M.; Zur Nieden, 

U.; Fiedler, U.; Weiler, E.W.; Muntz, 

K.; Conrad, U. Expression of a 

single-chain Fv antibody against 

abscisic acid creates a wilty phenotype 

in transgenic tobacco. Plant 

J. 8: 745-750, 1995. 

Carpita, N.; Sabularse, D.; Montezinos, 

D.; Helmer, D. P. Determination of 

the pore size of cell walls of living 

plant cells. Science, 205: 1144- 

1147, 1979. 

Conrad, U.; Manteuffel, R. Immunomodulation 

of phytohormones and 

functional proteins in plant cells. 

TRENDS in Plant Science, 6: 399- 

402, 2001. 

Crummett, W.B. Status of analytical 

systems for the determination of 

PCDDs and PCDFs. Chemosphere, 

12:429, 1983. 

De Jaeger, G.; De Wilde, C.; Eeckhout, 

D.; Fiers, E.; Depicker, A. The plantibody 

approach: expression of antibody 

genes in plants to modulate 

plant metabolismor to obtain pathogen 

resistance. Plant Mol. Biol., 

43:419-428, 2000. 

Fecker, L.F.; Kaufmann, A; Commandeur, 

U.; Commandeur, J.; Koenig, 

R.; Burgermeister, W. Expression 

of single-chain antibody fragments 

(scFv) specific for beet necrotic 

yellow vein virus coat protein or 25 

kDa protein in Escherichia coli 

and Nicotiana benthamiana. Plant 

Mol. Biol. 32: 979-986, 1996. 

Firek, S.; Draper, J.; Owen, M.R.L.; 

Gandecha, A.; Cockburn, B.; Whitelam, 

G.C. Secretion of a functional 

single-chain Fv protein in transgenic 

tobacco plants and cell suspension 

cultures. Plant Mol. Biol., 

23:861-870, 1993. 

Hiatt, A.C.; Cafferkey, R.; Bowdish, K. 

Production of antibodies in transgenic 

plants. Nature, 342:76-78, 

1989. 

Hiatt, A.; Mostov, K. Assembly of multimeric 

proteins in plant cells: characteristics 

and uses of plant-derived 

antibodies. In: Transgenic 

Plants: Fundamentals and Applications, 

ed. Hiatt A. Marcel 

Dekker Inc., New York, USA, 

pp.221-238, 1993. 

Langer, H.G.; Brady, T.P.; Briggs, P.R. 

Formation of dibenzodioxins and 

other condensation products from 

chlorinated phenols and derivatives. 

Environ. Health Perspect., 

5:3-8, 1973. 

Larrick, J.W.; Fry, K.E. Recombinant 

antibodies. Hum. Antibodies Hybridomas 

2: 172-189, 1991. 

Ma, J.K.; Hein, M.B. Immunotherapeutic 

potential of antibodies produced 

in plants. Trends Biotech. 

13: 522-527, 1995a. 

Ma, J.K.; Hein, M.B. Plant antibodies 

for immunotherapy. Plant Physiol. 

109: 341-346, 1995b. 

Ma, J.K-C..;Smith, R.; Lehner, T. Use of 

monoclonal antibodies in local passive 

immunization to prevent colonization 

of human teeth by Streptococcus 

mutans. Infect. Immun., 

55:1274-1278, 1987. 

Ma, J.K-C..; Hiatt, A.; Hein, M.; Vine, 

N.D.; Wang, F.; Stabila, P.; Van 

Dolleweerd, G.; Mostov, K.; Lehner, 

T. Generation and assembly of 

secretory antibodies in plants. Science, 

268:716-719, 1995. 

Milstein, C. Overview: monoclonal 

antibodies. In: Handbook of Experimental 

Immunology vol.4. 

Weir, D.M.(ed). Applications of Immunological 

Methods in Biomedical 

Sciences. Blacwell Sci. Publications, 

1986. 

Olnes, S.; Sandvig, K.; Petersen, O.W.; 

Van Deurs, B. Immunotoxins - entry 

into cells and mechanisms of 

action. Immunol. Today, 10:291- 

295, 1989. 

Owen, M.; Gandecha, A.; Cockburn, 

B.; Whitelam, G. The Expression of 

recombinant antibody fragments 

in plants. In: Transgenic Plants: 

A Production System for Industrial 

and Pharmaceutical Proteins. 

Edited by M.R.L. Owen and 

J. Pen. John Wiley & Sons Ltd. 

1996. 

Poland, A.; Kende, A. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin: 

environmental 

contaminant and molecular 

probe. Fed. Proc., 35:2404- 

2411, 1976. 

Poland, A.; Knutson, J.C. 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin 

and related 

halogenated aromatic hydrocarbons: 

Examination of the mechanism 

of toxicity. Ann. Rev. 

Pharmacol. Toxicol., 22:517-554, 

1982. 

Recinos, A., Silvey, K. J., Ow, D. J., 

Jensen, R. H.; Stanker, L.H. Sequences 

of cDNAs encoding immunoglobulin 

heavy- and lightchain 

variable regions from two 

anti-dioxin monoclonal antibodies. 

Gene,149:385-386, 1994. 

Stanker, L.H.; Watkins, B.; Vanderlaan, 

M. Monoclonal antibodies for 

dioxin: antibody characterization 

and assay development. Toxicology, 

45:229-243, 1987. 

Tavladoraki, P.; Benvenuto, E.; Trinca, 

S.; De Martinis, A.C.; Galeffi, P. 

Transgenic plants expressing a 

functional single-chain Fv antibody 

are specifically protected from 

virus attack. Nature, 366:469-472, 

1993. 

van Engelen, F.A; Schouten, A; Molthoff, 

J.W.; Roosien, J.; Salinas, J.; 

Dirkse, W.G.; Schots, A; Bakker, J.; 

Gommers, F.J.; Jongsma, M.A; et al. 

Coordinate expression of antibody 

subunit genes yields high levels of 

functional antibodies in roots of 

transgenic tobacco. Plant Mol. 

Biol. 26:1701-1710, 1994. 

Voss, A.; Nierbach, M.; Hain, R. Reduced 

virus infectivity in N. tabacum 

secreting a TMV-specific full size 

antibody (abstract). In 1 st International 

Meeting on The Production 

of Recombinat Proteins in 

Plants. University of Leicester, 

Leicester, July 24-27, 1994, pp 71. 

Yuan, Q.; Hu, W.; Pestka, J. J.; He, S. 

Y.; Hart, P. Expression of a functional 

antizearalenone single-chain 

Fv antibody in transgenic Arabdopsis 

plants. Appl. Environ. Microbiol., 

66:3499-3505, 2000. 

Zober, A.; Messerer, P. Huber, P. Trirty-four-year 

mortality follow-up of 

BASF employees exposed to 

2,3,7,8-TCDD after the 1953 accident. 

Int. Arch. Occup. Environ. 

Hlth., 62:139-157; 1990. 


A produção de insulina humana por 

Pesquisa 

ENGENHARIA GENÉTICA 

Beatriz Dolabela de Lima 

Professora Adjunta - Departamento de 

Biologia Celular – Universidade de Brasília 

bdlima@unb.br 

Bactéria transgênica produz insulina humana 

A engenharia genética e a 

biotecnologia moderna 

A tecnologia do DNA recombinante 

possibilita a obtenção de organismos 

com características novas ou não encontradas 

na natureza, o que permite uma 

nova alternativa para o melhoramento 

genético de espécies de valor 

biotecnológico. Desse modo, células de 

bactérias, leveduras e mesmo eucariontes 

superiores como plantas podem ser programadas 

com genes exógenos, abrindo 

a perspectiva de produção nestes organismos 

de polipeptídeos de interesse, 

como o interferon, o hormônio de crescimento, 

a insulina entre outros. A utilização 

de microrganismos 

“engenheirados”, capazes de sintetizar 

proteínas em grande quantidade, apresenta, 

sob o ponto de vista econômico, 

Figura 1: Estrutura da insulina humana: pró-insulina 

(cadeias B, C e A) e insulina (cadeias B e A). Setas 

pretas indicam o ponto de clivagem para a retirada da 

cadeia C da pró-insulina, originando a insulina ativa. 

Cadeia B, em rosa, cadeia C, em azul, e cadeia A, em 

amarelo 

uma vantagem considerável em relação 

aos processos clássicos de produção. 

A extração de proteínas eucarióticas, 

como a insulina, requer grandes quantidades 

de matéria-prima (pâncreas suíno 

e bovino), que nem sempre estão disponíveis 

e são, geralmente, de elevado 

custo. Isso torna o processo extrativo 

cada vez mais oneroso. Nesse contexto, 

o emprego de técnicas mais eficientes, 

como a do DNA recombinante, abriu 

novas perspectivas de produção. 

Diabetes mellitus 

O diabetes mellitus é um grupo de 

doenças causadas pela deficiência na 

secreção ou na ação do hormônio pancreático 

insulina, o que produz profundas 

anormalidades no metabolismo. Há 

duas classes principais de diabetes: o 

juvenil e o adulto. No 

primeiro, a doença 

começa cedo, tornando-se 

severa e, no 

último, é lento para 

se desenvolver, moderado 

e, 

freqüentemente, não 

reconhecido. 

Os sintomas característicos 

do diabetes 

são sede excessiva 

e frequente micção, 

levando à 

injestão de grandes 

volumes de água. Essas 

alterações são devidas 

à excreção de 


grandes quantidades 

de glicose na urina 

(glicosúria). O grande 

volume de urina 

no diabetes reflete a 

necessidade do rim 

de excretar uma certa 

quantidade de 

água junto com a glicose, pois a capacidade 

do rim de concentrar os solutos na urina 

tem um limite máximo. Outro sintoma é o 

nível da glicose sanguínea e como é a 

resposta à ingestão da glicose. Quando a 

concentração da glicose no sangue é significativamente 

alta é chamada de 

hiperglicemia. 

O pH do plasma sanguíneo de pessoas 

severamente diabéticas é freqüentemente 

menor que o valor normal 7,4, condição 

esta chamada de acidose. É causada pela 

superprodução de ácidos metabólicos e o 

pH do sangue pode cair a 6,8 ou abaixo, e 

levar a lesões irreparáveis nos tecidos, e à 

morte. Esse aumento da acidez é um 

indicativo de alterações profundas no balanço 

ácido-base do organismo. A acidez 

aumentada é devido à extensa formação de 

corpos cetônicos no fígado e à sua liberação 

no sangue. Como os tecidos não conseguem 

utilizar a glicose sanguínea, o 

fígado tenta compensar essa deficiência 

aumentando a utilização dos ácidos graxos 

como combustível, mas isso provoca a 

superprodução de corpos cetônicos, além 

da capacidade dos tecidos em oxidá-los. A 

atividade de glicoquinase está diminuída 

no diabetes já que é a insulina que estimula 

a biossíntese dessa enzima. Como conseqüência, 

forma-se pouco glicogênio. Como 

os carboidratos não estão sendo utilizados, 

as proteínas do organismo são usadas 

como combustíveis. Os aminoácidos sofrem 

perda dos seus grupos amino e os 

acetoácidos formados podem sofrer oxidação 

em dióxido de carbono e água, em 

parte pela via do ciclo do ácido cítrico. 

A administração de insulina para corrigir 

a deficiência endócrina e a administração 

de bicarbonato de sódio para corrigir a 

perda, tanto do sódio como da capacidade 

do tampão bicarbonato, podem trazer toda 

a química do organismo de volta para um 

balanço quase normal dentro de 12 a 24 

horas. Para seguir o curso de tal tratamento, 

as dosagens de glicose, pH e CO2 sanguí-

neos são realizadas frequentemente. 

Desse modo, 

o diabetes juvenil requer 

terapia com insulina e um 

cuidadoso controle, por 

toda a vida, do balanço 

entre a ingestão de glicose 

e a dose de insulina injetada 

(Lehninger, 1984). 

Insulina humana 

A insulina humana é 

produzida nas células ß 

pancreáticas, localizadas 

dentro dos conjuntos de 

células de 100 a 200 µm 

conhecidos como Ilhotas 

de Langerhans. Essas estão 

dispersas pelo pâncreas de 

muitos vertebrados superiores, 

constituindo cerca de 

1% da massa do orgão (Steiner et al., 

1985). A insulina tem sido isolada de 

uma grande variedade de espécies de 

vertebrados, sendo que, em todas elas, a 

molécula é composta de duas cadeias 

polipeptídicas (A e B) ligadas por pontes 

dissulfídricas. 

A insulina humana, como muitos 

hormônios protéicos, é sintetizada como 

uma proteína precursora maior, seguida 

de uma clivagem proteolítica, para gerar 

o hormônio ativo (Wang & Tsou, 1991). 

Desse modo, a insulina é produzida sob 

a forma de um único polipeptídeo, a prépró-insulina, 

com uma cadeia de 110 

aminoácidos. Os vinte e quatro primeiros 

aminoácidos formam o peptídeo 

sinal ou seqüência pré da proteína e têm 

a função de facilitar a entrada da mesma 

no retículo endoperiplasmático. Durante 

esse processo, o peptídeo sinal é separado 

da proteína, resultando na formação 

da pró-insulina (figura 1). Essa molécula 

resultante, na qual as cadeias A (21 

aminoácidos) e B (30 aminoácidos) estão 

ligadas pelo peptídeo conectante C 

(35 aminoácidos), é a precursora da 

insulina. Ela adquire sua conformação 

com a formação de duas pontes 

dissulfídricas e é transportada para o 

aparelho de Golgi, onde vai ser empacotada 

em grânulos de estoque. Durante a 

formação e maturação dos grânulos 

secretórios, a pró-insulina é clivada por 

enzimas proteolíticas do tipo da tripsina, 

resultando na liberação do peptídeo C. 

Desse modo, as duas cadeias A e B estão 

ligadas entre si por pontes dissulfídricas, 

tendo uma outra ponte interna na cadeia 

A, formando a molécula de insulina 

(figura 1) (Steiner et al., 1985). 

Figura 2: Comparação entre a seqüência nucleotídica do 

gene sintético (Ec gene) e do cDNA para a pró-insulina 

humana (Hs cDNA). Protein: seqüência protéica da próinsulina 

Construção do gene sintético 

para a insulina humana 

Dentre as várias maneiras pelas quais 

um gene eucariótico pode ser obtido 

para a expressão em procariotos, a síntese 

química oferece as seguintes vantagens: 

fornece diretamente a seqüência 

exata desejada; as seqüências 

codificadoras e não codificadoras podem 

ser desenhadas para a expressão 

procariótica; sítios de restrição podem 

ser removidos ou adicionados, íntrons 

retirados; não há necessidade da etapa 

de isolamento do mRNA ou DNA 

genômico e permite a alteração do gene 

de forma mais simples. 

Desse modo, a construção do gene 

sintético para a pró-insulina humana foi 

iniciada a partir da seqüência de 

aminoácidos dessa proteína descrita por 

Sures et al. (1980). Utilizando-se os 

códons genéticos preferenciais para 

Escherichia coli (De Boer & Katelein, 

1986) para a otimização da expressão do 

gene nessa bactéria, foi montado um 

gene codificando a proteína humana. A 

figura 2 mostra a comparação da seqüência 

de bases na fase de leitura do 

cDNA da pró-insulina humana (Bell et 

al., 1979; Sures et al., 1980) com o gene 

sintético montado nesse trabalho. Esse 

gene contém 18,6 % de bases substituídas, 

sendo 16,27 %, na terceira base, 1,16 

%, na segunda base, e 1,16 %, na primeira 

base dos códons. Nenhuma das modificações 

feitas nos códons alterou o 

aminoácido de correspondência. Após 

análise computacional, a presença de 

seqüências repetitivas, diretas ou inversas, 

maiores do que oito nucleotídeos 

não foi encontrada, evitando assim uma 

possível estrutura secundária local 

indesejada nos mRNAs 

transcritos a serem produzidos 

a partir destes genes, 

o que poderia afetar sua 

expressão. 

Para facilitar a 

clonagem, esse gene sintético 

para a pró-insulina 

humana foi predito contendo 

um sítio para a 

enzima de restrição Eco RI 

no início do gene, seguido 

de um códon para 

metionina (ATG), da região 

codante para a cadeia 

B, cadeia C e cadeia A, 

nesta ordem, do códon de 

término (TAA), e finalmente, 

de um sítio para a enzima 

de restrição Bam HI. Outros 

sítios para enzimas de 

restrição foram adicionados 

internamente no gene de modo a 

facilitar modificações posteriores. 

Após a definição da estrutura do gene 

sintético, foi realizada a sua montagem 

conforme a estratégia mostrada na figura 

3. Quatro oligonucleotídeos foram sintetizados 

para a cadeia B, quatro para a 

cadeia C e dois para a cadeia A. Esses 

oligos foram anelados em pares para a 

formação da fita dupla de DNA e foram 

ligados entre si, em duas etapas. Na 

primeira, foram montadas as cadeias B e 

C e, na segunda, montado o gene da próinsulina, 

sendo que nesta ordem: cadeia 

B, C e A. Esse gene foi clonado em um 

vetor para a realização do seqüenciamento 

de DNA e a confirmação da seqüência 

nucleotídica correta do gene. 

Construção de um vetor de 

hiper-expressão para E. coli 

Nos últimos anos, muitos vetores para 

E. coli têm sido construídos com diversas 

finalidades, entre essas, a clonagem de 

cDNAs, de fragmentos de DNA amplificados 

por PCR, transcrição in vitro e para a 

expressão e produção de proteínas 

heterólogas. Para cada finalidade, o vetor 

terá que apresentar determinadas características 

para otimizar sua utilização. Desse 

modo, para a construção de um sistema 

de expressão de proteínas em E. coli, seis 

elementos básicos são necessários: 

- uma região necessária para replicação 

estável e controle do número de cópias; 

- um marcador seletivo, como um 

gene conferindo resistência a antibiótico 

para a hospedeira; 

- um promotor para iniciação da transcrição 

e seu controle; 

- uma região terminadora da transcrição; 


Figura 3: Estratégia utilizada para a construção dos genes para a próinsulina 

humana para a expressão na bactéria E. coli 

- um sítio de ligação de ribossomas 

para a iniciação da tradução em uma 

trinca ATG apropriada; 

- e uma região de sítios apropriados 

para enzimas de restrição, para utilização 

nas clonagens dos genes a serem 

expressos. 

Seguindo esses requisitos para a construção 

do vetor de expressão pLMT8.5 

(figura 4), utilizamos a origem de 

replicação do plasmídeo pUC8, o gene 

de resistência à tetraciclina do plasmídeo 

RP4, o promotor pL isolado do fago 

Lambda, a região Shine Dalgarno sintética 

do fago T7, terminador de transcrição 

Rho-independente sintético, e uma 

região de múltiplos sítios únicos para 

enzimas de restrição (figura 4). 

Para a região de replicação estável e 

de controle do número de cópias do 

plasmídeo foi escolhida a origem de 

replicação do plasmídeo pUC8. Essa 

origem é derivada do plasmídeo pMB1 

(ou ColE1) onde mutações e deleções 

foram introduzidas de modo a aumentar 

o número de cópias do plasmídeo dentro 

da célula. Esses plasmídeos podem 

estar presentes em mais de 500 cópias 

por célula. 

O gene de resistência à tetraciclina 

foi escolhido e utilizado porque este 

permite que, além da seleção das bactérias 

recombinantes, o antibiótico 

tetraciclina estará constantemente fazendo 

pressão seletiva durante a fermentação. 

A resistência à tetraciclina consiste 

de uma proteína que bombeia o antibiótico 

para fora da célula, não permitindo 

sua atuação na inibição da síntese protéica 

no interior da bactéria. Isso tem como 

conseqüência, em uma fermentação industrial, 

que se utilizem menores quantidades 

do antibiótico, pois este não será 

inativado pela bactéria resistente e estará 

constantemente presente na fermentação. 

Assim, a produtividade no bioreator 

Figura 4: Mapa do 

vetor de expressão 

pLMT8.5 contruído 

para a produção da 

pró-insulina humana 

em E. coli. 

Tet R : gene de 

resistência a 

tetraciclina; ori: 

origem de 

replicação; MCS: 

região de sítios 

únicos para enzimas 

de restrição; pL: 

promotor pL; SD: 

seqüência Shine- 

Dalgarno; e TT: 

região de 

terminação de 

transcrição 

não será afetada devido ao acúmulo de 

bactérias sem plasmídeos. Esse fenômeno 

de acúmulo de bactérias sem 

plasmídeos foi observado por muitos 

pesquisadores e é responsável por dificuldades 

no escalonamento requerido 

para a comercialização de produtos 

recombinantes (Kumar et al., 1991). 

Para a iniciação da transcrição foi 

escolhido o promotor pL do bacteriófago 

Lambda. Este é um promotor forte e é 

regulado negativamente pelo repressor 

codificado pelo gene cI. A mutação 

cI857 tornou o repressor sensível à temperatura, 

funcional a 28oC e não funcional 

a 42oC. Assim, a expressão de 

seqüências codantes sob o controle desses 

promotores e pelo repressor cI857 

pode ser ativada simplesmente por uma 

mudança na temperatura da cultura, o 

que, principalmente em escala industrial, 

simplifica e barateia o processo. 

A partir de um promotor e de um 

início de transcrição, a RNA polimerase 

transcreve o RNA até o reconhecimento 

de um sítio de terminação, que funciona 

como um sinal para o término da transcrição. 

Dois tipos diferentes de 

terminadores são encontrados: 

terminadores simples ou Rho-independentes 

e terminadores Rho-dependentes 

(dependentes da proteína Rho). Os 

terminadores Rho-independentes possuem 

duas características: uma estrutura 

em forma de grampo, gerada por 

pareamento entre repetições invertidas, 

contendo uma região rica em pares G-C 

na base do grampo, separadas por uma 

curta distância, e outra, subseqüente da 

primeira, que contém uma região de, 

aproximadamente, seis resíduos de 

uridina no final da unidade. Esses 

terminadores parecem ter alguma função 

na proteção do mRNA, pela sua 

capacidade de formar uma estrutura em 

grampo, provavelmente fornecendo uma 

barreira contra a ação de uma exonuclease 

3' (Brawerman, 1987), e não dependem 

de um fator protéico, proporcionando 

uma efetiva finalização da transcrição no 

vetor de expressão. 

A etapa mais limitante na síntese 

protéica é a ligação dos ribossomas às 

moléculas de mRNA. Desde que o número 

de ribosomas na célula exceda a 

classe de mensageiros, uma maneira de 

aumentar a expressão de um gene 

clonado é aumentar o número dos transcritos 

correspondentes. Para tal, a maneira 

mais simples é clonar o gene de 

interesse em um plasmídeo com grande 

número de cópias. 

As duas características dos mRNAs 

de E. coli , que determinam onde e qual 

a eficiência do processo de reconheci- 


mento ribosoma-mRNA, são o códon de 

iniciação, geralmente AUG ou GUG, e a 

região Shine Dalgarno (SD), ou sítio de 

ligação de ribossomas (RBS). Essa região 

é complementar ao final 3' do RNA 

ribosomal 16S (Shine & Dalgarno, 1974; 

Shultzaberger et al., 2001). O SD tem 

tipicamente de três a seis nucleotídeos 

de tamanho e está localizado quatro a 

quinze nucleotídeos antes do códon de 

iniciação. Essa região tem a função de 

guiar o ribossoma para o ponto de início 

correto (Dreyfus, 1988). Olins et al. (1988) 

descreveram uma região SD a montante 

do gene 10 do bacteriófago T7 (g 10-L). 

Esse gene codifica para a proteína da 

capa, que é a proteína mais sintetizada 

após a infecção do fago T7. Essa região 

SD possui um grande potencial para 

otimizar a eficiência da tradução de 

genes homólogos e heterólogos clonados 

em E. coli. 

Para facilitar a clonagem de genes 

para a expressão no vetor, uma região 

apropriada de sítios únicos para enzimas 

de restrição foi adicionada entre a região 

promotora e o SD, e a região terminadora 

da transcrição, onde temos o sítio para a 

enzima de restrição NcoI contendo o 

códon ATG de início de tradução (figura 

4). 

Produção da 

pró-insulina humana 

Para a produção da pró-insulina, o 

gene sintético da pró-insulina foi 

subclonado no vetor de expressão 

pLMT8.5 e o plasmídeo recombinante foi 

denominado de pPTA1. Esse plasmídeo 

foi utilizado para a transformação da 

cepa E. coli N4830-1, pois essa possui o 

repressor cI termossensível. 

A cepa E. coli N4830-1 transformada 

Figura 5: Análise da expressão 

em diferentes tempos de indução 

da pró-insulina em E. coli. Gel 

desnaturante (SDS-PAGE) a 15% 

dos lisados protéicos totais das 

culturas, contendo o plasmídeo 

pLMT8.5 e o plasmídeo pPTA1 

(pLMT8.5 + gene da pró-insulina) 

com o plasmídeo pPTA1, foi utilizada 

para a indução térmica da Pró-insulina. 

Como controle, foi utilizadas cultura da 

cepa contendo o plasmídeo pLMT8.5 

sem o gene clonado. As proteínas 

induzidas estão mostradas na figura 5. 

Verifica-se a indução de uma proteína 

de, aproximadamente, 10.000 dáltons, 

que corresponde à Pró-insulina na cultura 

do recombinante pPTA1. Essa proteína 

corresponde a 20% das proteínas 

totais da bactéria. Nas amostras com o 

plasmídeo pLMT8.5, não observamos 

essa proteína induzida. Podemos concluir 

portanto, que ocorreu uma hiperexpressão 

da Pró-insulina a partir do 

gene clonado no plasmídeo pLMT8.5 

construído. 

Verificou-se também que ocorreu 

formação de corpos de inclusão da proteína 

recombinante produzida, o que 

auxilia a proteção contra proteólise e 

facilita sua purificação. Eles são formados 

como agregados citoplasmáticos que 

podem ser purificados após a lise da 

célula, centrifugação e solubilização das 

proteínas com, por exemplo, uréia ou 

guanidina. 

A perspectiva de produção a partir 

dessas bactérias recombinantes, obtidas 

nesse trabalho, nas condições de cultura 

utilizadas, é de 1 g de pró-insulina para 

cada 17 litros de cultura, com uma densidade 

celular de 10 9 células por ml. 

Considerações finais 

Esse trabalho foi realizado dentro do 

Projeto “Produção de insulina humana 

através de precursores recombinantes 

em Escherichia coli”, coordenado pelo 

Prof. Spartaco Astolfi Filho, com financiamento 

da Biobrás e PADCT/FINEP, 

dentro do Convênio UnB/Biobrás. Esse 

sistema de produção de insulina está 

patenteado nos Estados Unidos (patentes 

nos. 6068993, 30/05/2000, e 

6281329B1, 28/08/2001) e com pedido 

de patente no INPI, Brasil. 

Bibliografia 

Bell, G.I.; Swain, W.F.; Pictet, R.; Cordell, 

B.; Tischer, E. & Goodman, H.M. 

1979. Nucleotide sequence of a cDNA 

clone encoding human preproinsulin. 

Nature, 282, 525-7. 

Brawerman, G. 1987. Determinants of 

messenger RNA stability. Cell, 48: 5-6. 

De Boer, H.A. & Kastelein, R.A. 1986. 

Biased codon usage: an exploration 

of its role in optimization of translation. 

In: Maximizing gene expression; 

Reznikoff, W. & Gold, L.; eds. 

Butterworth Publishers, Stoneham, 

USA. 

Dreyfus, M. 1988. What constitutes the 

signal for the initiation of protein 

synthesis on Escherichia coli mRNAs? 

J. Mol. Biol., 204: 79-94. 

Kumar, P.K.P.; Maschke, H.E.; Friehs, K. 

& Schugerl, K. 1991. Strategies for 

improving plasmid stability in 

genetically modified bacteria in 

bioreactors. Tibtech, 9: 279-84. 

Lehninger, A.L. 1984. Princípios de Bioquímica. 

São Paulo, Savier. 

Olins, P.O.; Devine, C.S.; Rangwala, S.H. 

& Kavka, K.S. 1988. The T7 phage 

gene 10 leader RNA, a ribosomebinding 

site that dramatically enhances 

the expression of foreign genes in 

Escherichia coli. Gene, 73: 227-35. 

Shine, J. & Dalgarno, L. 1974. The 3’- 

terminal sequence of E. coli 16S 

ribosomal RNA: complementarity to 

nonsense triplets and ribosome 

binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 

USA, 71: 1342-6. 

Shultzaberger R.K., Bucheimer R.E., Rudd 

K.E. & Schneider T.D. 2001. Anatomy 

of Escherichia coli Ribosome Binding 

Sites. Journal of Molecular Biology, 

313: 215-28. 

Steiner, D.F.; Chan, S.J.; Welsh, J.M. & 

Kwow, S.C.M. 1985. Structure and 

evolution of the insulin gene. Ann. 

Rev. Genet., 19: 463-84. 

Sures, I.; Goeddel, D.V.; Gray, A. & 

Ullrich, A. 1980. Nucleotide sequence 

of human preproinsulin 

complementary DNA. Science, 208: 

57-9. 

Wang, C.C. & Tsou, C.-L. 1991. The 

insulin A and B chains contain 

sufficient structural information to 

form the native molecule. TIBS, 16: 

279-81. 


Biotecnologia aplicada ao 

Pesquisa 

CONTROLE BIOLÓGICO 

O entomopatógeno Metarhizium anisopliae 

Grupo de Biologia Molecular de Fungos Filamentosos do Centro de Biotecnologia do Estado do Rio Grande do Sul da UFRGS 

Melissa Franceschini 

Doutoranda em Biologia Celular e Molecular 

UFRGS 

melifran@dna.cbiot.ufrgs.br 

Ana Paula Guimarães 

Graduanda em Ciências Biológicas 

UFRGS 

apgm@dna.cbiot.ufrgs.br 

Melissa Camassola 


UFRGS 

melissa@dna.cbiot.ufrgs.br 

Ana Paula Frazzon 


UFRGS 

apaulagf@dna.cbiot.ufrgs.br 

César Milton Baratto 

Doutorando em Biologia Celular e Molecular 

UFRGS 

baratto@dna.cbiot.ufrgs.br 

Viviane Kogler 


UFRGS 

vkogler@dna.cbiot.ufrgs.br 

Márcia Vanusa da Silva 


UFRGS 

marcia@dna.cbiot.ufrgs.br 

Valéria Dutra 


UFRGS 

valdutra@dna.cbiot.ufrgs.br 

Luciano Nakazoto 

Doutorando em Biologia Celular e Molecular 

UFRGS 

lucnak@dna.cbiot.ufrgs.br 

Luiza Castro 

Mestranda em Biologia Celular e Molecular 

UFRGS 

luiza@dna.cbiot.ufrgs.br 

Lucélia Santi 


UFRGS 

lucelia@dna.cbiot.ufrgs.br 

Marilene Henning Vainstein 

Ph.D, Professora Adjunta do Depto. de 

Microbiologia e Pesquisadora do Centro de 

Biotecnologia 

CBiot-UFRGS 

mhv@dna.cbiot.ufrgs.br 

Augusto Schrank (Chefe do Grupo) 

Ph.D, Professor Adjunto do Depto. Biologia 

Molecular e Biotecnologia e Pesquisador do Centro 

de Biotecnologia 

CBiot-UFRGS 

augusto@dna.cbiot.ufrgs.br 

Fotos cedidas pelos autores 

Controle Biológico 

Apesar de os defensivos agrícolas terem uma alta e 

rápida eficiência, são necessárias aplicações repetidas 

desses produtos, o que representa grandes quantidades 

lançadas no ambiente e um alto custo. Esses produtos 

químicos propiciam uma alta produtividade, mas têm 

efeitos negativos sobre o solo, o clima, a vegetação, as 

águas, os animais e o homem, e provocam a seleção de 

mutantes resistentes, resultantes da forte pressão seletiva. 

Além disso, seu tempo de degradação no ambiente é da 

ordem de décadas, o que provoca uma concentração 

elevada dessas substâncias na cadeia alimentar. Nesse 

contexto, o controle biológico é uma alternativa viável 

para o combate de pragas e patógenos e vantajosa em 

relação ao controle químico, especialmente quanto ao 

impacto ambiental, ao custo, à especificidade e ao desenvolvimento 

de resistência. 

Entre os microrganismos patogênicos com aplicação 

potencial em controle biológico destacam-se os fungos 

filamentosos. Quando comparados a outros sistemas 

utilizados em controle biológico, como bactérias produtoras 

de toxinas, protozoários e vírus, os fungos apresentam 

como vantagem um mecanismo especializado de 

infecção, que ocorre pela sua penetração ativa nos 

hospedeiros, não dependendo, assim, da sua ingestão 

para que se inicie o processo de infecção. 

O maior entrave para a utilização de fungos filamentosos 

no controle biológico é o grande lapso de tempo 

entre a sua aplicação e a morte dos hospedeiros, se 

comparados com os pesticidas químicos. Durante esse 

período de tempo, as pragas agrícolas podem causar 

sérias perdas na produtividade da cultura-alvo. Um dos 

objetivos comuns no estudo desses microrganismos em 

controle biológico visa a aumentar a velocidade de morte 

dos hospedeiros para melhorar a eficiência do biocontrolador. 

Têm sido feitos esforços no intuito de melhorar a 

produção, a estabilidade e a aplicação de inóculos desses 

fungos. O entendimento das características básicas da 

relação entre o fungo e o inseto hospedeiro tem permitido 

conhecer a natureza da patogenicidade, possibilitando a 

introdução de genes específicos, altamente expressos em 

condições de infectividade, com vistas a acelerar o 

processo de infecção e de diminuir, assim, o tempo entre 

o início da infecção e a morte do hospedeiro (ST. LEGER 

et al., 1996). 

O Entomopatógeno Metarhizium anisopliae 

O fungo Metarhizium anisopliae é um Deuteromiceto 

amplamente distribuído na natureza e pode ser encontrado 

facilmente nos solos, onde sobrevive por longos 

períodos (ALVES, 1998). M. anisopliae infecta mais de 300 

espécies de insetos das diferentes ordens, incluindo 


Figura 1: Linhagens brasileiras do fungo Metarhizium anisopliae. A) 

RJc (Deois flavopicta – Rio de Janeiro); B) RJd (Deois flavopicta – Rio de 

Janeiro); C) M5 (Deois sp. - Pernambuco); D) AL (Mahanarva postigata - 

Alagoas); E) MT (Deois sp. – Mato Grosso); F) E9 (Deois flavopicta – 

Espírito Santo); e, G) E6S1 (Deois flavopicta – Espírito Santo). Ambas 

crescidas em Meio Cove sólido. Entre parênteses está descrito o 

hospedeiro em que a linhagem foi isolada e o Estado de origem 

pragas importantes (ALVES, 1998). Alguns 

de seus hospedeiros são pragas 

na agricultura, como a cigarrinha da 

cana-de-açúcar (Mahanarva posticata), 

a cigarrinha-das-pastagens (Deois 

sp e Zulia sp), a lagarta-da-soja (Anticarsia 

gemmatalis), a formiga saúva 

(Atta sexdens), os térmitas subterrâneos 

(Isoptera : Rhinotermitidae). Sua 

patogenicidade tem sido ainda demonstrada 

para carrapatos de diferentes 

gêneros e espécies (KAAYA et al., 

1996; ZHIOUA et al., 1997; FRAZZON 

et al., 2000). Vários fatores têm sido 

apontados como possíveis determinantes 

de patogenicidade, entre os 

quais, a produção de toxinas e a produção 

e secreção de enzimas hidrolíticas, 

como quitinases, proteases e lipases 

(CLARKSON & CHARNLEY, 1996). 

Alguns autores sugerem ainda que a 

expressão diferenciada das superóxido 

dismutases (SODs), enzimas que 

atuam como um sistema de defesa 

contra radicais livres de oxigênio 

(SCHRANK et al., 1993), e a presença 

Figura 2: Detalhes morfológicos de Metarhizium anisopliae. A) O 

fungo M. anisopliae apresenta micélio hialino e septado e esporos 

de coloração verde. B) Os esporos são cilíndricos. C) Algumas 

linhagens de M. anisopliae são infectadas por micovírus 

de micovírus, com genoma de dsRNA 

(BOGO et al., 1996b), influenciam a 

patogenicidade de M. anisopliae. São 

necessárias, entretanto, confirmações 

experimentais para essas observações. 

Por ser considerado um dos agentes 

mais promissores no controle de 

pragas, M. anisopliae tem sido um dos 

modelos mais estudados em relação 

ao isolamento e à seleção de linhagens 

do ambiente, ao isolamento de 

mutantes com características importantes 

para o controle biológico, ao 

estudo dos mecanismos de infecção, 

ao desenvolvimento de metodologias 

de biologia molecular e a estudos 

alternativos para produção, manutenção 

da viabilidade e formulação de 

biopesticidas. A Figura 1 mostra algumas 

linhagens brasileiras do fungo M. 

anisopliae, e suas origens. A Figura 2 

mostra detalhes morfológicos do fungo 

M. anisopliae. O nosso grupo de 

pesquisa tem estudado alguns aspectos 

básicos da biologia molecular de 

M. anisopliae, em especial o desenvolvimento 

de sistemas de transformação 

para permitir a re-introdução 

de genes manipulados in vitro (BOGO 

et al., 1996a), o estudo da regulação 

de quitinases (PINTO et al., 1996) e a 

clonagem e a caracterização do gene 

chit1, que codifica uma dessas quitinases 

(BOGO et al., 1998). O grupo 

dedica-se, ainda, ao estudo da aplicação 

de M. anisopliae como biocontrolador 

do carrapato Boophilus microplus 

(FRAZZON et al., 2000). 

O processo de infecção 

O processo de infecção de M. 

anisopliae em seus hospedeiros ocorre 

em fases sucessivas de germinação, 

diferenciação, penetração, colonização, 

reprodução e disseminação 

(SCHRANK et al., 1993; ALVES, 1998). 

O processo de infecção é iniciado 

pela germinação dos esporos sobre a 

cutícula do hospedeiro. Na superfície 

do esporo, ainda não germinado, foi 

detectada a presença de enzimas (proteases, 

esterases e N-acetilglicosidases) 

que têm efeito na adesão, na 

aquisição preliminar de nutrientes e 

que também causam modificações superficiais 

nas camadas mais externas 

da cutícula do hospedeiro (ST. LEGER 

et al., 1990). O esporo germina e o 

tubo germinativo se diferencia por 


dilatação da extremidade 

das hifas para a formação 

do apressório, uma estrutura 

especializada de penetração, 

estimulada pelo 

contato físico com a cutícula 

do hospedeiro (ST. 

LEGER et al., 1991b). Esse 

estímulo também é sensível 

a alterações da superfície, 

indicando um possível 

mecanismo pelo qual 

o patógeno reconhece 

seu hospedeiro (ST. LE- 

GER et al., 1990). 

Após a formação do 

apressório, ocorre o desenvolvimento 

de estruturas 

denominadas grampos 

de penetração, que 

são caracterizadas por 

uma alteração na parede 

celular da parte do apressório 

que está em contato 

com o hospedeiro, sendo 

mais fina e saliente (ST. LEGER et al., 

1991b). Evidências obtidas por microscopia 

eletrônica e histoquímica 

sugerem que a etapa de penetração 

ocorre por uma combinação de degradação 

enzimática e pressão mecânica 

(ST. LEGER et al., 1988a). Nesse processo 

são produzidas algumas enzimas 

como lipases, quitinases e proteases 

(ST. LEGER et al., 1986a, b, 1988b, 

1991a; PINTO et al., 1996; ALVES, 

1998). 

Após o processo de 

penetração, o fungo inicia 

a etapa de colonização 

do hospedeiro. As 

hifas que atravessam a 

cutícula do hospedeiro 

sofrem um engrossamento 

e se ramificam 

inicialmente no tegumento 

e, posteriormente, 

na cavidade geral do 

corpo, liberando toxinas 

e ocasionando a morte 

do hospedeiro devido à 

produção de metabólitos 

secundários denominados 

destruxinas, 

que afetam os canais de 

transporte de íons, envolvidos 

na resposta 

muscular e a integridade 

da membrana celular. 

O hospedeiro exibe 

vários sintomas incluindo inquietação, 

perda de coordenação e parada 

da ingestão de alimento (LAVERLAM, 

1999). 

Após a morte do hospedeiro, que 

ocorre de 4 a 5 dias após a infecção, as 

hifas se desenvolvem invadindo os 

diversos órgãos internos. Após o esgotamento 

dos nutrientes, as hifas se 

estendem para fora do corpo do hospedeiro, 

formando um micélio, que 

Figura 4: Teleóginas do carrapato B. microplus infectadas 

com o fungo acaricida M. anisopliae. A) Detalhe de hifas 

do fungo M. anisopliae se estendendo para fora do corpo 

de teleógina de B. microplus completamente infectada. B) 

Detalhe de uma teleógina de B. microplus completamente 

infectada pelo fungo M. anisopliae. A cutícula da teleógina 

foi parcialmente retirada 


Figura 3: Cutícula de teleógina 

de Boophilus microplus 

infectada com esporos de 

Metarhizium anisopliae. 10 8 

esporos do fungo foram 

incubados com cutícula de 

carrapato a 28 0 C por 24 horas. 

Fotos de microscopia 

eletrônica de varredura. A) 

Germinação de esporos com 

aumento de 100 vezes; 

primeiro detalhe, aumento de 

605 vezes; segundo detalhe, 

aumento de 4.900 vezes. B) 

Preferência dos esporos em 

germinar próximo a locais 

porosos e articulados da 

cutícula; no caso, pêlos; 

aumento de 2.000 vezes. C) 

Ponta de hifa do acaricida que 

atravessou a cutícula do 

carrapato. Aumento de 1.500 

vezes 

cobre a superfície do tegumento, resultando 

na mumificação. Sob condições 

ambientais apropriadas, ocorre a 

produção de esporos, que poderão 

ser disseminados pelo vento para infectar 

outros indivíduos (LAVERLAM, 

1999). As Figuras 3 e 4 mostram os 

estágios inicial e final do processo de 

infecção do fungo M. anisopliae em 

teleógina do carrapato B. microplus. 

As proteases 

Foi demonstrado que 

entre os genes expressados 

especificamente durante 

o processo de infecção 

de M. anisopliae 

no hospedeiro está o 

gene pr1A, originalmente 

pr1, que codifica uma 

protease do tipo subtilisina 

(PR1A), que tem uma 

participação marcante na 

penetração da cutícula 

do hospedeiro pelo fungo. 

ST. LEGER et al. 

(1992) demonstrou que 

a protease PR1A é mais 

efetiva na degradação 

estrutural das proteínas 

ligadas ‘a cutícula por 

ligação covalente, devido 

aos resíduos de carga

Tabela 1 Quitinases e genes de quitinases isolados de Metarhizium anisopliae. 

Quitinases Indução Ação Linhagem 

CHIT30 Quitina Exo / Endoquitinase E6 

CHIT33 Quitina Endoquitinase ME1 

CHIT43,5 Cutícula Endoquitinase ME1 

CHIT45 Cutícula Endoquitinase ME1 

CHIT60 Quitina Exo / Endoquitinase ATCC 20500 

CHIT110 Inibida por NAG Quitobiase ME1 

Genes Cópias N o de Aminoácidos Linhagem 

chit1 (42 kDa) Única 423 E6 

chi11 (58 kDa) Única 523 ATCC 20500 

chi2 (43 kDa) - 414 ME1 

chi3 (34 kDa) - 317 ME1 

positivas que se formam na superfície 

da molécula de PR1A em pH neutro 

ou alcalino. A Figura 5 mostra a capacidade 

do fungo M. anisopliae de 

alcalinizar o meio contendo substrato 

para proteases, confirmando pH ótimo 

para proteases sendo igual a 8 (ST. 

LEGER et al., 1999). 

O gene pr1A é altamente regulado 

e somente expressado durante a fase 

de penetração (ST. LEGER et al., 1992). 

Esse gene está sob controle duplo de 

expressão: i) pelo mecanismo de repressão 

catabólica regulado pelos níveis 

de carbono e nitrogênio (ST. 

LEGER et al., 1988b) e, ii) pela indução 

específica promovida pelas proteínas 

da cutícula (PATERSON et al., 1994). A 

protease PR1A hidrolisa de 25% a 30% 

das proteínas da cutícula dos hospedeiros 

liberando peptídeos que servirão 

de nutrientes para o fungo e 

substratos para a elaboração de outros 

determinantes da patogenicidade (ST. 

LEGER et al., 1986a). 

PR1A é a única protease de cutícula 

produzida em quantidade elevada 

em vários isolados patogênicos de M. 

anisopliae. Foi observado por ST. LE- 

GER et al. (1987) um aumento da 

protease PR1A durante a penetração 

do fungo M. anisopliae na cutícula de 

larvas de Manduca sexta. 

O gene pr1A foi clonado sob o 

controle de um promotor constitutivo 

e os transformantes, superexpressando 

PR1A, mostraram-se 25% mais eficientes 

na infecção de insetos (ST. 

LEGER et al., 1996). Nesse trabalho, foi 

definitivamente demonstrado o potencial 

da manipulação genética para 

ser efetivamente utilizada na construção 

de linhagens mais eficientes para 

o controle biológico a partir do conhecimento 

dos fenômenos básicos da 

etapa de penetração. A Figura 6 mostra 

a superprodução de PR1A de uma 

linhagem transformada de M. anisopliae 

em comparação com a linhagem 

selvagem. 

JOSHI et al. (1997), investigando 

genes envolvidos no processo de infecção 

de fungos entomopatogênicos, 

descreveram uma nova protease 

também do tipo subtilisina (PR1B) a 

partir de genes especificamente expressados 

por M. anisopliae durante 

seu desenvolvimento na cutícula de 

baratas (Blabarus gigantius). A dedução 

da seqüência de aminoácidos 

mostrou 54% de similaridade com a 

subtilisina PR1A. No entanto, a PR1B 

possui várias substituições na seqüência 

altamente conservada compreendendo 

o sítio ativo das subtilisinas. 

Essas substituições são cataliticamente 

críticas podendo reduzir a eficiência 

catalítica da protease. A função da 

protease PR1B na infecção de hospedeiros 

ainda não foi determinada. 

Atualmente se encontram disponíveis 

no GENBANK seqüências de mais 

oito genes de proteases da família das 

subtilisinas PR1 denominados de pr1D 

até pr1K, que foram isolados de M. 

anisopliae pelo grupo norte-americano 

liderado por St. Leger. Sua função 

ainda não foi estudada. 

Quitina e Quitinases 

Figura 5: Alcalinização de meio contendo substrato para proteases 

pelo fungo Metarhizium anisopliae. O meio utilizado apresenta como 

fonte de carbono apenas azocaseína. Para demonstrar em que faixa de 

pH o fungo cresce quando proteases são requeridas o meio foi 

complementado com o corante Vermelho de Bromocresol. Esse corante 

apresenta coloração variando do amarelo até o violeta quando o pH 

varia do ácido até o alcalino. O pH ótimo para proteases secretadas 

por M. anisopliae fica na faixa alcalina igual a 8. As setas indicam halo 

de degradação de azocaseína 

A quitina, depois da celulose, é um 

dos polímeros mais abundantes na 

natureza (FLACH et al., 1992). É encontrada 

como constituinte do exoesqueleto 

de insetos e de crustáceos, em 

conchas de moluscos e é o maior 

componente da parede celular de fungos 

(CABIB, 1987). As quitinases são 

enzimas hidrolíticas com a propriedade 

de hidrolisar a quitina em oligôme- 


Figura 6: Halo de degradação 

em meio com substrato para 

proteases de linhagens de 

Metarhizium anisopliae. A faixa 

mais clara em cada placa 

demonstra a degradação de 

azocaseína em meio que 

contém apenas azocaseína 

como fonte de carbono, em pH 

ótimo para proteases igual a 8. 

A linhagem E 6 

S 1 

é selvagem de 

M. anisopliae, enquanto a 

linhagem T136 é uma linhagem 

E 6 

S 1 

selvagens que foi 

transformada para que 

superexpressasse a protease 

PR1A. A linhagem apresentou 

halo de degradação 4 vezes 

maior que a linhagem 

selvagem. Esses dados são 

estatisticamente significantes 

(teste de Tukey para α = 0,05) 

ros de N-acetilglicosamina (NAG), que 

assim podem ser absorvidos e metabolisados 

(GOODAY, 1990; GOODAY 

et al., 1992). Muitos organismos produzem 

quitinases, entre eles, bactérias, 

fungos, crustáceos, insetos e plantas 

superiores. 

Em fungos, cuja parede celular é 

composta basicamente por polissacarídeos 

como quitina e glicanas (GOO- 

DAY et al., 1992), as enzimas quitinolíticas 

estão basicamente envolvidas 

nos processos de crescimento e diferenciação. 

Os fungos filamentosos também 

possuem quitinases que atuam 

em diferentes processos fisiológicos, 

como dispersão de esporos, autólise e 

nutrição (DE LA CRUZ et al., 1992; 

STIRLING et al. 1979). 

As enzimas quitinolíticas provavelmente 

desempenham um papel importante 

na penetração de fungos filamentosos 

através da cutícula dos hospedeiros. 

Essas enzimas se encontram 

sob forte regulação no fungo M. anisopliae, 

onde o sistema quitinolítico é 

regulado por um mecanismo de indução-repressão, 

tendo a quitina como 

Figura 7: Análise da produção de enzimas 

quitinolíticas por linhagens de Metarhizium 

anisopliae. As linhagens foram crescidas em 

meio com substrato para quitinases ligado 

(B) ou não (A) ao corante Azul de Remazol. 

A faixa mais clara nas placas representa a 

degradação do substrato pelo fungo. 1) E9; 

2) RJc; 3) MT; e, 4) E6S1. A linhagem E6S1 

demonstrou ser a mais promissora para 

estudos de produção de quitinases 

indutor tanto da síntese como da secreção 

de quitinases, e a glicose como 

repressor da sua síntese. A concentração 

do monômero NAG também regula 

a síntese e a secreção das quitinases, 

sendo que, em baixas concentrações, 

age como indutor, enquanto em 

altas concentrações, apresenta papel 

de repressor (BARRETO, 1996; MO- 

REIRA, 1998; Figura 7). 

Foi demonstrado em géis de atividade 

contendo glicol-quitina como 

substrato que uma linhagem de M. 

anisopliae altamente secretora produzia 

uma mistura complexa de enzimas 

quitinolíticas quando o fungo era cultivado 

em condições de indução. A 

presença de, aproximadamente, 10 

isoenzimas foi sugerida (ST. LEGER et 

al., 1993). Inibidores catabólitos reduzem 

a produção de todas as isoenzimas 

com apenas uma exceção. 

Essa atividade remanescente 

foi sugerido 

ser controlada separadamente 

das demais (ST. 

LEGER et al., 1993). Estudos 

demostraram mais de 

um gene codificando quitinase 

em M. anisopliae 

(Tabela 1). 

Até o momento, não 

foi confirmada a participação 

das quitinases na entomopatogenicidade 

de M. 

anisopliae. Apesar dos 

estudos bioquímicos e do 

conhecimento acumulado, 

pouco se sabe quanto aos 

tipos, a regulação, a localização, 

as seqüências envolvidas 

em sua glicosilação, 

a secreção e a participação 

das quitinases nos 

processos fisiológicos. 

Agradecimentos 

Agradecemos ao Prof. 

Dr. Elliot Watanabe Kitajima, 

do Núcleo de Apoio à 

Pesquisa em Microscopia 

Eletrônica Aplicada à Pesquisa 

Agropecuária (NAP/ 

MEPA) da USP, pelo auxílio 

e colaboração na obtenção 

das fotos por MET. 

Órgãos financiadores: 

CAPES e CNPq pelo apoio 

financeiro. 


ALVES, S.B. (1998) Fungos entomopatogênicos 

em controle microbiano de 

insetos. Editora Manole Ltda, Fealq, 

Piracicaba – SP, p.1163. 

BARRETO, C.C. (1996) Quitinases do 

fungo entomopatogênico Metarhizium 

anisopliae. Dissertação de Mestrado. 

Curso de Pós-Graduação em 

Genética e Biologia Molecular/UFR- 

GS, RS. 

BOGO, M. R., VAINSTEIN, M. H., ARA- 

GÃO, F .J. L., RECH, E., SCHRANK, A. 

(1996a) High frequency gene conversion 

among benomyl resistant 

transformants in the entomopathogenic 

fungus Metarhizium anisopliae. 

FEMS Microbiol. Let. 142:123- 

127. 


BOGO, M.R., QUEIROZ, M.V., SILVA, 

D.M., GIMÉNEZ, M.P., AZEVEDO, 

J.L., SCHRANK, A. (1996b) Doublestranded 

RNA and isometric viruslike 

particles in the entomopathogenic 


Mycol. Res. 100(12):1468-72. 

BOGO, M.R., ROTA, C.A., PINTO, Jr.H., 

CAMPOS, M., CORREA, C.T., VAINS- 

TEIN, M.H., SHRANK, A. (1998) A 

chitinase encoding gene (Chit1 gene) 

from the entomopathogen Metarhizium 

anisopliae: isolation and characterization 

of genomic and full 

length cDNA. Cur. Microbiol.. 37:1- 

6. 

CABIB, E. (1987) The synthesis and 

degradation of chitin. Adv. Enzymol. 

59:59-101. 

CLARKSON, J.M. & CHARNLEY, A.K. 

(1996) New insights into the mechanisms 

of fungal pathogenesis in insects. 

Trends Microbiol. 4(5):197- 

203, 1996. 

DE LA CRUZ, J., HIDALGO-GALLEGO, 

A., M.LORA, J., BENITEZ, T., PIN- 

TOR-TORO, J.A., LLOBEL, A. (1992) 

Isolation and characterization of 

three chitinases from Trichoderma 

harzianum. Europ. J. Biochem. 

206:859-867. 

FLACH, J., PILET, P.E., JOLLES, P. (1992) 

What´s new in chitinase research? 

Exper. 48:90-96. 

FRAZZON, A.P.G., DA SILVA VAZ Jr., I., 

MASUDA, A., SCHRANK, A., VAINS- 

TEIN, M.H. (2000) In vitro assessment 

of Metarhizium anisopliae isolates 

to control the cattle tick Boophilus 

microplus. Vet. Parasitol. 

93:117-25. 

GENBANK http://www.ncbi. 

nlm.nih.gov 

GOODAY, G. (1990) The ecology of 

chitin degradation. Microb. Ecol. 

10:387-431. 

GOODAY, G.H., ZHU, W.Y., DONNE- 

LL, R.W. (1992) What are the roles 

of chitinases in the growing fungus? 

FEMS: Micobiol. Let. 100:387-392. 

JOSHI, L., ST. LEGER, R.J., ROBERTS, 

D.W. (1997) Isolation of a cDNA 

encoding a novel subtilisin-like protease 

(Pr1B) from the entomopathogenic 

fungus, Metarhizium anisopliae 

using differential display-RT- 

PCR. Gene 197:1-8. 

KAAYA, G.P., MWANGI, E.N. and 

OUNA, E.A. (1996) Prospects for biological 

control of livestock tick Rhipecephalus 

appendiculatus and Amblyomma 

variegatum, using the entomogenous 

for Beauveria bassiana 

and Metarhizium anisopliae J. 

Invert. Pathol 67:15-20. 

LAVERLAM S.A. Cali – Colombia. Fevereiro, 

1999. http://cali. cetcol. 

net.co / ~ laverlam / e _ 

index.html 

MOREIRA, C. A. (1998) Regulação da 

secreção de proteínas do entomopatogênico 

Metarhizium anisopliae. 

Dissertação de Mestrado. 

Departamento de Biologia Celular 

do Instituto de Ciências Biológicas 

da Universidade de Brasília, Brasília, 

D.F. 

PATERSON, I.C., CHARNLEY, K., COO- 

PER, R.M., CLARKSON, J.M. (1994) 

Specific induction of a cuticle-degrading 

protease of the insect pathogenic 

fungus Metharhizium anisopliae. 

Microbiol. 140:185-189.0 

PINTO, A.S., BARRETO, C.C., SCHRANK, 

A., ULHOA, C.J.U., VAINSTEIN, M.H. 

(1996) Purification and characterization 

of an extracellular chitinase 

from the entomopathogen Metarhizium 

anisopliae. Can. J. Microbiol. 

43:322-327. 

SCHRANK, A.; BASSANESI, M. C.; PIN- 

TO JR, H.; COSTA, S. V.; BOGO, M. 

R.; SILVA, M. S. N. (1993) Superoxide 

dismutases in the entomopathogenic 

fungus Metharhizium anisopliae. 

Ciência e Cultura 45:200- 

205. 

ST. LEGER, R.J., COOPER, R.M., CHAR- 

NLEY, A.K. (1986a) Cuticle-degrading 

enzymes of entomopathogenic 

fungi: regulation of production 

of chitinolytic enzymes. J. Gen. Microbiol. 

132:1509-17. 

ST. LEGER, R.J..CHARNLEY, A.K., CO- 

OPER, R.M. (1986b) Cuticle-degrading 

enzymes of entomopathogenic 

fungi: synthesis in culture on 

cuticle. J. Invert. Pathol. 48:85-95. 

ST. LEGER, R.J., CHARNLEY, A.K., CO- 

OPER, R.M. (1987) Characterization 

of cuticle-degrading proteases produced 

by the entomopathogen Metarhizium 

anisopliae. Arch. Biochem. 

Biophys. 253:221-232. 

ST. LEGER, R. J.; DURRANDS, P. K.; 

CHARNLEY, A. K.; COOPER, R. M. 

(1988a) Role of extracellular chymoelastase 

in the virulence of Metarhizium 

anisopliae for Manduca 

sexta. J. Invert. Pathol. 52:285-293 

ST. LEGER, R.J., DURRANDAS, P.K., 

COOPER, R.M., CHARNLEY, A.K. 

(1988b) Regulation of production of 

proteolytic enzymes by the entomopathogenic 


Arch. Microbiol.41501: 413- 

416. 

ST. LEGER, R. J.; BUTT, T. M.; STAPLES, 

R. C.; ROBERTS, D. W. (1990) Second 

messenger involvement in differentiation 

of the entomopathogenic fungus 

Metarhizium anisopliae. J. Gen. 

Microbiol. 136:1779-1789. 

ST. LEGER, R. J.; COOPER, R. M.; CHAR- 

NLEY, A. K. (1991a) Characterization 

of chitinase and chitobiase produced 

by the entomopathogenic fungus Metarhizium 

anisopliae. J. Invert. Pathol. 

58:415-426. 

ST. LEGER, R. J.; ROBERTS, D. W.; STA- 

PLES, R. C. (1991b) A model to explain 

differentiation of appressoria by germlings 

of Metarhizium anisopliae. J. 

Invert. Pathol. 57:299-310. 

ST. LEGER, R., FRANK, D.C., ROBERTS, 

D.W., STAPLES, R.C. (1992) Molecular 

cloning and regulatory analysis the 

cuticle-degrading-protease structural 

gene from the entomopathogenic fungus 

Metharhizium anisopliae. J. Biochem. 

204:991-1001. 

ST. LEGER, R.J., FRANK, D.C., ROBERTS, 

D.W., STAPLES, R.C. (1993) Molecular 

cloning and regulatory analysis of the 

cuticle degrading protease structural 

gene from the entomopathogenic fungus 

Metarhizium anisopliae. Eur. J. 

Biochem. 204:991-1001. 

ST. LEGER, R.J., JOSHI, L., BIDOCHKA, 

M.J., ROBERTS, D.W. (1996) Construction 

of an improved mycoinsecticide 

overexpressing a toxic protease. Proc. 

Natl. Acad. Sci. USA. 50:183-212. 

ST. LEGER, R.J., NELSON, J.O., SCREEN, 

S.E. (1999) The entomopathogenic 

fungus Metarhizium anisopliae alters 

ambient pH, allowing extracellular 

protease production and activity. Microbiol. 

145:2691-99. 

STIRLING, J., COOK, G., POPE, A. (1979) 

Chitin and its degradation. In: Fungal 

wall and hyphal growth. British 

Mycological Society p. 169-188. 

ZHIOA, E., BROWING, M., JONHSON, 

P.W., GINSESBERG, H.S., LEBRUM, 

R.A. (1997) Pathogenicity of the entomopathogenic 

fungus Metarhizium 

anisopliae (Deuteromicetos) to Ixodes 

scapularum (Acari:ixodidae). J. Parasitol. 

83 (5): 815-818. 


Pesquisa 

ANTICORPOS 

HUMANIZADOS 

Andréa Queiroz Maranhão 

Profa. Dra. em Biologia Molecular-UnB 

Marcelo de Macedo Brígido 

Prof. Dr. em Bioquímica – UnB 

brigido@unb.br 


Humanização de anticorpos de interesse clínico 

sistema imune dos vertebrados 

é especializado 

no reconhecimento 

de substâncias e organismos 

estranhos e na 

sua posterior eliminação. Desse processo 

participam diversos tipos celulares 

e moléculas, e, dentre essas últimas, 

destacam-se os anticorpos ou imunoglobulinas, 

principais protagonistas da 

resposta imune humoral. A formação 

de imunoglobulinas em resposta a um 

patógeno ou a uma toxina culmina com 

a produção de moléculas de alta afinidade, 

com grande capacidade de distinção 

entre espécies moleculares semelhantes. 

Essa característica das imunoglobulinas 

e a possibilidade de se 

produzirem anticorpos específicos contra 

antígenos humanos em animais imunizados, 

levou à proposição de que 

essas moléculas poderiam ser utilizadas 

como fármacos, ou ainda para 

dirigir fármacos a locais específicos do 

corpo de pacientes. 

Tal proposição ganhou força com a 

descoberta de Milstein e Köhler acerca 

do processo de produção de anticorpos 

monoclonais 1 , o que gerou uma 

grande expectativa por parte da comunidade 

científica e da mídia. Esse processo 

envolve a imortalização de células 

produtoras de anticorpos (oriundas 

do animal imunizado) por fusão com 

células tumorais. Com essa tecnologia, 

que data de 26 anos, partiu-se para uma 

idéia de que os anticorpos monoclonais 

poderiam funcionar como balas 

mágicas, devido à sua especificidade 

por um dado antígeno, podendo alcançar 

específica e eficientemente um único 

tecido ou tipo celular. Esperava-se que, 

em pouco tempo, os anticorpos monoclonais 

chegassem à clínica médica 

como solução para diversos males, 

expectativa essa que foi exacerbada em 

1982, quando um anticorpo anti-idiótipo 

mostrou-se eficiente no tratamento 

de certo tipo de linfoma 2 . Esse período 

foi marcado por um investimento maciço 

por parte de empresas farmacêuticas. 

Esse entusiasmo inicial deu espaço 

a uma fase de ceticismo, quando nenhum 

outro anticorpo testado apresentava 

resultados clínicos significativos. 

Ao contrário, observava-se que alguns 

anticorpos podiam ser muito tóxicos, 

colocando em cheque a sua viabilidade 

clínica. Até o ano de 1994, apenas três 

anticorpos haviam sido aprovados para 

uso clínico, o Orthoclon, o Panorex e o 

ReoPro. Foi também na primeira metade 

da década de 90 que o quadro 

voltou a ser favorável aos anticorpos 

monoclonais. Dois fatores foram fundamentais 

nessa mudança de rumo: 

primeiro, foram obtidos resultados clínicos 

consistentes para diversos anticorpos 

monoclonais; o segundo fator 

foi o aparecimento dos anticorpos recombinantes 

humanizados 3 , que prometiam, 

com a chancela da engenharia 

genética, revolucionar o cenário de 

aplicação dos anticorpos monoclonais 

com uma nova especialidade de pesquisa 

em Biologia Molecular, a Engenharia 

de Anticorpos. A flexibilidade 

na manipulação genética de seu arcabouço 

peptídico e o acúmulo de informações 

sobre sua estrutura e função, 

fez das imunoglobulinas um produto 

de alto valor econômico e com grandes 

perspectivas biotecnológicas. 

Figura 1.- Representação esquemática da molécula de anticorpo 

e seus principais fragmentos. Os fragmentos Fab e o Fc derivados 

da molécula inteira de imunoglobulina podem ser obtidos por 

clivagem proteolítica. Os fragmentos recombinantes scFv e o FvFc 

apresentam um peptídeo conector flexível (linha vermelha) unido o 

carboxi-terminal da cadeia variável pesada com o amino-terminal da 

cadeia variável leve e são obtidos por manipulação genética dos 

genes de imunoglobulinas. Ressalta-se o caráter dimérico do fragmento 

FvFc, apresentando dois sítios de reconhecimento antigênico, 

como na molécula inteira 


Aspectos Estruturais 

dos Anticorpos 

Os anticorpos são proteínas de elevada 

massa molecular encontrados em 

abundância no soro de animais vertebrados. 

A molécula de imunoglobulina 

(figura 1) é de natureza tetramérica e 

pode ser caracteristicamente separada 

em duas cadeias pesadas e duas cadeias 

leves. Essas moléculas são responsáveis 

pelo reconhecimento de determinantes 

antigênicos das substâncias/invasores 

exógenos e também pela ativação 

de sistemas efetores celulares, que, 

em última instância, os eliminam. Devido 

às funções que desempenham, essas 

moléculas apresentam uma ambigüidade 

estrutural: por um lado, sua 

extremidade N-terminal (Fab – fração 

ligante ao antígeno) apresenta uma 

variabilidade superficial capaz de interagir 

com moléculas dos mais variados 

tipos, enquanto que a porção carboxiterminal 

(Fc-fração cristalizável) deve 

ser reconhecida por células efetoras do 

sistema imune, o que pressupõe uma 

certa constância estrutural 4 . É essa região 

(Fc) que se liga aos receptores de 

membrana citoplasmática de macrófagos, 

linfócitos e outras células efetoras, 

invocando a resposta imune a partir do 

reconhecimento do antígeno, o “corpo 

estranho”. A contribuição de cada uma 

das cadeias nessas funções é desigual, 

pois, enquanto a porção ligante ao 

antígeno (Fv – região formada pelos 

domínios variáveis de ambas as cadeias) 

é formada pelo domínio aminoterminal 

de ambas as cadeias, o Fc é 

formado unicamente pela cadeia pesada. 

As imunoglobulinas são, provavelmente, 

as moléculas mais bem estudadas 

em nível de estrutura tridimensional. 

5 O acúmulo de informação estrutural 

facilita a compreensão do funcionamento 

da molécula e permite estabelecer 

critérios para manipulação racional. 

Modelos tridimensionais explicam, 

por exemplo, como a variabilidade 

encontrada no amino-terminal da imunoglobulina, 

co-existe com uma estrutura 

espacial bastante conservada em 

todas as Fv que foram estudadas por 

difração de raios-X. O domínio variável 

apresenta uma estrutura estendida alternada 

com alças (“loops”). Seis dessas 

alças (três em cada cadeia) projetam-se 

para o solvente e participam 

com quase a totalidade dos pontos de 

Figura 2 – Esquematização de processos de humanização de 

imunoglobulinas. Um anticorpo monoclonal murino (em verde) apresenta 

limitações quanto ao seu uso repetitivo como fármaco, devido à 

resposta HAMA (human anti-mouse antibody). As primeiras tentativas 

de minimizar este potencial imunogênico foram feitas por meio da fusão 

das cadeias variáveis leve e pesada do anticorpo de camundongo 

(em verde escuro), com as cadeias constantes humanas (em laranja), 

formando moléculas quimeras. Estas moléculas eram ainda 

imunogênicas, assim os protocolos mais modernos de humanização 

preconizam o transplante das CDR murinas (linhas verdes) para cadeias 

variáveis humanas (em amarelo). Esta molécula teria ainda as cadeias 

constantes de imunoglobulinas humanas como na quimera e se apresenta 

de forma suficientemente invisível para o sistema imune 

contato, com o antígeno. Essas alças 

co-localizam-se com as regiões determinantes 

de complementariedade 

(CDR), onde está concentrada a diversidade 

entre as moléculas de imunoglobulinas 

6 . É nessa região que está 

localizado o paratopo, região complementar 

ao determinante antigênico (epitopo), 

responsável pela formação do 

complexo antígeno-anticorpo. 

Os anticorpos monoclonais são produzidos 

a partir de um único clone de 

linfócito B imortalizado. Durante a resposta 

imune humoral, cada clone de 

linfócito B produz um único tipo de 

molécula reativa a uma única estrutura 

química. Devido a isso, cada anticorpo 

apresenta uma única especificidade, 

ou seja, reage com um único tipo de 

molécula (antígeno). Por outro lado, 

durante a evolução da resposta imune, 

são selecionados clones cada vez mais 

afins por seu antígeno; dessa forma, 

anticorpos obtidos de animais hiperimunizados 

são ditos de alta afinidade, 

ligando-se fortemente ao antígeno e 

dificilmente soltando-o. Isso permite 

que um anticorpo reconheça e reaja 

com o antígeno mesmo que esse se 

encontre diluído em uma mistura complexa. 

São essas as características que 

tornam o anticorpo um reagente de 

escolha para detecção de quantidades 

ínfimas de antígeno dentro de um organismo. 

Imunoglobulinas como 

Medicamentos 

O interesse biotecnológico pelas 

imunoglobulinas é secular. A utilização 

de anticorpos para neutralizar toxinas, 

proposto por Behringer, gerou uma 

grande revolução no pensamento científico 

no final do século XIX. No Brasil, 

o pioneiro na utilização de soros foi 

Vital Brasil. Com ele surgiram fazendas 

para produção de soro anti-ofídico e 

contra outros venenos de animais peçonhentos, 

o que fez do Brasil uma 

referência nessa área. A segunda geração 

de anticorpos veio com o advento 


Figura 3 - Esquema geral para humanização de anticorpos. 

As seqüências codificadoras das cadeias leve e pesada do 

anticorpo, são obtidas a partir de um clone produtor do 

anticorpo monoclonal de interesse. Essas seqüências são comparadas 

com seqüências germinais a partir de um banco de genes 

germinais humanos utilizando-se do programa FASTA. As seqüências 

são comparadas e uma seqüência humanizada é proposta. 

Utilizando-se de um modelo tridimensional, a seqüência 

proposta é verificada. Esta seqüência proposta é retro-traduzida 

para seqüência nucleotídica e sintetizada a partir de 

oligonucleotídeos sintéticos e PCR. O novo gene é clonado em 

vetor de expressão apropriado e expresso em células de mamíferos 

em cultura 

dos anticorpos monoclonais, em 1975, 

o que gerou uma grande perspectiva na 

comunidade científica devido à possibilidade 

de criação de reagentes específicos, 

reativos a diferentes antígenos 

e com possibilidade, portanto, de resolver 

problemas, antes de difícil solução, 

como o ataque a células cancerígenas, 

a minimização da rejeição a enxertos, 

entre outros. Diferentemente do soro 

imune, o anticorpo monoclonal consiste 

em uma preparação homogênea, 

monoespecífica, que pode reconhecer 

um único e específico alvo dentro do 

organismo do paciente. Os anticorpos 

monoclonais são hoje uma realidade 

sendo utilizados para diversos fins: 

como moduladores da rejeição em pacientes 

transplantados, para o mapeamento 

de tumores, desintoxicação por 

drogas ou mesmo na imunização preventiva. 

Apesar do amplo potencial de aplicação 

dos anticorpos monoclonais, a 

utilização extensiva é limitada pela sua 

alta toxicidade. Os anticorpos monoclonais 

são proteínas normalmente produzidas 

em laboratório a partir de células 

de camundongos ou ratos, e quando 

injetados em pacientes humanos acaba 

gerando uma resposta imune contra a 

proteína estranha ao organismo. Os 

anticorpos são reconhecidos como corpos 

estranhos e podem gerar uma forte 

reação imune adversa. Esse problema 

inviabiliza a utilização dos anticorpos 

de uma forma repetitiva. A produção 

de anticorpos pelo paciente contra a 

preparação de anticorpos monoclonais, 

conhecida como resposta HAMA (do 

inglês human anti-murine antibodies), 

normalmente provoca a neutralização 

da ação do anticorpo, fazendo com 

que o paciente fique resistente ao medicamento 

7 . Em casos mais severos, a 

administração desses anticorpos pode 

resultar em febre, urticárias e, em uma 

forma extrema, pode redundar em comprometimento 

renal, devido a uma deposição 

glomerular de imuno-complexos. 

Esse efeito é bem conhecido, pois 

também representa um entrave à utilização 

repetitiva de soro contra peçonhas, 

como o anti-ofídico. O soro imune 

pode ser utilizado com segurança 

no primeiro acidente, mas pode provocar 

febre e outras seqüelas mais profundas 

a partir da segunda utilização. 

Essa resposta do indivíduo contra a 

administração de proteína heteróloga 

acaba por limitar o uso desses medicamentos 

e vem impedindo a sua popularização 

na terapia. 

A melhor maneira de ampliar a 

utilização dos anticorpos monoclonais 

na clínica médica é fazer uso de anticorpos 

humanos em substituição aos 

derivados de roedores. Em princípio, 

anticorpos humanos não devem induzir 

resposta imune significativa por serem 

reconhecidos pelo sistema imune 

como uma proteína própria do organismo 

humano. O grande inconveniente é 

que a produção de anticorpos monoclonais 

a partir de células humanas é 

metologogicamente mais complexa que 

a produção a partir de roedores. Além 

de mais laboriosa, a imortalização de 

células humanas produtoras de imunoglobulinas, 

normalmente implica numa 


manipulação com vírus, o que dificulta 

e até inviabiliza a utilização do produto 

na clínica médica. Outro problema refere-se 

à baixa afinidade dos anticorpos 

gerados, além de as linhagens 

celulares produtoras serem muito instáveis 

geneticamente. Portanto, foi só a 

partir da década de 90, com o progresso 

da pesquisa em engenharia genética, 

que se tornou possível a síntese de 

anticorpos por meio de recombinação 

gênica in vitro. Isso permitiu a modificação 

proposital de suas características 

imunoquímicas. Através da manipulação 

dos genes codificadores para cada 

uma das cadeias do anticorpo, é possível 

alterar a estrutura e a função, e, 

inclusive, incluir um caráter humano 

no anticorpo murino. A última geração 

de fármacos inclui moléculas de anticorpos 

recombinantes 1 . Uma grande 

variedade de moléculas pode ser obtida 

por esse processo, que permite 

atender a diferentes funções. Fragmentos 

reduzidos, contendo apenas a porção 

da molécula responsável pelo reconhecimento 

ao antígeno, têm sido 

utilizados principalmente para o mapeamento 

de tumores ou para a desintoxicação 

de fármacos, quando se desejam 

moléculas menores, com um melhor 

desempenho farmacodinâmico. 

Esse procedimento permite ainda que 

anticorpos de interesse terapêutico, obtidos 

normalmente de camundongos, 

tornem-se menos imunogênicos em humanos. 

O processo consiste em manipulação 

genética para tornar a estrutura 

de aminoácidos mais próxima da estrutura 

encontrada em anticorpos humanos, 

reduzindo a possibilidade de reações 

adversas no paciente, ao mesmo 

tempo em que mantém a especificidade 

do anticorpo murino original 3 . 

A manipulação resolve outro grande 

problema com os anticorpos monoclonais 

murinos: a atividade efetora 

necessária à atividade biológica do 

anticorpo. Essa atividade efetora é exercida 

pela porção constante da molécula, 

e depende do seu isotipo, ou seja, do 

tipo de cadeia pesada que se associa à 

região ligante ao antígeno. Alguns anticorpos 

de camundongo exercem atividade 

efetora em humanos, mas, em 

muitos casos, a atividade pretendida 

depende de cadeias constantes humanas 

específicas (Fc), como a cadeia γ1, 

para induzir a lise da célula alvo, ou γ4, 

para bloquear ou reduzir uma resposta 

imune exacerbada ou alérgica 1 . Portanto, 

torna-se importante a possibilidade 

de redefinição da Fc de um anticorpo, 

a fim de torná-lo atraente para sua 

utilização clínica. Além disso, é possível 

alterar deliberadamente a atividade 

efetora como, por exemplo, pela alteração 

de resíduos no Fc responsáveis 

pela reciclagem (“turn-over”) da molécula. 

Essa mudança não natural permite 

que o anticorpo mutante tenha uma 

maior permanência no sangue aumentando 

a eficácia do tratamento. 

Tornando Humanos os 

Anticorpos de Camundongos 

Existem dois tipos básicos de modificações 

introduzidas em anticorpos 

recombinantes para que estes assumam 

um caráter humano. A primeira 

delas é a fusão gênica da porção Fv do 

anticorpo original (de camundongo) à 

porção constante de uma imunoglobulina 

humana, formando uma quimera 

(figura 2). Apesar da introdução de 

uma porção Fc humana, esse tipo de 

construção ainda mostra uma grande 

imunogenicidade devido à preservação 

da região Fv de camundongo. Para 

a construção de um anticorpo totalmente 

humanizado uma porção constante 

é fusionada a uma Fv desenhada 

de forma que sua seqüência seja a mais 

próxima possível de uma Fv de anticorpo 

humano. Nesse caso, as cadeias leve 

e pesada variáveis são redesenhadas 

baseando-se em regiões variáveis leve 

e pesada de imunoglobulina humana 

homóloga à imunoglobulina de camundongo. 

Uma Fv humanizada, com 

atividade preservada, é conseguida pelo 

transplante das CDR do anticorpo murino 

para o anticorpo humano (demais 

regiões da Fv e regiões constantes), 

obtendo-se assim uma molécula humanizada 

(figura 2) que preserva a capacidade 

de interação com o antígeno. 

Nessa abordagem, é possível obter um 

anticorpo bem próximo àquela “molécula 

invisível” ao sistema imune do 

paciente que o receberá. O limite desse 

processo é obter uma molécula o mais 

humana possível sem perder a sua 

atividade biológica original. Esse limite 

decorre do fato de que a manipulação 

dos resíduos de aminoácidos das CDR 

pode levar a uma desestabilização das 

alças de contato. Essas alças estão envolvidas 

em um grande número de 

interações intramoleculares que não 

necessariamente estarão preservadas 

quando da introdução de uma nova 

CDR. Detectar estas interações e sanálas 

no sentido de se obter uma afinidade 

pelo antígeno, a mais próxima possível 

daquela do anticorpo original, é o 

desafio desta metodologia 1,3,8 . 

Além da preocupação com a manutenção 

da afinidade original e com a 

eliminação da imunogenicidade da molécula 

em si, outro aspecto relevante é 

a otimização da produção do anticorpo 

humanizado. Os vetores utilizados para 

tal propósito servem para dirigir a síntese 

da cadeia protéica do anticorpo 

recombinante em um sistema heterólogo 

(bactérias, leveduras ou mesmo células 

de mamíferos). Esses vetores são 

normalmente plasmídios, contendo um 

cassete de expressão, compatíveis com 

o tipo celular utilizado como hospedeiro. 

Para vetores em células de mamíferos, 

o promotor imediato de Citomegalovirus 

é o mais popularmente utilizado 

9 . Esses vetores são montados contendo 

os genes que codificam as cadeias 

constantes leve e pesada humanas, 

flanqueadas por sítios de restrição que 

facilitam a introdução dos domínios 

variáveis recombinantes humanizados 

gerados. Esses vetores possibilitam também 

a manipulação da atividade efetora 

através da clonagem de cadeias constantes 

de isotipos específicos. A escolha 

do isotipo e manipulações pontuais 

para aumentar a meia vida desses produtos 

na circulação sangüínea são exemplos 

de modificações trabalhadas diretamente 

no vetor. Pela manipulação do 

vetor, o autor pode escolher a priori a 

função da molécula a ser sintetizada. 

Além da indicação de uma resposta 

efetora específica através da escolha do 

isotipo de cadeia pesada, durante esse 

processo é possível manipular a molécula 

de imunoglobulina para que essa 

se apresente na forma de fragmentos 

(Figura 1). A utilização de porções 

menores da molécula, normalmente 

Fab ou Fv (este último, em geral, na 

forma de scFv - de cadeia única, apresentando 

um peptídeo conector flexível 

unindo as cadeias variáveis leve e 

pesada) é a visada, quando se pretende 

que a molécula tenha alta penetrabilidade, 

como, por exemplo, na utilização 

para diagnósticos de marcadores 

tumorais. Esse tipo de mini-molécula 

apresenta maior capacidade de penetração; 

no entanto, tem meia vida reduzida 

no soro do paciente. Quando se 

busca um maior tempo de circulação 

na corrente sangüínea, a opção, normalmente, 

é fazer a molécula inteira e 

expressá-la em sistemas eucarióticos, 


para que se consiga a montagem correta 

da estrutura tetramérica (com duas 

cadeias leves e duas cadeias pesadas) 

no retículo endoplasmático das células 

utilizadas para a expressão. Formas 

intermediárias, como o FvFc (Figura 2), 

entre o fragmento variável de cadeia 

única e o anticorpo inteiro, têm sido 

propostas mais recentemente 10 . 

A Experiência Brasileira 

No Brasil, o Instituto Butantan de 

São Paulo foi pioneiro na produção de 

anticorpos monoclonais com qualidade 

para utilização clínica. A utilização 

clínica desses anticorpos já é uma realidade 

no Brasil. No Centro de Biotecnologia 

do Instituto Butantan os anticorpos 

murinos anti-CD3 e anti-CD18 

são produzidos pelo cultivo dos hibridomas 

em bioreatores de alta capacidade. 

As normas utilizadas para o processamento 

dos anticorpos permitem a 

obtenção de produtos com qualidade 

para uso injetável humano. O anticorpo 

anti-CD3 foi testado clinicamente, 

com êxito, na reversão da rejeição de 

transplante de rim, fígado e coração e 

vem sendo utilizado regularmente pelo 

Instituto do Coração - INCOR . Esse 

anticorpo já vem sendo distribuído pelo 

Instituto Butantan e compete hoje com 

o produto Orthoclone®, um anti-CD3 

produzido pela Ortho Biotech. O anticorpo 

anti-CD18 está ainda em fase de 

testes clínicos, e tem uso potencial em 

transplante de órgãos, meningite bacteriana 

11 , choque séptico 12 e na recuperação 

de pacientes infartados. 

O transplante de órgãos representa 

uma solução clínica para uma série de 

doenças e diversos órgãos podem ser 

aproveitados para transplante. Esse 

procedimento, apesar de eficiente, apresenta 

dois problemas básicos que são a 

falta de doadores e a incompatibilidade 

entre doador e receptor. O primeiro 

problema deve ser reduzido com a 

nova lei brasileira de doação presumida 

de órgãos. O segundo problema 

depende, cada vez mais, de novos 

fármacos que consigam modular a resposta 

imune, de modo que torne o 

paciente tolerante ao órgão transplantado. 

Atualmente o tratamento é feito 

continuamente com corticóides e, de 

uma forma intermitente, com imunoglubinas 

policlonais anti-timócito (ATG) 

ou monoclonais anti-CD3. Ambas as 

preparações resultam em uma depleção 

acentuada das células T e, conseqüentemente, 

da resposta imune celular 

adversa ao enxerto. As duas preparações 

de anticorpos utilizadas são heterólogas 

e, portanto, não podem ser 

utilizadas de uma forma rotineira devido 

à perda de atividade da droga e à 

hipersensibilidade causada pela sua 

administração contínua. Ambos os efeitos 

são originados de uma resposta 

imune ao fármaco, que é visto pelo 

organismo como proteína estranha contra 

o qual são gerados anticorpos. Com 

o tempo esses anticorpos gerados pelo 

paciente acabam por diminuir o efeito 

do imunosupressor. 

Além do anti-CD3, primeiro anticorpo 

monoclonal introduzido na clínica 

médica, anticorpos alternativos contra 

outros marcadores celulares são 

também propostos como imunosupressores, 

entre eles o anti-CD18 e o anti- 

CD4. Diferentemente do marcador CD3, 

o CD18 é parte de um complexo protéico 

de adesão (LFA1) envolvido em 

processos de migração e infiltração 

linfocitária. Anticorpos anti-CD18 não 

necessariamente precisam depletar os 

linfócitos para atuar, sendo capazes de 

inibir processos inflamatórios em geral, 

processo este caracterizado por uma 

arregimentação de linfócitos T, que 

deixam a corrente sanguínea e migram 

através do endotélio vascular para o 

local do processo inflamatório. Anticorpos 

anti-CD18 foram testados com 

sucesso na inibição de diversos tipos 

de processos inflamatórios 13 . Ao contrário 

do anticorpo anti-CD3, que já tem 

um papel de destaque como adjuvante 

no tratamento de transplantados, o anticorpo 

anti-CD18 ainda se encontra 

em fase de testes clínicos. Suas aplicações 

são bastante amplas e incluem a 

redução do processo inflamatório em 

doenças infecciosas como a meningite. 

Nesse caso, a administração do anticorpo 

monoclonal resulta na prevenção 

das seqüelas neurológicas criada pelo 

grande afluxo de leucócitos que atravessam 

a membrana hemato-encefálica, 

que causam a resposta inflamatória, 

grande responsável pelos graves sintomas 

e mortandade da doença. 

Em 1997, o grupo de Imunologia 

Molecular da UnB 14 juntou-se ao Instituto 

Butantan e ao INCOR para desenvolver 

produtos humanizados para a 

Figura 4 - Reconhecimento de linfócitos humanos por fragmentos de 

anticorpos humanizados. O anticorpo humanizado contra o marcador 

de superfície de linfócitos, CD18, foi utilizado para corar linfócitos humanos 

fixados em lamina de microscópio e visualizado com anticorpo anti-Fc 

humana conjugado a fluoresceína. A imunofluorescência foi observada em 

microscópio de fluorescência (Ruggierro et al., em preparação). À direita 

os linfócitos foram corados com anticorpo anti-CD18 e à esquerda com 

um anticorpo irrelevante 

substituição dos anticorpos produzidos 

no I. Butantan. Na época, a idéia era 

criar competência nessa nova tecnologia 

e, ao mesmo tempo, tentar sanar 

problemas pontuais, que já estavam 

sendo alvo de pesquisa clínica no Brasil. 

Nesse intuito, foi montado um esquema 

de produção, onde se trabalha 

independentemente a porção variável 

e a cadeia constante do anticorpo. Por 

um lado, trabalhou-se em vetores para 

a produção dos anticorpos recombinantes 

que já continham a cadeia constante. 

Inicialmente foi escolhido o isotipo 

IgG1 humano, isotipo que tem 

características de fixação de complemento 

e arregimentação do sistema 

efetor (macrófagos e linfócitos T). Os 

vetores, plasmídios contendo um cas- 


sete de expressão heteróloga prevêem 

a fusão gênica da Fv diretamente à 

região constante γ1, para a cadeia pesada, 

e κ, para a cadeia leve. Os vetores 

estão sendo construídos para permitir a 

produção de anticorpos recombinantes 

completos e fragmentos de anticorpos 

que preservem a sua capacidade 

ligante. Estão sendo testados dois hospedeiros 

para a expressão heteróloga: 

a levedura metilotrófica Pichia pastoris, 

que vem sendo utilizada com sucesso 

para a expressão, em grande escala, 

de proteínas animais; e células de mamífero 

em cultura, que é uma tecnologia 

já dominada no Brasil e que permite 

uma grande produtividade, principalmente 

para moléculas grandes, como o 

caso do anticorpo completo (4 cadeias), 

que tem massa molecular de cerca 

de 150 kDa. 

Para o desenvolvimento da Fv, foi 

criado um protocolo diferente daquele 

utilizado por outros grupos no exterior 

(figura 3), onde se enfatiza a comparação 

entre os genes variáveis murinos 

(genes que codificam a Fv e que são 

selecionados durante a resposta a um 

dado antígeno) utilizados no anticorpo 

original, com uma biblioteca de genes 

variáveis germinais humanos (genes 

que não sofreram rearranjo, nem hipermutação). 

A utilização de genes variáveis 

(V genes) germinais (germline) 

tem sido proposta na literatura como 

uma alternativa à estratégia “best-fit”, 

onde o gene variável humano escolhido 

é aquele que possui a maior identidade 

com o gene murino, independente 

do nível de mutação acumulado em 

sua região codante. Thomlison e colaboradores 

15,16 definiram uma biblioteca 

de seqüências germinais de VH (cadeia 

variável pesada) e VL (cadeia variável 

leve), e vários autores vêm testando 

essa estratégia. No nosso laboratório, 

estamos desenvolvendo uma estratégia 

própria, que maximiza o conteúdo de 

resíduos humanos nas seqüências propostas. 

Nessa abordagem, procura-se a 

seqüência germinal mais próxima e 

inserem-se as seqüências correspondentes 

às CDR 1, 2 e 3 de ambas as 

cadeias. Através de modelagem molecular 

são acompanhados e revistos os 

possíveis impedimentos estruturais. Em 

um trabalho desenvolvido em nosso 

grupo 17, mostramos que é possível saturar 

a região variável pesada com resíduos 

humanos e manter atividade ligante 

compatível à do anticorpo original. 

Atualmente já se encontra disponível 

uma versão totalmente humanizada do 

anticorpo anti-CD18. Esse anticorpo, 

produzido em cultura de células animais, 

reconhece o antígeno especificamente 

e com as mesmas características 

de seletividade e afinidade que o anticorpo 

original obtido de hibridomas 

(Figura 4). 

Conclusão 

A utilização de fármacos à base de 

anticorpos recombinantes vem-se tornando 

uma realidade. O mercado mundial 

para anticorpos terapêuticos é de 

cerca de US$ 500 milhões. Os produtos 

humanizados também já ganham volume 

no mercado. Nos EUA vários anticorpos 

humanizados já foram liberados 

pelo FDA (Food and Drug Administration) 

ou outros organizações equivalentes 

de outros países (5 quiméricos e 

3 humanizados) e um grande número 

se encontra em fase de testes clínicos ( 

a grande maioria humanizados) 2 . Nos 

próximos dez anos, o mercado deverá 

ser invadido por essas imunoglobulinas 

de última geração. A perspectiva é 

de que a tecnologia de anticorpos recombinantes 

venha a fornecer insumos 

para diversas áreas da medicina, desde 

agentes imunomoduladores até vacinas 

recombinantes. Essa tecnologia tem 

sido utilizada, inclusive, com vistas ao 

tratamento de doenças como o câncer, 

a AIDS, e na prevenção de infecções 

bacterianas 18 . A manipulação de anticorpos 

já utilizados atualmente na medicina, 

em sua forma murina, que vem 

sendo realizada por grupos nacionais, 

permitirá a formação de competência 

necessária para o domínio dessa tecnologia 

no país, a partir das experiências 

bem sucedidas; outros anticorpos de 

interesse clínico deverão surgir como 

candidatos à humanização. 

Bibliografia 

1-Winter, G. & Milstein, C. (1991) Manmade 

antibodies. Nature 349: 293- 

299. 

2-Gleenie, M.J. & Johnson, P.W.M. 

(2000). Clinical Trials of Antibody 

Therapy. Immunol. Today 21: 403- 

410. 

3-Co, M.S. & Queen C. (1991) Humanized 

Antibodies for Therapy. Nature 

351: 501-502. 

4-Goldsby, R.A.; Kindt, T.J. & Osborne, 

B.A. (2000). Em: Kuby Immunology. 

pp: 83-149. 4ª Edição. W. H. 

Freeman and Company, New York, 

NY, USA. 

5-Padlan, E.A. (1 994). Anatomy of the 

Antibody Molecule. Molecular Immunol. 

31: 169-218. 

6-Branden, C. & Tooze, J. (1991). Em: 

Introduction to Protein Structure. Garland 

Ed.,NY, EUA. 

7-McCann, M.C. & Boyd, J.E. (1992) Em: 

Plasma and Recombinant Blood Products 

in Medical Therapy. Editor: CV 

Prowse., John Wiley & Sons Ltd ed., 

NY, EUA 

8-Homes, M.A. & Foote, J. (1997) Structural 

consequences of Humanizing an 

Antibody. J. Immunol. 158: 2192-201. 

9-Trill, J.J.; Shatzman, A.R. & Ganguly, S. 

(1995). Production of monoclonal antibodies 

in COS and CHO cells. Current 

Opinion in Biotechnology, 

6:553-560. 

10-Andrade, E.V.; Albuquerque, F.C.; Moraes, 

L.M.P.; Brigido, M.M.; Santos- 

Silva, M.A. (2000) Single-Chain Fv with 

Fc fragment of the Human IgG1 Tag: 

Construction, Pichia pastoris Expression 

and Antigen Binding Characterization. 

J. Biochem. 128, 891-895. 

11-Tuomanen, E. (1993). Breaching the 

blood-brain barrier. Sci Am. 268:80- 

84. 

12-Thomas, J.R.; Harlan, J.M.; Rice, C.L. & 

Winn, R.K. (1992). Role of leukocyte 

CD11/CD18 complex in endotoxic and 

septic shock in rabbits. J. Appl. Physiol. 

73: 1510-1516. 

13-Stambury et al. (1995) Em: Inborn Errors 

of Metabolism. Mcgraw Hill ed., 

NY, EUA 

14-www.unb/ib/cel/imol. 

15-Tomlinson, I.M, Walter, G.; Marks, J.D., 

Llewelin, M.B; Winter, G. (1992) The 

repertoire of human germline VH sequences 

reveals about fifty groups of 

VH segments with different hypervariable 

loops. J. Molec. Biol. 215: 175- 

182. 

16-Tomlinson, I.M.; Cox, J.P.L.; Gherardi, 

E.; Lesk, ªM.; Chothia, C. (1995) The 

Repertoire of the humans Vk domain. 

EMBO J. 14:4628-4638. 

17-Caldas, C.A., Coelho,V. P. C. V., Rigden, 

D. J., Neschich G., Moro A. M. and 

Brígido, M. M.. (2000). Design and 

synthesis of germline-based hemi-humanized 

single chain Fv against the 

CD18 surface antigen, Protein Engineering, 

13:353-360. 

18-Beninatti et al. (2000). Therapy of mucosal 

candidiasis by expression of an 

anti-idiotype in human commensal bacteria. 

Nat Biotechnol. 18: 1060-1064. 


Pesquisa 

CIANOBACTÉRIAS 

TÓXICAS 

O uso de marcadores moleculares para avaliar a diversidade genética 

Maria do Carmo Bittencourt-Oliveira 

Profa. Dra. do Dep. Ciências Biológicas da UNESP, 

campus de Assis,SP. 

mbitt@assis.unesp.br 

Mariana Cabral de Oliveira 

Profa. Dra. do Dep. Botânica da USP, SP. 

mcoliveira@usp.br 

João Sarkis Yunes 

Prof. Dr. da Unidade de Pesquisas em Cianobactérias, 

FURG, RS. 

dqmsarks@super.furg.br 


Em determinadas condições ambientais, 

tais como temperaturas médias 

diárias acima de 25 o C, concentrações de 

nutrientes numa razão N:P 

(nitrogênio:fósforo) entre 20:1 e 10:1 e 

pH acima de 7.5, algumas populações 

de cianobactérias apresentam um intenso 

crescimento, conhecido como florações 

(Figura 1), as quais podem ser 

fenômenos naturais regionais de ocorrência 

sazonal, mas que, na maior parte 

das vezes, estão relacionadas à eutrofização 

artificial causada por excesso de 

nutrientes vindos de efluentes domésticos 

e rejeitos industriais. 

As florações de cianobactérias podem 

causar gosto e odor desagradável 

na água, além de alterar o equilíbrio 

ecológico do ecossistema aquático. No 

entanto, o mais grave é que certas 

espécies são capazes de produzir toxinas 

que podem ser acumuladas na rede 

trófica e produzir diferentes sintomas de 

intoxicação, atingindo conjuntos de organismos 

muito além da comunidade 

aquática. 

Entre as cianobactérias que podem 

causar florações em corpos de água 

continentais, destacam-se aquelas que 

produzem as cianotoxinas (Figura 2). As 

cianotoxinas são liberadas para o ambiente 

quando as células se rompem. 

Essas toxinas não são retiradas da água 

pelos tratamentos convencionais das 

redes públicas de abastecimento e são 

resistentes à fervura. As cianotoxinas 

produzem efeitos especiais nos mamíferos, 

sendo classificadas como neurotoxinas 

e hepatotoxinas. Foram as hepatoxinas 

que ocasionaram a morte de mais 

de 60 pacientes em uma clínica de 

hemodiálise em Caruaru, estado de Pernambuco, 

em 1996 (Jochimsen et al. 

1998). 

Monitoramento da água 

Figura 1. Florações de 

cianobactérias potencialmente tóxicas. 

A. reservatório destinado ao 

abastecimento público, estado de 

Pernambuco; B. tanque de piscicultura, 

estado de São Paulo 

A Fundação Nacional da Saúde (FU- 

NASA), em colaboração com a Organização 

Panamericana da Saúde (OPAS), 

redigiu uma atualização da portaria 36/ 

MS/90, que definiu as normas e os 

padrões de potabilidade da água para 

consumo humano no Brasil, incluindo a 

obrigatoriedade do monitoramento da 

ocorrência de cianobactérias potencialmente 

nocivas, testes de toxicidade e 

análises de algumas cianotoxinas (microcistina, 

cilindrospermopsina, saxitoxina) 

tanto na água bruta do manancial 

utilizado para a captação de água, como 

na água tratada para consumo doméstico 

(Portaria MS/1.469, de 29 de dezembro 

de 2000). 

O monitoramento dos mananciais e 

reservatórios de água pode incluir a 

identificação das espécies potencialmente 

tóxicas e o acompanhamento de sua 

densidade, através de contagem. No 

entanto, a identificação desses microrganismos 

baseada em características 

morfológicas, apesar de amplamente 

utilizada e recomendada (Chorus & 

Bartram 1999), tem-se mostrado inadequada, 

devido à extensa plasticidade 

fenotípica de algumas espécies (Figura 

3) (Otsuka et al. 2000; Bittencourt-Oliveira 

2000). Além disso, o uso de características 

morfológicas é inadequado, 

visto que a toxicidade é uma característica 

intra-populacional (Bittencourt-Oliveira 

& Yunes 2001). Por isso, outras 

técnicas também podem ser empregadas, 

e são recomendadas como padrões: 

bioensaios com camundongos, 

detecção de toxinas através de Cromatografia 

Líquida de Alta Performance 

(HPLC) ou análises imunoenzimáticas 

específicas. Porém nenhuma destas análises 

são preditivas, ou seja, elas só são 

efetuadas quando a floração tóxica já se 

estabeleceu. 

A predição desses fenômenos, porém, 

torna-se extremamente importante, 

tendo em vista o aumento da ocorrência 

de florações tóxicas em grandes 

sistemas de abastecimento de água e o 

alto custo da tecnologia atual para remover 

as toxinas quando implementada 

na rotina do monitoramento. Portanto, 

uma das alternativas seria buscar marcadores 

moleculares que identificassem a 

presença de cepas de cianobactérias 

potencialmente tóxicas antes da ocorrência 

da floração. 

Diversidade genética de 

Microcystis aeruginosa 

Para entender a dinâmica das florações 

de cianobactérias em ecossistemas 

eutrofizados, é importante entender sua 

diversidade genética a fim de monitorar 

essas populações. Microcystis aeruginosa 

é uma das espécies potencialmente 

tóxicas capazes de produzir a microcistina 

e uma das responsáveis por grande 

parte dos relatos de intoxicação 

(CETESB 1997). 


Tabela 1. Cepas clonais de Microcystis estudadas indicando a presença do marcador molecular (+) para o gene que codifica 

para microcistina sintetase e a constatação da toxicidade através da análise de imunoensaio. Cepas pertencentes ao mesmo 

local e data foram isoladas a partir da mesma população coletada em um único ponto do corpo d´água. 

LG-SP: Lagoa das Garças, Parque Estadual das Fontes do Ipiranga, São Paulo, SP; CT-SP: Reservatório do Sistema Cantareira, 

Mairiporã, SP; LJ-RJ: Lagoa de Jacarepaguá, Rio de Janeiro, RJ; TB-PE: Reservatório de Tabocas, São Lourenço da Mata, PE; 

TP: Reservatório de Tapacurá, Vitória de Santo Antão, PE; LS-MG: Lagoa Santa, MG; BB-SP: Reservatório de Barra Bonita, Barra 

Bonita, SP; TM: Reservatório de Três Marias, BA. 

FCLA: Coleção de Microrganismos da Faculdade de Ciências e Letras de Assis-UNESP. NPPN: Coleção do Núcleo de Pesquisa 

em Produtos Naturais-UFRJ. 

NA: não analisada. 

Cepa Espécie Localidade Data de Coleta Marcador Toxicidade 

Molecular 

FCLA30 M. aeruginosa LG-SP Nov.96 - Não tóxica 

FCLA158 M. aeruginosa LG-SP Dez.96 - Não tóxica 


FCLA174 M. aeruginosa LG-SP Dez.96 - Tóxica 




FCLA155 M. aeruginosa LG-SP Dez.96 + Tóxica 



FCLA299 M. aeruginosa LG-SP Fev. 97 + Tóxica 

FCLA236 M. aeruginosa LG-SP Mar.97 + Tóxica 

FCLA232 M. aeruginosa LG-SP Mar.97 + NA 

FCLA262 M. aeruginosa LG-SP Mar.97 + Tóxica 

FCLA235 M. aeruginosa LG-SP Abr.97 + Tóxica 

FCLA310 M. aeruginosa LG-SP Abr.97 - Não tóxica 

FCLA298 M. aeruginosa LG-SP Mai.97 + Tóxica 

FCLA450 M. aeruginosa LG-SP Jul.97 - Tóxica 

NPPN-JB1 M. aeruginosa LG-SP 1990 + Tóxica 

FCLA225 M. aeruginosa CT-SP Març.97 + NA 

FCLA296 M. aeruginosa CT-SP Març.97 - Não tóxica 

FCLA16 M. cf. “panniformis” BB-SP Nov.99 - Tóxica 

FCLA 97 M. cf. “panniformis” BB-SP Abr.00 - NA 



FCLA 100 M. cf. “panniformis” BB-SP Abr.00 + NA 

NPPN-LJ4 M. aeruginosa LJ-RJ 1995 + Tóxica 

NPPN-LJ47 M. aeruginosa LJ-RJ 1996 + Tóxica 

NPPN-LS1 Microcystis sp. LS-MG 1993 + NA 

FCLA07 Microcystis sp. TB-PE 1997 - Não tóxica 

FCLA17 Microcystis sp. TP-PE Set.99 - Não tóxica 

FCLA08 Microcystis sp. TB-PE Fev.99 - Não tóxica 

FCLA18 Microcystis sp. TM-AL ____ + Tóxica 

Bittencourt-Oliveira et al. (2001) 

analisaram 15 linhagens clonais e não 

axênicas da cianobactéria M. aeruginosa, 

coletadas em diversas localidades e 

em diferentes datas (amostras coletadas 

por C. Sant´Anna, C. Bicudo e D. Bicudo). 

Para isso, utilizaram como marcador 

molecular um fragmento de cerca 

de 580 pares de bases do operon da 

ficocianina (cpcBA), que se mostrou 

adequado em estudos comparativos utilizando 

espécies e populações. O cpc- 

BA é específico de cianobactérias; dessa 

forma, é possível utilizar culturas contaminadas 

com outras bactérias não-fotossintetizantes, 

fungos, microalgas verdes 

ou qualquer outro microrganismo, 

desde que não possua esse pigmento, e 

até mesmo em amostras coletadas diretamente 

da natureza. 

Constatou-se que as seqüências de 

DNA do cpcBA nas populações brasileiras 

de M. aeruginosa são mais diversificadas 

do que aquelas disponíveis em 

bancos de dados. A diversidade de 

populações brasileiras de Microcystis 

também foi confirmada com outras 18 

cepas utilizando RFLP-PCR (Figura 4) 

(Cunha 2000). 

Em uma pequena lagoa ornamental 

no município de São Paulo, estado de 

São Paulo, foram detectados 6 genótipos 

distintos (Figura 5), em coletas 

realizadas mensalmente em um único 

ponto amostrado (Bittencourt-Oliveira 

et al. 2000). Essas alterações nos genótipos 

podem ocorrer sem alteração correspondente 

dos fenótipos predominantes. 

Da mesma forma, fenótipos diferen- 


tes, ou seja, de distintas morfologias 

de colônias, podem 

ter genótipos semelhantes 

(Figura 3). 

Marcadores moleculares 

para microcistina 

Nos procariotos e em 

algumas linhagens de eucariotos 

primitivos, pequenos 

polipeptídeos de origem 

não-ribossomal podem ser 

sintetizados por enzimas denominadas 

peptídeos sintetases. 

A maioria dos genes 

de peptídeos sintetases tem 

uma estrutura modular, onde 

cada módulo codifica uma 

sintetase específica. A inativação 

de um gene de peptídio 

sintetase (mcyB) de uma 

cepa hepatotóxica resultou 

na perda da produção de 

microcistina, demonstrando 

que o gene mcyB codifica 

para a microcistina sintetase 

(Dittmann et al. 1997). Dessa 

forma, a diferença básica 

entre as populações tóxicas 

e não-tóxicas de Microcystis 

estaria na presença de um 

ou mais genes que codificam 

para a microcistina sintetase 

(Nishizawa et al 1999, 

2000). Sendo assim, as linhagens 

tóxicas poderiam 

ser localizadas através de 

marcadores moleculares 

para genes que codificam 

para essas enzimas. 

Iniciou-se, então, um estudo 

abordando a possibilidade 

de utilização de marcadores 

moleculares para cianobactérias 

tóxicas ou potencialmente 

tóxicas, objetivando a detecção 

de linhagens cultivadas e de 

populações naturais capazes de expressar 

a microcistina, independentemente 

de sua categoria taxonômica e da produção 

dessa toxina no momento da 

Figura 2. Cianobactérias potencialmente tóxicas. A. 

Microcystis aeruginosa; B. Planktothrix agardii; C. 

Cylindrospermopsis raciborskii (tricoma espiralado). D. 

Anabaena circinalis 

Figura 3. Colônias de Microcystis aeruginosa mantidas 

sob cultivo e isoladas de uma mesma população. A identificação 

tradicional de cianobactérias baseia-se em características 

morfológicas, como a forma da colônia, diâmetro 

celular, espessura da mucilagem, etc. Através da 

morfologia, essas duas colônias (A e B) seriam 

identificadas como duas espécies distintas. O 

seqüenciamento de DNA utilizando o operon cpcBA-IGS 

e regiões adjacentes indica que essas duas cepas pertencem 

à mesma espécie 

análise. Tais esforços também foram 

iniciados em outros centros de pesquisa 

no exterior (Del Campo et al. 2001, 

Rouhiainen et al. 2001, Song et al. 2001). 

Linhagens pertencentes ao gênero 

Microcystis pertencentes à Coleção de 

Microrganismos da Faculdade 

de Ciências e Letras de Assis 

(FCLA), da Universidade Estadual 

Paulista (UNESP) estão 

sendo analisadas em relação à 

produção de microcistina, utilizando 

o método imunoenzimático, 

com o kit EnviroLogix, 

correlacionadas com a presença 

ou a ausência do gene 

que codifica para a microcistina 

sintetase, o mcyB. 

Utilizando-se a técnica de 

PCR (Polymerase Chain Reaction) 

com DNA iniciadores 

(“primers”) específicos para o 

gene que codifica para a microcistina 

sintetase, observouse 

que, em cepas que apresentaram 

diferentes níveis de 

concentração de microcistina 

(µg de toxina/mg de células), 

também foi detectada a presença 

de único produto amplificado 

com, aproximadamente, 

780bp (Figura 6), indicando 

a presença do gene 

para produção de microcistina 

(Tabela 1). 

Isolados de uma mesma 

população apresentaram genótipos 

distintos em relação à 

presença ou não do gene que 

codifica para a microcistina 

sintetase. Isso confirma nossa 

hipótese de que a população 

é formada por um mosaico de 

genótipos e a toxicidade é 

uma característica intra-populacional. 

A composição desse mosaico, 

com indivíduos geneticamente 

diferentes dentro da 

mesma população, cada qual 

possivelmente com sua tolerância 

a fatores ambientais e 

potencialidade diferenciada de toxicidade, 

poderia explicar as alterações de 

microcistinas em florações já investigadas 

(Bittencourt-Oliveira & Yunes 2001) 

e a não correlação entre conteúdo de 

microcistina e número de células (Kotak 

Figura 4. Perfil eletroforético em gel de agarose mostrando 6 

genótipos de Microcystis aeruginosa (1-11 e 14-18) coletadas nos 

estados de São Paulo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e Pernambuco 

e 1 genótipo de Microcystis wesenbergii. Genótipo A corresponde 

às canaletas: 1, 3, 7, 10, 11. Genótipo B: 2. Genótipo C: 4, 5, 8, 

14. Genótipo D: 6, 9, 15. Genótipo E: 17. Genótipo F: 18. O fragmento, 

correspondente a um trecho do cpcBA foi digerido com a 

enzima de restrição MspI. M: marcador molecular (Gibco BRL). 

Microcystis wesenbergii (12 e 13) 


Figura 5. Ocorrência (quadros 

negros) de seis genótipos distintos 

(G1 a G6) de Microcystis 

aeruginosa em uma lagoa eutrófica 

do Parque Estadual das Fontes do 

Ipiranga, no município de São Paulo-SP, 

constatados através do 

seqüenciamento do cpcBA-IGS. As 

coletas foram realizadas em um 

único ponto do corpo d´água. Várias 

cepas foram isoladas de uma 

mesma amostra 

et al 1995). 

Nem sempre houve correspondência 

entre as técnicas de imunoensaio e a 

de marcadores moleculares para a microcistina 

sintetase (Tabela 1), indicando 

que outros genes poderiam estar 

envolvidos na produção de microcistina. 

Em vista da potencialidade dos recursos 

genéticos associados à diversidade 

biológica das cianobactérias no Brasil, 

faz-se necessário ampliar o estudo 

da variabilidade genética, bem como 

zelar pela sua conservação, através da 

implantação de bancos de germoplasmas 

de cianobactérias. Essas coleções 

de germoplasma permitirão assegurar a 

procura e conservação de novos genes 

de interesse biotecnológico, como aqueles 

associados à síntese de substâncias 

bioativas, tais como as cianotoxinas. 


Bittencourt-Oliveira, M.C. (2000). 

Development of Microcystis aeruginosa 

(Kützing) Kützing (Cyanophyceae/Cyanobacteria) 

under cultivation 

and its taxonomic implications. 

Algolog. Stud. 99:29-37. 

Bittencourt-Oliveira, M.C; Oliveira, 

M.C.; Bolch, C.J.S. (2000). Sucessão 

de genótipos de Microcystis aeruginosa 

(Cyanobacteria/Cyanophyta) 

em um reservatório eutrófico. 

Resumos do Seminário Internacional 

do Instituto Internacional de 

Figura 6. Identificação do marcador 

molecular mcyB em cepas de 

Microcystis aeruginosa. M: Marcador 

molecular (Gibco BRL). 1, 3 e 5: 

Cepa tóxica (FCLA236) mostrando o 

produto amplificado, correspondente 

ao mcyB (setas), utilizando, respectivamente, 

100, 20 e 200ng de DNA. 2 

e 4: Cepa não tóxica (FCLA30) 

Ecologia, São Carlos, SP, Brasil, p. 

46. 

Bittencourt-Oliveira, M.C; Oliveira, 

M.C.; Bolch, C.J.S. (2001). Genetic 

variability of some Brazilian strains 

of Microcystis aeruginosa complex 

(Cyanophyceae/Cyanobacteria) 

using the nucleotide sequence analysis 

of the intergenic spacer and 

flanking regions from cpcBA-phycocyanin 

operon. J. Phycol. 37(5): (in 

press). 

Bittencourt-Oliveira, M.C. & Yunes, J.S. 

(2001). Detecção de cianobactérias 

hepatotóxicas através de marcadores 

moleculares: dados preliminares. 

Resumos do VIII Congresso 

Brasileiro de Limnologia, 

João Pessoa, Brasil, p. 230. 

CETESB-Companhia de Tecnologia 

de Saneamento Ambiental. 

(1997). Manual de Orientações em 

Casos de Florações de Algas Tóxicas: 

um Problema Ambiental e de Saúde 

Pública. Série Manuais, 14/CETESB. 

São Paulo 

Chorus I. & Bartram J. (eds). (1999). 

Toxic Cyanobacteria in water: A guide 

to the Public Health Consequences, 

Monitoring and Management. E 

& FN Spon, London. p.416. 

Cunha, M.C.C. (2000). Estudo taxonômico 

de populações de Microcystis 

spp. (Cyanophyta) utilizando RFLP- 

PCR. Dissertação de Mestrado Universidade 

Federal Rural de Pernambuco, 

Recife, 2000. 73p. 

Del Campo, F.F., Sanz-Alférez, S.; Padilla, 

C.; Hernández, L.E.; Chahlafi, Z.; 

Foronda, D.; Sanchis, D. (2001). Molecular 

characterization and peptide toxin 

analysis of Microcystis strain from a 

Spanish drinking water reservoir. Fifth 

International Conference On Toxic Cyanobacteria, 

Abstract Book, Noosa, Queensland, 

Australia, Julho 2001. 

Dittmann, E.; Neilan, B.; Erhard, M.; 

Von Döhren, H.; Börner, T. (1997). 

Insertional mutagenesis of a peptide 

synthetase gene which is responsible 

for hepatotoxin production in the cyanobacterium 

Microcystis PCC7806. Mol. 

Microbiol. 26: 779-787. 

Jochimsen, E.M.; Carmichael, W.W.; An, 

J.; Cardo, D.; Cookson, S.T.; Holmes, 

C.E.M.; Antunes, M.B.C.; Melo-Filho, 

D.A.; Lyra, T.M.; Barreto, V.; Azevedo, 

S.M.F.O. & Jarvis, W.R. (1998). 

Liver failure and death following exposure 

to microcystin toxins at a hemodialysis 

center in Brazil. The New England 

Journal of Medicine. 36:373-378. 

Kotak, B.G., Lam, A. K-Y., Prepas, E.E., 

Kenefick, S.L. & Hrudy, S.E. (1995). 

Variability of the hepatotoxin microcystin-LR 

in hypereutrophic drinking water 

lakes. J. Phycol. 31:248-63. 

Nishizawa, T.; Asayama, M. Fujii, K.; 

Harada, K.; Shirai, M. (1999). Genetic 

analysis of the peptide synthetase 

genes for a cyclic heptapeptide microcystin 

in Microcystis spp. J. Biochem. 

126: 520-529. 

Nishizawa, T.; Ueda, A.; Asayama, M. 

Fujii, K.; Harada, K.; Ochi, K. Shirai, 

M. (2000). Polyketide synthase gene 

coupled to the peptide synthetase module 

involved in the biosynthesis of the 

cyclic heptapeptide microcystin. J. Biochem. 

127: 779-789. 

Otsuka, S., Suda, S., Li, R., Matsumoto, S. 

& Watanabe, M. M. (2000). Morphological 

variability of colonies of Microcystis 

morphospecies in culture. J. Gen. 

Appl. Microbiol. 46: 39-50. 

Rouhianien, L. ; Vakkilainen, T.; Siemer, 

B. Sivonen, K. (2001). Genes 

Encoding Microcystin Synthesis in Anabaena. 

Fifth International Conference 

On Toxic Cyanobacteria, Abstract Book, 

Noosa, Queensland, Australia, Julho 

2001. 

Song, L.; Pan, H.; Liu, P.; Lei, L. (2001). 

Detection of hepatotoxic Microcystis 

strains by PCR with intact cells from 

both culture and environmental samples. 

Fifth International Conference On 

Toxic Cyanobacteria, Abstract Book, 

Noosa, Queensland, Australia, Julho 

2001. 


Pesquisa 

PEPTÍDEOS 

ANTIBIÓTICOS 

Peptídeos antibióticos produzidos por aracnídeos 

Sirlei Daffre 

Doutora em Bioquímica 

Professora Assistente Doutora do Departamento 

de Parasitologia, ICB, USP 

sidaffre@icb.usp.br 

Antônio Miranda 

Doutor em Ciências 

Professor Adjunto do Departamento de 

Biofísica, UNIFESP 

miranda.biof@epm.br 

M. Teresa M. Miranda 

Doutora em Bioquímica 

Professora Livre-Docente do Departamento de 

Bioquímica, IQ, USP 

mtmirand@iq.usp.br 

Philippe Bulet 

Doutor em Biologia e Fisiologia 

Diretor de Pesquisa do Intitut Biologie 

Moleculaire et Cellulaire, Centre National de 

la Recherche Scientifique (CNRS), 

Estrasburgo, França 

P.Bulet@ibmc.u-strasbg.fr 

Pedro I. da Silva Jr. 

Doutor em Ciências 

Pesquisador do Instituto Butantan 

pisjr@usp.br 

Alessandra Machado 

Doutora em Química Orgânica 

Pós-Doutora do Departamento de Bioquímica, 

IQ, USP 

Amachado@iq.usp.br 

Andréa C. Fogaça 

Doutoranda em Biologia da Relação 

Patógeno-Hospedeiro, ICB, USP 

deafog@usp.br 

Daniel M. Lorenzini 

Doutorando em Biologia da Relação 


dloren@usp.br 

Lourivaldo S. Pereira 

Doutorando em Biologia da Relação 


lourival@usp.br 

Marcos A. Fázio 

Doutorando em Biologia Molecular, UNIFESP 

fazio.biof@infar.epm.br 

Eliane Esteves 

Mestranda em Biologia da Relação Patógeno- 

Hospedeiro, ICB, USP 

eli_esteves@hotmail.com 

s doenças infecciosas estão 

entre as principais causas de 

morte da população humana. 

Esse fato é devido, em 

grande parte, ao surgimento de microorganismos 

multi-resistentes aos antibióticos. 

Portanto, apesar da disponibilidade 

de um grande número de antibióticos 

de última geração, torna-se ainda 

fundamental buscar compostos que 

possam atuar como novas drogas a 

serem utilizadas no combate as doenças 

infecciosas (Lohner & Staudegger, 

2001). 

O surgimento do grande número 

atual de cepas bacterianas resistentes 

pode ter várias origens, sendo uma 

delas decorrente do próprio tipo de 

vida do ser humano. O principal fator é, 

sem dúvida, o consumo excessivo e 

inapropriado dos antibióticos por homens, 

outros animais e na agricultura. 

A prescrição do antibiótico é geralmente 

empírica e sem a identificação prévia 

do agente patogênico através de exames 

laboratoriais. Além disso, a sua 

venda sem exigência de uma prescrição 

médica em alguns países, associada 

ao suprimento irregular desse medicamento,, 

à baixa qualidade da medicação 

e ao seu mal uso pelos pacientes 

(que muitas vezes não completam o 

tratamento), contribuem para a seleção 

de novos microorganismos multiresistentes. 

Associada a isso, uma grande 

quantidade de agentes antimicrobianos 

vem sendo usado na agropecuária 

para promover o crescimento de plantas 

e animais, o que ocasiona um aumento 

da resistência de microorganismos 

que são transmitidos para o homem. 

Ao mesmo tempo, o aumento da 

migração da população e o transporte 

de animais ou de produtos de origem 

animal trazem doenças para áreas onde 

nunca haviam se instalado, resultando 

no espalhamento de microorganismos 

resistentes aos antibióticos. Mudanças 

Marcelo R. Burgierman 

Mestrando em Biologia da Relação Patógeno- 

Hospedeiro, ICB, USP 

marusso@zipmail.com.br 


Figura 1. Possíveis mecanismos de ação dos peptídeos antimicrobianos 

(Lohner, 2001) 


ambientais, tais como desmatamento 

e alterações climáticas 

também proporcionam contato 

mais íntimo dos homens com 

animais e insetos que transmitem 

doenças muitas vezes desconhecidas 

(Lohner & Staudegger, 

2001). 

Assim sendo, várias medidas 

sócio-político-econômicas deveriam 

ser tomadas para a contenção 

do desenvolvimento e de 

transmissão de resistência antimicrobiana. 

Redução do uso inapropriado 

e excessivo dos antibióticos 

no tratamento de doenças 

em geral, tanto humanas 

quanto de animais domésticos e 

da própria agricultura, poderia 

ser uma dessas medidas. Paralelamente, 

para que se consiga um 

efetivo controle das doenças infecciosas, 

tornou-se vital investir 

em pesquisa e em pesquisadores 

que possam se dedicar à 

busca de substâncias naturais ou 

sintéticas que exibam atividades antimicrobianas 

específicas e, acima de 

tudo, que as exerçam através de mecanismos 

de ação alternativos daqueles 

dos antibióticos disponíveis. 

Nesse contexto, a pesquisa, a purificação, 

e a caracterização química, 

biológica e estrutural de novas substâncias 

antimicrobianas provenientes da 

fauna e da flora brasileira são valiosas, 

uma vez que a própria evolução tratou 

de selecionar um vastíssimo espectro 

de substâncias eficientes que defendem 

contra infecções. 

Diariamente, nós humanos estamos 

expostos a muitos patógenos em potencial 

através da ingestão, inalação e 

contato com superfícies infectadas. 

Como a resposta humoral e celular 

adaptativa requer a expansão clonal 

dos linfócitos B e T, e leva até 7 dias 

para poder realmente ficar ativa contra 

as infecções, ela não é a responsável 

pelo impedimento inicial da instalação 

desses organismos. Portanto, dependemos 

da resposta imune inata para nos 

defender de infecção (Janeway, 1998). 

Os efetores da resposta imune inata 

incluem as células fagocíticas, tais como 

neutrófilos e macrófagos, de outros 

leucócitos, incluindo mastócitos, das 

proteínas do soro, tais como as do 

sistema de complemento, e dos peptídeos 

antimicrobianos (Hancock & Diamond, 

2000). Esses últimos são elementos 

primitivos da resposta imune 

Figura 2. Estruturas tridimensionais da 

magainina (Hara et al., 2001). indolicidina 

(Rozek et al., 2000), drosomicina (Landon 

et al., 1997) e teta-defensina (Trabi et al., 

2001). Representadas, em amarelo, a 

estrutura folha β-pregueada e, em rosa, a 

estrutura α-hélice) 

de todas as espécies de ser vivo, cujas 

vias de indução são relativamente conservadas 

em vertebrados, insetos e plantas 

(Hoffman et al., 1999, Dangl & 

Jones, 2001). Recentemente, foi demonstrada 

a participação deles na 

modulação do processo inflamatório 

de mamíferos (Hancock & Diamond, 

2000). 

Mais de 700 peptídeos antimicrobianos 

já foram identificados em todas as 

espécies vivas, incluindo bactérias, fungos, 

insetos, moluscos, crustáceos, aracnídeos, 

plantas, pássaros, anfíbios, peixes, 

mamíferos, entre outros (http:// 

bbcm1.univ.trieste.it/~tossi/pag1.htm). 

Em geral, são moléculas pequenas de 

até 5 kDa que exibem um alto teor de 

aminoácidos básicos e, pelo menos, 

50% de aminoácidos hidrofóbicos 

(ver revisões em Andreu & 

Rivas, 1998; Bulet et al., 1999; 

Hancock & Diamond, 2000). 

Apresentam um amplo espectro 

de atividade contra bactérias, 

fungos, vírus e parasitas. O mecanismo 

de ação mais bem conhecido 

é através da sua inserção 

na membrana celular que 

causa a destruição ou a permeabilização 

da mesma, levando o 

microorganismo à morte (Figura 

1). Alternativamente, os peptídeos 

antimicrobianos podem se 

ligar a um receptor da membrana, 

levando a uma perda específica 

de sua função. Além disso, 

ao se translocarem através da 

membrana, essas moléculas podem 

atuar intracelularmente, impedindo 

a síntese de metabólitos 

importantes para o microorganismo. 

Por atuarem em diferentes 

compartimentos celulares, 

esses compostos tornam-se 

candidatos promissores para o desenvolvimento 

de drogas importantes no 

combate a patógenos resistentes aos 

antibióticos convencionais (Lohner, 

2001). 

Os peptídeos antimicrobianos podem 

ser agrupados de acordo com suas 

propriedades químicas e estruturais em 

2 classes: lineares e cíclicos. Os lineares, 

não apresentam o aminoácido cisteína 

em sua composição, e podem ser 

subdivididos nos que formam uma α- 

hélice anfipática após contato com a 

membrana celular (por exemplo, magainina 

de sapo, Hara et al., 2001) e os 

ricos em um determinado tipo de aminoácido, 

tais como prolina, histidina e 

triptofano (por exemplo, indolicidina 

de bovino, Rozek et al., 2000). Os 

Figura 3. Alinhamento da gomesina com outros peptídeos antimicrobianos: 

taquiplesina e polifemusina de límulos, androctonina de escorpião e 

protegrina de suíno (Silva, Jr. et al., 2000) 


Tabela 1. Peptídeos antimicrobianos isolados da hemolinfa da aranha Acanthoscurria gomesiana 

cíclicos são peptídeos que apresentam 

resíduos de cisteína em sua estrutura, 

podendo ter as extremidades aminoterminal 

abertas (por exemplo, drosomicina 

da mosca Drosophila melanogaster, 

Landon et al.1997) ou as extremidades 

fechadas (por exemplo, tetadefensina 

de macaco, Trabi et al. 2001) 

(Figura 2). 

Gomesina e outros peptídeos antimicrobianos 

da aranha 

caranguejeira 

Entre os invertebrados, os estudos 

que visam caracterizar a estrutura e a 

atividade dos peptídeos antimicrobianos, 

assim como a regulação gênica 

deles concentram-se, principalmente, 

no grupo dos insetos (Bullet et al., 

Figura 4. Estrutura tridimensional da gomesina determinada por 

ressonância magnética nuclear (RMN). À direita, a representação 

esquemática da molécula (Mandard et al., 2001) 

1999). Já há alguns anos, o grupo de 

pesquisa da Dra. Sirlei Daffre (Departamento 

de Parasitologia, ICB-USP) vem 

trabalhando ativamente na identificação 

e caracterização de peptídeos em 

duas espécies de aracnídeos: a aranha 

caranguejeira Acanthoscurria gomesiana 

e o carrapato de boi Boophilus 

microplus. Esses peptídeos são importantes 

para a defesa desses animais 

contra infecções e, como tal, 

poderão ser usados no desenvolvimento 

de novas drogas 

para uso na medicina e 

na agricultura. Nos últimos 

anos, o referido grupo passou 

a contar com a colaboração 

de outros três grupos de 

pesquisa: o da Dra. M. Teresa 

M. Miranda (Departamento 

de Bioquímica, IQ-USP), 

o do Dr Philippe Bulet (Centre 

National de la Recherche 

Scientifique, CNRS, Estrasburgo, 

França) e o do Dr. 

Antonio Miranda (Departamento 

de Biofísica, UNI- 

FESP). Quatro peptídeos foram 

isolados da hemolinfa 

(sangue) da aranha caranguejeira 

(Tabela I; Silva Jr., 

2000). Um deles, denominado 

gomesina, apresentou um 

amplo espectro de atividade 

contra bactérias, fungos e o 

parasita causador da leishmaniose 

(Silva Jr., 2000; Sil- 


Figura 5. Atividades 

antimicrobianas dos análogos 

sintéticos de gomesina (Gm). 

As atividades são expressas 

através da concentração mínima 

do peptídeo que causa 

100% de inibição de crescimento. 

PB 1 = 217 mOsM; 1.0 

g de Peptona + 86 mM NaCl 

em 100 mL de H 2 

0. PB 2 = 367 

mOsM; 1.0 g de Peptona + 

137 mM NaCl em 100 mL de 

H 2 

0. ½ PDB 3 = 79 mOsM; 1.2 

g de dextrose de batata em 

100 mL de H 2 

O). ½ PDB 4 = 

333 mOsM; 1.2 g de dextrose 

de batata em 100 mL de H 2 

O 

+ 137 mM NaCl 

va Jr. et al., 2000). É um octadecapeptídeo 

de massa molecular equivalente a 

2270,4 Da apresentando quatro resíduos 

de cisteína envolvidos em duas pontes 

dissulfeto (2-15 e 6-11), um ácido 

piroglutâmico na extremidade N-terminal 

e uma arginina α-amidada como 

resíduo C-terminal. Sua estrutura cíclica 

com terminação aberta apresentando 

um ácido piroglutâmico N-terminal 

e a amidação C-terminal possivelmente 

protegem o peptídeo contra degradação 

por proteases. A gomesina é um 

peptídeo altamente básico (pI calculado 

de 12,7), pois contém seis resíduos 

de aminoácidos carregados positivamente 

(cinco argininas e 

uma lisina). Apresenta 

um alto grau de similaridade 

com a família dos 

peptídeos básicos dos límulos: 

taquiplesinas e 

polifemusinas (50%; 

Nakamura et al., 1988; 

Miyata et al., 1989), da 

androctonina isolada do 

escorpião (23%; Ehret- 

Sebatier et al, 1996) e da 

protegrina presente em 

leucócitos de suínos 

(17%; Kokryakov et al., 

1993) (Figura 3). A disposição 

das pontes dissulfeto, 

Cys1-Cys4 e 

Cys2-Cys3, é idêntica 

para todos estes peptídeos, 

sugerindo que a 

gomesina pode adotar 

uma estrutura “β-hairpin” 

como a encontrada 

nas taquiplesinas (Kawano 

et al., 1990; Tamamura 

et al., 1993), protegrinas 

(Aumelas et al., 1996; 

Fahrner et al., 1996), e 

androctonina (Mandard 

et al., 1999). Resultados 

recentes da análise da 

gomesina por ressonância 

magnética nuclear 

(RMN) em solução comprovam 

a ocorrência 

dessa estrutura na molécula 

(Mandard et al., 

2001; Figura 4). A gomesina 

forma uma estrutura 

do tipo “β-hairpin” 

com folhas beta pregueadas 

anti-paralelas ligadas 

por uma volta β estabilizada 

por duas pontes 

dissulfeto. Ela ainda 

apresenta uma característica 

anfipática bem definida, 

de forma similar 

às estruturas determinadas 

para seus análogos 

taquiplesina e protegrina. 

Esse tipo de estrutura 

foi observado também 

em vários outros peptídeos antimicrobianos, 

cujos aminoácidos básicos 

(carregados positivamente em pH 

fisiológico) seriam responsáveis pela 

interação inicial eletrostática com os 

grupos carregados negativamente dos 

lipídeos das membranas dos microorganismos. 

Posteriormente, ocorreria a 


inserção da porção hidrofóbica dos 

peptídeos na membrana, promovendo 

a sua uma desestabilização (Oren & 

Shai, 1998). 

A gomesina mostrou uma forte ação 

antimicrobiana contra 14 bactérias 

Gram-positivas, 10 bactérias Gram-negativas, 

9 fungos filamentosos e 5 leveduras 

(Silva Jr. et al., 2000). Entre esses 

microorganismos, existem várias bactérias 

causadoras de infecções hospitalares, 

tais como a Staphylococcus aureus, 

a Staphilococcus saprophiticus, a 

Streptococcus pyogenes e a Pseudomonas 

aeruginosa. Além de causadoras 

de infecções hospitalares, a Staphylococcus 

aureus causa meningite e furúnculos, 

a Staphilococcus saprophiticus 

provoca infecção no trato urinário e a 

Streptococcus pyogenes, a febre reumática. 

Ainda como patogênicas aparecem 

a Klebsiella pneumoniae, causadora 

da pneumonia, a Listeria monocytogenes, 

associada à meningite e 

pneumonia, a Candida albicans, responsável 

pela candidíase, a Cryptococcus 

neoformans, causadora da meningite, 

a Salmonella thyphimurium, responsável 

pela salmonelose e a Tricophyton 

mentagrophytes, causadora da 

micose superficial. 

Embora apresente uma certa atividade 

hemolítica (Silva Jr. et al., 2000), a 

gomesina tem-se mostrado um antimicrobiano 

com um grande potencial 

para aplicações terapêuticas em humanos, 

outros animais e em plantas. Essa 

afirmação decorre da combinação das 

seguintes propriedades: amplo espectro 

de atividade, rápida ação antimicrobiana 

e características estruturais que 

conferem alta estabilidade à molécula. 

Gomesina: importância das 

pontes dissulfeto para 

sua atividade 

Com o objetivo de elucidar a importância 

das pontes dissulfeto na expressão 

da atividade biológica desse peptídeo 

e, ao mesmo tempo, buscar análogos 

mais seletivos e/ou mais estáveis à 

degradação enzimática que ele, foram 

sintetizados manualmente pelo método 

da fase sólida, os compostos listados 

na Figura 5. Esses compostos foram 

purificados por cromatografia líquida 

de fase reversa (RP-HPLC) e caracterizados 

por RP-HPLC e cromatografia 

liquida acoplada a um espectrômetro 

de massa do tipo electrospray (LC/MS). 

As atividades antimicrobianas foram 

Figura 6. Processamento da Gomesina. O transcrito do gene da 

gomesina é traduzido em uma proteína precursora de 9,7kDa. Essa 

proteína apresenta um peptídeo sinal (amarelo) e uma região carboxi 

terminal carregada negativamente (azul). A proteína precursora é processada 

pela remoção do peptídeo sinal e da região carboxiterminal, 

a glutamina da extremidade amino-terminal é modificada em ácido 

piroglutâmico e a arginina carboxi-terminal é amidada 

determinadas pelo ensaio líquido de 

inibição de crescimento contra Micrococcus 

luteus (bactéria Gram-positiva), 

Escherichia coli (bactéria Gram-negativa) 

e Cândida albicans (levedura), 

sendo expressas através da concentração 

mínima do peptídeo que causa 

100% de inibição de crescimento (Silva 

Jr et al., 2000). Como pode ser observado 

na Figura 5, os análogos que apresentam 

somente uma das pontes dissulfeto, 

os monocíclicos {[Cys(Acm)6, 

11], [Cys (Acm) 2,15], [Ser6,11] e [Ser2,15] 

- Gomesina}, foram de 2 a 4 vezes 

menos ativos que a gomesina nativa 

Figura 7. Possível mecanismo de processamento da cadeia α da 

hemoglobina bovina no intestino do carrapato de boi B. microplus e 

geração do fragmento antimicrobiano 33-61. A cadeia α é clivada 

entre os resíduos de metionina (32) e de fenilalanina (33) pela 

enzima 1 e entre os resíduos de lisina (61) e valina (62) pela 

enzima 2, gerando o peptídeo antimicrobiano 

para os três microorganismos testados, 

tanto nos meios com baixa concentração 

de NaCl (86 mM; PB 1 ) ou sem sal 

(PDB 3 ), como naqueles com uma concentração 

fisiológica de NaCl comparável 

ao do soro humano (137 mM NaCl; 

PB 2 e PDB 4 ). Já os análogos sem as duas 

pontes dissulfeto, os lineares 

{[Ser2,6,11,15] e [Cys(Acm)2,6,11,15] 

Gm} foram de 2 a 16 vezes menos ativos 

que a gomesina nativa, na ausência e 

em baixa concentração de NaCl, sendo 

essa atividade reduzida mais ainda nos 

meios com uma concentração de 137 

mM de NaCl (cerca de 4 a 64 vezes). 


Observamos que há uma variação nesta 

redução dependendo do microorganismo, 

sendo significativamente maior 

para E.coli (32 a 64 vezes). A influência 

do sal na atividade da gomesina pode 

ser explicada pelo fato de o sódio estar 

competindo com os grupos carregados 

positivamente da gomesina durante a 

interação inicial eletrostática entre estes 

e os grupos carregados negativamente 

da membrana celular do microorganismo 

(Fázio et al., 2001). 

É extremamente importante esclarecer 

que embora os análogos sintetizados 

tenham apresentado atividades 

antimicrobianas mais baixas do que a 

gomesina nativa, eles exibiram atividades 

hemolíticas reduzidas em relação à 

dela: de 2 a 11 vezes na concentração 

de 100 µM. Esses resultados sugerem 

que ambas as pontes dissulfeto são 

importantes para a expressão da atividade 

antimicrobiana da gomesina e 

que os análogos estudados apresentam 

uma especificidade de ação diferenciada 

contra certos microorganismos. Isso 

ocorre, muito provavelmente, devido 

às variações da composição da membrana 

de cada microoorganismo, afetando 

na interação inicial eletrostática 

entre os grupos carregados positivamente 

da gomesina com os grupos 

negativos da membrana, e/ou na inserção 

da gomesina na porção hidrofóbica 

da membrana. Estudos envolvendo 

modificações adicionais da gomesina 

estão sendo realizados com o objetivo 

de se obter em análogos mais ativos e 

seletivos não hemolíticos. 

Precursor da gomesina 

Através da clonagem do cDNA da 

gomesina, verificamos que esse peptídeo 

é traduzido na forma de uma 

proteína precursora de 9,7 kDA (Figura 

6, Lorenzini et al., 2001). Essa proteína 

apresenta um peptídeo sinal, indicando 

que o precursor da gomesina é 

direcionado ao retículo endoplasmático, 

que está provavelmente ligado à via 

de transporte para vesículas exocíticas 

para a liberação do peptídeo no meio 

extracelular. A região carboxi-terminal 

da proteína precursora é composta de 

aminoácidos ácidos, enquanto que a 

região que corresponde ao peptídeo 

maduro é composta de aminoácidos 

básicos. A porção carboxi-terminal carregada 

negativamente pode interagir 

com a parte catiônica do peptídeo para 

estabilizar a conformação do precursor 

e permitir o processamento proteolítico 

ou ainda proteger a célula produtora 

de interações de suas membranas com 

a região básica do peptídeo, evitando 

assim a atividade tóxica contra a mesma. 

A gomesina encontra-se armazenada 

nos grânulos dos hemócitos, como 

evidenciado por técnicas de imunofluorescência 

usando o anticorpo antigomesina, 

sendo secretada para o plasma 

da aranha pelo menos 2 horas após 

uma infecção experimental. Verificouse 

que o gene que codifica para o 

peptídeo é transcrito predominantemente 

nos hemócitos de animais não 

infectados experimentalmente, tendo 

uma baixa expressão nos outros tecidos 

analisados: coração, intestino, hepatopâncreas, 

ovários, músculos e glândula 

de veneno (Lorenzini et al., 2001). 

Fragmento da hemoglobina 

bovina com atividade antimicrobiana 

no intestino do carrapato 

A investigação da produção de peptídeos 

antimicrobianos em outro aracnídeo, 

o carrapato de boi Boophilus 

microplus, feito no nosso laboratório, 

forneceu-nos um resultado surpreendente. 

Foi identificado um fragmento 

da cadeia α da hemoglobina bovina 

referente à região compreendida entre 

os resíduos 33 ao 61, com propriedades 

antimicrobianas (Fogaça et al., 1999). 

Esse peptídeo, com massa molecular 

de 3.205,6 Da, foi inicialmente isolado 

Aranha caranguejeira 

Acanthoscurria gomesiana 

do intestino do carrapato. Para determinar 

seu espectro de ação, sintetizou-se 

quimicamente o mesmo que, após caracterização 

apropriada, foi testado 

contra várias cepas de bactérias e de 

fungos. Observou-se que o fragmento 

da cadeia α da hemoglobina bovina 

age em concentrações micromolares 

apenas contra bactérias Gram-positivas 

e contra fungos, não tendo sido ativo 

contra bactérias Gram-negativas. No 

entanto, a molécula da hemoglobina 

intacta não apresenta atividade antimicrobiana 

quando testada em concentrações 

superiores à do fragmento 33- 

61 da cadeia α da hemoglobina bovina. 

Verificou-se também que esse fragmento 

apresenta atividade hemolítica 

baixa, descartando uma possível função 

digestiva. 

Dados na literatura mostram que a 

hemoglobina é digerida dentro dos 

eritrócitos de mamíferos gerando fragmentos 

com diferentes atividades biológicas, 

tais como liberação de corticropina 

in vitro e a marcação das doenças 

Alzhzeimer e isquemia, entre outras 

(Ivanov et al., 1997). Recentemente, foi 

descrita a geração de fragmentos de 

hemoglobina com atividade antimicrobiana 

após seu tratamento in vitro com 

enzimas comerciais (Mak et al., 2000; 

Froidevaux et al., 2001). No entanto, 

até o momento, o único fragmento 

antimicrobiano da hemoglobina que é 

gerado fisiologicamente é o 33-61 da 

cadeia α da hemoglobina bovina, detectado 

no intestino do carrapato B. 


microplus (Fogaça et al., 1999). Com 

base nessas informações, foi analisado 

se os eritrócitos bovinos rompidos in 

vitro apresentavam atividade antimicrobiana. 

Nenhuma atividade foi detectada, 

sugerindo que a hemoglobina 

dever estar sendo processada no intestino 

do carrapato por enzimas produzidas 

neste órgão, gerando assim o fragmento 

33-61 com propriedades antimicrobianas 

(Figura 7). Iniciou-se a investigação 

das enzimas intestinais de 

B. microplus responsáveis pela clivagem 

da hemoglobina e a geração do 

fragmento ativo. Após a incubação da 

hemoglobina bovina com um extrato 

de intestino de carrapatos, foi observada 

a expressão de atividade antimicrobina. 

Essa foi inibida pela incubação 

simultânea com um inibidor de áspartico-proteinase 

(pepstatina) e um inibidor 

de cisteino-proteinase (E-64). Esse 

resultado sugere que, pelo menos, duas 

enzimas - uma áspartico e uma cisteíno-proteinase 

- estejam envolvidas na 

geração do fragmento antimicrobiano a 

partir da proteólise da hemoglobina. A 

purificação e caracterização dessas enzimas 

estão sendo realizadas. 

A presença de uma atividade antimicrobiana 

no intestino dos carrapatos 

é de extrema importância para a defesa 

contra infecções desses animais, uma 

vez que as fêmeas podem ingerir bactérias 

do couro do hospedeiro durante 

a alimentação. Além disso, após a alimentação, 

as fêmeas se desprendem 

do couro do bovino caindo ao solo, 

colocando seus ovos em um ambiente 

muitas vezes bastante contaminado por 

microorganismos. No entanto, não só o 

intestino dos carrapatos é susceptível 

às infecções. A presença de outros três 

peptídeos antibacterianos, contendo 

cisteína, na hemolinfa desses animais 

foi também detectada (Fogaça et al., 

2001). A presença de vários peptídeos 

antimicrobianos em um mesmo animal 

é importante para garantir um espectro 

de ação amplo contra vários tipos de 

patógenos, garantindo assim a sobrevivência 

do animal alvo. Além disso, os 

peptídeos podem atuar sinergisticamente 

durante o combate às infecções. 

Conclusão 

Além de vitais para o entendimento 

da ação antimicrobiana fisiológica desempenhada 

nos aracnídeos estudados, 

os peptídeos detectados também 

poderão ser usados como moléculasbase 

para o desenvolvimento de novas 

drogas antibióticas. Como já descrito 

acima, não há dúvida de que, com o 

surgimento de novos microorganismos 

resistentes à antibióticos, existe a necessidade 

urgente de se desenvolverem 

novas classes de antibióticos. Peptídeos 

antimicrobianos purificados, de 

diversas espécies de animais, apresentam 

características desejáveis a uma 

nova classe de antibióticos: um largo 

espectro de atividade, incluindo isolados 

resistentes a antibióticos convencionais; 

matam rapidamente, evitando a 

seleção de mutantes resistentes; apresentam 

sinergia com outros antibióticos; 

neutralizam endotoxinas e, portanto, 

bloqueiam a resposta septicêmica; 

e podem matar microorganismos 

em animais modelos. No entanto, vários 

problemas precisam ser resolvidos 

para serem produzidos em escala industrial. 

Um deles é por apresentarem 

uma massa molecular relativamente 

grande em relação aos antibióticos usados 

comercialmente; terão então, que 

ser produzidos por técnicas de biologia 

molecular, de modo a obter-se moléculas 

recombinantes, com um custo mais 

baixo. Apesar de várias metodologias 

terem sido descritas, nenhuma delas 

até agora foi usada em escala industrial 

(Hancock & Scott, 2000). Uma alternativa 

seria a produção por recombinação 

em genética em plantas (Parizotto 

et al., 2000). Outro problema é a toxicidade 

que alguns desses peptídeos 

apresentam contra células de mamíferos. 

Como citado anteriormente, isso 

poderá ser conseguido por meio de 

modificações químicas na estrutura 

dessas moléculas. Outro aspecto a ser 

considerado é a resistência desses peptídeos 

à ação proteolítica do nosso 

organismo. No entanto, existem estratégias 

para proteger os peptídeos contra 

proteases, tais como a de incorporálos 

em lipossomos ou a de usar modificações 

químicas (Hancock & Scott, 

2000). Já existem, pelo menos, cinco 

empresas no mundo trabalhando na 

produção e estabelecimento de peptídeos 

antimicrobianos como novos antibióticos: 

Magainin (EUA), PPL Therapeutics 

(Inglaterra), Intrabiotics (EUA), 

Micrologix (Canadá) e Entomed (França), 

o que indica ser esse um campo 

bastante promissor. Portanto, os peptídeos 

antimicrobianos não são somente 

importantes como componentes do sistema 

imune inato participando do combate 

às infecções, mas seus análogos 

químicos ou recombinantes apresentam 

um grande potencial para serem 

aplicados como antibióticos no combate 

contra microorganismos resistentes a 

antibióticos conhecidos ou mesmo contra 

novos alvos. 

Agradecimentos 

Os autores agradecem o suporte 

técnico dado por Susana Pessoa de 

Lima e o trabalho dos alunos de Iniciação 

Científica Ernesto S. Nakayasu, 

Aline H. Fukuzawa e Luciana M. Kaku. 

Sirlei Daffre, M. Teresa M. Miranda e 

Antônio Miranda recebem bolsa produtividade 

do CNPq. Alessandra Machado, 

Andréa C. Fogaça, Daniel M. Lorenzini, 

Eliane Esteves, Lourivaldo dos 

Santos Pereira são bolsistas da FAPESP. 

Marcelo Russo Burgierman recebe bolsa 

da CAPES. Marcos Antônio Fázio é 

bolsista do CNPq. Este trabalho recebe 

apoio financeiro da FAPESP através do 

projeto Temático 98/11372-4 e do projeto 

individual 00/03642-3. 

Bibliografia 

Andreu, D.; Rivas, L. Animal antimicrobial 

peptides: an overview. Biopolimers 

47: 415-433, 1998. 

Aumelas, A.; Mangoni, M.; Roumestand, 

C.; Chiche, L.; Despaux, E.; 

Grassy, G.; Calas, B.; Chavanieu, A. 

Synthesis and solution structure of 

the antimicrobial peptide protegrin- 

1. Eur J Biochem 237:575-583, 1996. 

Bulet, P.; C. Hetru; J. L. Dimarcq; D. 

Hoffmann. Antimicrobial peptides 

in insects; structure and function. 

Dev Comp Immunol. 23:329-44, 

1999. 

Dangl, J.L.; Jones, J.D.G. Plant pathogens 

and integrated defence responses 

to infection. Nature 411: 

826-833, 2001. 

Ehreth-Sabatier, L.; Loew, D.; Goyffon, 

M.; Fehlbaum, P.; Hoffmann, J.A.; 

Van Dorsslaer , A.; Bulet, P. Characterization 

of novel cysteine-rich antimicrobial 

peptides from scorpion 

blood. J. Biol. Chem. 27147:29537- 

29544, 1996. 

Fahrner, R. L.; Dieckmann, T.; Harwig, 

S. S.; Lehrer, R. I.; Eisenberg, D. & 

Feigon, J. Solution structure of protegrin-1, 

a broad-spectrum antimicrobial 

peptide from porcine leukocytes. 

Chem Biol. 3:543-550, 1996. 

Fázio, M.A.; Daffre, S.; Miranda, M.T.M.; 

Bulet, P.; Miranda, M. Importance 


of the intramolecular disulfide bridges 

in the biological activity of gomesin. 

Proceedings Book of the 

17th American Peptide Symposium 

2001, in press. 

Fogaça, A. C.; Silva, Jr., P.I.; Miranda, 

M.T.M; Bianchi, A.G.; Miranda, A. P; 

Ribolla, P.E.; Daffre, S. Antimicrobial 

activity of a bovine hemoglobin 

fragment in the tick Boophilus microplus. 

J Biol. Chem. 274:25330- 

25334, 2000. 

Fogaça, A.C.; Miranda, A.; Daffre, S. 

Antimicrobial peptides from the cattle 

tick. Programa e Resumos da 

XXX Reunião anual da SBBq, pp.32, 

2001. 

Froidevaux, R.; Krier, F.; Nedjar-Arroume, 

N.; Vercaigne-Marko, D., Kosciarz, 

E.; Ruckebusch, C.; Dhulster, 

P.; Guillochon D. Antibacterial activity 

of a pepsin-derived bovine hemoglobin 

fragment. FEBS Lett 

23:159-63, 2001. 

Hancock, R.E.W. ; Diamond, G. The 

role of cationic antimicrobial peptides 

in innate host defense. Trends 

in Microbiology 8: 402-410, 2000. 

Hancock, R.E.W.; Scott, M.G. The role 

pf antimicrobial peptides in animal 

defenses. PNAS 97: 8856-8861, 2000. 

Hara T.; Kodama, H.; Kondo; M.; Wakamatsu, 

K.; Takeda, A..; Tachi T.; 

Matsuzaki, K. Efects of peptide dimerization 

on pore formation: Antiparallel 

disulfide-dimerized magainin 

2 analogue. Biopolymers 58:437- 

446, 2001. 

Hoffmann, J. A.; Kafatos, F. C.; Janeway, 

C. A.; Ezekowitz, R. A. Phylogenetic 

perspectives in innate immunity. 

Science, 284:1313-1318, 

2000. 

Janeway, C.A.Jr. Presidential address to 

the American Association of Immunologists. 

The road less traveled by: 

the role of innate immunity in the 

adaptative immune response. J. Immunol. 

61: 539-544, 1998. 

Kawano, K.; Yoneya, T.; Miyata, T.; 

Yoshikawa, K.; Tokunaga, F.; Terada, 

Y. ; Iwanaga, S. Antimicrobial 

peptide, tachyplesin I, isolated from 

hemocytes of the horseshoe crab 

(Tachypleus tridentatus). NMR determination 

of the beta-sheet structure. 

J Biol. Chem. 265:15365-15367, 

1990. 

Kokryakov, V. N.; Harwig, S. S.; Panyutich, 

E. A.; Shevchenko, A. A.; Aleshina, 

G. M., Shamova, O. V.; Korneva, 

H. A.; Lehrer, R. I. (1993) Protegrins: 

leukocyte antimicrobial peptides 

that combine features of corticostatic 

defensins and tachyplesins. FEBS 

Lett. 327:231-236, 1993. 

Landon, C.; Sodano, P.; Hetru, C.; Hoffmann, 

J.; Ptak M. Solution structure 

of drosomycin, the first inducible 

antifungal protein from insects. Protein 

Science 6: 1878-1884, 1997. 

Lohner, K. The role of membrane lipid 

composition in cell targeting of antimicrobial 

peptides. In “Development 

of novel antimicrobial agents: 

Emerging strategies. Lohner, K. (ed), 

Horizon Scientific Press, England, 

pp 149-165, 2001. 

Lohner , K.; Staudegger, E. Are we on 

the threshold of the post-antibiotic 

era?. In “Development of novel antimicrobial 

agents: Emerging strategies. 

Lohner, K. (ed), Horizon Scientific 

Press, England, pp 1-15, 2001. 

Lorenzini, D.; Fukuzawa, A.H.; Bijovsky, 

A.T.; Daffre, S. Molecular characterization 

of gomesin, an antimicrobial 

peptide from spider hemocytes. 

Programa e Resumos da XXX 

Reunião anual da SBBq, pp.32, 2001. 

Mak P.; Wójcik K.; Silberring J.; Dubin 

A. (2000). Antimicrobial peptides 

derived from heme-containing proteins: 

Hemocidins. Antonie van 

Leeuwenhoek 77: 197-207, 2000. 

Mandard, N.; Sy, D.; Maufrais, C.; Bonmatin, 

J. M.; Bulet, P.; Hetru, C.; 

Vovelle, F. Androctonin, a novel 

antimicrobial peptide from scorpion 

Androctonus australis: solution 

structure and molecular dynamics 

simulations in the presence of a 

lipid monolayer. J. Biomol. Struct. 

Dyn. 17:367-380, 1999. 

Mandard, N.; Bulet, S.; Caille, A.; Daffre, 

S.; Vovelle, F. Solution structure 

of gomesin,an antimicrobial cysteine-rich 

peptide from spider. Submetido 

no European J. Biochem., 

2001. 

Miyata, T.; Tokunaga, F.; Yoneya, T.; 

Yoshikawa, K.;, Iwanaga, S.; Niwa, 

M.; Takao, T.; Shimonishi, Y. Antimicrobial 

peptides, isolated from 

horseshoe crab hemocytes, tachyplesin 

II, and polyphemusins I and 

II: chemical structures and biological 

activity. J. Biochem. (Tokyo), 

106:663-668, 1989. 

Miranda, A.; Koerber, S.C.; Gulyas, J.; 

Lahrichi, S.L.; Craig, A.G.; Corrigan, 

A.; Rivier, C.; Vale, W.; Rivier, J. J. 

Conformationally Restricted Competitive 

Antagonists of Human/Rat 

Corticotropin-Releasing Factor. Med. 

Chem., 37:1450-1459, 1994 

Nakamura, T.; Furunaka, H.; Miyata, T.; 

Tokunaga, F.; Muta, T.; Iwanaga, S.; 

Niwa, M.; Takao, T.; Shimonishi, Y. 

Tachyplesin, a class of antimicrobial 

peptide from the hemocytes of 

the horseshoe crab (Tachypleus tridentatus). 

Isolation and chemical 

structure. J. Biol. Chem. 263:16709- 

16713, 1988. 

Oren, Z.; Shai, Y. Mode of action of 

linear amphipathic α-helical antimicrobial 

peptides. Biopolimers 47: 

451-463, 1998. 

Parizotto, E.A.; De Lucca, P.C.; Jungmann, 

L.; Kemper, E.L.; Silva, A.C.; 

Leite, A. Plantas como biorreatores. 

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 

17: 12-17, 2000. 

Rozek A.; Friedrich, C.L.; Hancock, R.E. 

Structure of the bovine antimicrobial 

peptide indolicidin bound to dodecylphosphocholine 

and sodium 

dodecyl sulfate micelles. Biochemistry 

39:15765-15774, 2000. 

Silva Jr, P.I. Sistema imune em aracnídeos: 

estrutura química e atividade 

biológica de peptídeos antimicrobianos 

da hemolinfa da aranha Acanthoscurria 

gomesiana. Tese apresenatda 

ao Instituto de Ciências 

Biomédicas da USP para obtenção 

do título de doutor em Ciências, 

2000. 

Silva Jr, P.I.; Daffre, S.; Bulet . Isolation 

and full characterization of gomesin, 

an 18-residue cysteine-rich defense 

peptide from the spider Acanthoscurria 

gomesiana hemocytes 

with sequence similarities to horseshoe 

crab antimicrobial peptides 

of the tachyplesin family. J. Biochem. 

Chem. 275: 33464-33470, 

2000. 

Tamamura, H.; Kuroda, M.; Masuda, 

M.; Otaka, A.; Funakoshi, S.; 

Nakashima, H.; Yamamoto, N.; 

Waki, M.; Matsumoto, A. & Lancelin, 

J. M. A comparative study of the 

solution structures of tachyplesin I 

and a novel anti-HIV synthetic peptide, 

T22 ([Tyr5,12, Lys7]-polyphemusin 

II), determined by nuclear 

magnetic resonance. Biochim. Biophys. 

Acta 1163: 209-216, 1993. 

Trabi, M.; Schirra, H.J.; Craik, D.J.T. 

Three-dimensional structure of RTD- 

1, a cyclic antimicrobial defensin 

from Rhesus macaque leukocytes. 

Biochemistry, 2001: 4211-4221, 

2001. 


Pesquisa 

Novas perspectivas para adaptação de 

Culturas ao Cerrado 

Contribuição da biologia molecular na compreensão e solução dos efeitos tóxicos do alumínio em plantas 

Geraldo M. A. Cançado, 

Eng o Agrônomo, M.S., EPAMIG. 

cancado@epamigcaldas.gov.br 

Newton Portilho Carneiro, 

Biólogo, Ph.D. EMBRAPA/CNPMS 

newtonc@cnpms.embrapa.br 

Andréa Almeida Carneiro, 

Bióloga. Ph.D. EMBRAPA/CNPMS 

andreac@cnpms.embrapa.br 

Antônio Álvaro Corsetti Purcino, 

Eng o Agrônomo, Ph.D. EMBRAPA/CNPMS 

corsetti@cnpms.embrapa.br 

Claudia Teixeira Guimarães, 

Eng a Agrônoma, D.S. EMBRAPA/CNPMS 

claudia@cnpms.embrapa.br 

Vera Maria Carvalho Alves, 

Eng a Agrônoma, D.S. EMBRAPA/CNPMS 

vera@cnpms.embrapa.br 

Sidney Netto Parentoni, 

Eng o Agrônomo, M.S. EMBRAPA/CNPMS 

sidney@cnpms.embrapa.br 

Isabel Regina Prazeres de Souza, 

Eng a Agrônoma, Ph.D. EMBRAPA/CNPMS 

isabel@cnpms.embrapa.br 

Edilson Paiva, 

Eng o Agrônomo, Ph.D. EMBRAPA/CNPMS 

edilson@cnpms.embrapa.br 

Fotos e ilustrações cedidas pelos autores 

acidez do solo é um dos 

principais fatores que limitam 

a produção agrícola 

nos trópicos. O Cerrado 

brasileiro ocupa 205 

milhões de hectares do território nacional 

(fig. 1) e, apesar de apresentar 

excelentes qualidades no que se refere 

à topografia, luminosidade, temperatura 

e estrutura física do solo, se caracteriza 

por possuir baixa fertilidade, pH 

ácido e elevada saturação de alumínio 

(Al) (Embrapa/CNPAC, 2000). O Al é 

tóxico para a grande maioria das espécies 

de plantas cultivadas, promovendo 

a paralisação do crescimento radicular 

e, conseqüentemente, prejudicando o 

desenvolvimento das plantas. O Cerrado 

tem sido considerado como uma das 

últimas grandes fronteiras mundiais disponíveis 

para a expansão agropecuária, 

assumindo importância estratégica para 

o Brasil. Entretanto, para que seu uso 

possa ocorrer de forma cada vez mais 

eficiente e racional, é imprescindível 

que juntamente com as atuais práticas 

utilizadas na exploração agrícola dessa 

região, novas alternativas sejam criadas 

para amenizar ou mesmo eliminar as 

adversidades impostas por aquele ambiente. 

As alternativas de manejo mais utilizadas 

para contornar a toxidez provocada 

pelo Al fundamentam-se no uso 

de duas práticas. Uma delas é o processo 

da calagem, que consiste na precipitação 

do Al solúvel pela adição de 

calcário ao solo. Embora seja uma prática 

corriqueira na agricultura, sua eficiência 

limita-se à camada superficial do 

solo, já que a incorporação do calcário 

em profundidades maiores é economicamente 

inviável. Assim, a calagem favorece 

o desenvolvimento radicular 

apenas na camada superficial do solo, o 

que torna a planta mais susceptível aos 

períodos de veranicos, muito comuns 

na região. Além disso, os efeitos da 

calagem nas camadas superficiais são 

ainda mais reduzidos sob “plantio direto”, 

onde não se utiliza implementos 

agrícolas para revolver o solo. 

Outra prática que vem sendo bastante 

enfatizada é a utilização de cultivares 

mais tolerantes ao Al. Hoje a 

Embrapa Milho e Sorgo, em Sete Lagoas-MG, 

tem identificado e caracterizado, 

em seu germoplasma, milho e sorgo 

tolerantes a níveis que variam de 40% a 

60% de saturação de Al no solo. Os 

níveis de saturação são calculados em 

função da concentração de cátions no 

solo. Métodos de seleção e variabilidade 

genética em milho são mostrados na 

Figura. 1 - Área do Cerrado brasileiro. Fonte: Embrapa Cerrados (2000) 


Figura 2 – Métodos de seleção de milho tolerante a Al e variabilidade genética em milho. 

A = Comprimento da raiz seminal; B = Ensaio em casa de vegetação de uma variedade tolerante e uma susceptível 

ao Al; C =. Variabilidade genética em milho 

figura 2. A idéia desse artigo é descrever 

sucintamente como a biologia molecular 

tem contribuído para aumentar os 

conhecimentos relacionados com os 

mecanismos de tolerância das plantas 

ao estresse de Al. Além do que, com a 

integração de técnicas da biologia molecular 

nos programas de melhoramento 

genético, espera-se que o desenvolvimento 

de cultivares com melhor adaptação 

aos ambientes desfavoráveis seja 

mais rápido e eficiente. Dessa forma, a 

utilização da prática de calagem, associada 

ao uso de genótipos mais adaptados 

às condições de solo ácido com 

elevada saturação de Al serão estratégias 

de maior potencial para a utilização 

sustentável do Cerrado. 

Figura 3 - Mecanismo proposto para explicar tolerância ao Al 

baseado na exudação de ácido orgânico pela raiz: plantas de milho 

tolerantes ao Al exudam suficiente ácido orgânico para quelatizar o 

Al e impedir sua penetração na raiz. As raízes demonstradas nas 

fotos foram coradas com hematoxilina para detecção do Al (Cançado 

et al., 1999) 

Efeitos do Al em plantas - O Al, 

terceiro elemento mais abundante na 

crosta terrestre, quando em soluções 

ácidas (pH

Figura 4 – Trabalhos de modificação da expressão do gene da citrato sintase em planta. 

A: Mapa do plasmídio pCAMBIA C2 (1303); B: Construção gênica Citrato Sintase (CS); Promotores CAMV35S e 

ToRB7; AC: CS de Dauca carota com peptideo sinal de mitocôndria; AD: CS de Dauca carota sem peptídeo sinal 

de mitocôndria; AE: CS de Escherichia coli ; NOS: Sítio de poliadenilação NOS ; E: EcoRI; B: BamHI; H: HindIII 

pode ainda promover alterações na 

permeabilidade da membrana plasmática 

devido a alterações na fluidez e na 

densidade do empacotamento dos fosfolipídeos, 

aumento na síntese de lignina, 

prejudicando o processo de elongação 

celular, inibição da absorção de O 2 

nos ápices radiculares devido a interferência 

no fluxo de elétrons na mitocôndria 

e a danos ao fotossistema II, reduzindo 

a taxa fotossintética (Jones e 

Kochian, 1995). 

A elucidação dos processos bioquímicos 

e fisiológicos que atuam no processo 

da tolerância ao Al, principalmente 

no que se refere à identificação e à 

compreensão da regulação dos genes 

envolvidos a partir de técnicas moleculares 

é de fundamental importância 

para o melhoramento genético. 

Mecanismos de tolerância ao Al - 

Nem todas as espécies de plantas 

respondem de forma semelhante ao 

estresse causado pelo Al. Ao que parece, 

as plantas utilizam-se de vários mecanismos 

para contornarem os efeitos 

tóxicos do Al. Os mecanismos de tolerância 

ao Al propostos na literatura 

podem ser classificados em dois grupos: 

i) mecanismos de exclusão ou 

apoplásticos, com a imobilização ou 

neutralização do Al externamente à 

célula, e ii) mecanismos simplásticos, 

decorrentes da imobilização ou neutralização 

do Al dentro da célula (Taylor, 

1991; Kochian, 1995). Várias formas de 

ação, distribuídas entre estes dois mecanismos, 

têm sido propostas, na tentativa 

de explicar como as plantas podem se 

desenvolver na presença do Al, sendo a 

maioria delas apenas especulativa. Entretanto, 

alguns dos mecanismos citados 

com maior freqüência na literatura 

serão descritos sucintamente a seguir. 

A baixa Capacidade de Troca Catiônica 

(CTC) da parede celular da raiz tem 

sido associada à tolerância ao Al. Segundo 

este modelo, plantas com elevada 

CTC radicular adsorvem mais Al, elevando 

a concentração desse metal próximo 

às células. No entanto, para algumas 

espécies de plantas, não há nenhuma 

relação entre a CTC radicular e a 

tolerância ao Al. Embora a membrana 

plasmática seja considerada como um 

dos alvos do Al, em alguns casos, ela 

pode atuar como uma barreira à absorção 

deste elemento para o interior da 

célula. Foi observado que a densidade 

de cargas elétricas negativas presentes 

em membranas das células do ápices 

radiculares de trigo eram, em média, 

26% superior no genótipo sensível em 

relação ao tolerante (Yermiyahu et al. 

1997). Assim, alterações na composição 

de fosfolipídeos da membrana plasmática 

podem contribuir para a tolerância 

ao Al, por dificultar a interação deste 

com a membrana plasmática. 

O aumento de pH na região da 


rizosfera também é uma forma de exclusão 

do Al, pois leva à formação de uma 

zona de precipitação deste elemento. 

Certas plantas absorvem nitrogênio preferencialmente 

na forma de NO 3- 

, em 

relação à forma de NH 4 

+ 

e, como conseqüência 

dessa absorção diferencial, há 

um maior efluxo de íons OH - pela raiz, 

o que promove a elevação do pH na 

rizosfera. Outra barreira que o Al pode 

enfrentar para atingir as regiões sensíveis 

do meristema radicular é a mucilagem, 

substância formada por polissacarídeos, 

que reveste a superfície radicular. 

Em plantas de trigo tolerantes ao Al, 

a síntese contínua de mucilagem nos 

ápices radiculares dificulta a penetração 

do Al, protegendo as regiões de crescimento 

da raiz. Já foi demonstrado que a 

mucilagem pode ser responsável por 

reter até 35% do Al presente no apoplasto 

(Archambault et al., 1996). 

A síntese de calose, um poliglicosídeo 

formado por unidades de 1,3-βglucano 

que se acumula na parede 

celular, também é uma resposta das 

plantas aos diversos tipos de estresses 

(Simmons et al., 1992). Genótipos de 

trigo sensíveis ao Al produzem mais 

calose do que genótipos tolerantes quando 

expostos a este elemento (Horst et 

al., 1997; Zhang et al., 1994; Llugancy et 

al., 1994). A enzima 1,3-β-glucanase 

está incluída na família das proteínas PR 

(pathogenesis related), já que muitas de 

suas isoformas são induzidas durante

infecções fúngicas. Análises do padrão 

de síntese do mRNA da 1,3-β-glucanase, 

isolado de ápices radiculares de 

trigo, demonstram que a expressão deste 

gene é fortemente regulada pela presença 

de Al (Cruz-Ortega et al., 1997). 

Desta forma, o padrão de síntese de 

calose pode ser um bom indicativo do 

grau de injúria que o Al causa nas raízes, 

podendo, inclusive, ser utilizado como 

um parâmetro de seleção. 

Dentre os mecanismos de exclusão, 

a exudação de moléculas quelantes que 

complexam o Al tem sido o mais estudado. 

Tais quelantes são liberados no 

apoplasto e/ou na rizosfera, impedindo 

que o Al alcance seus sítios de toxidez. 

O Al, uma vez complexado com a 

molécula exudada pela raiz, perde seu 

efeito fitotóxico. Uma importante classe 

desses quelantes são os ácidos orgânicos 

de baixo peso molecular provenientes 

do ciclo dos ácidos tricarboxílicos. 

Um modelo do mecanismo de 

como ácidos orgânicos podem se complexar 

com íons de Al no solo é descrito 

na figura 3. Em trigo, o Al pode estimular 

a exudação do ácido málico e succínico 

(Delhaize et al. 1993a; 1993b), já 

em milho, foi observada a exudação de 

ácido cítrico, málico e trans-aconítico 

(Pellet et al., 1995, Jorge e Arruda, 

1997). Trabalhos semelhantes na Embrapa 

Milho e Sorgo observaram que 

plântulas de milho tolerantes ao Al 

exudavam ácido cítrico e ácido málico 

em concentrações superiores às plântulas 

sensíveis ao Al. Parece que nos 

genótipos tolerantes à 

presença do Al regula o 

surgimento de canais aniônicos 

que facilitam a 

exudação destes ácidos 

das células do tecido 

apical (Piñeros e Kochian, 

2001). Uma das evidências 

mais convincentes 

sobre o envolvimento 

da exudação de ácidos 

orgânicos na tolerância 

ao Al foi apresentado 

por Fuente-Martínez 

et al. (1997), com a produção 

de plantas de tabaco 

e mamão, superexpressando 

a enzima citrato 

sintase. Em função 

dessa super produção e 

exudação de citrato, as 

plantas transgênicas 

apresentaram aumento 

significativo na tolerância 

ao Al. A atividade da 

enzima citrato sintase foi também aumentada 

pela exposição de plantas de 

centeio ao Al (Li et al. 2000). Por outro 

lado, evidências recentes indicam que 

as enzimas envolvidas na síntese dos 

ácidos orgânicos, como malato desidrogenase 

e citrato sintase não são induzidas 

pelo Al em cultivares de milho mais 

tolerantes (Alves et al., dados não publicados, 

Embrapa Milho e Sorgo). 

A indução da síntese de proteínas 

específicas pode também estar relacionada 

com a resposta de plantas ao 

estresse causado pelo Al. Basu et al. 

(1994) observaram o acúmulo significativo 

de proteínas em solução nutritiva 

contendo Al, onde um genótipo tolerante 

de trigo havia sido cultivado, em 

comparação com o sensível. Segundo 

os autores, tais proteínas poderiam ter 

uma ação semelhante aos ácidos orgânicos, 

quelando o Al solúvel. Vários 

trabalhos demonstram alterações na síntese 

de proteínas em ápices radiculares 

para diferentes espécies de plantas, 

quando expostas ao Al (Cançado e 

Paiva, 1999). Tais alterações vão desde 

a indução até a inibição completa de 

determinados polipeptídeos, sendo que, 

na maioria das vezes, apresentam padrões 

de expressão diferenciados entre 

os genótipos tolerantes e sensíveis. 

Genética da tolerância ao Al - O 

uso de cultivares mais tolerantes à toxidez 

do Al apresenta-se como uma solução 

sustentável, propiciando ganhos 

permanentes de produtividade em solos 

sob vegetação de cerrado. Para tal, 

diversos estudos têm sido conduzidos 

no intuito de elucidar a genética da 

tolerância ao Al em milho, trigo, sorgo 

e soja, espécies cultivadas, de grande 

interesse econômico para o Cerrado. 

Trabalhos sobre genética da tolerância 

a Al abrangem alguns tópicos envolvendo 

a identificação de fontes de tolerância 

e a avaliação de populações 

segregantes em cruzamentos contrastantes, 

que culminam em estudos de 

herança e do tipo de ação gênica associada 

com a tolerância (Cançado e Paiva, 

1999). 

A grande maioria dos estudos de 

herança da tolerância ao Al tem sido 

conduzida em trigo, onde os resultados 

sugerem que um pequeno número de 

genes controlariam esta característica. 

Em milho, os resultados quanto ao 

número de genes e ao tipo de ação 

gênica são conflitantes, mas parece existir 

um consenso quanto à existência de 

poucos genes envolvidos na expressão 

da tolerância. No entanto, a tolerância 

ao Al em sorgo parece ser uma característica 

dominante e monogênica, enquanto 

que, em arroz, tem sido considerada 

como herança poligênica, com 

efeitos aditivos significativos. Adicionalmente 

à existência de genes maiores 

explicando grande parte da variação 

para tolerância ao Al, existem evidências 

sugerindo que genes modificadores 

podem ter papel importante na modulação 

do efeito desses genes maiores. 

Quanto ao modo de ação gênica, em 

Figura 5 – Atividade do GUS em plantas transgênicas de tabaco (A); plantas 

de tabaco transformadas (B); Gradiente de Al (0 and 6 ppm) Placa (C):, Tubo 

(D); Plantas transgênicas de tabaco crescendo em 6 ppm, em teste de hematoxilina 

(E); Southern blot de algumas plantas transformadas; sonda higromicina 

(F), sonda factor de elongamento 1 alfa (G) 


geral, a tolerância ao Al tem sido reportada 

como característica dominante, 

podendo variar de acordo com o nível 

de Al utilizado na solução nutritiva. 

Com o advento dos marcadores moleculares, 

tornou-se possível identificar 

e mapear regiões genômicas associadas 

com a tolerância, o que pode ser utilizado 

como estratégia alternativa para clonagem 

dos genes de interesse e para dar 

suporte aos estudos sobre os mecanismos 

envolvidos nos processo da tolerância. 

Dentre os cinco QTLs explicando 

60% da tolerância ao alumínio em 

milho, dois deles estavam mapeados 

próximos aos genes da isocitrato desidrogenase 

e malato desidrogenase (Ninamango-Cárdenas, 

2000), enzimas que 

atuam na via metabólica dos ácidos 

orgânicos, um dos principais mecanismos 

propostos para a tolerância ao 

alumínio em plantas (Kochian, 1995). 

Outro QTL, identificado por Ninamango-Cárdenas 

(2000) foi mapeado próximo 

ao Alm2, um QTL também associado 

com a tolerância ao alumínio, em 

milho (Sibov et al., 1999). O desenvolvimento 

da raiz seminal de plântulas 

crescidas em solução nutritiva na presença 

de níveis tóxicos de Al tem sido 

um índice fenotípico bastante utilizado 

na avaliação da tolerância ao Al, em 

milho, por apresentar alta herdabilidade 

e baixo coeficiente de variação ambiental 

(Martins et al., 1999). 

O mapeamento comparativo pode 

também fornecer informações complementares 

sobre a conservação de genes 

e de mecanismos de tolerância ao alumínio 

entre espécies relacionadas. Existem, 

hoje, evidências de uma possível 

conservação de alguns genes de tolerância 

ao alumínio entre gramíneas correlacionadas 

como trigo, aveia e cevada. 

Prospecção de genes induzidos 

pelo Al - Alterações na expressão de 

genes induzidos por estresses ambientais 

vêm sendo relatadas para várias 

espécies vegetais. Projetos de seqüenciamento 

genômico e técnicas de análise 

de expressão diferencial de genes como 

microarrays e RT-PCR têm auxiliado a 

identificação de genes cuja expressão é 

alterada por estresses ambientais. Recentemente, 

com o uso de mutantes de 

Arabdopsis thaliana tolerantes e sensíveis 

ao Al, tem sido possível identificar 

genes que têm sua expressão alterada 

pelo Al, como é o caso do mutante 

tolerante ao Al (alr-104), cuja tolerância 

baseia-se na elevação do pH da rizosfera. 

Muitos destes genes poderão ser 

utilizados em transformação genética de 

plantas, na tentativa de tornar culturas 

de interesse agronômico mais tolerantes 

ao Al, ou ainda, serem utilizados como 

marcadores moleculares em programas 

de seleção genética. Recentemente, sete 

clones de cDNA induzidos pelo Al foram 

isolados em ápices radiculares de trigo 

cultivado, sendo que alguns dos clones 

apresentavam elevado grau de homologia 

com genes que codificam para inibidores 

de proteinases, fenilamonioliases 

(PAL) e proteínas do tipo PR (Snowden 

et al., 1995, Richards et al., 1994, Snowden 

et al., 1993). Em tabaco, foi isolado 

um clone (pAl 201), induzido pela presença 

do Al e pela supressão de fósforo 

inorgânico (Pi), cuja seqüência completa 

demonstrou homologia com genes 

que codificam para peroxidases (Ezaki 

et al. 1996). Estudos com as linhagens de 

milho L-36 (sensível) e a Cateto 237 

(tolerante) mostraram que o Al diminuiu 

a atividade da peroxidase somente no 

ápice das raízes da linhagem sensível. 

Independente da presença de Al, observou-se 

ainda que as duas linhagens 

apresentavam polimorfismo para duas 

isoenzimas aniônicas da peroxidase no 

ápice radicular. Tais observações sugerem 

que a peroxidase faça parte de um 

mecanismo constitutivo que confere proteção 

ao tecido radicular da cultivar 

tolerante quando exposta ao Al (Souza 

et al., dados não publicados). 

Em Arabidopsis thaliana, observouse 

a indução transiente de cinco genes 

nos ápices radiculares, poucas horas 

após sua exposição ao Al. Outros quatro 

genes, cuja transcrição aumentou por 

períodos de tempo mais longos, também 

foram isolados, enquanto outros 

dois genes apresentaram níveis de expressão 

reduzido ao longo do tratamento 

com Al (Richards et al. 1998). Alguns 

desses genes mostram homologia com 

genes induzidos pela presença de ozônio, 

um forte oxidante, assim como com 

peroxidases, BCB (Blue Copper Binding 

Protein) e GST (Gluthatione-S-transferase), 

sugerindo uma relação entre a 

toxidez por Al e o estresse oxidativo. Na 

linhagem de milho Cateto 237 (tolerante), 

o Al induziu a expressão dos genes 

da ascorbato peroxidase, da metionina 

sintase, de uma hemoglobina, do gene 

vivíparo 3, de uma proteína associada 

com a senescência e de uma invertase da 

parede celular (Purcino et al., dados não 

publicados, Embrapa Milho e Sorgo). É 

interessante notar que, como observado 

em Arabidopsis, alguns dos genes estão 

também ligados a mecanismos fisiológicos 

que conferem proteção contra o 


estresse oxidativo, confirmando uma 

possível participação deste mecanismo 

como um componente importante da 

reação das plantas a níveis tóxicos de Al 

(Richards et al., 1998). 

Em trigo, genes induzidos por Al 

possuem elevada homologia com genes 

de peroxidases (war4.2), proteinases de 

cisteína (war5.2), fenil-amonia liase 

(war7.2) e oxalato oxidases (war13.2) 

(Hamel et al. 1998). 

Estratégias moleculares para aumento 

da tolerância ao Al em plantas 

- As técnicas de DNA recombinante têm 

permitido a identificação de genes relacionados 

com a tolerância à toxidez de Al 

de uma série de espécies vegetais. Esses 

genes são os primeiros candidatos para 

serem mapeados em populações segregantes 

para a tolerância ao Al, assim 

como fontes para construções gênicas 

em teste com transgênicos. Baseando na 

estratégia proposta por Fuente-Martinez 

et al. (1997), onde plantas transgênicas 

superexpressando o gene da citrato sintase 

(CS) isolado da bactéria Pseudomonas 

aeruginosa, aumentaram os níveis 

de tolerância ao Al, trabalhos vêm sendo 

desenvolvidos na Embrapa Milho e Sorgo. 

Plantas de tabaco estão sendo transformadas 

com o gene da citrato sintase 

isolado de Escherichia coli e de cenoura 

(Daucus carota), regulados por promotores 

constitutivos (CaMV 35S) e raizespecíficos. 

O grande objetivo da pesquisa 

é gerar uma tecnologia que possa ser 

transferida para culturas de maior importância 

para a região do Cerrado, tais 

como o milho e a soja (Fig. 3 e 4). 


ARCHAMBAULT, D. J., ZHANG, G., 

TAYLOR, G. J. Accumulation of Al in 

root mucilage of an Al-resistant and 

an Al-sensitive cultivar of wheat. Plant 

Physiology, v.112, n.4, p.1471-1478, 

1996. 

BASU, U., BASU, A., TAYLOR, G. J. 

Differential exudation of polypeptides 

by roots of aluminum-resistant 

and aluminum-sensitive cultivar of 

Triticum aestivum L. in response to 

aluminum stress. Plant Physiology, 

v.106, n.1, p.151-158, 1994. 

CANÇADO, G.M.A., LOGUERCIO, L.L., 

MARTINS, P.R., PARENTONI, S.N., 

LOPES, M.A., PAIVA, E.; BORÉM, A. 

Hematoxylin staining as a phenotypic 

index for aluminum tolerance selection 

in tropical maize. Theoretical 

and Applied Genetics, v.99, p.747- 

754, 1999.

CANÇADO, G.M.A., PAIVA, E. Genética 

e Bioquímica da Tolerância de Plantas 

ao Alumínio. In: Inter-relação 

Fertilidade, Biologia do Solo e Nutrição 

de Plantas. (Eds) José Oswaldo 

Siqueira et al. Viçosa: SBCS, Lavras: 

UFLA/DCS, 1999. pp : 363-388. 

CRUZ-ORTEGA, R., CUSHMAN, J. C., 

OWNBY, J. D. cDNA clones encoding 

1,3-beta-glucanase and a fimbrin-like 

cytoskeletal protein are induced 

by Al toxicity in wheat roots. 

Plant Physiology, v.114, n.4, 

p.1453-1460, 1997. 

DELHAIZE, E., CRAIG, S., BEATON, C. 

D. et al. Aluminum tolerance in 

wheat (Triticum aestivum L.): I. uptake 

and distribution of aluminum 

in root apices. Plant Physiology, 

v.103, n.3, p.685-693, 1993a. 

DELHAIZE E., RYAN P. R., RANDALL P. 

J. Aluminum tolerance in wheat (Triticum 

aestivum L.): II. aluminumstimulated 

excretion of malic acid 

from root apices. Plant Physiology, 

v.103, n.3, p.695-702, 1993b. 

EZAKI, B., TSUGITA, S., MATSUMOTO, 

H. Expression of a moderately anionic 

peroxidase is induced by aluminum 

treatment in tobacco cells: possible 

involvement of peroxidase isoenzymes 

in aluminum ion stress. 

Physiologia Plantarum, v.96, n.1, 

p.21-28, 1996. 

FUENTE-MARTÍNEZ, J., HERRERA-ES- 

TRELLA, L. Advances in the undertanding 

of aluminum toxicity and 

the development of aluminum-tolerant 

transgenic plants. Advances in 

Agronomy. v.66, p.103-119, 2000. 

FUENTE-MARTÍNEZ, J., RAMÍREZ-RO- 

DRÍGUEZ, V., CABRERA-PONCE, J. 

L., HERRERA-ESTRELLA, L. Aluminum 

tolerance in transgenic plants 

by alteration of citrate synthesis. 

Science. v.276, p.1566-1568, 1997. 

HAMEL, F.; BRETON, C.; HOUDE, M. 

Isolation and characterization of 

wheat aluminum-regulated genes: 

possible involvement of aluminum 

as a pathogenesis response elicitor. 

Planta, v.205, n.4, p.531-538, 1998. 

HAUG, A., SHI, B., VITORELLO, V. 

Aluminum interaction with phosphoinositide-associated 

signal transduction. 

Archives of Toxicology, 

v.68, n.1, p.1-7, 1994. 

HORST, W. J., PUSCHEL, A. K., SCHMO- 

HL, N., MONIZ, A. C. (ED.); FURLA- 

NI, A. M. C. (ED.), SCHAFFERT, R. E. 

Induction of callose formation is a 

sensitive marker for genotypic aluminium 

sensitivity in maize. (ed.); 

Fageria, N. K. (ed.), Rosolem, C. A. 

(ed.), Cantarella, H. Fourth international 

symposium on plantsoil 

interactions at low pH, Belo 

Horizonte, Minas Gerais, Brazil, 17- 

24 March 1996. Plant-and-Soil. 1997, 

192: 1, 23-30 

HUANG J. W., PELLET D. M., PAPER- 

NIK L. A. et al. Aluminum interactions 

with voltage-dependent calcium 

transport in plasma membrane vesicles 

isolated from roots of aluminum-sensitive 

and -resistant wheat 

cultivars. Plant Physiology, v.110, 

n.2, p.561-569, 1996. 

JONES, D. L., KOCHIAN, L. V. Aluminum 

inhibition of the inositol 1,4,5- 

trisphosphate signal transduction 

pathway in wheat roots: a role in 

aluminum toxicity? Plant Cell. v.7, 

n.11, p.1913-1922, 1995. 

JORGE, R. A., ARRUDA, P. Aluminuminduced 

organic acids exudation by 

roots of an aluminum-tolerant tropical 

maize. Phytochemistry. v.45, 

n.4, p.675-681, 1997. 

KOCHIAN L. V. Cellular mechanisms of 

aluminum resistance in plants. Annual 

Review of Plant Physiology, 

v.46, p.237-260, 1995. 

LI XF, MA JF, MATSUMOTO H. Pattern 

of aluminum-induced secretion of 

organic acids differs between rye 

and wheat. Plant Physiology. v.123, 

n.4, p.1537-1544, 2000. 

LLUGANY, M., MASSOT, N., WISSE- 

MEIER, H. et al., Aluminium tolerance 

of maize cultivars as assessed by 

callose production and root elongation. 

Z. Pflanzenernähr Bodenk., 

v.157, p.447-451, 1994. 

MARTINS, P.R.; PARENTONI, S.N.; LO- 

PES, M.A.; PAIVA, E. Eficiência de 

índices fenotípicos de comprimento 

de raiz seminal na avaliação de 

plantas individuais de milho quanto 

a tolerância ao alumínio. Pesq. Agropec. 

Bras., v.34, p.1897-1904, 1999 

NINAMANGO-CÁRDENAS, F.E. Mapeamento 

de QTLs associados com a 

tolerância ao alumínio em milho 

(Zea mays L.). Tese Mestrado, UNESP 

- Jaboticabal, SP, 2000. 

PELLET, D.M.; GRUNES, L.G.; KOCHI- 

AN, L.V. Organic acid exudation as 

na aluminum – tolerance mechanism 

in maize (Zea mays L.), Planta, 

196:788-795, 1995. 

PIÑEROS, M.A . KOCHIAN, L. A patchclamp 

study oon the physiology of 

Aluminum toxicity and aluminum 

tolerance in maize. Identification 

and characterization of Al 3+ -induced 

anion channels. Plant Physiol. 125: 

292-305, 2001. 

RICHARDS, K.A., SCHOTT, E.J., SHAR- 

MA, Y.K., DAVIS, K.R., GARDNER, 

R.C. Aluminum induces oxidative stress 

genes in Arabidopsis thaliana. Plant 

Physiol. 116: 409-418, 1998. 

RICHARDS, K. D., SNOWDEN, K. C., 

GARDNER, R. C. wali6 and wali7: 

genes induced by aluminum in wheat 

(Triticum aestivum L.) roots. Plant 

Physiology, v.105, p.1455-1456, 1994. 

SHI, B., CHOU, K., HAUG, A. Aluminium 

impacts elements of the phosphoinositide 

signalling pathway in neuroblastoma 

cells. Molecular and Celular 

Biochemistry, v.121, n.2, p.109- 

118, 1993. 

SIBOV, S.T, GASPAR, M., SILVA, M.J., 

OTTOBONI, L.M.M., ARRUDA, P., 

SOUZA, A.P. Two genes control 

aluminum tolerance in maize: genetic 

and molecular mapping 

analyses. Genome, v.42, p.1-8, 1999 

SIMMONS, C. R., LITTS, J. C., HUANG, N., 

RODRIGUEZ, R. L. Structure of a rice 

beta-glucanase gene regulated by ethylene, 

cytokinin, wounding, salicylic 

acid and fungal elicitors. Plant Molecular 

Biology, v.18, p.33-45, 1992. 

SIVAGURU M., HORST W.J. The distal 

part of the transition zone is the most 

aluminium-sensitive apical root zone 

of maize. Plant Physiology, v.116, 

p.155-163, 1998 

SIVAGURU, M., FUJIWARA, T., SAMAJ, J., 

BALUSKA, F., YANG, Z., OSAWA, H., 

MAEDA, T., MORI, T., VOLKMANN, 

D., MATSUMOTO, H. Aluminum-induced 

1®3-B-D-Glucan inhibits cellto-cell 

trafficking of molecules through 

plasmodesmata. A new mechanism 

of aluminum toxicity in plants. 

Plant Physiology, v.2000, p.991-1006, 

2000. 

SNOWDEN, K. C., RICHARDS, K. D., 

GARDNER, R. C. Aluminum-induced 

genes: induction by toxic metals, low 

calcium, and wounding and pattern 

of expression in root tips. Plant Physiology, 

v.107, n.2, p.341-348, 1995. 

SNOWDEN, K. C., GARDNER, R. C. Five 

genes induced by aluminum in wheat 

(Triticum aestivum L.) roots. Plant 

Physiology, v.103, n.3, p.855-861, 

1993. 

TAYLOR, G.J. Overcoming barriers to 

understanding the cellular basis of 

aluminium resistance. Plant Soil, 

171:89-103, 1991. 

ZHANG, G., HODDINOT, J., TAYLOR, G. 

J. Characterization of 1,3-b-D-glucan 

(callose) synthesis in roots of Triticum 

aestivum in response to aluminum. 

Journal of Plant Physiology, v.144, 

n.3, p.229-234, 1994. 


Pesquisa 

Laranja 

TRANSGÊNICA 

Transformação de laranja visando resistência ao cancro cítrico usando genes de peptídeos antibacterianos 

Brasil é o maior produtor 

mundial de laranja, 

com 355 milhões de caixas 

produzidas em 2000/ 

01, o que corresponde a 

cerca de 30 % da produção mundial. 

Além disso, o país é responsável por, 

aproximadamente, metade da produção 

mundial de suco concentrado (61 o 

Brix), um dos principais produtos agrícolas 

exportados pelo Brasil. O volume 

de recursos movimentados pelo 

agronegócio citrícola supera R$ 5 bilhões 

por ano, gerando cerca de 400 

mil empregos diretos, somente no estado 

de São Paulo, o maior produtor do 

Brasil. 

A citricultura nacional apresenta 

vários problemas fitossanitários, entre 

os quais se destacam a larva minadora 

dos citros (Phyllocnistis citrella), a pinta 

preta (doença fúngica provocada 

por Guignardia citricarpa), a clorose 

variegada dos citros (CVC, causada 

pela bactéria Xyllela fastidiosa) e o 

cancro cítrico (causada pela bactéria 

Xanthomonas axonopodis pv. citri). 

Cancro cítrico 

O cancro cítrico tem provocado 

grandes prejuízos tanto no Brasil como 

em outros países produtores de citros. 

Essa doença afeta toda a parte aérea da 

planta, causando lesões em frutos, folhas 

e ramos (Figura 1). Os frutos ficam 

depreciados e caem precocemente, reduzindo 

a produção da planta. As 

portas de entrada para a bactéria do 

cancro são ferimentos em folhas causados 

pelo vento ou pelo ataque da larva 

minadora dos citros. 

O controle do cancro cítrico tem 

sido realizado através de medidas para 

prevenir a introdução da bactéria e da 

erradicação das plantas contaminadas. 

Para isso, são realizadas por agências 

fiscalizadoras, inspeções periódicas em 

pomares comerciais e domésticos. As 

plantas cítricas contaminadas, bem 

João Carlos Bespalhok Filho 

IAPAR, Laboratório de Biotecnologia, 

bespa@hotmail.com 

Adilson Kenji Kobayashi 


adilson@sercomtel.com.br 

Luiz Filipe Protásio Pereira 


lpereira@pr.gov.br 

Luiz Gonzaga Esteves Vieira 


lvieira@pr.gov.br 


Figura 1. Frutos de laranja apresentando sintomas de cancro 

cítrico (Foto gentilmente cedida pelo Dr. Rui Pereira Leite) 


Figura 2. Expressão do gene marcador gus em plantas 

transgênicas de laranja Pêra 

como as não contaminadas, num raio 

de 30 metros, são cortadas e incineradas. 

Somente no ano de 1999, foram 

gastos cerca de R$ 33 milhões na 

erradicação de pomares infectados nos 

Estados de São Paulo e Minas Gerais. 

Entretanto, a presença e o progresso 

epidêmico do cancro cítrico em 

diversas regiões produtoras de citros 

ao redor do mundo, e a sua recente 

introdução e reintrodução em vários 

países têm levantado dúvidas quanto à 

eficiência da adoção exclusiva de medidas 

para impedir a sua introdução 

em novas áreas e para a erradicação 

completa da doença em regiões onde 

ela foi introduzida (Leite, 1990). 

O desenvolvimento de variedades 

cítricas agronomicamente aceitáveis 

com adequado nível de resistência, é 

ainda a forma mais econômica e eficiente 

de controlar o cancro cítrico. 

Entretanto, o melhoramento de citros é 

um processo longo, principalmente 

pelos aspectos botânicos desse gênero. 

Grande parte das espécies apresenta 

poliembrionia e longo período juvenil, 

o que dificulta a seleção de genótipos 

por hibridação. A obtenção de 

uma nova variedade é um processo 

que leva em média 30 anos. Os principais 

avanços têm sido obtidos pela 

seleção de mutações naturais. 

Frente a esses problemas, a transformação 

genética da laranjeira mostra-se 

como uma estratégia de melhoramento 

muito promissora, podendo 

ser utilizada para a introdução de novas 

características em variedades elite, 

reduzindo o tempo necessário para o 

lançamento de novos cultivares. 

Transformação genética de citros 

Plantas transgênicas de citros já 

foram obtidas por meio da introdução 

direta de DNA em protoplastos (Vardi 

et al., 1990); por co-cultivo de segmentos 

internodais ou de epicótilo com 

Agrobacterium (Moore et al., 1992; 

Kaneyoshi et al., 1994; Peña et al., 

1995; Gutiérrez et al., 1997; Cervera et 

al., 1998), e por bombardeamento de 

partículas em suspensões embriogênicas 

de nucelo (Yao et al., 1996). Atualmente, 

o método mais utilizado de 

transformação genética em citros é a 

transformação mediada por Agrobacterium, 

utilizando-se segmentos de 

epicótilo de 1 cm como explantes. 

Usando esse sistema, já foram obtidas 

plantas transgênicas de laranja doce 

(C. sinensis;) (Peña et al., 1995; Bond & 

Roose, 1998), C. aurantifolia (Peña et 

al., 1997), C. aurantium (Gutiérrez et 

al., 1997), Carrizo citrange (C. sinensis 

X Poncirus trifoliata; Moore et al., 

1992), P. trifoliata (Kaneyoshi et al., 

1994) e grapefruit (C. paradisi; Luth & 

Moore, 1999. 

Figura 3. Construção usada nos experimentos de transformação 

Entretanto, a eficiência de transformação 

utilizando esse protocolo de 

regeneração ainda é baixa. Isso se 

deve, principalmente, ao pequeno 

número de brotos obtidos por explante 

e ao grande número de escapes. 

Além disso, as plantas transgênicas 

obtidas por esse sistema são juvenis, 

sendo necessário vários anos para que 

se possa avaliar algumas de suas características 

comerciais (produtividade, 

qualidade de fruto etc). Com vistas a 

contornar esse problema, Cervera et al. 

(1998) utilizaram internódios de plantas 

maduras de laranja doce cultivar 

Pineapple como explantes para transformação, 

conseguindo que as plantas 

transgênicas florescessem após 14 

meses. 

A falta de técnicas adequadas de 

cultura de tecidos de cultivares de 

laranja doce adaptados às nossas condições 

agroecológicas tem dificultado 

o uso da tecnologia de transformação 

de plantas nessa cultura. Visando a 

minimizar esse problema, o Laboratório 

de Biotecnologia Vegetal do IAPAR 

desenvolveu novos protocolos de regeneração 

de laranja doce Pêra, usando 

segmentos finos transversais tanto 

de tecidos juvenis (Bespalhok et al., 

2001) quanto de maduros (Kobayashi 

et al., 2001). Esses novos protocolos 

permitem a transformação de laranja, 

tanto através de Agrobacterium tumefaciens 

como também via biobalística. 

Essa metodologia foi utilizada em experimentos 

preliminares para a otimização 

do sistema de transformação, 

utilizando o plasmídeo pBE2113, que 

contém o gene gus sob controle de 

promotores constitutivos (Figura 2). 

Uso de peptídeos antibacterianos 

Várias estratégias têm sido utilizadas 

para aumentar a resistência de 

plantas a doenças bacterianas através 

da engenharia genética. Entre essas 

estratégias destacam-se: a produção de 

peptídeos antibacterianos, a inibição 

de fatores de virulência e o aumento 

das defesas naturais e morte celular 

programada no local da infecção (Mourgues 

et al., 1998). 

Todos os organismos superiores 

possuem sistemas de proteção contra 

infecções por microorganismos. Os insetos 

possuem um eficiente sistema de 

defesa contra bactérias e outros parasitas. 

Esse sistema, que foi bastante estu- 


dado em Hyalophora cecropia, é responsável 

pela produção de peptídeos 

com potente atividade antitibacteriana, 

tais como as cecropinas. 

Cecropinas pertencem a uma família 

de pequenos peptídeos, isolados da 

hemolinfa de insetos, que exibem atividade 

lítica e antibactericida contra 

muitas bactérias gram-positivas e gramnegativas 

(Boman & Hultmark, 1987). 

Estruturalmente, esses peptídeos têm 

uma região N-terminal bastante básica 

e uma longa seqüência hidrofóbica na 

região C-terminal. Essas características 

são necessárias para a ação antibacteriana 

das cecropinas através da formação 

de canais nas membranas, provocando 

o vazamento de componentes 

celulares e, conseqüentemente, a morte 

da bactéria (Christensen et al., 1988). 

Vários trabalhos de transformação 

de espécies vegetais com peptídeos 

antibacterianos foram publicados nos 

últimos anos. Batata e fumo foram as 

espécies mais utilizadas, principalmente 

pela facilidade de cultura de tecidos e 

a importância das bacterioses. Montanelli 

& Nascari (1991) transformaram 

batata com um gene responsável pela 

produção de cecropina e encontraram 

resultados positivos contra Ralstonia 

solanacearum em testes preliminares 

in vitro com extratos de plantas transgênicas. 

Jaynes et al. (1993), utilizando 

o gene Shiva-1 (um análogo sintético 

da cecropina), controlado pelo promotor 

do inibidor de proteinase II de 

batata, obtiveram alta expressão em 

plantas transgênicas de fumo que mostraram 

um aumento de resistência a R. 

solanacearum. Por outro lado, Florack 

et al. (1995) transformaram fumo com 

genes de cecropina B, mas não conseguiram 

aumentar a resistência dessa 

espécie contra R. solanacearum e P. 

syringae pv. tabaci. A rápida degradação 

da cecropina por proteases endógenas 

foi apontada como responsável 

pela baixa detecção do peptídeo nas 

plantas transgênicas, apesar da correta 

transcrição do gene inserido. Também, 

Hightower et al. (1994) não conseguiram 

aumentar a resistência de plantas 

de fumo a P. syringae pv. tabaci com 

a introdução de um gene quimérico de 

cecropina A/B. 

Além das cecropinas, outros tipos 

de peptídeos têm sido utilizados em 

plantas com vistas a controlar doenças 

bacterianas. Norelli et al. (1994) observaram 

que plantas transgênicas de maça 

Figure 4. Análise de PCR de plantas transgênicas de laranja Pêra. O 

DNA foi isolado de folhas e amplificado com primers específicos 

para o gene da sarcotoxina dando um produto de 268 pb. Coluna 

M, marcador 100 pb; coluna C, controle negativo, laranja Pêra não 

transformada; colunas 1-10, plantas transgênicas; coluna P, plasmídeo 

pST10 

expressando o gene da atacina E mostraram 

maior resistência a Erwinia 

amylovora. Plantas transgênicas de 

batatas com resistência a Erwinia 

amylovora foram obtidas por Düring et 

al. (1993) através da inserção do gene 

da lisozima do bacteriófago T4. 

Os resultados até agora relatados 

na literatura indicam que a transformação 

com peptídeos antibacterianos tem 

grande potencial para ser usada no 

melhoramento vegetal, principalmente 

através do uso de construções gênicas 

capazes de expressar esses peptídeos 

extracelularmente e, também, pela 

modificação desses peptídeos visando 

a conseguir a sua maior estabilidade 

frente à degradação por proteases endógenas. 

Sarcotoxina 

A sarcotoxina é um peptídeo antibacteriano 

isolado de larvas de Sarcophaga 

peregrina pelo grupo do Dr. 

Natori, Universidade de Tókio (Japão). 

Figura 5. Processo de obtenção de plantas transgênicas de laranja Pêra a 

partir de tecido maduro 


Esse peptídeo possui 39 aminoácidos e 

pertence ao grupo das cecropinas. Em 

estudos in vitro, a sarcotoxina mostrou-se 

altamente eficiente na inibição 

do crescimento de algumas bactérias 

causadoras de doenças em plantas, 

especialmente para X. axonopodis pv. 

citri (Ohshima et al., 1999). 

A expressão da sarcotoxina em plantas 

de tabaco sob controle de um 

promotor constitutivo aumentou a resistência 

a duas bactérias fitopatogênicas: 

P. syringae pv. tabaci e E. carotovora 

subsp. carotovora (Ohshima et 

al., 1999). Também, plantas de tabaco 

transformadas com o gene da sarcotoxina 

sob o controle de um promotor 

induzido por ácido salicílico (PR1a) 

apresentaram um aumento na resistência 

tanto a bactérias fitopatogênicas 

como a fungos Rhizoctonia solani e 

Pythium aphanidermatum (Mitsuhara 

et al., 2000). 

Apesar de ainda serem necessários 

mais estudos sobre a segurança alimentar 

da sarcotoxina, resultados recentes 

mostram que a sarcotoxina tem 

pouca ação sobre microrganismos benéficos 

que fazem parte da flora intestinal 

humana (Mitsuhara et al., 2001). 

Transformação de citros 

com o gene da sarcotoxina 

Figura 6. Plantas inoculadas com isolado de X. axonopodis pv. citri (10 4 

cfu/ml) após 26 dias. Planta não transgênica utilizada como controle (esquerda) 

e planta transgênica expressando sarcotoxina (direita) 

A obtenção de plantas transgênicas 

de laranja doce de cultivares plantados 

no Brasil com o gene da sarcotoxina é 

uma estratégia muito promissora para 

aumentar a tolerância à bactéria do 

cancro cítrico. Assim, foram realizados 

trabalhos de transformação de plantas 

de laranja com o gene da sarcotoxina 

no Labotatório de Biotecnologia Vegetal 

do IAPAR. O plasmídeo utilizado 

para transformação (pST10) contém o 

gene da sarcotoxina (stx IA) ligado a 

um peptídeo sinal que tem a função de 

exportar o peptídeo para o espaço 

intercelular sob controle do promotor 

constitutivo 35S, do vírus do mosaico 

da couve-flor e o gene da neomicina 

fosfotransferase (npt II), que confere 

resistência ao antibiótico canamicina 

(Figura 3). Esse plasmídeo foi cedido 

ao IAPAR através de um convênio 

científico com o Instituto Nacional de 

Recursos Agrobiológicos (NIAR, Japão). 

A metodologia de transformação 

de laranja usou a estirpe EHA-105 de 

Agrobacterium tumefaciens como vetor 

para inserção do gene da sarcotoxina. 

Um aspecto inovador da metodologia 

é a utilização de segmentos finos de 

material vegetal maduro para a transformação, 

o que reduz em, pelo menos, 

cinco anos o início de produção e 

avaliação das plantas transgênicas. Em 

experimentos preliminares, plantas de 

laranja Pêra regeneradas a partir de 

tecido maduro floresceram após 12 

meses em casa de vegetação. 

Internódios de mudas de laranja 

Pêra mantidas em casa de vegetação 

foram utilizados como explantes iniciais. 

Esses internódios foram desinfestados, 

cortados transversalmente em segmentos 

de 1-2 mm e imersos em meio 

contendo Agrobacterium. Os explantes 

foram então co-cultivados por 72 

horas e transferidos para meio de indução 

de gemas com 200 mg/l cefotaxima, 

200 mg/l timetina e 25 mg/l canamicina. 

Após três semanas no escuro, 

os segmentos que apresentavam gemas 

foram transferidos para meio de 

alongamento ainda com a presença de 

antibióticos. Após 3-4 semanas no meio 

de alongamento, as gemas regeneradas 

maiores que 1 mm foram microenxertadas 

em plântulas de Carrizo citrange 

germinadas in vitro. Quando os 

enxertos apresentavam de 3 a 4 folhas, 

pequenos segmentos de tecido foliar 

foram utilizados para detecção da presença 

do gene da sarcotoxina através 

de PCR. Enxertos apresentando a banda 

correspondente ao gene da sarcotoxina 

(Figura 4) foram então transplantados 

diretamente em solo ou 

novamente enxertados em plantas de 

limão cravo em casa de vegetação 

(Figura 5). 

Foram obtidos diversos eventos de 

laranja Pêra transgênica contendo o 

gene da sarcotoxina. As plantas transgênicas 

foram clonadas através de 

enxertia em porta-enxertos de limão 

cravo para serem inoculadas com a 

cepa 306 da bactéria de X. axonopodis 

pv citri. 

A inoculação das plantas transgênicas 

com a bactéria do cancro cítrico 

é feita pelo método de infiltração em 

folhas novas utilizando-se seringas hipodérmicas. 

A avaliação da resistência 

é feita após três semanas através da 

contagem de lesões por área foliar e 

do re-isolamento da bactéria. 

A análise de Western blot em folhas 

mostrou que há uma variação na 

expressão da sarcotoxina nos diferentes 

eventos. Os resultados da inoculação 

das plantas transgênicas com a 

bactéria do cancro cítrico mostraram 

que as plantas apresentando maiores 

quantidades de sarcotoxina foram mais 


esistentes ao cancro cítrico (Figura 6). 

Considerações finais 

O projeto para o desenvolvimento 

da laranja transgênica foi iniciado em 

1999 e tem sido financiado pelo CNPq, 

através do programa RHAE, e pela 

Fundação Araucária (Governo do Estado 

do Paraná). Deverão ser feitos ainda, 

estudos necessários para se conhecer 

o efeito da introdução do gene da 

sarcotoxina nas plantas, na segurança 

alimentar e o seu impacto no ambiente, 

antes que essa tecnologia possa ser 

utilizada de maneira mais ampla. A 

grande eficiência do protocolo de transformação 

de laranja desenvolvido torna 

possível a inserção de novos genes 

que podem contribuir para minimizar 

outros problemas da citricultura, tais 

como o ataque de pragas e a resistência 

a estresses abióticos. 

Além do Instituto Agronômico do 

Paraná, através do Laboratório de Biotecnologia, 

outras instituições brasileiras 

que atuam no desenvolvimento de 

plantas transgênicas de laranja são: o 

Centro de Citricultura do Instituto Agronômico 

de Campinas (IAC), em Cordeirópolis 

(SP), a Escola Superior de 

Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ) e 

o Centro de Energia Nuclear (CENA), 

da USP, em Piracicaba (SP). 

Referências bibliográficas 

Bespalhok F.; Kobayashi, A.K.; Pereira, 

L.F.P.; Hissano, Z. & Vieira, L.G.E. 

(2001) In vitro adventitious shoot 

regeneration from sweet orange using 

thin epicotyl sections. Crop Breed 

Appl Biotech 1:27-34. 

Boman, H.G. & Hultmark, D. (1987) 

Cell-free immunity in insects. Ann 

Ver Microbiol 41:103-126. 

Bond, J.E. & Roose, M.L. (1998) Agrobacterium-mediated 

transformation of 

the commercially important citrus 

cultivar Washington navel orange. 

Plant Cell Rep 18:229-234. 

Cervera, M.; Juarez, J.; Navarro, A.; Pina, 

J.A.; Duran-Vila, N.; Navarro, L. & 

Peña, L. (1998) Genetic transformation 

and regeneration of mature tissues 

of woody fruit plants bypassing 

the juvenile stage. Transgenic Res 

7:51-59. 

Christensen, B.; Fink, J.; Merrifield, R.B. 

& Mauzerall, D. (1988) Channel-forming 

properties of cecropins and 

related model compounds incorporated 

into planar lipid membrane. 

Proc Nat Acad Sci USA 85:5072-5076. 

Düring, K.; Porsch, P.; Fladung, M & 

Lorz, H. (1993) Transgenic potato 

plants resistant to the phytopathogenic 

bacterium Erwinia carotovora. 

The Plant J 3: 587-598. 

Florack, D.; Allefs, S.; Bollen, R.; Bosch, 

D.; Visser, B. & Stiekema, W. (1995) 

Expression of giant silkmoth cecropin 

B genes in tobacco. Transgenic 

Res 4: 132-141. 

Gutiérrez-E, M.A.; Luth, D. & Moore, 

G.A. (1997) Factors affecting Agrobacterium-mediated 

transformation 

in Citrus and production of sour 

orange (Citrus aurantium L.) plants 

expressing the coat protein gene of 

citrus tristeza virus. Plant Cell Rep 16: 

745-753. 

Hightower, R.; Baden, C.; Penzes, E. & 

Dunsmuir, P. (1994) The expression 

of cecropin peptide in transgenic 

tobacco does not confer resistance to 

Pseudomonas syringae pv tabaci. 

Plant Cell Rep 13: 295-299. 

Jaynes, J.M.; Nagpala, P.; Destefano- 

Beltran, L.; Hong-Hung, J.; Kim, J.; 

Denny, T. & Cetiner, S. (1993) Expression 

of a cecropin B lytic peptide 

analogue in transgenic tobacco confers 

enhanced resistance to bacterial 

wilt caused by Pseudomonas solanacearum. 

Plant Sci 8:43-53. 

Kaneyoshi, J.; Kobayashi, S.; Nakamura, 

Y.; Shigemoto, N. & Doi, Y. (1994). A 

simple and efficient gene transfer 

system of trifoliate orange (Poncirus 

trifoliata Raf.). Plant Cell Rep 13: 

541-545. 

Kobayashi, A.K.; Bespalhok F., J.C.; Pereira, 

L.F.P.; Molinari, H.B.C.; Galvão, 

R.M & Vieira L.G. (2001) Agrobacterium-mediated 

transformation 

of sweet orange cv. Pêra (Citrus 

sinensis L. OSBECK) with sarcotoxin 

antibacterial peptide gene. IV Latin- 

American Meeting on Plant Biotechnology, 

Goiânia, GO, p. 125-125. 

Leite, R.P. (1990) Cancro cítrico: prevenção 

e controle no Paraná. Circular N o 

61, Fundação Instituto Agronômico 

do Paraná, Londrina, Pr, 51p. 

Luth, D. & Moore, G. (1999) Transgenic 

grapefruit plants obtained by Agrobacterium 

tumefaciens-mediated 

transformation. Plant Cell Rep 57:219- 

222. 

Mitsuhara, I.; Matsufuru, H.; Ohshima, 

M.; Kaku, H.; Nakajima, Y.; Murai, 

N.; Natori, S. & Ohashi, Y. (2000) 

Induced expression of sarcotoxin IA 

enhanced host resistance against both 

bacterial and fungal pathogens in transgenic 

tobacco. Mol Plant Microbe In 

13:860-868. 

Mitsuhara, I.; Nakajima, Y.; Natori, S.; Mitsuoka, 

T. & Ohashi, Y. (2001) In vitro 

growth inhibition of human intestinal 

bacterial by sarcotoxin IA, an insect 

bactericidal peptide. Biotechnol Lett 

23:569-573. 

Montanelli, C. & Nascari, G. (1991) Introduction 

of an antibacterial gene in 

potato (Solanum tuberosum L.) using a 

binary vector in Agrobacterium rhizogenes. 

J Genet Breed 45: 307-316. 

Moore, G.A.; Jacono, C.C.; Neidigh, J.L.; 

Lawrence, S.D. & Cline, K. (1992) Agrobacterium-mediated 

transformation of 

Citrus stem segments and regeneration 

of transgenic plants. Plant Cell Rep 

11:238-242. 

Mourgues, F.; Brisset, M. & Chevreau, E. 

(1998) Strategies to improve plant resistance 

to bacterial diseases through genetic 

engineering. Tibtech 16:203-210. 

Norelli, J.L.; Aldwinckle, H.S.; Destefano- 

Beltran, L. & Jaynes, J.M. (1994) Transgenic 

‘Malling 26’ apple expressing the 

attacin E gene has increased resistance 

to Erwinia amylovora. Euphytica 77: 

123-128. 

Ohshima, M.; Mitsuhara, I.; Okamoto, M.; 

Sawano, S.; Nishiyama, K.; Kaku, H.; 

Natori, S. & Ohashi, Y. (1999) Enhanced 

resistance to bacterial diseases of 

transgenic tobacco plants overexpressing 

sarcotoxin IA, a bactericidal peptide 

of insect. J Biochem 125: 431-435. 

Peña, L.; Cervera, M.; Juárez, J.; Navarro, 

A.; Pina, J.A. & Durán-Vila, N. (1995) 

Agrobacterium-mediated transformation 

of sweet orange and regeneration of 

transgenic plants. Plant Cell Rep 14:616- 

619. 

Peña, L.; Cervera, M.; Juárez, J.; Navarro, 

A.; Pina, J.A. & Navarro, L. (1997) 

Genetic transformation of lime (Citrus 

aurantifolia Swing.): factors affecting 

transformation and regeneration. Plant 

Cell Rep 16:731-737. 

Vardi, A.; Bleichman, S. & Aviv, D. (1990) 

Genetic transformation of Citrus protoplasts 

and regeneration of transgenic 

plants. Plant Sci 69:199-206. 

Yao, J-L.; Wu, J-H.; Gleave, A.P. & Morris, 

B.A.M. (1996) Transformation of citrus 

embryogenic cells using particle bombardment 

of transgenic embryos. Plant 

Sci 113:175-183. 


Pesquisa 

Vacinas de DNA 

MULTIVALENTES 

Pesquisas abrem caminho para a vacina ideal 

Marcio de Oliveira Lásaro 

Aluno de doutorado do curso de Pós-graduação 

do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - 

UFRJ 

molasaro@biof.ufrj.br 

Carolina Tereza Cequalini Rohr 

Aluna de Biologia - Universidade Presbiteriana 

Mackenzie 

carolzinhar@hotmail.com 

Luís Carlos de Souza Ferreira 

Professor Titular Departamento de Microbiologia, 

Instituto de Ciências Biomédicas- USP 

lcsf@usp.br 

Figura 1: Estratégia para a geração 

de vacinas de DNA multivalente 

baseada em mistura de plasmídeos 

que codificam para antígenos 

diferentes. Cada um dos genes x e 

y são clonados em diferentes 

plasmídeos e inoculados juntos na 

mesma formulação. As proteínas 

expressas são processadas individualmente 

e apresentadas ao sistema 

imune por moléculas de MHC 

pós cerca de 180 anos 

da descoberta e aplicação 

da vacina contra a 

varíola, feita pelo Dr. 

Edward Jenner, em 

Gloucestershire, um pequeno 

município a oeste de Londres, a 

doença foi considerada erradicada do 

planeta, em 1977. Esse evento celebrou 

de forma definitiva o papel das vacinas 

como um dos principais instrumentos 

na prevenção de doenças infecciosas e 

consagrou-as como uma das mais importantes 

descobertas na área médica 

de todos os tempos. Entretanto, a vitória 

contra a varíola representou apenas 

uma batalha vencida em uma guerra, na 

qual, a cada ano, milhões de vidas ainda 

são perdidas, sobretudo de crianças, 

vítimas de doenças que poderiam 

ser evitadas caso dispuséssemos 

de formulações vacinais 

contra diversos patógenos que 

afligem a humanidade. 

Em 1974, a Organização 

Mundial da Saúde estabeleceu 

como prioridade a implantação 

do Programa Ampliado de 

Imunização com vistas a permitir 

à população infantil ter acesso 

a vacinas eficazes contra algumas 

das principais doenças infecciosas 

(pólio, tuberculose, difteria, 

tétano, coqueluche, sarampo, 

cachumba, rubéola, hepatite). Outras 

vacinas capazes de prevenir doenças 

que ainda apresentam elevados índices 

de mortalidade e morbidade são 

aquelas desenvolvidas para o controle 

das meningites bacterianas (meningocócica 

e a causada pelo H. influenza do 

tipo B), a catapora (varicela), a pneunonia 

bacteriana e a gripe. A maioria 

dessas vacinas são administradas em 

regime de múltiplas doses, com intervalos 

definidos e em diferentes momentos 

da vida do indivíduo, o que aumenta os 

custos e pode levá-lo à desistência durante 

os programas de imunização. Uma 

alternativa para esse problema são vacinas 

multivalentes, isto é, formulações 

que contenham em sua composição 

antígenos capazes de gerar proteção 

contra diversas doenças. O sucesso dessa 

abordagem foi demonstrado por exemplos 

como a vacina tríplice viral (sarampo, 

cachumba e rubéola), a tríplice 

bacteriana (difteria, coqueluche e tétano), 

ou ainda as vacinas multivalentes 

contra meningites meningocócicas e 

pneumonia pneumocócica, todas utilizadas 

com sucesso há vários anos. Infelizmente 

a estratégia não é universal e 

algumas limitações não puderam ser 

superadas. Restrições relacionadas com 

a solubilidade dos antígenos vacinais e 

a competição antigênica, quando a presença 

de um antígeno suprime ou diminui 

as respostas imunológicas induzidas 

contra outro antígeno co-administrado, 

impediram o desenvolvimento 

de novas formulações multivalentes ativas 

contra um maior número de doenças. 

Recentes descobertas na área de 

pesquisa vacinal reacenderam as esperanças 

que novas formulações multivalentes, 

ativas contra um número ilimitado 

de doenças, possam ser criadas em 

um breve futuro. Dentre essas novas 

tecnologias, destacam-se as vacinas 

genéticas, ou vacinas de DNA. Essas 

vacinas são formadas por plasmídeos 

capazes de induzir respostas imunológicas 

em indivíduos inoculados com 

DNA purificado, reflexo da transfecção 

de células que passam a produzir os 

antígenos responsáveis pela proteção 

contra um patógeno específico (Azevedo 

& Oliveira, 1997; Silva, 1997; Lásaro 

& Ferreira, 1999). Ao contrário das vacinas 

convencionais, que se baseiam na 

inoculação de microrganismos mortos, 

atenuados ou de frações acelulares 

purificadas para induzir uma resposta 

imunológica, as vacinas de DNA empre- 


Figura 2: Estratégia para geração 

de vacinas de DNA multivalente 

baseada em minigenes ou 

politopos. Regiões de genes que 

codificam epitopos específicos 

para linfócitos T citotóxicos, B ou 

T auxiliares (T, B, Th; na figura) 

são clonados na mesma fase de 

leitura em um único plasmídeo. 

Após a inoculação do plasmídeo 

no hospedeiro, o minigene 

expresso é processado e os 

epitopos são apresentados ao 

sistema imune por moléculas de 

MHC 

gam um protocolo único para sua produção, 

o que resulta em considerável 

redução de custos, além de evitar o 

contato direto com o patógeno ou com 

produtos dele extraídos. 

Pela própria composição e mecanismo 

de ação, as vacinas de DNA mostram 

grande potencial para a elaboração 

de formulações multivalentes. Como 

não se trabalha com os microrganismos 

ou com produtos deles isolados, as 

limitações ficam eliminadas quanto à 

solubilidade antigênica. Com o auxílio 

de técnicas de clonagem gênica, é possível 

inserir em um mesmo plasmídeo, 

ou em plasmídeos diferentes, vários 

genes que codifiquem para antígenos 

oriundos de um mesmo patógeno ou de 

patógenos diferentes. Por outro lado, 

como as células transfectadas do próprio 

indivíduo se encarregam de produzir 

os antígenos codificados pelos genes 

nelas introduzidos, espera-se que sejam 

minimizados problemas relacionados 

com a competição antigênica. As pesquisas 

para o desenvolvimento de vacinas 

de DNA multivalentes avançam em 

ritmo acelerado e três estratégias principais 

são investigadas por grupos de 

pesquisa que trabalham nessa área: (i) 

vacinas baseadas em mistura de plasmídeos, 

(ii) vacinas baseadas em politopos 

ou minigenes e (iii) vacinas que 

codificam proteínas híbridas. 

Vacinas de DNA multivalentes baseadas 

em mistura de plasmídeos 

Nesse tipo de estratégia, dois ou 

mais plasmídeos, cada um deles codificando 

para um antígeno específico, são 

combinados em uma única formulação 

(Figura 1). Animais inoculados com a 

mistura de plasmídeos desenvolveram 

resposta imunológica e/ou proteção tão 

eficientemente ou melhor do que aqueles 

indivíduos imunizados com apenas 

um plasmídeo que dirige a expressão 

de um único antígeno. Vacinas baseadas 

nessa metodologia podem empregar 

um mesmo tipo de vetor plasmidial 

ou plasmídeos diferentes, desde que 

estes sejam capazes de promover a 

expressão dos antígenos necessários à 

indução da resposta imunológica. Por 

exemplo, uma vacina de DNA composta 

por plasmídeos diferentes que codificavam 

para as proteínas ESAT-16, MPT- 

64, MPT-63 e KatG do 

Mycobacterium tuberculosis, resultou 

na indução de respostas imunológicas 

específicas a cada um dos antígenos em 

níveis semelhantes aos observados em 

animais imunizados com cada um dos 

plasmídeos isoladamente (Morris et al., 

2000). 

Outro estudo baseado no vírus influenza 

mostrou que a mistura de dois 

plasmídeos, que codificavam para a 

hemaglutinina (HA) e a neuroaminidase 

(NA) virais conferiu maior proteção 

em camundongos do que aquela obtida 

com os mesmos plasmídeos aplicados 

isoladamente (Chen et al., 1999). Além 

disso, a adição de um terceiro plasmídeo 

que codificava para outra proteína 

viral não interferiu nas respostas imunológicas 

obtidas para as proteínas HA 

e NA. Essas observações demonstram 

que vacinas de DNA multivalentes baseadas 

na mistura de plasmídeos podem 

ser feitas sem o comprometimento 

da resposta induzida por cada um dos 

antígenos codificados. 

Entretanto, o uso de plasmídeos que 

possuem promotores com atividade 

muito diferente pode acarretar diferença 

nas quantidades de antígenos e resultar 

em resposta imune induzida diferenciada 

frente aos respectivos antígenos 

codificados. A produção de um 

determinado antígeno sob o controle 

de um promotor forte pode gerar um 

quadro semelhante à competição antigênica 

em função do maior recrutamento 

de células apresentadoras de 

antígenos (APC, do inglês antigen-presenting 

cells). Essa competição pelas 

APCs pode resultar em resposta imunológica 

maior e mais rápida em relação 

ao(s) antígeno(s) presente(s) em maior 

quantidade. Talvez um reflexo de um 

microambiente induzido pela produção 

de mediadores químicos da resposta 

imune (citocinas), que, por sua vez, 

influenciam a resposta imune tanto em 

magnitude (produção de anticorpos) 

como em população de linfócitos T 

ativados (padrão Th1/Th2). Tais desdobramentos 

indicam que as vacinas de 

DNA multivalentes baseadas em mistura 

de plasmídeos devem, sempre que 

possível, utilizar um mesmo plasmídeo 

para a construção das formas recombinantes, 

presentes na formulação final. 

A inoculação de vacinas de DNA 

pode ser feita de várias maneiras: a 

biobalística emprega partículas de ouro 

revestidas com DNA introduzidas através 

da pele por gases sob pressão. O 

DNA pode ser encapsulado em partículas 

lipídicas (lipossomos) e administrado 

por via intranasal, ou, ainda, bactérias 

atenuadas, como Salmonella ou 

Shigella, que podem ser administradas 

por via oral e, após destruição por 

células fagocitárias, acabam por liberar 

o DNA, que conduzirá a expressão do 

antígeno pelas células do hospedeiro 

(Azevedo & Oliveira, 1997, Lásaro & 

Ferreira, 2000). No entanto, a inoculação 

intramuscular ainda representa a 

forma mais usual de aplicação de vacinas 

de DNA, tanto em animais como em 

humanos, e a quantidade mínima de 

DNA capaz de induzir resposta imune 

protetora representa uma grande preocupação 

para aqueles que trabalham no 

desenvolvimento de formulações multivalentes. 

A dose de DNA a ser inoculada 

não pode ser tão baixa a ponto de 

mostrar-se incapaz de induzir resposta 

imune no hospedeiro mamífero, nem 

tão alta a ponto de saturar a capacidade 

do indivíduo em responder ao estímulo, 

o que acarretaria desperdício do 

material vacinal. Alguns pesquisadores, 


Figura 3: Estratégia baseada na 

expressão de proteínas híbridas. 

Genes que codificam para 

proteínas inteiras ou somente 

domínios imunologicamente 

importantes são clonados na 

mesma fase de leitura, em um 

único plasmídeo. Após a 

inoculação do plamídeo no 

hospedeiro, a proteína híbrida é 

processada e apresentada ao 

sistema imune por moléculas de 

MHC 

preocupados com essa questão, demonstraram 

que cobaias imunizadas 

com pequenas quantidades (13 µg) de 

uma mistura de plasmídeos que codificavam 

para glicoproteínas do vírus herpes 

simplex do tipo 2 (HSV-2), agente 

causador do herpes genital, obtiveram 

uma proteção tão boa quanto aquelas 

observadas em animais imunizados com 

doses maiores (McClements et al., 1996). 

Estes resultados, assim como outros 

trabalhos baseados em diferentes vacinas 

de DNA, demonstram que formulações 

multivalentes podem ser aplicadas 

em quantidades relativamente pequenas 

sem o comprometimento das respostas 

imunológicas induzidas. 

Vacinas de DNA multivalentes 

baseadas em minigenes 

Vacinas de DNA multivalentes também 

podem ser geradas a partir da 

construção de minigenes ou politopos. 

Essa estratégia consiste na utilização de 

oligonucleotídeos que, uma vez clonados 

em ordem contígua e no mesmo 

referencial de tradução em um mesmo 

plasmídeo, codificam para epitopos derivados 

de antígenos oriundos de um 

ou mais patógenos (Figura 2). Uma 

vantagem inerente a essa estratégia 

é o fato de ser possível expressar 

epitopos específicos para 

linfócitos B, T ou citotóxicos 

e excluir seqüências 

não relevantes para gerar 

resposta imunológica, 

ou mesmo seqüências 

responsáveis pela 

indução de respostas cruzadas 

com antígenos do 

próprio indivíduo, o que 

poderia resultar em doença 

auto-imune. 

Em um estudo baseado 

em uma vacina que continha 

dez epitopos oriundos de antígenos 

do vírus influenza, citomegalovírus 

murino, vírus da coriomeningite 

linfocitária, adenovírus e vírus Sendai, 

mostrou que essa estratégia é capaz de 

ativar resposta citotóxica e de memória 

até um ano após a imunização de camundongos 

(Thomson et al., 1998). Em 

outro estudo, uma vacina de minigenes 

composta por seis epitopos específicos 

para linfócitos B, T citotóxicos e T 

auxiliadores, derivados dos vírus da 

estomatite vesicular, sincicial respiratório, 

coriomeningite linfocitária, mengovírus 

e vírus Sendai, além de antígeno 

da 

bactéria 

Mycobacterium tuberculosis, foi capaz 

de gerar resposta imunológica em todos 

os camundongos imunizados, sem indícios 

de competição antigênica. Além 

disso, os animais imunizados com a 

vacina de DNA multivalente desenvolveram 

resposta protetora para o mengovírus 

e o vírus da coriomeningite 

linfocitária (Ling Ling & Whitton, 1996). 

Na estratégia de minigenes podem 

ser incorporados aminoácidos que atuem 

como espaçadores para os diferentes 

epitopos expressos pela vacina de 

DNA, de modo que lhe confira uma 

maior flexibilidade estrutural do produto 

e permita sua apresentação mais 

eficiente pelas APCs. Essa hipótese foi 

testada com plasmídeos que expressavam 

vários epitopos de diferentes proteínas 

do vírus do papiloma humano 

(HPV), o principal agente etiológico do 

câncer cervical uterino (Velders et al., 

2001). Tais plasmídeos diferiam entre si 


quanto à presença de nucleotídeos que 

ladeavam os minigenes e codificavam 

para a seqüência de aminoácidos Ala- 

Ala-Tyr. A incorporação dessas seqüências 

espaçadoras melhorou o processamento 

e a apresentação dos epitopos 

pelas APCs, e aumentou a proteção 

conferida pela vacina de 50% para 100% 

dos animais imunizados quanto ao desenvolvimento 

de tumores ainda não 

estabelecidos. Para animais que já tinham 

um tumor estabelecido, a vacina 

com os minigenes e os espaçadores 

resultou na cura de 90% dos animais 

imunizados. Esses resultados atestam o 

potencial profilático e terapêutico das 

vacinas de DNA multivalentes e ressaltam 

a importância dessa estratégia vacinal, 

tanto para o controle de doenças 

infecciosas como para a erradicação de 

certos tipos de câncer. 

No entanto, para que seja possível 

empregar a estratégia vacinal multivalente 

baseada em minigenes, é imprescindível 

que os diferentes epitopos tenham 

sido previamente definidos e caracterizados 

quanto ao seu potencial 

imunogênico. Além disso, o polimorfismo 

natural das populações humanas 

para moléculas do sistema de histocompatibilidade 

principal (MHC), responsável 

pela apresentação de epitopos processados 

na superfície de APCs, representa 

uma potencial limitação capaz de 

influir negativamente na eficácia dessas 

vacinas. Entretanto, essas dificuldades 

podem ser contornadas com a expressão 

de um maior número de epitopos 

ou pelo emprego de seqüências protéicas 

maiores que englobem vários epitopos. 

Vacinas de DNA multivalentes baseadas 

em proteínas híbridas 

Nessa estratégia, genes que codificam 

para proteínas inteiras, ou para 

domínios estruturais importantes, de 

um ou mais patógenos, são clonados 

em um único plasmídeo (Figura 3). 

Desaa forma, não há necessidade de 

localizar ou caracterizar os epitopos 

presentes e, dependendo da construção 

a ser feita, torna-se possível preservar, 

pelo menos em parte, epitopos não 

contíguos ou conformacionais. Nessas 

construções, a restrição imposta pela 

variabilidade natural do MHC é minimizada, 

pois, a partir de seqüências protéicas 

maiores, o processamento e a 

apresentação pelas APCs ocorrerá na 

grande maioria dos indivíduos imunizados.

Uma vacina de DNA multivalente 

capaz de conferir proteção contra diferentes 

sorotipos do vírus da raiva exemplifica 

a estratégia baseada na expressão 

de proteínas híbridas (Jallet et al., 1999). 

Nesse trabalho, foram construídos plasmídeos 

capazes de codificar proteínas 

híbridas oriundas da fusão de diferentes 

regiões de proteínas G do envelope de 

diferentes sorotipos virais. Algumas dessas 

construções foram capazes de induzir 

respostas imunológicas contra as diferentes 

proteínas G e conferir proteção a 

vários sorotipos virais em camundongos 

imunizados. 

Em nosso laboratório trabalhamos 

com um protótipo de vacina de DNA 

bivalente baseada na expressão de uma 

proteína híbrida, resultado da fusão da 

glicoproteína D (gD) do vírus herpes 

simplex tipo 1 (HSV-1) e uma adesina 

fimbrial (CFA/I), responsável pela aderência 

ao epitélio intestinal humano da 

Escherichia coli enterotoxigênica 

(ETEC), um dos principais agentes causadores 

da diarréia dos viajantes. A estratégia 

empregada consistiu na substituição 

de uma seqüência central da proteína 

gD do HSV-1 pela seqüência do 

antígeno CFA/I de ETEC. A administração 

intramuscular dessa vacina de DNA 

bivalente em camundongos foi capaz de 

gerar anticorpos contra os dois antígenos 

(Figura 4). Experimentos adicionais indicaram 

que os anticorpos anti-gD gerados 

nos animais imunizados com a vacina 

bivalente foram capazes de bloquear a 

infecção viral enquanto os anticorpos 

contra a porção CFA/I reconheciam a 

proteína expressa pela ETEC. Além disso, 

a utilização dessa vacina bivalente em 

consórcio com uma outra vacina baseada 

em linhagem atenuada de Salmonella, 

capaz de expressar o antígeno CFA/ 

I, ocasionou em marcante efeito sinérgico, 

tanto para a resposta de anticorpos 

sistêmicos, mas, sobretudo, para a resposta 

local, com a produção de anticorpos 

do isotipo IgA, específicos para o 

CFA/I, resposta essencial para uma efetiva 

proteção contra patógenos entéricos, 

como a ETEC (Lásaro & Ferreira, 

2000). Esses resultados abrem perspectivas 

interessantes para o desenvolvimento 

de vacinas de DNA multivalentes 

contra patógenos que possuam estratégias 

de virulência distintas e exigem, 

portanto, a indução de uma ampla gama 

de respostas imunológicas. 

Conclusões e perspectivas 

O principal objetivo da pesquisa em 

Figura 4: Resposta de anticorpos 

séricos em camundongos imunizados 

com vacina de DNA 

bivalente baseada na fusão da 

proteína gD de HSV-1 e a proteína 

CFA/I, de ETEC. O soro de 

animais imunizados com duas 

doses (100mg) da vacina por via 

intramuscular, foram testados em 

reações em que a proteína CFA/I, 

isolada de ETEC, ou a proteína 

gD, do HSV, foram submetidas à 

eletroforese em gel de 

poliacrilamida e, posteriormente, 

transferidas para membranas de 

nitrocelulose. A presença de 

bandas reativas, após a ligação 

dos anticorpos, foi demonstrada 

com o uso de anticorpos de 

coelho conjugados com a 

peroxidase, capazes de reconhecer 

imunoglobulinas de camundongos 

vacinas é criar uma formulação multivalente 

ideal que seja segura mesmo para 

indivíduos imunocomprometidos, e 

capaz de induzir níveis de proteção 

elevados e duradouros contra um grande 

número de doenças infecciosas, em 

uma única dose. Embora a vacina ideal 

ainda não possa ser obtida com a tecnologia 

atualmente disponível, o impressionante 

avanço das pesquisas nesse campo, 

como a descoberta das vacinas de 

DNA, nos levam a crer que esse sonho 

está cada vez mais próximo da realidade. 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 

An, L.L. & Whitton, J.L. (1997) A multivalent 

minigene vaccine, containing 

B-cell, cytotoxic T-lymphocyte, and 

Th epitopes from several microbes, 

induces appropriate responses in 

vivo and confers protection against 

more than one pathogen. Journal 

of Virology 71:2292-2302. 

Azevedo, V. & Oliveira, S.C. (1997) 

Vacinas de DNA. Biotecnologia, 

Ciência & Desenvolvimento 5:40- 

43. 

Chen, Z.; Matsuo, K.; Asanuma, H.; 

Takahashi, H.; Iwasaki, T.; Susuki, 

Y.; Aizawa, C.; Kurata, T. & Tamura, 

S. (1999) Enhanced protection against 

a lethal influenza virus challenge by 

immunization with both hemagglutinin- 

and neuraminidase- expressing 

DNAs. Vaccine 17:653-659. 

Jallet, C.; Jacob, Y.; Bahloul, C.; Drings, 

A.; Desmezieres, E.; Tordo, N. & 

Perrin, P. (1999) Chimeric Lyssavirus 

Glycoproteins with Increased Immunological 

Potential. Journal of 

Virology 73:225-233. 

Lásaro, M.O. & Ferreira, L.C.S. (2000). 

Vacinas contra diarréia. Novas perspectivas 

baseadas em vacinas de 

DNA. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, 

14:28-32. 

McClements, W. L.; Armstrong, M. E.; 

Keys, R. D. & Liu, M. A. (1996) 

Immunization with DNA vaccines 

encoding glycoprotein D or glycoprotein 

B, alone or in combination, 

induces protective immunity in animal 

models of herpes simplex virus- 

2 disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 

USA 93:11414-11420. 

Morris, S.; Kelley, C.; Howard, A.; Li, Z 

& Collins, F. (2000) The immunogenecity 

of single and combination 

DNA vaccines against tuberculosis. 

Vaccine 18:2155-2163. 

Silva, CL. (1997) Vacinas Gênicas. Biotecnologia, 

Ciência & Desenvolvimento 

3:323-34 

Thomson, S.A.; Sherritt, M.A.; Medveczky, 

J.; Elliott, S.L.; Moss, D.J.; Fernando, 

G.J. P.; Brown, L.E. & Suhrbier, 

A. (1998) Delivery of multiple 

CD8 cytotoxic T cell epitopes by 

DNA vaccination. Journal of Immunology 

160:1717-1723. 

Velders, M.P.; Weijzen, S.; Eiben, G.L.; 

Elmishad, A.G.; Kloetzel, P.M.; Higgins, 

T.; Ciccarelli, R.B.; Evans, M.; 

Man, S.; Smith, L. & Kast, W.M. 

(2001) Defined flanking spacers and 

enhanced proteolysis is essential for 

eradication of established tumors by 

an epitope string DNA vaccine. Journal 

of Immunology 166:5366-5373. 


Pesquisadores identificam fruta riquíssima 

em vitamina C 

Imagine uma frutinha que tenha uma concentração 

de vitamina C cem vezes maior que a da 

laranja e quatro vezes maior que a da acerola. 

Esse fruto é o camu-camu (Myrciaria dubia), 

pertencente à família Myrtaceae e é encontrado 

às margens dos rios e lagos de águas pretas, na 

região amazônica. 

Pesquisadores do Instituto Nacional de Pesquisa 

da Amazônia (INPA/MCT) demonstraram que o 

camu-camu tem a maior concentração de vitamina 

C encontrada na natureza: 6.000 miligramas 

em 100 gramas do fruto. 

Segundo o coordenador de Pesquisa do INPA, 

Wanderli Pedro Tadei, com o trabalho de engenharia 

genética, seria possível transferir o complexo 

gênico do camu-camu para a laranja, por 

exemplo, proporcionando uma rica e acessível 

fonte desta vitamina, principalmente para as populações 

mais carentes. “Este efeito na saúde 

pública é incalculável, uma vez que a vitamina C 

reforça o sistema imunológico e torna o organismo 

humano mais resistente à contaminações por 

vírus e bactérias’, diz o pesquisador. 

Tadei ressalta, ainda, os resultados econômicos 

que o camu-camu pode gerar, seja por meio da 

exportação do produto geneticamente modificado 

ou do desenvolvimento de novas tecnologias, 

gerando divisas para o País. 

Esse é apenas um dos muitos produtos da Amazônia 

cuja pesquisa pode resolver uma série de 

problemas nacionais, de áreas tão diversas quanto 

saúde e nutrição, desemprego ou balança 

comercial. 

O potencial do camu-camu foi apresentado pro 

Wanderli Pedro Tadei, na reunião de dirigentes 

das Unidades de Pesquisa ligadas ao MCT, realizada 

nos dias 20 e 21 últimos e no debate Ciência 

Amazônica, na Câmara dos Deputados, no 

dia 22. 

Nos dois eventos, ele afirmou que a 

Biodiversidade da Amazônia é nosso ouro verde. 

Estima-se que o Brasil possua entre 15% e 20% 

de toda a biodiversidade mundial e o maior número 

de espécies endêmicas (que só ocorrem 

naquele local) do planeta. 

São 55 mil espécies vegetais ou 22% do total no 

planeta, 524 mamíferos (sendo 131 endêmicos), 

517 anfíbios (294 endêmicos), 1.622 aves (191 

endêmicas) e 468 répteis (172 endêmicos), além 

de 3 mil espécies de peixes de água doce (três vezes maior 

que em qualquer outro país) e provavelmente entre 10 

e 15 milhões de insetos. Somente a Amazônia responde 

por cerca de 26% das florestas tropicais remanescentes no 

planeta. 

Somos o primeiro mundo em biodiversidade, comenta 

Tadei, temos que ser também na exploração dessa 

biodiversidade. 

Hoje, o conhecimento faz a diferença; temos que investir 

e formar competências locais. Esse investimento, em sua 

análise, dará retorno ecológico, econômico e social imprescindíveis 

para região e para o país. 

Tadei explicou que a demanda por alta competência 

ocorre em conseqüência de trabalhos que vêm sendo 

desenvolvidos na região, nos últimos 47 anos. O INPA, 

juntamente com outras Instituições, realizou o 

mapeamento da biodiversidade amazônica e, mesmo que 

60% da área ainda não tenham sido visitados por um pesquisador, 

está cientificamente comprovada uma evidência: 

seu enorme potencial. 

Elaina Daher 

Fonte: MCT 

www.tulane.edu/~dmsander/Big_Virology/ 

BVHomePage.html Book Pictutres of Virus tem 

várias imagens e informações sobre o mundo dos 

vírus que podem ser úteis na preparação de aulas e 

apresentações. 

www.microbelibrary.org/Visual/page1.htm 

Visual Resources é oferecido pala Sociedade 

Americana de Microbiologia (ASM) e dispõe de 

imagens, animações e vídeos de vários 

microrganismos. 

vector.cshl.org/resources/ 

BiologyAnimationLibrary.htm Gene Almanac 

tem animações de reações de PCR, Southern blot e 

seqüenciamento, muito úteis para alunos e 

professores. 

Fique Atento! O uso educacional de imagens, 

animações e vídeos é geralmente permitido, mas 

fique atento aos direitos autorais. 

BioDicas é assinada por Marcio O. Lasaro 

marciolasaro@hotmail.com 


EMBRAPA 

(Repete Fotolito 3º capa última edição)

Bio pdf - Biotecnologia

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