GHID DE EXAMINARE MICROSCOPICĂ Florenţa Albu

Editura Florenţa Sfântul Albu Ierarh NicolaeISBN 978-606-577-071-3MICROSCOPIE GENERALÃExaminarea microscopicã a produselor alimentare şi furajereGHID DE EXAMINAREMICROSCOPIC ĂExaminarea microscopicã este o metodã aplicatã pentru identificarea, pe bazacaracterelor microscopice caracteristice sau prin compararea cu o mostrã dereferinţã, a componentelor normale sau strãine din produsele alimentare saufurajere. Aceste produse pot fi materii prime, adjuvanţi sau produse finite.Prin component strãin se înţelege orice material diferit de structura normalã aprodusului, şi a cãrui prezenţã este condiţionatã de deficienţe de prelucrare,depozitare sau transport a produsului respectiv. In aceastã categorie intrã materialede contaminare, rezultate în urma fenomenelor de descompunere (texturi degradateîn urma unor acţiuni de naturã parazitarã sau a unor fenomene fizico-chimice,paraziţi sau fragmente ale acestora, etc.), materiale din mediul de prelucrare (nisip,pamânt, fragmente de sticlă, ruginã, lemn, plastic, textile, metal, etc.) sau altecorpuri organice sau anorganice (fragmente de insecte, fire de pãr, dejecţii aleinsectelor, pasãrilor sau animalelor, oase, pene, cristale, etc.).Examinarea microscopicã are ca scop identificarea acestor componente princomparatie sau pe baza unor caractere identificabile la microscop. Acest mod deexaminare este facilitat de efectuarea unor teste suplimentare bazate pe reacţiichimice şi care pot ajuta la confirmarea identitãţii structurilor examinate.Editura Sfântul Ierarh NicolaeISBN 978-606-577-072-0

În general, microscopul de laborator este alcãtuit dintr-un suport (talpă) pecare este fixat un braţ (sau stativ) care susţine tubul binocularului, revolverulrotativ în care sunt montate obiectivele, o carcasã cu masa port-obiect şicondensatorul. Carcasa conţine dispozitivele de deplasare fină, micrometrică, şi dedeplasare grosierã a obiectivului faţã de micropreparat (obiect). Cele douădispozitive sunt controlate de verniere şi pot fi coaxiale sau separate. În funcţie detipul microscopului, deplasarea faţã de obiect se poate realiza prin deplasareaverticalã a stativului (masa fixă) sau a mesei portobiect (stativul fix).Deplasarea orizontalã a mesei, pe două planuri, se realizează cu ajutorul unuidispozitiv solidar cu masa portobiect. În talpa microscopului sunt montate, deregulã, sursa de lumină şi oglinda care direcţioneazã lumina la 90 0 sprecondensator (fig. 1). La partea superioarã a stativului se gãseşte un corp de legăturăcare conţine o prismã deviatoare. Aceastã prismã modificã traseul fluxuluiluminos pentru a face legătura între obiectiv şi ocular. La corpul de legãturã esteataşat tubul binocular şi un ghidaj prismatic sau cu elemente de rostogolire în careintrã revolverul cu obiectivele (fig. 1).Preparatul pentru examinare care mai este denumit şi obiect, este aşezat deregulã, pe o lamă portobiect din sticlă. Preparatul poate fi examinat direct sau poatefi acoperit cu o lamelă din sticlă, de indice de refracţie (n) şi grosime standardizate(d) 1 . Pentru acurateţea examinării este recomandatã numai utilizarea lamelor şilamelelor standardizate.1 Valorile standard sunt d= 0,17 mm şi n i = 1,524 pentru lamele iar pentru lame d = 1 mm.- 3 -

Fig. 2. Schema de principiu a dispozitivului optic al microscopului1.1.1. Sisteme de iluminare cu câmp luminos (CL)Preparatul microscopic (obiectul) poate fi examinat prin luminã transmisãsau diascopică (în care obiectul este examinat prin transparenţă) sau prin luminãreflectatã sau episcopică (în care obiectul este examinat prin lumina reflectatã decãtre acesta). Aceste metode de iluminare constituie sistemul de iluminare cucâmp luminos. Dispozitivul de iluminare al microscopului este alcãtuit înprincipiu, dintr-o sursã de luminã (S), condensatorul (C), diafragma de câmp (D C ),oglinda (O) şi diafragma de apertură (D A ) care se gãseşte în tubul condensatorului.Schema de principiu a dispozitivului de iluminare al microscopului este prezentatăîn figura 2.Elementele de focalizare a luminii primite de la sursa de iluminare suntoglinda (fig. 2) şi condensatorul (vezi fig. 1). Condensatorul este constituit dintr-unansamblu de lentile şi poate fi deplasat pe verticală cu ajutorul unui vernier.Lumina care strãbate condensatorul poate fi reglată ca diametru al fluxului cuajutorul unei diafragme reglabile situate la nivelul condensatorului şi care estedenumitã diafragmã de apertură. Condensatorul, la unele microscoape, poate fireglat şi prin înclinarea axei verticale, iar de acest lucru se va ţine cont la reglareamicroscopului.- 4 -

1.1.2. ObiectiveObiectivele (fig. 1) sunt fixate în revolver câte patru sau cinci (în funcţie detipul constructiv) şi au puteri de mărire diferite. Puterea de mărire este notatã pepartea exterioară a tubului obiectivului, alături de apertura numericăcorespunzãtoare (spre exemplu un obiectiv de imersie are notaţia 100 x / 1.25).Conform standardelor DIN/ISO, puterea de mărire a obiectivelor este codificatăpe tubul extern al obiectivului, sub forma unui inel de o anumită culoare. Codulculorilor corespunzãtoare claselor de obiective este prezentat în tabelul 1.Obiectivele pot fi de putere micã sau medie (2-43 x ) sau pot fi obiective de puteremare (50-120 x). Obiectivele care necesită un mediu lichid între obiectiv sipreparat sunt denumite « obiective de imersie » iar cele obişnuite sunt cunoscute ca« obiective uscate » (fig. 4). Obiectivele de imersie au un al doilea inel colorat înfuncţie de tipul mediului lichid care poate fi utilizat (sau recomandat) (vezi fig. 4 şitab. 1).Fig. 4. Schema de comparaţie între obiective uscate şi de imersie şimarcajele acestora.Pe suprafaţa externã a tubului obiectivului se găsesc marcate indicativereferitoare la tipul obiectivului, lungimea acestuia, distanţa de lucru sau, la uneletipuri, grosimea lamelei care poate fi utilizată. In tabelul 1 sunt indicateproprietãţile obiectivelor în funcţie de tipul de corecţie. Acestea pot fi acromate,- 5 -

d =(1/ 2) NA(1)Unde : d = limita rezoluţiei= lungimea de unda a luminii transmiseNA = apertura numericaÎn tabelul 1 sunt prezentate caracteristicile unor obiective mici, medii şi mari(uscate şi de imersie). Pe tubul extern al unui obiectiv de 10 x , spre exemplu, se vaputea vedea notaţia 10 x/0.25 (cu inel galben) care indicã puterea de mãrire şiapertura numericã corespunzãtoare. Din acelaşi tabel se poate observa distanţaminimã dintre două puncte separate care pot fi vizualizate (puterea de rezoluţie).Odatã cu creşterea puterii de mãrire, scade proporţional şi distanţa de lucru dintreobiectiv şi lama portobiect. Din formula (1) de calcul a limitei rezoluţiei d, se poateobserva cã rezoluţia este invers proporţionalã cu lungimea de undã a luminiitransmise prin obiectul examinat. In acest fel, devine evident cã pentru obţinereaunei rezoluţii cât mai bune, lungimea de undã a luminii transmise trebuie sã fie câtmai micã (fig. 5).Fig. 5. Relaţia dintre capacitatea de rezoluţie şi lungimea de undăLungimea de undã a luminii obţinutã de la becurile microscoapelor sesitueazã în jurul valorii de 550 nm. De regulã, pentru examinarea la microscop, seutilizeazã un filtru albastru (ex. BG 33-BG 38) aşezat în calea fluxului luminosînainte ca lumina sã ajungã la condensator. Utilizarea unui astfel de filtru ajutã- 7 -

ochiul observatorului sã perceapã mai detailatstructurile observate la microscop. Existã şi altetipuri de filtre care au scopuri diferite. Astfel, filtrulgri (ex. N 16) atenueazã intensitatea luminiitransmise fara a influenţa temperatura culorii (înexemplul de mai sus codul filtrului indica capacitatea de reducţie N 16 = 100/16 =6.3 %). Filtrul verde (ex. VG 9) mãreşte contrastul color al imaginii, ceea ce ducela obţinerea unor detalii mai bune în special pentru microfotografii sau laexaminarea în fluorescenţã.Tab. 1OBIECTIVE PENTRU MICROSCOAPETipul decorecţieAcromatPlanacromatPlanfluoritPlanapocromatPutere de mãrire(magnificaţie)Aperturanumericã (NA)Distanţa delucru (mm)Codul deculoare alobiectivuluiCodul deculoaresuplimentar(imersie)4 x 0.10 30.00 Rosu -10 x 0.25 6.10 Galben -20 x 0.40 2.10 Verde -40 x 0.65 0.65 Albastru deschis -60 x 0.80 0.30 Albastru cobalt -100 x 1.25 0.18 Alb -0.5 x 0.02 7.00 - -1 x 0.04 3.20 Negru -2 x 0.06 7.50 Maron -4 x 0.10 30.00 Rosu -10 x 0.25 10.50 Galben -20 x 0.40 1.30 Verde -40 x 0.65 0.57 Albastru deschis -50 x (ulei) 0.90 0.40 Albastru deschis Negru100 x (ulei) 1.25 0.17 Alb Negru40 x 0.65 0.48 Albastru deschis -100 x 0.90 0.26 Alb -4 x 0.13 17.10 Rosu -10 x 0.30 16.00 Galben -20 x 0.50 2.10 Verde -40 x 0.75 0.72 Albastru deschis -40 x (ulei) 1.30 0.20 Albastru deschis Negru60 x 0.85 0.30 Albastru cobalt -100 x 0.90 0.30 Alb -100 x (ulei) 1.30 0.20 Alb Negru2 x 0.10 8.50 Maron -4 x 0.20 15.70 Rosu -10 x 0.45 4.00 Galben -20 x 0.75 1.00 Verde -- 8 -

40 x 0.95 0.14 Albastru deschis -40 x (ulei) 1.00 0.16 Albastru deschis Negru60 x 0.95 0.15 Albastru cobalt -60 x (ulei) 1.40 0.21 Albastru cobalt Negru60 x (apa) 1.20 0.22 Albastru cobalt Alb100 x (ulei) 1.40 0.13 Alb Negru1.1.4. Microscopul cu contrast de fazã (CF)Pentru identificarea structurilor componentelor examinate este utilmicroscopul echipat cu contrast de fazã (fig. 6). In principiu, dispozitivul decontrast de fazã introduce un inel de fazã, în calea fluxului luminos care ajunge lapreparat. In acest caz obiectul nu mai este iluminat prin transparenţă iar obiectulapare iluminat intens pe un fond întunecat. Principiul contrastului de fazã prevedecã lumina directã capãtã un defazajde 90 0 , intensitatea luminii directeeste micşoratã aproape comparabilcu intensitatea luminii difractate şilumina difractatã interfereazã culumina directã a cãrei intensitateeste micşoratã şi deplasatã în fazã.La microscopul de acest tip,condensatorul poate fi reglat şi caînclinaţie, în aşa fel încât lumina ajunge la obiect sub un anumit unghi deincidenţã.Un aspect deosebit de important pentru acurateţea observaţiilor la microscop,este reglarea sau centrarea fluxului luminos care trebuie sa ajunga la obiectivperfect centrat. Aceasta se realizeaza prin ajustarea inclinaţiei oglinzii din talpamicroscopului cu ajutorul şuruburilor de ajustare.- 9 -

Fig. 6. Reprezentare schematică a dispozitivului de contrastCentrarea fluxului luminos se realizează prin îndepãrtarea geamului mat din calealuminii şi vizualizarea 4 filamentului (la becuri cu incandescenţã) sau a reţelei (labecuri cu halogen sau fluorescente) (fig.7) :abFig. 7. a) Diferite tipuri de lãmpi : A-halogen B–Hg 50 C- Hg 100b) Imaginea filamentului (bec cu incandescenţã) Oc 7 x –Ob 10 xPentru centrarea cu dispozitivul CF se regleazã condensatorul pentruînclinaţie în plan vertical. In acest scop se foloseşte în locul unuia dintre oculare olunetã specialã cu care se poate vizualiza poziţia inelului de fazã. Reglarea se facepânã la fixarea acestui inel în centrul câmpului vizual.4 Aceasta reglare se efectueazã cu un ocular de 7 x şi un obiectiv de 10 x- 10 -

1.1.5. Microscopul cu dispozitiv polarizantÎn anumite situaţii, este necesarã examinarea cu luminã polarizatã. Faţã demicroscopul obişnuit, microscopul polarizantsimplu conţine un dispozitiv polarizor situat înfaţa condensatorului şi o lamă compensatoare ().Cu ajutorul luminii polarizate se pot observamateriale anisotrope organice sau anorganice, sepot diferenţia cristale (fig. 8 A) sau fragmente desticlă (fig. 8 B). Substanţele anisotrope se caracterizeazã prin apariţia în câmpul deexaminare a culorilor de polarizare iar cele isotrope prezintã transparenţă(extincţie) completã. De notat cã examenul cu lumina polarizatã se poate combinacu observarea în contrast de fazã.Fig. 8. A) Cristal în luminã polarizatã,B) Fragment de sticlă- 11 -

1.2 Stereomicroscopul1.3Stereomicroscopul este compus, în principiu, din aceleaşi piese ca şimicroscopul, cu deosebirea cã examenul obiectului se face prin iluminarereflectatã. Practic, este o lupã de examinare dar care are capacitatea de mãriremult mai mare.Fig. 9 Stereomicroscopul de tip Wild- 12 -

Stereomicroscopul poate avea o putere de mãrire de la 10 la ~250 x în funcţie deaplicaţia la care este folosit. Puterea totalã de mãrire se calculeazã în mod identicprin multiplicarea puterii ocularului cu cea a obiectivului. In cazul în care suntmontate obiective suplimentare, puterea de mãrire a acestora se multiplicã cuputerile ocularului şi obiectivului principal. La stereomicroscop, spre deosebire demicroscopul compus, piesa care este schimbatã este ocularul (10-32 x) în timp ceputerea obiectivului este, în general, fixă 5 (0.5-5.0 x). Ca şi în cazul microscopului,obiectivele stereomicroscoapelor pot fi codificate color 6 dupã puterea de mãrire aacestora. Codurile si specificaţiile obiectivelor sunt prezentate în tabelul 2 :Tipul decorecţiePlan acromatPlan apocromatOBIECTIVE PENTRU STEREOMICROSCOAPE 7Putere de mãrire(magnificaţie)Aperturanumericã (NA)Distanţa de lucru(mm)Tab. 2Codul de culoare alobiectivului0.5 x 0.045 155 Roşu0.75 x 0.68 117 Galben1 x 0.09 84 Alb1.5 x 0.14 50 Verde2 x 0.18 40 Albastru0.5 x 0.066 136 -1 x 0.13 54 -1.6 x 0.21 24 -În figura 9 este reprezentată structura principală a stereomicroscopului de tipWild. La unele stereomicroscoape este prevãzutã şi posibilitatea iluminãriiobiectului prin transparenţă, situaţie în care sursa de luminã este aşezatã sub masaportobiect, într-un sistem asemãnãtor celui de la microscop. În acord cu celeprezentate mai sus referitor la capacitatea de rezoluţie, la dispozitivul de iluminareexternã se va ataşa un filtru albastru care va facilita observarea detaliilor de pesuprafaţa obiectului de examinat. Pentru examenul pe placa de sticlă este depreferat sã se aşeze sub placã o hârtie de culoare neagrã pentru componentedeschise la culoare, sau una de culoare albã în cazul componentelor colorate sau5 Existã stereomicroscoape la care se obţin magnificaţii în trepte prin rotirea unui cursor.6 Existã şi producãtori care nu folosesc sistemul de codificare al obiectivelor.7 Sunt prezentate specificaţii pentru obiective obişnuite, folosite în laboratoarele biomedicale.- 13 -

negre 8 . Iluminarea se face de preferinţã cu o sursã de cel mult 30 W iar sursa poatefi configuratã lateral, frontal sau combinat. Rezultate optime se obţin la iluminaresimultanã lateralã şi frontalã (fig. 10) :Fig. 10. Schema de configurare a surselor de iluminare externã (combinatã)Identificarea microscopicã2.1 Pregãtirea examinăriiEste esenţialã omogenizarea foarte atentã a probei de analizat. Examinareapentru identificare microscopică se realizează în câteva etape. Într-o prima etapăare loc separarea fragmentelor pe baza dimensiunii acestora. Aceasta se realizeazăprin separarea mecanicã prin filtrare, sitare, flotaţie sau selectarea vizualã. În cazulîn care este necesarã mãrunţirea mecanicã a unor granule sau conglomerate, sepoate face mojararea manualã sau mãcinarea în moara electricã. În acest caz,trebuie însã ţinut cont de turaţia aplicatã pentru a nu fragmenta prea fincomponente care pot fi recunoscute macroscopic (se începe cu o turaţie micã~1000-2000 r.p.m. timp de 5-10”). Fragmentele mai mari sunt apoi examinate la8 Stereomicroscoapele sunt prevãzute cu un disc opac cu două suprafeţe (alb/negru) care acoperã masa. portobiect- 14 -

stereomicroscop unde vor fi observate caracterele macroscopice (detalii desuprafaţã, texturã) consistenţã (se încearcã fragmentarea prin presare), culoareaparticulelor, dimensiunile acestora, etc., aspecte care vor fi notate alãturi dedimensiunea fracţiei analizate (ex. nr. sitei pe care s-a facut separarea).2.1.1 SitareaPentru separarea diferitelor componente prin sitare se folosesc două tehnici :sitarea uscatã şi sitarea umedã. In primul caz se face sitarea amestecurilor uscate,alcãtuite din componente de dimensiunidiferite sau a amestecurilor obţinute prinmãcinare şi uscare. In cazul sitãrii umedese folosesc site cu diametrul de cel puţin15-20 cm (cu ochiuri de 60, 100, 150m) 9 . Sitarea se efectueazã sub curent deapã caldã (50-60 0 C) menţinând sita la~30 0 înclinaţie. In funcţie de natura componentelor separate, este opţionalãadãugarea de detergent 10 , caz în care spãlarea se efectueazã pânã la îndepãrtareacompletã a spumei rezultate. Reziduul rãmas pe sitã este uscat şi apoi transferatcantitativ cu o soluţie alcoolicã într-un pahar curat. Dupã separarea şi uscareareziduului obţinut, acesta poate fi supus unei etape de hidrolizã acidã sau bazicã.2.1.2 FiltrareaFiltrarea este utilizatã pentru separareasuspensiilor fine din soluţii sau rezulate prinumectarea reziduului rãmas la sitare. Pentru filtrarese foloseşte hârtie de filtru de porozitate medie,corespunzãtoare pentru majoritatea aplicaţiilor. Inpentru iluminare externã şi un disc din sticlă matã, semitransparent, pentru iluminare transmisã.9 Vezi Anexa 3.10 In mod uzual se foloseşte un detergent anionic.- 15 -

anumite cazuri, când sedimentul este foarte fin iar filtrarea dureazã prea mult, sepoate aplica filtrarea sub vid în pâlnie Hirsch sau în filtru ceramic. In situaţiilecând conţinutul de substanţe grase sau coloizi îngreuneazã filtrarea, se foloseşteapa fierbinte pentru spãlarea filtrului 11 , iar în situaţiile când amestecul conţinesubstanţe amidonoase se foloseşte soluţie fierbinte de HCl 1-2%.2.1.3 Sedimentarea şi flotaţiaSepararea fragmentelor pe baza densitãţii acestora, se face utilizând tehnicasedimentului de concentrare. Aceasta constã în separarea fragmentelor prinsuspendarea amestecului într-un volum de solvent cu densitate mare (cloroform,clorura de metilen, tetracloretan). Pentru separarea sedimentului, proba estesuspendatã în solvent într-o pâlnie de separare. Dupã omogenizare fragmenteleuşoare (cu densitate mai micã) vor flota iar fragmentele mai grele vor rãmâne însediment. Prin îndepãrtarea solventului cu elementele flotante va ramânesedimentul concentrat care va examinat sistematic pentru identificareacomponentelor sale. Partea flotantã este examinatã dupã îndepãrtarea solventuluiprin uscare. În general componentele pãrţii flotante sunt reprezentate de structuricu densitate micã : ţesuturi vegetale, fire de pãr, ţesut muscular deshidratat,fragmente de elitre ale unor insecte, etc. Separareafragmentelor pe baza dimensiunii se poate face atâtdin proba ca atare sau din fracţiile de lasedimentarea cu solvent. Aceastã separare seefectueazã cu ajutorul sitelor standard cudimensiuni diferite ale ochiurilor. Numerotareasitelor poate fi fãcutã dupã standardul ISO saustandardul USA. În Anexa 3 sunt prezentate11 In funcţie de metoda utilizatã se pot folosi şi solvenţi organici care dizolvã grãsimile şi uşureazã filtrarea.- 16 -

deschiderile nominale ale sitelor standard corespunzãtoare celor 2 standarde denumerotare 12 .2.2 Examinarea microscopica 13Dupã obţinerea fracţiilor prin diverse metode de separare, pentru completareaobservaţiilor, se va face apoi examinarea la stereomicroscop şi/sau la microscop.Pentru obţinerea unui preparat microscopic obiectul trebuie secţionat saufragmentat la dimensiuni de ~0.1-0.3 mm. Fragmentele astfel obţinute pot necesitaapoi un tratament chimic pentru clarificarea structurii.Fig. 11. Sigilarea lamelei peste preparatul microscopic.Agenţii de clarificare utilizaţi au proprietăţi diferite (vezi Anexa 2- reactivi),cei mai utilizaţi fiind cloralhidratul, glicerina sau parafina. Aceste substanţe au îngeneral densitate şi vâscozitate mare, ceea ce face ca porii şi canaliculele sã nupoata fi penetrate prin capilaritate, devenind astfel mai vizibile (rãmân umplute cuaer şi apar negre) fapt care ajutã la identificare. Pentru clarificarea texturilor maidure (ex. cu celuloza, lignina) este necesar un tratament prin hidrolizã acidã iar încazul substraturilor proteice, un tratament prin hidrolizã bazicã. Dupã clarificare seexecutã preparatul între lamă şi lamelă şi care poate fi apoi examinat la microscop.12 Vezi pagina 37.13 Aplicatia nu se refera la examenul histologic cu preparat obtinut la microtom- 17 -

Pentru fixarea 14 lamelei atunci când se efectueazã examinarea repetatã, se poateprepara un amestec 15 de ulei de parafina cu parafină solidã (1 :1) se încãlzeşte la70 0 C pe baie de apã pânã la lichefiere şi apoi se aplicã pe marginile lamelei (vezifigura 11). Pe o lamă pot fi delimitate 2 câmpuri la care se pot aplica agenţi declarificare sau colorare diferiţi (de exemplu un câmp pentru reacţia cu iod, etc.) sauunul dintre cãmpuri va fi cu un preparat de referinţã.2.3 Reacţii chimice de confirmareÎn foarte multe situaţii este utilă colorarea preparatului (vezi Anexa 2 şimetodele de lucru). Colorarea 16 se face pentru deosebirea matricelor cu proprietăţidiferite, cum sunt grăsimile, cerurile, glucidele complexe, ţesuturi osoase. Pentrusãrurile minerale existã o serie de teste chimice ale cãror rezultate sunt reacţiivizibile sau coloraţii specifice ionilor care reacţioneazã. Rezultatul unui singur testchimic nu va putea fi considerat aplicabil decât în corelaţie cu alte teste şi cucaracterele microscopice observate. Pentru maximã acurateţe, un reactiv nu va fiaplicat unui grup de fragmente şi reacţiile vizibile sunt urmãrite substereomicroscop pentru observare imediatã. În acest scop, se pune pe o lamă desticlă o picatura de reactiv şi apoi sub stereomicroscop se împinge particula înpicãtura de reactiv (fig. 12) cu ajutorul unei spatule sau pense. Reacţia se noteazãşi se comparã cu un rezultat cunoscut.Fig. 12. Efectuarea reactiilor chimice pe lama de examinare14 Existã mai multe tipuri de montanţi disponibili comercial.15 Un alt amestec util este combinaţia de glicerina –gelatina.16 Sunt excluse aici coloratia vitala sau alte tipuri de colorare utilizate în histopatologie- 18 -

2.4 Numãrãtori efectuate la microscop (stereomicroscop)Numãrarea presupune trecerea sistematicã peste preparat. În microscopieacest lucru se realizeaza prin utilizarea lamelor care au câmpuri delimitate pentrunumãrare. Aceste câmpuri au forma de pãtrat (sau câmpuri dreptunghiulare) lacare se cunoaşte exact dimensiunea laturilor. Numãrarea începe de regulã de lacolţurile câmpului şi se face o trecere succesivã în zig-zag pentru evitareanumãrãrii repetate a aceleiaşi particule (fig. 13) :Fig. 13. Numãrarea prin trecerea succesivã prin fiecare câmp2.5 Mijloace de mãsurareMãsurarea structurilor, vizualizate la microscop sau la stereomicroscop, esteutilã atât pentru caracterizarea acestora, cât şipentru compararea cu preparate de referinţă. Pentrumãsurare existã oculare care au prevăzut unmicrometru de mãsurare a cãrui scalã gradatã estevizualizatã prin ocular. Pentru calibrarea acestormicrometre oculare se utilizeaza micrometrele de masă (sau de câmp). Un astfel demicrometru este construit sub forma unei plãcuţe metalice (pentrustereomicroscop) sau din sticlă transparentã (pentru microscopul cu luminã- 19 -

transmisã) pe care se gãseşte o scalã de 10 mm gradatã la 0.1 mm. Privind prinocularul cu micrometru se suprapune imaginea micrometrului peste cea amicrometrului de masã. Prin comparare se mãsoarã echivalenţa în gradaţii amicrometrului ocular (fig. 14). Dacã, spre exemplu, s-au numãrat 3 gradaţii de 0,1mm de pe micrometrul de masã corespunzătoare prin suprapunere la 1 gradaţie pemicrometrul ocular, rezultã cã pentru fiecare gradaţie de pe micrometrul ocularcorespund 0,3 mm în câmpul vizual.Fig. 14. Ajustarea micrometrului ocular cu micrometrul de masãPentru microscop, o modalitate simplã de calibrare a micrometrului oculareste utilizarea unei camere de numãrare, care poate fi gãsitã în majoritatealaboratoarelor medicale. Camerele de numãrare sunt prevãzute cu o reţea deprecizie, la care se cunosc exact dimensiunile orizontale ale ochiurilor reţelei ( dela 0,05 la 0,25 mm) şi adâncimea (de la0,1 la 1 mm) ceea ce asigurãposibilitatea de numãrare pe unitateade volum. Cele mai cunoscute camerede numãrare sunt hemocitometreleutilizate pentru numãrarea celulelorsanguine. Hemocitometrele sunt utilizate, în general, pentru mãsurarea şinumãrarea de particule cu dimensiuni mai mici de 50-100 m. In figura de mai jossunt prezentate reţelele de la trei modele de camere de numãrare utilizate pentru- 20 -

numãrarea şi mãsurarea celulelor, bacteriilor, granulelor de polen, sau a altorparticule de mici dimensiuni.Fig. 15. Aspectul şi dimensiunile reţelelor la diferite tipuri de hemocitometreOcularele de microscop specializate pot fi cu micrometru simplu sau cu reţea.Micrometrul ocular, la majoritatea modelelor, constã dintr-o scalã de 10 mmsubdivizatã în 8, 10 sau 100 diviziuni. Micrometrele specializate pentru mãsurareaparticulelor sau fibrelor pot avea marcaje ajutãtoare pentru mãsurãtoribidimensionale. In lipsa micrometrelor sepoate utiliza dimensiunea relativã a câmpuluivizual observat de utilizator, ţinând cont deputerea de mãrire a obiectivului ales. Cu unobiectiv de 10 x şi un ocular de 10 x ( total 100x) diametrul câmpului vizual este deaproximativ 1600 m (fig. 16). În cazul în care vom trece la un alt obiectiv sepoate face un calcul rapid : spre exemplu la un obiectiv de 40 x (400 x) se vacalcula 100/400 x 1600 = 400 m. În acest caz diametrul câmpului vizual va fi de~400 m.- 21 -

Fig. 16. Diametrul aproximativ al câmpului vizual la microscop.Mãsurarea poate fi efectuatã şi pe verticalã (în adâncime) pentru apreciereagrosimii sau înãlţimii structurii examinate. În acest caz trebuie însã ca partea ceamai înaltã şi partea cea mai joasã a preparatului sã poatã fi bine focalizate.Diferenţa de înãlţime se apreciazã pe baza gradaţiilor de pe viza fină ( ~ 3 m)(vezi fig. 16). Pentru mãsurarea exactã (realã) trebuie cunoscut şi indicele derefracţie al obiectului, folosind formula de mai jos :n 0d (real) = d’ (2)n iunde : d (real) = grosimea realã a obiectuluid’= diferenţa de focalizare (gradaţia de pe viza fină)n 0 = indicele de refracţie al obiectuluin i = indicele de refracţie al mediului dintre lama portobiect şi obiectiv (aer= 1)Fig. 16. Elementele de mãsurare pe orizontalã şi în adâncime (la două modele de microscop).- 22 -

În mod particular, structuri de mai mari dimensiuni pot fi mãsurate şi cuajutorul vernierelor gradate ( 0,01-0,02 mm) care sunt dispuse pe cele două axe alemesei port obiect (fig. 16). Pentru stabilirea reperului vizual în câmpul microscopictrebuie folosit un ocular cu scalã. Prin deplasarea reperului faţã de obiectulexaminat, se stabilesc puncte pe vernierele gradate ale mesei port-obiect, obţinândastfel valori de mãsurare.2.5.1 Mãsurarea microfotograficãÎn cazul microscoapelor la care se pot realiza imagini digitale ale preparatelor,existã posibilitatea efectuãrii de mãsurãtori cu ajutorul programelor dedicateacestui scop. Atunci când se utilizeazã imaginile digitale trebuie sã se ţinã cont deputerea de mãrire a ocularului şi respectiv a obiectivului dar mai ales de valoareade zoom optic sau digital utilizatã. De preferat este sã se utilizeze capturi deimagine direct, fără a utiliza capacitatea de mãrire a camerei. In figura 17 esteexemplificat modul de obţinere al imaginii digitale utilizate pentru mãsurare.Microscoapele la care se ataşeazã camere foto digitale sunt prevãzute cu un un altreilea tub ocular configurat pentru acest scop. Existã diverse programe pentrucaptura şi prelucrarea microfotografiilor. Pentru obţinerea imaginilor utile esteesenţialã stabilirea raportului contrast/luminozitate iar în cazul în care imaginiletrebuie sã fie color este necesar un obiectiv de tip apocromat (vezi tab. 1).Fig. 17. A –imagine corectã ; B -imagine la care s-a utilizat puterea de mãrire aobiectivului camerei de luat vederi.- 23 -

2.6. Etapele examinării simple la microscopPentru utilizarea mai facila a microscopului, sunt recomandaţi urmatorii pasi deexecuţie :1. ALEGEREA OCULARULUI ( 7 x 10 x 16 x )2. ALEGEREA OBIECTIVULUI ( se începe cu un obiectiv mic - obiectiv de 10 x )3. FIXAREA LAMEI CU PREPARAT PE MASA PORT-OBIECT4. FIXAREA CONDENSORULUI LA PUTERE MAXIMA5. SE DESCHIDE DIAFRAGMA DE CAMP LA ¾6. PRIVIND IN BINOCULAR SE APROPIE OBIECTIVUL CU VIZA GROSIERA7. IMAGINEA APARUTA SE CLARIFICA CU VIZA FINA8. SE DESCHIDE DIAFRAGMA DE CAMP LA 1/1 (COMPLET)9. SE REGLEAZA INTENSITATEA LUMINII DIN CONDENSOR (VERTICAL)10. SE SCHIMBĂ OBIECTIVELE PE RÂND LA 20 x, 40 x11. IMAGINEA SE CLARIFICĂ CU VIZA FINĂ- 24 -

GHID DE IDENTIFICARE MICROSCOPICĂ3.1 Identificarea seminţelor de buruieni şi plante toxice3.1.1. Cereale şi seminţe furajere întregiSeminţele de buruieni şi plante toxice constituie impuritãţi botanicecare pot constitui un risc pentru producţia şi sãnãtatea animalelor, atuncicând se gãsesc în dieta acestora. După standardele de stat 17 , impurităţile suntcatalogate ca şi corpuri strãine care sunt clasificate în corpuri inerte(pãmânt, praf, paie, pleavã, etc.) şi amestec de alte seminţe de culturã şiseminţe de diferite buruieni, etc. Corpurile strãine se determinã cantitativ,trecând proba printr-un sistem de cel puţin 4 site cu ochiurile de 3.0-2.0-1.0-0,5 mm în diametru, cantitãţile obtinute prin sitare se cântãresc şi seexprimã procentual, ca total corpuri strãine şi separat pe tipuri şi mărimi.Proba luatã în analizã depinde de mãrimea seminţelor (grãunţelor):pentru cele mari (porumb, mazãre, soia, etc.), proba va fi de 100-200 g,pentru cele mijlocii (orz, ovãz, secarã, etc.) de 50 g, iar pentru cele mici(mei, in, etc.) de 10-25 g. Pentru a determina semintele (grãuntele) atacatede dãunãtori, se asazã proba pe o coala de hârtie, examinând integritatea lor(cu ochiul liber sau cu stereomicroscopul); cu aceastã ocazie se constatã si17 Vezi Anexa 5 –Standarde pentru seminte.- 25 -

prezenta insectelor (si fragmente ale acestora) sau a diferitelor larve inprobã.Cereale atacate de dãunãtoriIn general, se admit urmãtoarele proporţii de corpuri strãine (%), pe clase depuritate, în functie de tipul seminţelor :Clasa depuritateOvaz Orz Porumb SecaraCorpuri Alte Corpuri Alte Corpuri Alte Corp uri Alt einerte seminte inerte seminte inerte seminte inerte seminteI 1 2 2 2 1 2 12II 1-3 2—4 2—4 2-5 1—2 2-3 1-2 2—3III 3 4 Article I. 5 2 3 2 3Seminţele speciilor de plante toxice sau dãunãtoare nu sunt acceptate decât- 26 -

în limitele maxime indicate in Anexa DC 32/2002/EC. Semintele deburuieni se vor indica procentual, dupa felul lor (se indicã specia) ca siproportia de seminţe seci, sistave, sparte, etc., care aparţin culturii deprovenienţã a probei. Acestea din urmã au caracter limitativ ca impuritãţivegetale (organice).3.1.2. Uruieli si amestecuri mãcinateÎn general, uruielile au aceleasi însuşiri ca si grãunţele (seminţele) dincare provin, dar uneori survin cauze care le depreciazã, de exemplu, întimpul uruirii pot pãtrunde în ele corpuri strãine (praf, corpuri metalice,etc.), pot fi pãstrate in conditii necorespunzatoare, sau chiar pot fi falsificateprin adãugare de produse calitativ inferioare 18 . Corpurile strãine (%) indicăpuritatea probei. Corpurile metalice pot fi separate şi cu ajutorulelectromagnetilor. In general, suspendarea probei măcinate într-un solvent(cloroform, tetracloretan) cu densitate mare conduce la separarea sedimentuluiconcentrat constituit in principal din partea grea a probei care contine corpurilestraine minerale, metalice şi ţesuturile vegetale lignificate. Seminţele deburuieni, de plante toxice, sporii de mucegai (scleroti, etc.) se identificã prinexaminarea directã, la stereomicroscop, a probei asezatã pe un fond alb.18 Spre exemplu, adaosul de tarâte sau coji mãcinate.- 27 -

Domeniu de aplicareMod de lucru generalAceasta procedurã se poate utiliza acolo unde detectarea si identificareasemintelor, fragmentelor acestora si a altor componente vegetale din amestecurifurajere, se efectueaza prin examen macro/microscopic pe baza caracterelor tipice. Echipament si accesorii (Vezi Anexa 1). Reactivi (vezi Anexa 2).A. Pregătirea probeiEste necesarã, în prealabil, o foarte bunã omogenizare a probei. Se iau cel putin500 g de probã care se omogenizeazã cu ajutorul omogenizatorului-divizor.Din cantitatea omogenizată, o fractie de 5-10 g se întinde în strat subţire pe o foaiede hârtie si se examineazã cu ochiul liber (de preferinţã in lumină naturalã). Pentruo examinare mai atentă, se poate utiliza o lupã de birou. În cazul dispersiei decomponente foarte diferite (corpuri străine foarte mari) se efectuează sitarea probeipe site cu ochiuri cu Ø de la 3-0,1 mm. Fragmentele mari (vizibile cu ochiul liber),de forme sau culori diferite se selecteazã cu penseta pentru examinarea ulterioara lastereomicroscop 19 . Fracţiile de pe site se cântaresc (0.001g) si se noteazã alãturide numãrul sitei corespondente (diametrul ochiurilor) pentru a putea fi exprimate19 Aparatura este listata in Anexa 1.- 28 -

procentual. În lipsa omogenizatorului 20 , se iau 200 g proba care se întinde în stratuniform de cel mult 1 cm înãlţime, pe o coalã de hârtie albã. Proba seuniformizează cu ajutorul unei rigle sau spatule şi se formatează în formã de pãtrat.Cu ajutorul riglei se împarte în 16 pãtrăţele aproximativ egale. Se aleg 8 pãtrate în« sah » care se separã de restul grãmezii si se amestecã. Se repetã operaţiunea pânãla obţinerea unei probe de aproximativ 200 g.B. Examinare generalãProba omogenizatã se întinde în strat subţire 21 pe o tãviţã şi se examinează cuajutorul lupei. Seminţele identificate sunt apoi examinate la stereomicroscop undese noteazã dimensiunile, culoarea, forma şi aspectul capsulei. La foarte multespecii ornamentaţia capsulei permite identificarea. Este utilã secţionarea seminţeilongitudinală/transversalã cu ajutorul unui bisturiu sau lame şi separarea stratuluialeuronic ataşat capsulei. Examinarea la microscop 22 a capsulei poate da indicaţiiasupra speciei in funcţie de forma şi dispunerea celulelor în straturi. Pentrufragmentele de seminţe, o micã porţiune de probã (sau fracţia de pe sită) seamestecă cu puţină apã şi se examinează la stereomicroscop in lumină normală.20 Sau in prezenta corpurilor straine mari.21 Stratul nu trebuie sa fie mai gros decât inaltimea a trei seminte suprapuse.- 29 -

Aceasta examinare poate da informaţii generale despre compoziţia amestecului. Demulte ori se pot identifica astfel fragmente de ţesuturi vegetale, seminţe întregi maimici, fragmente lemnoase, etc. În cazul unor componente care necesităidentificare, se face la stereomicroscop caracterizarea generalã prin notareadimensiunilor, culorii, texturii şi a consistenţei. Este esenţială cunoaştereacaracterelor seminţelor plantelor de culturã pentru a putea face diferenţierea întreacestea şi seminţele nedorite.Teste chimice orientative 23Prezenţa seminţelor toxice se poate stabili şi prin probe de culoareorientative: o probã mãcinatã (sau uruialã) se introduce intr-un balonErlenmeyer, iar peste ea se introduce un amestec de 100 parti alcool etilic(70°) si 5 parti acid clorhidric; amestecul se fierbe, se agitã si se lasa apoi înrepaus pentru sedimentare ; culoarea lichidului se va modifica dupa felulsemintelor de plante toxice continute; dacã proba nu contine seminte toxice,lichidul de deasupra este incolor sau slab gãlbui, dacã contine cornul secarii,lichidul are culoarea cãrnii, dacã conţine seminte de Agrostema githago, sau deLolium temulentum, lichidul de extracţie are culoarea oranj. Se mai poateefectua şi examenul de flotaţie cu cloroform, în care semintele se stratificãdiferit, dupã greutatea lor. Pentru aceasta, se introduce o cantitate de 2-5 gproba într-o eprubetã, se trateazã cu cloroform, se agitã eprubeta, apoi se lasãpentru sedimentare; neghina (Agrostema githago), fiind grea, cade la funduleprubetei sub formã de particule de culoare neagrã; cornul secãrii (Clavicepsspp.) rãmâne la suprafatã, tot sub formã de particule de culoare neagrã; alteseminte se situeaza la nivele diferite, avind culori diferite, astfel cã pot fiseparate si identificate.22 Cu coloratie sau pentru examen in lumina polarizata.23 Vezi Anexa 3.- 30 -

Pentru a determina nisipul, praful sau alte particule de origine mineralã, setrateazã proba, într-o eprubetã, cu solutie de clorura de zinc, apoi se agitã.Corpurile inerte vor cadea la fundul eprubetei, iar particulele organice rãmân lasuprafata ; dupa decantare se separã depozitul de nisip, se usuca, se cântãrestesi se exprimã procentual. Nisipul se mai poate determina astfel : se ia o.probade circa 20 g uruieli, se introduc într-un pahar înalt si îngust, se trateazã cu apã,pâna la înãltimea de 3/4 din pahar; se agita apoi continutul cu o baghetã desticlã si dupã decantare se îndepãrteazã cu atentie apa tulbure; se repetãoperatia de spãlare pânã se obtin ape limpezi, reziduul mineral se usuca, secântãreste si se exprimã procentual.În cazul particulelor de mici dimensiuni sau a celor rezultate din fragmentareaunei piese mai mari se fac preparate pe lama pentru examenul la microscop. Inacest caz dimensiunea particulelor trebuie sa fie ajustata la mai putin de 0.1-0.3mm. Examenul la microscopul compus se face în luminã normalã (filtru albastru)si cu dispozitivul de contrast. Textura observată (celule, formaţiuni structurale,etc.) se poate caracteriza suplimentar prin teste chimice efectuate pe preparat.Pentru identificarea amidonului, pe lama de examinare la microscop se aşează launa dintre margini (la nivelul îmbinării cu lamela) o picătură de soluţie de iod (5) sise examinează din nou preparatul. Granulele de amidon vor fi colorate in albastrualbastruinchis, celuloza din fragmente in galben iar proteinele in galben –maroniu.Identificarea amidonului, spre exemplu, intr-o probă mãcinatã de seminţe deoleaginoase 24 , indicã prezenţa altor seminţe. Toate detaliile observate sunt notate.În acelasi mod se face testul cu solutie de KOH (10) . Tratamentul alcalin producegelatinizarea granulelor de amidon, dizolvă proteinele şi saponifică grăsimile. Înacelaşi timp accentuează coloraţia roşietică produsă de taninul din ţesuturi şiclarifică preparatul. Dacă acest tratament nu este suficient pentru clarificareapreparatului, se utilizează tratamentul cu agent de clarificare I (3) pentru 2-3 ore sauo cantitate redusă de probă se amestecă cu agentul de clarificare II (4) se încãlzeşte24 Semintele de oleaginoase nu contin amidon.- 31 -

uşor pe lamã şi apoi se examineazã. Pentru separarea substanţelor celulozice, semacerează proba cu amestec de clorat de potasiu-acid azotic (11) şi se încălzeştetimp de 20-30’. Celuloza brută se deosebeşte de substanţele de infiltrare (lignina,suberina) prin adãugare de soluţie proaspãt preparată de iod (13) unei fracţii deprobă umezită in prealabil. Substratul celulozic se va colora în albastru iarsubstanţele de infiltrare in galben.Substantele grase, răşinile, uleiurile, cerurile din componenţa celulelorvegetale, vor fi colorate în roşu prin tratarea probei cu soluţie de Sudan IV (14) si 2-3 picături de soluţie de cloral-hidrat (4) urmată de o uşoară încălzire. Un testsuplimentar constă in tratarea separată a probei cu eter de petrol şi cu alcool etilic.Eterul dizolvă grasimile, cerurile sau răşinile. Alcoolul dizolva, de regula, uleiurileesentiale si rasinile dar are efect redus asupra grasimilor si cerurilor. Pentruevidentierea taninurilor sau a tesuturilor impregnate cu tanin, se efectueaza testulcu acetat de fier (12) sau clorura ferica (12) . In ambele cazuri culorile dezvoltate suntverde sau albastru.Examenul în fluorescenţăPentru examenul în fluorescenţă se utilizează stereomicroscopul şimicroscopul compus. Tehnica de iluminare a preparatului poartă numele de epifluorescenţăşi se rezumă la observarea culorii fluorescente după excitareapreparatului cu o lumină ultravioletă incidentă. Utilizarea tehnicii de examinare influorescenţă poate fi foarte utilă pentru stabilirea originii ţesuturilor examinate sauidentificarea tipurilor de seminţe. Foarte multe structuri ale ţesuturilor vegetale, înspecial cele de depozitare, prezintă fenomenul de autofluorescentă la tratamentulcu reactiv Schiff 25 . Este foarte importantă alegerea corecta a colorantilor utilizatitinând cont de structurile care vor fi evidentiate. Astfel, pentru colorareaproteinelor sunt utilizate safranina, eozina, fucsina acida, acridin orange,acriflavina, pentru colorarea lipidelor se utilizeaza Rosu si Albastrul de Nil, Sudan,25 Col. PAS -Vezi anexa cu reactivi.- 32 -

verde luminos, iar pentru colorarea amidonului Rosu de Congo, acidul periodic,solutia Lugol, etc. Culorile obtinute la colorarea acestor structuri trebuie sa fie binecunoscute pentru a putea face caracterizarea corectă a preparatului.Porumb- sectiune endosperm colorata PAS-Verde luminos (CL 26 , 200 x)Detalii -structura endospermului (in stanga) are colorate granulele de amidon (fuchsia) intr-omatrice proteica (verde inchis) in timp ce embrionul (dreapta) contine majoritatea lipidelormiezului si foarte putine proteine26 CL= examen in câmp luminos- 33 -

Ovãz - secţiune endosperm colorată Roşu de Congo (FL 27 , 200 x)Detalii -se remarcă autofluorescenţa compuşilor fenolici în stratul aleuronic (dreapta-albastru) sicoloraţia roşie a endospermului datorată ß-glucanilor (stânga)Ovãz - secţiune endosperm colorata acriflavina-HCl (FL, 200 x)Detalii -acidul fitic care se găseşte predominant în stratul aleuronic generează coloraţia roşieportocalie(stânga)27 FL =examen in fluorescenta- 34 -

Orz - secţiune endosperm colorată PAS-albastru Evans (CL, 400 x)Detalii -granulele de amidon din endosperm sunt colorate în roşu-închis iar pereţii celulari suntcoloraţi în albastru- 35 -

Caractere morfologice identificabileÎn cazul seminţelor întregi, nedecorticate, este esenţială comparareacaracterelor morfologice generale. Aceste caractere sunt: dimensiunea (lungime,latime, diametru), forma seminţei, aspectul şi tipul ornamentatiilor 28 de pesuprafaţa cuticulei. După stabilirea atentă a acestor caractere se poate facecompararea cu mostre sau imagini ale preparatelor de comparaţie 29 .Dacă se lucrează cu fragmente de seminţe trebuie stabilit gradual dacă estevorba de un ţesut vegetal 30 şi nu de un artefact, apoi se face şi examinarea lamicroscop. Pentru examinarea la microscop este utilă examinarea în luminapolarizată sau, ca alternativă, efectuarea unei coloraţii. Cele mai multe informaţiisunt obţinute de la fragmentele de cuticulă, respectiv din epidermă, mezocarp şistratul aleuronic. Distribuţia şi forma celulelor care constituie aceste straturi oferă28 La unele specii datorita ornamentatiilor caracteristice identificarea poate fi facuta direct.29 Ghid de identificare a semintelor de buruieni (CD-R).30 Vezi si testele chimice- 36 -

mai multe informaţii decât examinarea structurilor, de cele mai multe ori amorfe,ale endospermului sau cotiledonului.Structura seminţei la monocotiledonate - în dreapta imagine la microscop aendospermului şi a embrionului (200 x , CL, PAS - Verde luminos)- 37 -

Bob de orez– aspectul în secţiune transversală şi detaliu al endospermului şistratului epidermic (col. PAS)Bob de grâu – aspectul in secţiune transversală şi detaliu al endospermului şistratului epidermic (col. PAS)- 39 -

Bob de ovãz – aspectul în secţiune transversală şi detaliu al endospermului şistratului epidermic (col. PAS)- 40 -

Examen în lumină polarizată (100 x)-cuticula (familia Euphorbiaceae)Stânga –Ricinus communis dreapta – Jatropha curcasExamen în lumină polarizată (200 x)-cuticulă (şi strat aleuronic)Stânga –Crotalaria spp. dreapta – Camelina sativaExamen in lumina polarizata (100 x)-cuticula (fam. Brassicaceae)- 41 -

Stânga –Brassica juncea dreapta – Brassica nigraExamen microscopic -cuticula si strat aleuronicStânga –lolium temulentum (200 x) dreapta – Lolium remotum (100 x)Examen in lumina polarizata (400 x)-Claviceps purpurea(Periteciu cu asce)- 42 -

Speciile de buruieni si plante toxice (impuritati botanice) din Anexa DC2002/32/EC 11. Ricinul (Ricinus communis L.)Ricinul este o plantă originara din India şi face parte din familia Euphorbiaceae.Are o mare variabilitate de areal si aspect, astfel cã poate fi gãsit sub formã dearbore, de 10-12 m înãltime în zonetropicale sau de 3-5 m în ţărilemediteraneene, în timp ce în zonelenordice, unde este cultivat mai mult caplantã de ornament, are aspect de arbust.Fructele sunt trilobate, cu suprafatatepoasã, de culoare verde sau rosie. Infiecare lob se dezvolta o samânta mare cusuprafata cu aspect marmorat. Ricinul1 Directive 2002/32/EC of the European Parliament and of the Council of 7 May 2002 on undesirable substances inanimal feed (E.C.O.J. n° L 140 of 30/5/2002,- 43 -

este cultivat si in scop comercial pentru uleiul nevolatil (90% acid ricinoleic)extras prin extractie cu solventi din seminte sau prin presare.Producţia de seminţe de ricin în scopuri industriale (1,05 Mt) estepreponderentă înIndia şi China şimai puţinimportantă inBrazilia. Uleiul 2 dericin este folosit defoarte mult timp capurgativ dar are si multe alte utilizări comerciale, cum sunt fabricarea maselorplastice, textile, vopsele sau cosmetice. Ricinul are toxicitate ridicata din cauzacontinutului în ricin, o glicoproteină hidrosolubilă foarte concentrată inendospermul semintelor 3 dar prezenta in cantitati mai mici si in celelalte portiuniale plantei. Este considerat unul dintre cele mai puternice toxice naturale 4 . Există omare variabilitate în privinţa sensibilitătii la toxină.2 Uleiul ca atare nu este foarte toxic, semintele macinate intregi contin toxina.3 Insotita de un alcaloid (ricinina).4 Actioneaza prin inactivarea ribozomilor .- 44 -

Cabalinele prezintă cea mai mare sensibilitate, cudoza letală (p.o 5 ) de 0.1 g/kg mc, apoi celelaltespecii de fermă cu doza letalã de 1-2 g/kg mc(p.o) cu exceptia caprinelor la care aceastã dozãajunge la 5,5 g/kg mc. Toate animalele de fermãsi cele de companie, sunt vulnerabile. Seminţelesunt toxice numai dacă învelişul extern (cuticula)este îndepărtată. Seminţele înghiţite intacte trec prin tubul digestiv, în general, fărăincidente. Simptomele pot apare chiar şi după 18-24 ore de la ingerare. Acesteadebutează cu stare depresivă, uşoară hipertermie, după care predominã tulburãrilegastrointestinale, voma, diaree profuzã, colica abdominalã. Animalele afectatemanifestă apoi convulsii, colaps circulator si apoi moartea la aproximativ 36 ore dela consum. Mecanismele principale sunt iritatia gastrointestinala, anafilaxia şisocul.2. Purghera (Jatropha curcas L.)Jatropha curcas este o plantă din familiaEuphorbiaceae, ca şi ricinul, cunoscutăpentru potentialul toxic. Este originaradin America centrala dar este cultivata pescara larga in tarile tropicale. Creşte subformă de arbust sau arbore de 5-6 mînaltime. Fructele uscate complet se desfacin trei valvule dintre care cel putin douacontin câte o singura samanta alungita, deculoare neagra. Planta, inclusiv semintele,este utilizata pe scara larga pentru diferite5 Administrare orala (per os)- 45 -

scopuri casnice si in medicina traditionala. Utilizarea comerciala a uleiului prezintaun interes mai scazut, desi proprietatile sunt similare celui de palmier. Semintelecontin ca principiu activ, curcina, care este o glicoproteina similara ricinului si areun mod de actiune asemanator. La omsimptomatologia consecutiva ingerarii seminteloreste asemanatoare celei asociate iritatieigastrointestinale. Debutul este brusc cu dureriabdominale puternice, senzatii de arsura la circa30 minute dupa ingerare, urmate de diaree(uneori hemoragica) si deshidratare accentuata. In unele cazuri apar si tulburaricardiovasculare si ale sistemului nervos central. Se considerã cã 2 seminte pot aveaun puternic efect purgativ in timp ce 4-5 seminte pot produce moartea subiectului.Intoxicatiile produse la animale sunt cunoscute în practica veterinara in zoneleunde creste planta. Studiile efectuate asupra toxicitatii orale ale J. curcas au aratatca exista diferente de sensibilitate între speciile de rumegatoare. Vacile care auprimit 0.25-1 g/kg furaj au murit in interval de 19 ore de la administrare, in timp cecaprele care au primit aceeasi doza au murit in intreval de 7-21 zile. Nu a foststabilita o relatie directa cu capacitatea citotoxica in aceste cazuri sau posibilitateade metabolizare a substantei active, continuta de seminte, in metaboliti mai multsau mai putin toxici. Furajarea pasarilor cu seminte fierte de J. curcas produceîntârziere in crestere, pierdere in greutate, modificari metabolice (crestereanivelului de creatinina serica) si mortalitate proportionala cu cresterea procentuluide seminte în dietã.3. Croton (Croton tiglium)Este o planta din familia Euphorbiaceae, cu un areal larg, din India pânã în NouaGuinee, nordul Indoneziei si China. Poate fi gasita sub forma de arbust sau arborede peste 12 m. Fructele au forma triangulatã (trilobata) si contin 3 seminte. Estemai putin toxica decât genurile descrise mai sus.- 46 -

Substanta toxica majoritara din compozitie este reprezentata de crotin 6 cu un modde actiune asemanator cu cel al ricinului. Simptomatologia este determinata deactiunea iritanta gastrointestinala si purgativa. Uleiul de croton este produscomercial în cantitãti reduse, în special in India, sursa principala de semintecomercializate fiind regasita în nordul Indiei.Planta are si unele proprietati terapeutice folosite în medicina traditionala. InEuropa poate fi gãsita ca plantã ornamentalã.6 Nume generic pentru un grup de glicoproteine cu toxicitate variabila.- 47 -

4. Crotalaria spp 7 . (Crotalaria spectabilis, Crotalaria giant)Denumita şi buruiana „plesnitoare” 8 , este oplantă anuală, perenã, de 1,5-2 m, cu fructeasemănătoare cu mazãrea, cu multe seminţecare, atunci când sunt uscate, produc zgomotulde unde şi denumirea plantei. La începutulsecolului trecut, mai multe specii 9 deCrotalaria au fost duse din Africa în SUApentru a fi utilizate pentru controlul eroziuniisolului, ca îngrasamânt vegetal, ca sursa deazot, etc 10 .Aceasta activitate a fost discontinuă dar în acest mod plantele au fost diseminate peteritoriul tãrii, iar semintele care patrund in culturile de cereale pot produceintoxicatii animalelor de ferma.Dintre acestea, cel mai puternic afectate sunt pãsãrile. Crotalaria spp. nu creste inEuropa decât ca rezultat al cultivarii. Posibilitatea de a contamina soia (respectivfãina de soia) importata din SUA in Europa este motivul includerii acestui gen inanexa Directivei.7 Laur porcesc (pop.)8 In engleza rattlebox sau rattleweed (rattle=sunãtor, zanganit)9 De fapt peste 600 de specii dintre care au fost identificate 6-7 specii cu potential toxic pentru animale.10 In India sunt folosite in medicina traditionala pentru tratarea scabiei- 48 -

Dintre speciile existente, Crotalaria giant striata si Crotalaria spectabilis au unpotential toxic mai ridicat. Plantele si semintele sunt toxice in egalã mãsurã princontinutul de monocrotalinã 11 , un alcaloid hepatotoxic prezent în întreaga plantã.Consumul de C. spectabilis de catre gãinile ouãtoare duce la scaderea rapida aouatului si cresterea mortalitatiiClinic, intoxicaţia se manifestă prin mişcări dezordonate şi dezorientare. Laexamenul necropsic se constată rupturi hepatice (sau hemoragii de suprafaţă înstadiile incipiente), hemoragie internă şi acumulare de lichid în cavitateaabdominală 12 . In cazul hrănirii experimentale cu seminţe măcinate s-au putut11 Este alcaloidul (pirozilidinic) majoritar alaturi de fulvina si crispatina12 In unele cazuri apare ciroza hepatica.- 49 -

observa efecte adverse la un conţinut de 0.01-0.1 % în dietã, în timp ce la uncontinut de 0.3 % apare mortalitate. Procente in dietă mai mici de 0.05 % reducsever ouatul şi procentul de eclozionare.5. Camelina sativa (L.) Crantz (in fals, lubit)Camelina este o plantă din familia Brassicaceae, cultivata in Europa încã din epocabronzului pentru uleiul extras din seminte si ca sursa de fibra vegetala. A fostcultivata pe scara larga dar productia comerciala a fost înlocuitã cu introducereauleiului de rapita. Uleiul are proprietati asemanatoare cu ale uleiului de in 13 si areun continut mai scazut de glucozinolat 14 decât speciile de Brassica. Acest din urmaaspect favorizeaza chiar utilizarea semintelor (faina) in hrana animalelor 15 . Nu estefoarte clar motivul pentru care aceasta planta, tinând cont de cele de mai sus, a fostinclusa in anexa Directivei. Unul din motive ar putea fi faptul că atunci când inul(Linum usitatissimum) era cultivat pe scară largă in Europa, această plantă era oburuiana comună atât în culturile de in cât si in cele de cereale. In consecintă,Camelina sativa a fost considerată nedorită in amestecurile de cereale si probabilacesta este unul dintre motivele includerii in anexă.13 Contine acid linolenic 30-40%, acid eicosenic 15% si acid erucic

6. Semintele de mustar 16Familia de plante cunoscute sub numele generic de „mustar” cuprinde mai multespecii si subspecii 17 ale acestora. In aceasta grupa sunt incluse rapita 18 (canola) simustarul dar acestea sunt denumiri comerciale si nu stiintifice. Familia„mustarului” este de fapt Brassicaceae 19 (Cruciferae) si este una dintre cele maibogate, cu peste 40 de genuri si peste 200 de specii salbatice si cultivate.Taxonomia speciilor listate in anexa a fost revizuitã, astfel cã în prezent, nu existãdistinctie între diversele subspecii de Brassica juncea. In consecinta, subspeciiledenumite „Indian”, „brun”, „chinezesc” sunt considerate simple varietati deBrassica juncea iar mustarul „sareptian” apare ca un termen a cãrui existentã estelegatã doar de contextul directivei.6.1. Brassica juncea (L.) –(mustar indian, chinezesc sau brun)16 In directiva : „mustard seeds”17 Unele dintre acestea sunt considerate varietati in cadrul speciei.18 Brassica rapa.( sin. B. campestris) si Brassica napus19 Genul reprezentativ este Brassica spp.(spre exemplu mustarul salbatic Sinapis arvensis face parte din aceeasifamilie)- 51 -

Este o plantă perenã de 1-1,5 m provenită din incrucisarea Brassica nigra cuBrassica rapa. Locul de origine este considerat sud-vestul Indiei si Asia undedistributia naturala a celor doua specii s-a suprapus. Inainte de 1940 B. juncea afost considerata inferioara B. nigra pentru obtinerea mustarului dar din 1940 a fostimportata din China o noua varietate 20 de B. juncea care a devenit larg cultivata 21 .Continutul de substante toxice este reprezentat, ca importantă, de sinigrina (2-propenil-glucozinolat) care după hidroliza enzimatică (mirozinaza) se transformăîn alil-izotiocianat 22 . Sinigrina se regãseste în întreaga plantã cu variaţii de continutin timpul diferitelor faze de vegetatie si culminând cu acumularea in seminte petimpul formării si maturării acestora.Conţinutul mediu de alil-izotiocianat din B. juncea este de 0,9 % (0,25-1.4 %). Inurma hidrolizei enzimatice rezultã şi alti compuşi volatili (metil, butil, benzil) dar20 Cu seminte galbene21 Spre deosebire de B. nigra, aceasta putea fi recoltata mecanizat.22 Lichid volatil cunoscut ca “ulei de mustar”- 52 -

în concentratii foarte mici. Alil-izotiocianatul este foarte iritant si are efectrubefiant si vezicant asupra tesuturilor. In experientele pe celule ovariene (liniecelulara de hamster chinezesc) s-a demonstrat un efect citotoxic de 1000 de ori maimare 23 decât glucozinolatul. Izotiocianatii produc hipotiroidism 24 la animalele deexperienta iar sinigrina induce aberatii cromozomiale in vitro. In exeperientele defurajare, efectuate pe oi, cu concentratii de 10 mmol/ zi, administrate in furajegranulate la discretie, s-a constatat reducerea consumului dietei si crestereanivelului de -glutamil-transpeptidazã, ceea ce indicã leziuni hepatice.6.2. Brassica nigra (mustar negru)Este o plantã cu crestere rapida, atingând dimensiuni de pânã la 4 m care produceseminte de culoare brun închis pânã la negru (~1 mm ). Originea speciei nu estecunoscutã exact dar se presupune cã provine dintr-un nucleu mediteranean. Estelarg rãspânditã în sudul si centrul Europei si este o buruianã frecventã atât înculturi cât si în locuri virane. O treime din masa semintelor de mustar negru esteconstituitã din ulei al cãrui continut mediu de acid erucic este de 40%.Ca si celelalte specii, contine sinigrinã si implicit alil-izotiocianat ca principiitoxice. In afara sinigrinei contine si o proteina termostabila cu rol de factorantitriptic.23 Are activitate citotoxica semnificativa la mai putin de 1 g/ mL24 Gusa endemica sau hipotiroidismul se manifesta prin hipertrofia tiroidei.- 53 -

6.3. Brassica carinata (mustar etiopian)Este un hibrid natural rezultat din B. nigra si B. oleracea 25 , originarã din Etiopiaunde este cunoscutã ca sursa verde si pentru uleiul obtinut din seminte. Este oplantã foarte rezistenta la seceta si temperaturi înalte. Ca si celelate specii descriseanterior, semintele au un continut important de glucozinolat. Planta a reprezentat laun moment dat o sursa de ulei de uz nealimentar, în Europa si Canada. Uleiul dinsemintele de B. carinata are un continut ridicat (~50 %) de acid erucic.7. Madhuca 26 (Madhuca longifolia (L.) Machr.)Madhuca longifolia este un arbore cu coroana largã si foarte densã, cultivat în zonecu clima caldã pentru uleiul continut de semintele sale. Din punct de vederetaxonomic, nu se mai face distinctie, conformanexei din directiva, între Madhuca longifoliasi Madhuca indica, astfel cã, acum, acesteasunt considerate sinonime. Uleiul din seminte,care este un ingredient uzual în grasimilehidrogenate utilizate în India, contine acid oleic(46.3 %) si acid linoleic (17.9 %) ca si acizigrasi nesaturati alãturi de acid palmitic (17.8%) si acid stearic (14.0 %) dintre cei saturati.Semintele degresate contin 29.4 % proteina si9.8 % saponine 27 . La acest nivel deconcentratie, saponinele sunt componenta toxicã actionând iritant asupra mucoaseidigestive si prin hemolizã. Detoxifierea prin tratament termic reduce foarte multdigestibilitatea, nefiind o metodã practicã. In schimb, prin macinare si extractie cusolventi (2-propanol) se reduce foarte mult concentratia de saponine iar fãina astfel25 B. oleracea – exista 3 varietati : varza, conopida si gulia.26 Alte denumiri : Mahua, mowrah, bassia.27 Termenul este derivat de la Saponaria officinalis plantã utilizata din vechime pentru calitãtile sale de sãpun.Saponinele sunt glicozizi care se gãsesc în multe alte plante (Agrostema githago, Helleborus niger, Aesculushippocastanum, Asparagus officinalis, etc.)- 54 -

ezultatã constituie o valoroasã sursã proteicã 28 . Includearea turtelor neprocesate înproportie de 20 % 29 în hrana vacilor lactante nu afecteazã consumul hranei,digestibilitatea, productia de lapte, compozitia acestuia.Fãina de seminte neprocesate este de asemenea bine toleratã de cãtre vacilelactante. Nu existã suficiente date despre furajarea cu seminte netratate sau fãinaacestora, a altor specii de fermã în afara rumegãtoarelor. In orice caz, prezentasaponinelor toxice este nedoritã si ca atare si prezenta semintelor de Madhucalongifolia nu trebuie sa depãseasca nivelele de tolerantã ale rumegãtoarelor.8. Prunus armeniaca (cais, zarzãr) si Prunus dulcis var. Amara (migdal) 3028 Pentru alimente si furaje.29 Din total substanta uscata30 Inclusiv Prunus virginiana- 55 -

Familia Rosaceae include multi copaci fructiferi inclusiv caisul si migdalul, la acãror sâmburi face referire anexa. Plantele din aceasta familie contin în frunze,seminte si radacini, glicozide cianogenice, dintre care, amigdalina 31 este cel maifrecvent si mai important din punct devedere cantitativ. Amigdalina are otoxicitate proprie destul de redusã. Aceastase manifestã numai când sâmburii fructelorsunt zdrobiti pentru ca sã fie posibilãactivitatea enzimelor care hidrolizeazaamigdalina. In prima fazã a hidrolizei, careeste efectuatã de o ß-glicozidazã specificã,rezultã prunasina 32 iar apoi prinintermediul altei ß-glicozidaze specificã prunasinei, rezultã mandelonitril siglucozã. Mandelonitrilul (aglicon) este mai apoi metabolizat cu o liazã specificã la4-hidroxi-benzaldehidã si HCN 33 . Nu s-a putut încã stabili un nivel sigur pentrucantitatea de glicozide cianogenice 34 ingeratã, în mare parte datoritã lipsei deinformatii toxicologice, cu exceptia HCN pentru care existã mai multe studiiefectuate si informatii. In principal, HCN conduce la scãderea nivelului deutilizare a oxigenului tisular, provocând anoxia histotoxicã 35 . Toate mamiferelesunt sensibile la intoxicatia cu HCN, doza minimã letalã fiind de ~ 2 mg/kg mc 36 .In general rumegatoarele sunt mai sensibile decât monogastricele.31 D-mandelonitril- gentobiozid (agliconul este mandelonitrilul)32 D-mandelonitril-D-glucozid33 Migdalele pot contine peste 250 mg HCN/100 g seminte.34 Aceste substante (inclusiv acidul cianhidric) se gasesc de altfel si in multe nutreturi care compun obisnuit dietaanimalelor de ferma (anumite furaje verzi, leguminoase, sorg, etc.). In acest sens, in anexa este mentionat un nivelpermis de concentratie pentru HCN in anumite materii prime si nutreturile combinate.35 Anoxia rezultã din inactivarea citocromoxidazei de cãtre HCN, care se combinã cu Fe 3+ /Fe 2+ din enzimã.36 Unitate de masã corporalã.- 56 -

Subprodusele industriale de la preparareafructelor uscate, conservate, producerea degemuri, erau utilizate pentru adaus în hranaanimalelor. Crescãtorii, nutritionistii siproducãtorii de nutreturi combinate cunoscriscurile utilizãrii de astfel de subprodusela care, s-a renuntat în prezent.9. Fagus silvatica 37 – (ghindã si jir) 38In aceastã categorie sunt incluse fructele si semintele arborilor de pãdure cum suntfagul (Fagus silvatica) sau stejarul (Quercus robur) utilizate pentru hranatraditionalã a porcilor. Aceste produse erau folosite prin administrare în ratie saupãsunare directã, în sistem de crestere traditional, pentru porcii la îngrasat, pentrupãsãri sau cãprioare.Resturile rãmase dupã extragerea uleiului din ghindã erau utilizate pentrufabricarea de turte pentru furajarea animalelor. Semne de intoxicatie au fostraportate atunci când s-au utilizat turte cu un continut ridicat de coji, administratela discretie.37 In anexa directivei apare doar Fagus silvatica dar pentru ca se mentioneaza ghinda si jirul împreunã, am facutreferire si la Quercus robur (stejar).38 In anexa sunt mentionate fructele întregi (nedecorticate)- 57 -

Cauza realã a intoxicatiilor nu este cunoscutã dar se presupune a fi datoratãprezentei saponinelor. In mod special, caii sunt mai sensibili, dar majoritateacazurilor semnalate au implicat rumegãtoare. In amestecurile furajere se verificãexistenta fructelor nedecorticate.10. Lolium temulentum L. (raigras, zâzanie)Intoxicatia cu aceasta specie este cunoscutã la animale 39 încã din secolul XIX princontaminarea fãinii. Extractele de seminte administrate experimental pe cale oralãsi intraperitonealã la soareci produc sindrom de depresie gradualã a sistemuluinervos central, cu comã si moarte prin sincopã respiratorie. Semintele de Loliumtemulentum contin lolina 40 (alcaloid pirolizidinic), 6-metil lolina si lolinina 41 .39 Se cunosc cazuri si la om40 In 1985 a fost identificata temulina care s-a dovedit mai târziu un artefact de izolare.41 Studiile de toxicitate individualã asupra alcaloizilor au demonstrat o slabã toxicitate iar efectele asupra SNC seobtin prin efect cumulat al mai multor alcaloizi.- 58 -

Partea aerianã a plantei contine lolina si un alcaloid cu nucleu fenantrenic,perlolina. Originea alcaloizilor a fost un timp necunoscutã dar acum se stie cãlolina (alcaloid insecticid) este invariabil produsã în simbiozã 42 cu fungi din genulNeotyphodium. Astfel, a fost demonstrat cã Neotyphodium uncinatum produce, înmediu minimal si în absenta plantei, lolina, N-acetil-norlolina si N-formil-lolina sicã acesti alcaloizi nu sunt sintetizati ca rãspuns al plantei la infestare 43 .11. Lolium remotum SchrenkIntroducerea acestei specii în anexa se datoreazã unui sindrom de pãsunat,predominant neurologic, care apare în sudul si vestul Australiei. Acesta debuteazãca urmare a consumului de cantitãti mari de seminte cu gale 44 de L. remotuminfestat cu un nematod (Anquina agrostis) si o specie de bacterie Clavibactertoxicus 45 . Amestecul de toxine cuprinde 8 glicolipide a cãror actiune se manifestãsi exeprimental, la miei, cu simptome clinice si leziuni ale creierului. Dozele maimici, care nu produc intoxicatia, au efect asupra productiei oilor, în special asupradezvoltãrii lânii. L. remotum în absenta semintelor infestate nu prezintã pericolpentru animale iar relevanta in Europa a sindromuluiaustralian este nedemonstratã.12. Datura stramonium (ciumãfaie)Aceastã specie este cunoscutã de foarte mult timp pentruproprietãtile sale toxice 46 , 47 . Principalele substante activedin compozitia plantei sunt alcaloizi tropanici: atropina,hiosciamina si scopolamina 48 . Continutul maxim dealcaloizi se regãseste în tulpinã si frunzele plantei(majoritar hiosciamina) si mai putin în seminte. Actiunea42 Valabil pentru genurile Lolium spp. si Festuca spp.43 Un exemplu similar este cazul Festuca spp. in cazul infestãrii cu Acremonium coenophialum44 Noduli infestanti formati pe suprafata semintelor45 Initial a fost descrisã ca o tulpina de Corynebacterium.46 Una dintre denumirile traditionale americane face referire la moartea unor soldati britanici in sec XVIIintoxicati cu D. stramonium.47 Si datorita proprietatilor halucinogene (sunt mentionate si cazuri de delir datorate consumului de miere toxicãprovenitã din specii de Rhododendron, Datura stramonium şi Hyoscyamus niger )48 Se gasesc si în Atropa belladonna si Hyoscyamus niger.- 59 -

toxicã este datoratã antagonismului competitiv cu acetilcolina la nivelulreceptorilor muscarinici centrali si periferici. Receptorii periferali sunt la nivelulglandelor exocrine, muschilor netezi si cardiac. In urma intoxicatiei se producparalizii iar consecutiv efectului asupra sistemului nervos central (ca aminetertiare) rezultã sindromul anticolinergic central, manifestat cu psihozã acutã sidelir. Aceste substante se absorb rapid prin mucoasa gastricã si intestinalã. Timpulde înjumãtãtire al atropinei este de ~ 4 ore, prin metabolizarea hepaticã (hidrolizã)se reduce jumãtate din cantitatea initialã iar restul este eliminat nemodificat prinurinã. Intoxicatia prin pãsunare directã este mai rar întâlnitã la animale pentru cãdin cauza gustului neplãcut, rareori animalele consumã suficient material vegetalca sã producã intoxicatia. La rumegãtoare mari se manifestã prin excitabilitatenervoasã, tremor si dezorientare. La rumegãtoarele mici (oaie si capra) pe lângãsimptomele de la rumegãtoarele mari, se mai constatã instabilitatea trenuluiposterior si cãderi bruste.Cele mai multe cazuri de intoxicatie se produc prin administrarea de fân sau altefuraje cultivate pentru masa verde, care contin D. stramonium.- 60 -

Ocazional a fost detectatã ca si contaminant în soia 49 din recolte provenite dinAmerica de Sud.13. Claviceps purpurea (ergot 50 , cornul secarei)Genul Claviceps 51 cuprinde specii de fungi foarte specializati care paraziteazãpartea floralã a unor pãioase. Pe timpul parazitãrii, ovarul 52 florii este înlocuit cu ostructurã fungalã numita sfacelã din care în timp se dezvoltã sclerotul 53 . In timpuldezvoltãrii acestuia, sporii, denumiti conidii, sunt amestecati cu un lichid desecretie siropos, cu continut ridicat de zaharuri, asemanator cu mierea, care atrageinsectele si poate realiza în acest fel diseminarea sporilor. Majoritatea speciilor deClaviceps paraziteazã specific o specie de plantã cu exceptia C. purpurea care sepoate dezvolta pe mai mult de 200 specii de plante. Sclerotii multor specii deClaviceps contin alcaloizi toxici pentru om si animale. Unele substante suntutilizate si in scop farmaceutic 54 (ergotamina, ergometrina) datoritã efectelorexercitate asupra vaselor sanguine, asupra musculaturii netede, etc. Este largrãspândit în lume, în special în zonele temperate unde sclerotii se pot dezvolta maibine 55 . Impactul economic asupra culturilor este de mai micã importantã. Dintretoate speciile cel mai bine cunoscut este C. purpurea cu denumirea comunã de49 Se mai poate întâlni Datura ferox L. care are acelasi continut toxic.50 Ergot este un termen general utilizat pentru toate speciile de Claviceps.51 Claviceps purpurea, Claviceps africana, Claviceps sorghi, etc.52 Ovarul se afla situat la partea inferioara a pistilului (pistilul are doua componente :stigmatul si ovarul)53 Sclerotul este un tesut fungic dur si compact (dimensiunile sale sunt de câteva ori mai mari decât samântagazdã (dimensiunea sclerotului este diferentiata in functie de dimensiunile semintelor)..54 Inaintea obtinerii de culturi pure in scopuri industriale, ergotul a fost cultivat pe secarã (Secale cereale)55 Sclerotii nu se dezvoltã bine in zone cu clima foarte caldã (nu germineaza).- 61 -

ergot (cornul secarei). Limita toleratã în culturile de cereale variazã de la 0.3 %pentru secarã, la 0.1 % în grâu sau ovãz. Concentratii mai mari influenteazãcalitatea recoltelor. Sclerotii de C. purpurea au aspect alungit, drept sau curbat, de1-4 ori dimensiunea semintei gazdã, cilindrici pe sectiune si cu capete rotunjite.Culoarea tipicã la exterior este neagrã, cu variatii de la rosu-închis la negru. Ininteriorul sclerotului culoarea peretilor este de la alb la gri cu aspect rugos. Pesuprafatã se pot observa conidii uscate de culoare gri deschis. Conidiile sunt ovale,hialine si au dimensiuni de 4-6 x 2-3 m.- 62 -

- 63 -

- 64 -

14. Seminte de buruieni, fructe nemãcinate si nedecorticateAceastã categorie, care poate cuprinde multe specii de plante, este inclusã în anexadirectivei si oferã o anumitã flexibilitate în cuprinsul listei impuritãtilor botanice,dar este deschisã unor interpretãri. Asa cum am mentionat anterior, spre exemplu,în cazul saponinelor 56 sau acidului cianhidric 57 , chiar unele ingrediente obisnuiteale nutreturilor contin astfel de substante iar în altã ordine de idei, toate plantelevasculare contin „glicozide”. In consecintã, în aceastã categorie generalã se potinclude buruieni si plante toxice care sunt specifice florei locale 58 . In acest scop,trebuie întocmitã o listã de plante care se pot regãsi în mod obisnuit printre furajeleverzi si semintele de culturã si care pot constitui un factor toxic sau un factorlimitativ pentru sãnãtatea si nutritia animalelor. Aceastã listã trebuie sã fie ladispozitia fiecãrui laborator oficial care executã analiza botanicã sau decelareaimpuritãtilor botanice microscopic identificabile. La punctele 1-13 sunt descrise oserie de specii, cu continut toxic, specii dintre care unele exotice. Pe plan localexistã însã si unele buruieni, unele nocive, altele nedorite (necomestibile) caimpuritãti în culturi sau furaje verzi si care vor fi incluse la acest punct.Plantele necomestibile sunt cele cu tulpini lignificate, cu diametru de peste 5mm, aspre, cu ghimpi, cu ariste, etc., cum sunt: Xanthium spinosum, Cyrsium56 Vezi si pct. 7 –Madhuca longifolia si notele de subsol57 Vezi si pct. 8 –Prunus armeniaca si notele de subsol58 In afara impuritatilor listate in anexa directivei exista si alte plante (intregi sau seminte ale acestora) specificetarii, care sunt considerate nedorite in standardele de calitate interne.- 65 -

arvense, Sonchus oleraceus, Rumex sp., Salvia sp., Lepidium sp., Equisetum sp.,ca si cele care provoacã leziuni sau ulceratii, cum sunt Bromus tectorum, Setariaverticillata, Holcus lanatus, Stipa pennata, Stipa capillata, etc.Aceste genuri si specii trebuie identificate si cuantificate ca plante întregisau portiuni ale acestora în furajele verzi sau uscate. Ocazional, se pot gãsi sisemintele acestora în cereale 59 . Unele plante influenteazã negativ calitateaproductiei animalelor, prin modificarea gustului si mirosului normal, cum suntArthemisia absinthium, Matricaria chamomilla, Alliaria officinallis, Lepidiumdraba, pentru lapte sau Allium ursinum pentru carne.Plantele nocive contin substante toxice (alcaloizi, toxalbumine, etc.) care potprovoca uneori chiar moartea animalelor. Unele dintre acestea contin substantaactivã în tulpini, frunze si flori, cum sunt Veratrum album si V. nigrum, Daturastramonium, Hyosciamus niger, Solanum nigrum, Xanthium strumarium, Cicutavirosa, Colchycum autumnale, Euphorbia sp., etc. iar altele au fructe si seminteotrãvitoare, cum sunt Lolium themulentum, Papaver rhoeas, Agrostemma githago,Delphinium consolida, etc.59 De regulã sunt specii care se gãsesc în fânete si nu în culturile de cereale.- 66 -

ANEXA 1.1TESTE SUPLIMENTARE PENTRU TESUTURI VEGETALETest Reactie vizibila Rezultat posibil ObservatiiAgent de clarificare I şi II Prin incalzire uşoara este clarificată Diferenţiere tesut(3,4)structura matriceivegetal/ososParafina (ulei) (16) Prin flotaţie porii răman umpluţi cu aer Structuri reticulare cu spaţiimari, secţiuni medulare, etc.Este util pentru retelesau canale capilareTestul cu iod/iodura (5) 1. coloraţia matricei albastru –violet Amidon2. coloraţia matricei galbenă Celuloza3. coloraţie galben-portocaliu/maron Proteine Natura proteinelor nuHidroliza cu clorat/acidazotic (11) şi testul cu iod (13)1. Coloraţie albastră2. Coloraţie galbenăCelulozaTestul cu floroglucinol (20) Coloraţie rosie LigninaHidroliza cu KOH (10)Substanţe de infiltrare –lignina, suberină1. Gelatinizarea substructurilor Granulele de amidon suntgelatinizatese poate precizaFavorizeazăexaminarea altorstructuri2. Preparatul se clarifică şi capatăcoloraţie rosieticăTaninuri din substratTestul cu actat sau clorura Coloraţie verde / albastră Taninuri din substratferica (12)Coloratie cu Sudan IV (14) Coloraţie rosie Substante grase, raşini,ceruri, uleiuri- 67 -

3.2 ŢESUTURI ANIMALE şi MINERALE DIN FURAJEDomeniu de aplicareAcest ghid se va utiliza acolo unde este necesara identificarea şi diferenţiereacomponentelor minerale şi animale (fragmente de oase, cristale de sare, fosfaţi,carbonaţi, etc.) din amestecuri furajere, prin examen microscopic pe bazacaracterelor tipice sau testelor de confirmare.Echipament şi accesorii (Vezi Anexa 1) .Reactivi (vezi Anexa 2)A. Pregatirea probelorEste necesara o buna omogenizare a probei globale inainte de examinare. Secantăresc cca. 10 g (± 0.001 g) de furaj într-un pahar Berzelius de 100 ml şi secompleteaza la 1/3 cu CHCl (1) 3 . Se amesteca conţinutul cu o bagheta şi se lasă înrepaus 1 minut. Fracţia flotabila (care poate conţine fragmente de ţesuturi, fibremusculare, păr, pene, etc.) se separă cu o spatulă de pe suprafaţa lichidului intr-oplaca Petri ( Ø = 9 cm) şi se evapora solventul pe o baie de apa. In funcţie deaspectul probei se poate filtra şi apoi se concentreaza solventul. Dupa uscare sesiteaza reziduul pe site de dimensiuni adecvate dimensiunilor particulelor (0,4, 0,6,0,8, 1,0). Dupa separarea fracţiei flotabile, sedimentul concentrat (care continefragmente de oase, minerale sau fragmente vegetale lignificate) este reluat cuCHCl 3 şi trecut cantitativ pe o hartie de filtru uscata şi tarata în prealabil. Hartia defiltru cu reziduul se usucă la aer şi apoi la etuva la 103 ±2 0 C timp de ½ - 1 oră.Dupa acest interval se răceşte în exsicator şi se cantăreşte ((± 0.001 g). Prindiferenţa fată de tara hartiei goale se determina masa reziduului.B. ExaminareB.1. Particule organiceFracţiile individuale de pe site se examineaza la stereomicroscop (25 x -50 x)cu iluminare frontală sau laterală la unghi de cca. 45 0 cu filtru albastru. Suportul- 68 -

de examinare poate fi sticla mata sau hartie albastră. Se noteaza aspectulparticulelor, forma, culoarea, consistenta, rezistenta la presiune. Pentru compararese recomandă folosirea mostrelor de referinţa.Fragmentele mici din reziduul trecut prin site, se examinează şi la microscop(100 x -400 x) cu condensatorul reglat la putere mica şi cu filtru albastru. Pe lamade examinare, cu un strat foarte fin de reziduu se adauga 2 picaturi de agent declarificare (I) (3) şi se examineaza sistematic (vezi anexa 2.1). Se adaugă apoi pelama 1 picatura sol. iod (5) şi se reexaminează :- particulele de amidon sunt colorate în albastru-pal pana la negru,- drojdiile sau alte celule proteice sunt colorate pânã la maro inchis.Daca este necesar se poate incălzi o mica cantitate din reziduu cu cca. 5 ml agentde clarificare (II) (4) . Dupa răcire se pun 1-2 picaturi pe o lama microscopica, seacopera cu lamela şi se examinează la microscop.B.2. Particule mineraleDin preparatul obţinut la pct. A se colectează fracţia care sedimenteaza (careconţine particulele minerale), se indepartează solventul prin uscare şi se trecesedimentul uscat pe site de dimensiuni diferite (pct. A).Se face examinarea la stereomicroscop (50 x). In general oasele de animale,peşte, solzi de peşte şi fragmente de cochilii sunt identificabile. Formaţiunileanorganice (minerale) pot fi recunoscute pe baza formelor acestora.. De exemplu,cristalele de sare sunt de regula cubice şi pot fi colorate, calcitul (CaCO 3 ) areforma romboedrică, ( vezi anexa 2.2). Deoarece forma cristalelor nu esteintotdeauna identificabilă (stare amorfa) se efectuează şi teste chimice derecunoastere.C. Teste de confirmare 60Particulele de origine necunoscută (neidentificabile vizual) se aşeaza cu opensetă pe o placa Petri şi se sparg cu atenţie prin presarea usoară pe o suprafaţăplanã. Lucrând sub stereomicroscop, se separă fragmentele la 1-2 cm distanţa intre60 în funcţie de natura particulelor pot fi efectuate teste adiţionale de recunoaştere- 69 -

ele. Lânga fiecare fragment se aşează o picătură de reactiv iar apoi se împinge cupenseta fragmentul în mijlocul picăturii, urmărind modificările (vezi anexa ) careau loc la contactul cu reactivul. De preferinţa, sub placa se aşeaza o foaie deculoare neagra pentru o mai buna vizibilitate. Lumina este preferabil sã fie naturalăsau se utilizează filtrul albastru, în cazul iluminării laterale. Testul preliminartrebuie efectuat cu AgNO (6) 3 care poate indica prezenţa clorurilor şi a fosfaţilor şiface diferenţa de structurile osoase. Este preferabil ca testele cu soluţii de acizi sãfie efectuate ca variantă suplimentară.D. Calcul şi evaluareIn cazul în care estimarea cantitativă este necesară se va proceda conform acestuipunct. Estimarea cantitativă se poate face global (% de oase şi minerale) sau pegrupe de componente ( ex. % de particule minerale sau % de particule osoase) :R x 100(a) Reziduu de …………. ( %) =Munde : R = masa fracţiei (g) de reziduu din sedimentul concentratM = masa probei (g)- 70 -

expansiuneANEXA 2.1TESTE DE CONFIRMARE PENTRU MINERALE 22. Particulele nu se dizolva (dar se dizolva în Oxalat de calciuTest HCl) Reactie vizibila Rezultat posibil ObservatiiTestul cu1. Particule Cristalele rezistente devin albe la acţiunea şi au reactivilor tendinţa de probabil Cărbune sare sau (clorura) cochiliiKOH/KClO 3(10,11)2. Cristalele capată culoarea galbenă şi aparexcrescenţe aciculare galbenecalcinatefosfat dicalcicTestul cu AgNO 3 (6) 4. Particulele devin incet negre fragmente de oase3. Se formează ace de culoare albă, solubile sulfaţi de Mn sau Mg1. Efervescenţa puternică CaCO 3Testul cu HCl (2) 2. Lipsa efervescenţei sau de mica intensitate se efectueaza testeleTestul cu molibdat(7)1. Formare de cristale galbene la mica distanţade particulãurmătoarefosfat tricalcic, orice os sauroca fosfaticã 61Testul Millon (8) 4. Particulele se dizolva incet rocă fosfatică1. Particulele dezintegrate flotează şi devin deculoare roz-rosietica2. Particulele dezintegrate flotează şi devin deculoare roz-rosietică şi se decolorează în cca. 5min.3. Particulele se umflă dar ramân în parteainferioarăproteinefosfaţi din osrocă fosfatica defluorinatăTestul cu H 2 SO 4 (9)1. Se formeaza cristale aciculare, lungi laadăugare de acid sulfuric la soluţia acidă(HCl) a particuleiprezenţa calciului.Testul cu 1. Particulele se dizolva cu efervescenţa CaCO 3CH COOH (17)61 ( toti fosfaţii reactionează dar fosfaţii mono- şi dicalcici se evidenţiază cu AgNO 3 )- 71 -

ANEXA 2.2MODELE CRISTALINECaCO 3 (Calcit)CaCO 3 (Aragonit)NaClOxalat de calciuFosfat monocalcicFosfat tricalcicMgSO 4 CaSO 4- 72 -

3.3 ŢESUTURI ANIMALE DIN FURAJEDomeniu de aplicareAceastă metodă se va utiliza acolo unde detectarea constituenţilor de origineanimală (definiţi ca produse de la procesarea carcaselor sau părţilor acestora, de lamamifere, pasãri sau peşti) din furaje, se efectueaza prin examen microscopic.Constituenţii de origine animală sunt identificaţi pe baza caracterelor microscopicetipice ( ex. fibre musculare, părţi de oase sau cartilaje, fire de păr, sânge, coaja deou, oase de peşte ,etc.). In cazul în care se cere şi o apreciere cantitativă a acestorconstituenţi, se vor urma instrucţiunile de la subcapitolul Calcul al acestui material.SensibilitateIn funcţie de natura constituenţilor (< 0.1 %)Echipament şi accesorii (Vezi Anexa 1) .Reactivi (vezi Anexa 2)A. Pregătirea probeiEste necesară o foarte bună omogenizare a probei globale. Aglomerarile saugranulele se mojarează usor sau se mărunţesc în moară cu cuţit la turaţie mică(1500-2000 r.p.m.) timp de ~10 sec. In funcţie de natura materialului ( numai dacăeste necesar se mărunţeste) se iau cel putin 10 g de probă care se impart în douăfracţii, una de cel puţin 5 g pentru partea filtrată (pe site) şi una de cel putin 5 gpentru sedimentul concentrat. Colorarea şi clarificarea cu reactivi esterecomandată pentru identificare (vezi anexa 3.1)B. Examinare: Identificarea constituenţilor de natură animală în filtratO cantitate de min. 5-10 g din probă este trecuta prin site ( 0,1-2 mm) în cel puţindouă fracţii. Fracţia cu dimensiuni >0.5 mm (sau o parte reprezentativa din fracţie)se intinde în strat subţire pe un suport adecvat şi se cauta componenţii de origine- 73 -

animală la stereomicroscop cu diferite puteri de mãrire (cel mult 50 x). In stratul(-urile) cu

S x c(b) Fragmente de oase % =(animale terestre)WS x d(c) Fragmente de oase şi solzi % =(peşte)W(S =masa sedimentului [mg], c 62 = factor de corecţie [%] pentruestimarea procentului de oase animale în sediment, d= factor decorectie [%] pentru estimarea procentului de oase de peşte şi solzi însediment, W=masa probei prelucrata pentru sedimentare {mg).Estimarea valorii pentru constituenţi de origine animalăProporţia de oase în produsele animale este variabilă. In cazul făinii de oaseprocentul este de 50-60% iar în cazul făinii de carne de 20-30%; la făina de peşteprocentul de oase şi solzi este variabil în funcţie de specie, în general de 10-20%.Daca se cunoaste specia de la care provine produsul, se poate calcula conţinutulestimat:Conţinut estimat de constituenţi de la animale terestre (%)S x c(i)= x 100W x fConţinut estimat de constituenţi de peşte (%)S x d= x 100- 75 -

(ii)W x f(S =masa sedimentului [mg], c 63 = factor de corecţie [%] pentruestimarea procentului de oase animale în sediment, d 64 = factor decorecţie [%] pentru estimarea procentului de oase de peşte şi solzi însediment, f = factorul de corecţie pentru proporţia de oase dinconstituenţii de origine animală din probă, W=masa probei prelucratăpentru sedimentare [mg]).Exprimarea rezultatelor :Pot exista urmatoarele situaţii :La capacitatea de identificare la microscop, nu există constituenţi de origineanimală (asa cum sunt definiţi la pct. în proba analizatăLa capacitatea de identificare la microscop, există constituenţi de origine animalăîn proba analizată. In acest caz , raportul examinarii poate fi specificat astfel:In funcţie de experienţa analistului :-Exista constituenţi de origine animală. Continuţul de fragmente de oase(peşte/animale terestre)-In cazul fragmentelor de oase de la animale terestre, eventual specificat de lapasãri sau mamifere, este estimat un ordin de mãrire de ….%, egal cu ….%constituenţi animali când se calculeaza în baza a ….% oase în constituenţi animaliutilizând factorul de corecţie f,-sau, au fost gasiţi constituenţi de origine animală în cantitaţi măsurabile.Pentru situaţiile când oasele animalelor terestre au fost identificate, raportul trebuiesa conţină date suplimentare, astfel :-Posibilitatea ca următorii constituenţi sã fie derivaţi de la mamifere, nu poate fiexclusă;Aceasta clauza nu este necesară daca fragmentele de oase de la animale terestre aufost identificate ca aparţinând pasãri lor sau mamiferelor.63 Factor de corecţie estimat de către analist în sediment64 Factor de corecţie estimat de către analist în sediment- 76 -

RecomandăriSe recomandă ca, în cazul constituenţilor voluminoşi şi în cantitate mare,sedimentul obţinut la filtrare sã fie împărţit în doua fracţii (de exemplu utilizareaunei site cu ochiuri de 250 m [ 0.3]). Fracţiunea cu constituenţi voluminoşi poatefi examinată ca preparat cu ulei de parafină iar fracţiunea cu particule fine trebuieexaminată la microscop.Sedimentul concentrat, dacă este necesar, poate fi divizat mai departe utilizând unagent de concentrare cu densitate mai mare sau poate fi examinat prin spălarisuccesive cu apă şi cloroform (sau clorură de metilen).În funcţie de experienta analistului, identificarea originii poate fi fãcutã utilizândun preparat specific histologic, prin care se face compararea cu preparatul probei.ANEXA 3.1TESTE SUPLIMENTARE PENTRU TESUTURI ANIMALE 65Test Reactie vizibila Rezultat posibil ObservatiiAgent de clarificare I şi Prin incalzire usoară este Diferenţiere ţesutII (3,4) clarificata structura matricei vegetal/ososParafina (ulei) (16)Prin flotaţie porii raman umpluţicu aerStructura osoasaTestul Bradford (15) Reactiv specific pentru proteine –coloraţie albastrăStructuri proteice (ţesutmuscular/osos)Testul cu iod/iodura (5)1. coloraţia matricei albastru –violetAmidon2. coloraţia matricei galbenă Celuloza3. coloraţie galbenportocaliu/maronProteineTestul Millon (8) Coloraţie roz la incălzire usoară Componente osoaseTestul pt. cistina (18)Coloraţie neagra/maronie laincălzire usoarăConstituenţi cu cistina –păr, fanere65 A se compara şi cu Anexele 1.1 , 2.1, şi 2.2 pe timpul lucrului- 77 -

ANEXA 1APARATURA SI MATERIALE PENTRU MICROSCOPIEStereomicroscop cu iluminare ( 15-20 W) laterala/frontală şi transmisă cu filtre pentruvizualizare –albastru (pentru culoarea naturală), verde (pentru fluorescenţă), alb mat(antireflexie). Oculare necesare : 10 x (cu rigla de măsurare), 16 x, 32 x. Obiectivestereo: 1 x şi 1,6 x.Microscop compus, binocular inclinat , lumina transmisă (30-100 W), condensorreglabil, dispozitiv contrast. Oculare necesare : 7 x, 10 x. Obiective apocromatice : 6 x,10 x, 20 x, 40 x şi pentru imersie 90-100 x.Balanţa analitică ( 0,001 g)Site circulare inoxidabile cu diametrul ochiurilor de la 5 mm – 0,1 mm şi vas de captare.Moara electrică de laborator cu cuţit ( turaţie utila de la 1000 la 5000 rpm)Mojar cu pistil pentru omogenizarea probelor cu solvenţiPlaci Petri de Ø = 90-150 mmLame de sticla standard pentru microscopie şi lamelePlaci de plastic transparent (55 x 100 mm) pe care se traseaza cu un vârf ascuţit liniiparalele (4,5 mm) la distanţa de 2 mm.Spatula şi microspatulePensete –dreapta şi curba cu vârfuri ascuţite şi plate, bisturiu sau cutterMicropipete ( volum util 5-200 L)Pipete cu volum util de 1, 5, 10 mLCentrifuga de laborator ( 6 x 10 mL) 1000-7000 rpmLampa UV -365 nm (15-30 W)Lampa de examinare (150 W mat).Sticlărie de laborator : eprubete, pahare Berzelius ( 100, 300, 800 mL), pahareEhrlenmeyer (100, 300 mL cu slif şi dop), pâlnii de separare (100-500 mL), pâlnii defiltrare.Hârtie de filtru (porozitate medie şi mica) Watman nr. 40-42.78

ANEXA 2REACTIVI 66 PENTRU MICROSCOPIE1) CHCl 67 3 p.a.2) HCl diluat (1:1) : 1 parte HCl + 1 parte apă3) Agent de clarificare (I) : amestec de 10 g cloralhidrat/ 10 ml apa/ 10 ml glicerina4) Agent de clarificare (II) : amestec de 160 g cloralhidrat în 100 ml apa + 10 ml HCl5) Iod solutie: 0,75 g KI + 0,1 g I 2 în 30 ml apă la care se adaugă 0,5 ml HCl (1:1)6) AgNO 3 soluţie 10 % în apă7) Molibdat de amoniu soluţie : 10 g molibdat + 100 ml HNO 3 se completează la 1000 ml.8) Reactiv Millon (conţine azotat mercuric)9) H 2 SO 4 diluat (1:1) : 1 parte H 2 SO 4 + 1 parte apa10) KOH soluţie 5 %11) KClO 3 : se amestecă 0,5 g KClO 3 cu HNO 3 (diluat 1:1)12) Fe(CH 3 COO) 3 sau FeCl 3 soluţie 1 % în apă (se prepară extempore)13) Iod soluţie : ZnCl 2 100 g se amestecă cu 60 ml apă în flacon cu dop la care se adaugă 20 gKI şi 0.5 g I 2 . Se adaugă cateva cristale de I 2 în amestec pentru saturare şi se lasă în repaus14) Sudan IV soluţie alcoolică aprox . 0.09 %15) Reactiv Bradford (utilizat pentru detectarea proteinelor)16) Parafina (ulei)17) CH 3 COOH diluat (1:1) : 1 parte CH 3 COOH + 1 parte apa18) Reactiv pentru cistină ( 2 g acetat de plumb + 10 g NaOH se dizolva în 100 ml apa)19) Rodamina 6G soluţie alcoolică 0,5 %20) Floroglucinol soluţie : se amestecă 8 g floroglucinol cu 20 ml HCl concentrat şi secompleteazã la 100 ml cu alcool etilic.21) Medii utilizate pentru obiectivele de imersie (recomandate glicerina şi uleiul de cedru)Mediu lichid n d AperturaGlicerina 1.47158 1.35Ulei de cedru 1.51525 1.40Anisol 1.5163 1.40Monobrom-naftalena 1.65820 1.6066 In funcţie de natura componentelor identificate se pot folosi şi alţi reactivi care pot servi la identificarea matricei.67 Se poate utiliza şi tetracloretan (d= 1,62)- 79 -

ANEXA 3STANDARDISOSTANDARD USADESCHIDERENOMINALAØ (inch)12.5 mm a 68 ½ in. a 0.500 2.6711.2 mm7 / 16 in 0.438 2.458.5 mm3 / 8 in 0.375 2.278.0 mm3 / 16 in 0.312 2.07DIAMETRU NOMINALAL FIRELOR SITEIØ (mm)6.7 mm 0.265 in. 0.265 1.876.3 mm ¼ in. a 0.250 1.825.6 mm Nr 3½ 0.223 1.684.75 mm Nr 4 0.187 1.544.00 mm Nr 5 0.157 1.373.35 mm Nr 6 0.132 1.232.80 mm Nr 7 0.111 1.102.38 mm Nr 8 0.0937 1.002.00 mm Nr 10 0.0787 0.9001.70 mm Nr 12 0.0661 0.8101.40 mm Nr 14 0.0555 0.7251.18 mm Nr 16 0.0469 0.6501.00 mm Nr 18 0.0394 0.580850 m Nr 20 0.0331 0.510710 m Nr 25 0.0278 0.450600 m Nr 30 0.0234 0.390500 m Nr 35 0.0197 0.340425 m Nr 40 0.0165 0.290355m Nr 45 0.0139 0.247300 m Nr 50 0.0117 0.215250 m Nr 60 0.0098 0.180212 m Nr 70 0.0083 0.152180 m Nr 80 0.0070 0.131150 m Nr 100 0.0059 0.110125 m Nr 120 0.0049 0.091106 m Nr 140 0.0041 0.07690 m Nr 170 0.0035 0.06475 m Nr 200 0.0029 0.05363 m Nr 230 0.0025 0.04453 m Nr 270 0.0021 0.03768 Aceste dimensiuni nu sunt standardizate dar sunt incluse pentru cã sunt utilizate frecvent- 80 -

BIBLIOGRAFIE1. *** Council Directive 1999/29/EC of 22 April 1999 on the undesirablesubstances and products in animal nutrition (E.C.O.J. n° L 115 of 04/05/1999,)2. *** Directive 2002/32/EC of the European Parliament and of the Council of 7May 2002 on undesirable substances in animal feed (E.C.O.J. n° L 140 of30/5/2002, p. 10).3. Abdel-Fattah, M., Rizk, A.M. and Hussiney H.A. 1991. Chemistry and toxicityof Lolium species. In: Poisonous Plant Contamination of Edible Plants (eds. RizkA.F.M. and Hussiney H.A.), pp. 95-106. CRC Press Inc, Baton Rouge, USA.4. Adeyemi, O.A., Balogun, M.O. and Fasina, 2001. Response of finishingbroilers to graded levels of boiled Jatropha seeds , Ind. J. Anim. Sci. 71, 800-803.5. Ahmed, O.M.M. and Adam, S.E.I. 1979. Effects of Jatropha curcas on calves.Vet. Pathol. 16, 476-482.6. Astwood E.B., Greer, M.A, Ettlinger, M.G. (1949): J. Biol. Chem. 181, 121.7. Basu, A.K., Ghosh, A. and Dutta, J. 1973. Fatty acid composition of mustard(Brassica nigra) seed oil by gas-liquid chromatography. J Chromatogr.86, 232-233.8. Berkov, S. and Philipov, S. 2002. Alkaloid production in diploid andautotetraploid plants of Datura stramonium. Pharm. Biol. 40, 617-621.9. Blankenship, J.D., Spiering, M.J., Wilkinson, H.H., Fannin, F.F., Bush, L.P.siSchardl, C.L., 2001. Production of loline alkaloids by the grass endophyte,Neotyphodium uncinatum, in defined media. Phytochem. 58, 395-401.10. Budin, J.T., Breene,W.M. and Putnam, D.H. 1995. Some compositionalproperties of camelina (Camelina sativa L. Crantz) seeds and oils. J. Am. OilChem. Soc. 72, 309-315.- 81 -

11. El Dirdiri N.I., Wasfi I.A., Adam S.E.I.. Toxicity of Datura stramonium tosheep and goats. Vet. Hum. Toxicol. 23, 242-246, (1981)12. Fenwick, G., Heaney, R. and Mullin, W. 1983. Glucosinolates and theirbreakdown products in food and food plants. CRC, Crit.Rev. Food Sci. Nutr. 18,123-201.13. Gao, Z.C., Jiang,Y.X., Li, J.F., Hou, S.S., Li, J. and Liu, X.M. 1989.Performance of growing-fattening pigs fed with glandless cottonseed meal.Chinese oeJ.Anim. Sci. 25 , 13-16.14. Rangkadilok, N., Nicolas, M.E., Bennett, R.N., Premier, R.R., Eagling, D.R.and Taylor, P.W.J. 2002. Developmental changes of sinigrin and glucoraphaninin three Brassica species (Brassica nigra, Brassica juncea and Brassica oleraceavar. italica). Scientia Horticulturae, 96, 11-26.15. Dini Luciana , Food microscopy/microstructure, Dipartimento di Scienze,Universita de Lecce, 2000.16. B. Herman and J. J. Lemasters (eds.), Optical Microscopy: Emerging Methodsand Applications. Academic Press, New York, 1993,- 82 -