Föreläsning 1
Föreläsning 1
Föreläsning 1
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Cellbiologi_VT13<br />
Olof Olsson<br />
Email: olof.olsson@tbiokem.lth.se<br />
Tel:
Målsättning med föreläsningen<br />
Ge en översiktsbild över hur den nuvarande cellen har<br />
utvecklats<br />
Vad är liv?<br />
Från molekyl till cell<br />
Från prokaryot till eukaryot<br />
Den endosymbiontiska teorin<br />
Hur vet vi allt de4a? Ge en översikt över olika<br />
metoder som utny4jas för a4 studera cellen
Liv - vad behövs för liv?<br />
• Replikation dvs förökning<br />
• Fortplantning?<br />
• Evolution?<br />
• Inneslutning av cellulära komponenter?
Vid vilken komplexnivå börjar själva livet?<br />
• En RNA molekyl?<br />
• En DNA molekyl?<br />
• Ett protein (ex prion)<br />
• En icke-innesluten självreplikerande DNA- (ex.<br />
transposon) eller RNA-molekyl (ex viroid)?<br />
• En ibland innesluten självreplikerande DNA eller<br />
RNA molekyl?<br />
Virus<br />
• En integrerad DNA molekyl som replikeras när<br />
värd-DNAt replikeras?<br />
Retrovirus, plasmider, transposoner<br />
• En replikerande enhet vad som helst?<br />
Ett datavirus
Viroid -<br />
Coconut<br />
Cadang Cadang<br />
Patogenen består av en 247<br />
nukleotider lång RNA molekyl.<br />
Den translateras inte (med<br />
undantag för ett protein)<br />
Ett liv?
Syntetiskt liv?
Design of life<br />
• Läs av hela sekvensen från en levande organism<br />
• Syntetisera små DNA bitar från nukleotider (dNTPs)<br />
inköpta på tex Sigma<br />
• Sätt ihop dessa i större och större enheter så att det<br />
ursprungliga genomet rekonstrueras<br />
• Lägg till lite extra sekvenser som tillför nya<br />
användbara egenskaper till det syntetiska genomet<br />
• Utgå från en lämplig cell som kan bära genomet och<br />
inaktivera (bryt ner) hela genomet i denna cell<br />
• Tillför det syntetiska genomet till den genomlösa<br />
celler<br />
• Hokus pokus, ”nytt” liv har formats
• We report the design, synthesis and assembly of the<br />
1.08- Mbp Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 genome<br />
starting from digitized genome sequence information<br />
and its transplantation into a Mycoplasma capricolum<br />
recipient cell to create new Mycoplasma mycoides<br />
cells that are controlled only by the synthetic<br />
chromosome.<br />
• The only DNA in the cells is the designed synthetic<br />
DNA sequence, including “watermark” sequences and<br />
other designed gene deletions and polymorphisms,<br />
and mutations acquired during the building process.<br />
The new cells have expected phenotypic properties<br />
and are capable of continuous self-replication.
”Watermark sequences”<br />
En speciell (hemlig) DNA kodtabell för hela det<br />
latinska alfabetet inkluderande punkter, komma<br />
etc konstruerades<br />
Följande ”syntetiska information” lades in i<br />
sekvensen<br />
En hälsning till den som gjorde koden<br />
Namnen på de 46 forskare som deltog i projektet<br />
Tre hemliga citat<br />
www adressen till den syntetiska organismens egen hemsida<br />
För att läsa detta behöver man knäcka koden
The assembly of a synthe/c M. mycoides<br />
genome in yeast. A synthe/c M. mycoides<br />
genome was assembled from 1,078<br />
overlapping DNA casseBes in three steps.<br />
In the first step, 1,080-‐bp casseBes<br />
(orange arrows), produced from<br />
overlapping synthe/c oligonucleo/des,<br />
were recombined in sets of 10 to produce<br />
one hundred nine ~10-‐kb assemblies<br />
(blue arrows). These were then<br />
recombined in sets of 10 to produce<br />
eleven ~100-‐kb assemblies (green<br />
arrows). In the final stage of assembly,<br />
these eleven fragments were recombined<br />
into the complete genome (red circle).<br />
With the excep/on of 2 constructs that<br />
were enzyma/cally pieced together in<br />
vitro (27) (white arrows), assemblies were<br />
carried out by in vivo homologous<br />
recombina/on in yeast. Major varia/ons<br />
from the natural genome are shown as<br />
yellow circles. These include 4<br />
watermarked regions (WM1-‐WM4), a 4-‐<br />
kb region that was inten/onally deleted<br />
(94D), and elements for growth in yeast<br />
and genome transplanta/on. In addi/on,<br />
there are 20 loca/ons with nucleo/de<br />
polymorphisms (asterisks). Coordinates of<br />
the genome are rela/ve to the first<br />
nucleo/de of the natural M. mycoides<br />
sequence. The designed sequence is<br />
1,077,947 bp. The loca/ons of the Asc I<br />
and BssH II restric/on sites are shown.<br />
CasseBes 1 and 800-‐810 were<br />
unnecessary and removed from the<br />
assembly strategy (11). CasseBe 2<br />
overlaps casseBe 1104 and casseBe 799<br />
overlaps casseBe 811.
Koden är naturligtvis knäckt!<br />
Watermark 2 contains a quote from James Joyce: "To<br />
live to err, to fall, to triumph, to recreate life out of life".<br />
Watermark 3 contains a quote from Robert<br />
Oppenheimer (uncredited): "See things not as they are,<br />
but as they might be".<br />
Watermark 4 contains a quote from Richard Feynman:<br />
"What I cannot build, I cannot understand".<br />
Läses i tripletter från en egen genetisk kod där de olika bokstäverna<br />
etc motsvaras av var och en av de möjliga 64 tripletterna
En levande,<br />
replikerande<br />
bakterie<br />
Syntetiskt DNA!<br />
Syntetiskt liv???<br />
Tänk att lagra alla<br />
familjebilderna i sin<br />
egen lilla bakterie!
Viktiga parametrar för<br />
”högre” (självsupporterande) liv<br />
• Energi<br />
Ur organismsynpunkt kan energi kan fångas från ljus<br />
och/eller energirika molekyler (oorganiska eller<br />
organiska)<br />
Energin måste kunna utnyttjas i det biologiska<br />
systemet, dvs frigöras och fångas i det biologiska<br />
systemet<br />
Kan ske mha katalytiska molekyler tex RNA och protein<br />
Måste kanaliseras till att både underhålla befintligt<br />
cellmassa och att bygga upp nya strukturer
Hur uppkom biologiskt liv?<br />
• Olika teorier finns<br />
Skapelseberä+elsen<br />
Intelligent Design (ID)<br />
Livet uppstod från enkla organiska molekyler, däre?er uppnås<br />
en ökad komplexitet (polymerer) genom evoluBon (ursoppa-‐<br />
teorin)<br />
Polymerer eller tom livet utvecklades utanför jorden???<br />
Kanske nådde livet jorden via inflöde från meteorer, kometer<br />
eller ”interstellular dust”<br />
Polycycliska aromatiska kolväten har hittats i en nebulosa<br />
Väl på jorden, utvecklades molekylerna vidare lite varstans<br />
eller på ytor i speciellt gynnsamma mikromiljöer?<br />
”Cold start” eller ”hot start”??
Hur uppkom biologiskt liv?<br />
• Olika teorier finns<br />
Skapelseberä+elsen<br />
Intelligent Design (ID)<br />
Utanför jorden och kom hit via meteorer, kometer och/<br />
eller ”interstellular dust”<br />
På jorden<br />
”Cold start” eller ”hot start”??<br />
EvoluBonsteorin
Variation<br />
Selektion<br />
Evolution<br />
Nedärvning till nästa generation<br />
• ”Det naturliga urvalet* leder<br />
till organismer med bättre<br />
konkurrenskraft, högre<br />
överlevnadsvärde och<br />
effektivare reproduktion<br />
*Darwin C (1859) On the<br />
Origin of Species by<br />
Means of Natural Selection<br />
(John Murray, London).
Intelligent Design (ID)<br />
• Livet är för komplext för att ha kunna uppstå och<br />
utvecklas på rent slumpmässiga grunder<br />
Vissa biologiska organ är oreducerbart komplexa och<br />
det är orimligt att de skulle kunna uppstå enbart<br />
genom mutationer och naturligt urval som<br />
evolutionsteorin bygger på<br />
• ID förespråkare tar ofta avstånd från kreationismen<br />
(dvs en bokstavlig tro på skapelseberättelsen) och<br />
menar därmed att deras argument vilar på en<br />
vetenskaplig grund<br />
Det är således inte Gud som är designern, men vem<br />
denne är specificeras inte
•<br />
”Evolutionsteorin är bara en teori”
Teori kontra hypotes<br />
• En teori är underbyggd med experimentella data<br />
• En bra teori byggs upp underlång tid där nya<br />
frågor som uppstår med nya data återigen testas<br />
experimentellt med kompletterande försök<br />
• Är teorin riktig bra kan man använda den till att<br />
förutse saker<br />
• En hypotes har däremot ingen experimentell<br />
grund<br />
men den utgör en utgångspunkt för att göra<br />
experiment som underbygger eller förkastar<br />
hypotesen
Human evolution<br />
• Selection has changed over the years!
Unanswered questions<br />
• Where on earth did life start?<br />
• Multiple starts?<br />
Different locations, different times<br />
Hot or cold start or both?
Psykrofiler Termofiler
Miller-Urey experimentet<br />
Enkla<br />
molekyler kan<br />
polymerseras<br />
till mer<br />
komplexa
Från enkla molekyler till polymerer<br />
• Millerexperimentet visade att enkla organiska molekyler kan<br />
bildas under förhållanden som skulle kunna ha rått under<br />
prebiotiska tider (ursoppan)<br />
Om man upphettar CO2, CH4, NH3, H2 med H2O och<br />
utsätter mixarna för elektriska urladdningar eller UV ljus bildas<br />
både karboxylsyror, aminosyror och urea.<br />
Polymerer kan teoretiskt bildas från sådana organiska molekyler<br />
Polypeptider (protiner), polynucleotider (nukleinsyror) och<br />
sockerpolymerer (stärkelse, ß-glukaner, cellulosa, etc)<br />
Dock bildades även höga koncentrationer av ämnen<br />
som inhiberar polymerbildning i Millers försök<br />
Det finns heller inga spår av kvävehaltiga organiska<br />
föreningar i sediment, som man borde förvänta sig
Replikation är en<br />
förutsättning för liv<br />
• Vissa polynucleotider är kapabla att mediera sin<br />
egen biosyntes<br />
Komplementär parning leder till en formation av<br />
exakta kopior av den ursprungliga sekvensen<br />
Självreplikerande molekyler genomgår naturlig<br />
selektion<br />
2D och 3D-strukturer påverkar stabilitet och<br />
interaktion med andra molekyler (4D)
Replikerande molekyler<br />
Förmåga att katalysera en<br />
reaktion som leder till att det<br />
bildas en exakt kopia av sig<br />
själva<br />
Inte perfekt, dvs enstaka fel i<br />
systemet som leder till att<br />
evolutionen drivs vidare<br />
Utveckling av nya 3D former<br />
av molekyler med nya<br />
katalyserande egenskaper<br />
Princip för självreplikering
RNA molekyler kan bilda ett<br />
otal olika strukturer via intern<br />
basparning
RNA har de egenskaper som<br />
behövs för att skapa variation<br />
• Kan veckas ihop till komplexa<br />
strukturer med intern<br />
basparning<br />
• Katalysiska RNA kan bildas<br />
Ribozymer<br />
• Primärstrukturen kan bära på<br />
genetisk information
”The RNA world”<br />
• Specialiserade RNA molekyler som kunde<br />
katalysera biokemiska reaktioner uppstod<br />
således<br />
Informationsflöde polynukleotider till polypeptider<br />
Diverse mikro RNA med reglerande funktioner<br />
Utan inneslutning blir det dock svårt<br />
att få fart på processerna
Inneslutning<br />
• Ökar sannolikheten att reaktiva molekyler träffar på<br />
varandra<br />
• Gör att den frigjorda energin bättre utnyttjas<br />
• Tillåter uppbyggnad av mer komplexa strukturer<br />
• Tillåter enzymatiska kedjereaktioner (pathways)<br />
Ger möjlighet till interaktion mellan diverse aktiva molekyler.<br />
Leder till snabbare och mer specifika reaktioner<br />
• Biokemiska produkter och strukturer kan<br />
ackumuleras. En cellspecialisering kan ske<br />
• Måste dock tillåta kommunikation med yttervärlden<br />
Membranproteiner, transportörer<br />
Membraner definierar den första cellen
Lipider formar spontana<br />
membraner i vatten<br />
Det är således rätt lätt att förstå<br />
hur inneslutning kunde utvecklas<br />
Figure 11-13 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010)
Vad hände med RNA i slutna cellsystem?<br />
• DNA ersatte (delvis) RNA som den genetiska<br />
polymeren<br />
Det finns tex fortfarande RNA virus (inneslutna i<br />
celler)<br />
• Protein som huvudsaklig katalysator<br />
Finns fortfarande ribozymer<br />
• RNA är fortfarande starkt involverat i proteinsyntesen<br />
tRNA, rRNA, mikro RNA har mycket viktiga<br />
uppbyggande och reglerande funktioner i<br />
proteinsyntesen<br />
• Metabola pathways utvecklas<br />
• Cell kompartmentalisering (eukaryoter)
Vad finns det för fördelar med DNA jämför<br />
med RNA som informationslagrande molekyl?<br />
Allt mer avancerade organismer krävde allt större molekyler<br />
för att lagra den allt mer omfattande genetiska<br />
informationen<br />
DNAt är dubbelsträngat, primärsekvensen är mer skyddad<br />
Mer avancerade replikerings- och proof-reading<br />
funktioner behövde utvecklas efterhand som molekylen<br />
blev större<br />
Inpackning i kromatin (Eukaryoter)<br />
Högre genetiska funktioner utvecklas (”The histone code”)<br />
Epigentics, imprinting
Det<br />
centrala<br />
dogmat<br />
DNA ger RNA<br />
RNA ger protein<br />
Kan RNA ge DNA?<br />
Kan protein ge<br />
RNA?<br />
?<br />
?
Från prokaryoter till eukaryoter<br />
• Med ökas syretillgång kunde energin i organiska molekyler<br />
utnyttjas bättre<br />
• Mer komplexa biokemiska pathways utvecklades då vilket<br />
innebär att en komplicerad slutprodukt kan syntetiserades i<br />
flera delsteg där produkten av ett steg är substratet till nästa<br />
• Detta ökade behovet av interna membraner<br />
Yta till volym förhållandet ökade<br />
Kompartmentalisering tillät att mikromiljöer inne i cellen kunde<br />
utvecklas<br />
A högre specialisering inne i cellen kunde ske<br />
Multicellulära organismer kunde utvecklas<br />
• Endosymbiosis skedde<br />
Mitokondrier och kloroplaster utvecklades
Den eukaryota cellen<br />
Uppbyggd av komplexa membransystem<br />
Vissa membraner har slutits och bildar organeller<br />
Innehåller mitokondrier
Typisk djurcell
Model för den eukaryota cellens uppkomst<br />
Med avveckling av cellväggen blir plasmamembranet mer flexibelt.<br />
Invaginationer kan då ske vilket leder till ytförstoring och så<br />
småningom även en kompartmentalisering. Ett cytoskelett<br />
utvecklas också för att öka stabiliteten och underlätta den interna<br />
kommunikation mellan olika delar av cellen
De ursprungliga organellerna bildades<br />
således från plasmamembranet<br />
Utsidan i plasmamembranet är därför insidan i organellmembranen.<br />
ER är en förlängning av kärnans dubbelmembran. ER blev därför en<br />
struktur med ett enkelmembran
Mitokondria och<br />
kloroplaster<br />
• Skiljer sig från övriga organeller på ett antal punkter<br />
• Tros ha evolverat oberoende av en eukaryota cellen<br />
och i ett senare skede inkorporerats i denna<br />
• Detta kallas för den ”endosymbiontiska teorin”
Inkorporering av en prokaryot cell (blivande<br />
mitokondrie) i en primitiv eukaryot
Utveckling av fotosyntetiserande eukaryoter
Cellvägg<br />
Cellmembran<br />
Endoplasmatiskt<br />
nätverket (ER)<br />
Golgiapparat<br />
Vakuol<br />
Lysosomer<br />
Peroxisomer<br />
Kärna<br />
Mitokondrier<br />
Kloroplaster<br />
Växtcellen
Argument som talar för den<br />
endosymbiontiska teorin<br />
• Det finns fortfarande eukaryoter som saknar både kloroplaster (alla<br />
djur) och mitokondrier (anaeroba organismer)<br />
• Mitokondrier och kloroplaster innehåller DNA<br />
• Liknar prokaryoter vad gäller basala funktioner som DNA replikering,<br />
transkription, translation. DNA och RNA polymeraset och<br />
ribosomerna har följaktligen prokaryot struktur<br />
• Utgör helt egna organeller, fortfarande isolerade från övriga<br />
membransystem och ingår inte i den vesikulära trafiken<br />
• Har högt specialiserade dubbelmembran<br />
• Yttermembranet innehåller det speciell transportproteinet porin som<br />
är typiskt för prokaryoter (finns inte i övriga membraner i cellen)<br />
• Innermembranet innehåller fosfolipiden kardiolipin som har 4<br />
fettsyror. Detta gör membranet mycket ogenomträngligt för diverse<br />
joner, som istället transporters ut och in via diverse transportproteiner
Energifixering och utnyttjande<br />
Kloroplaster Mitokondria
Hur vet vi då allt detta?<br />
Resultat av diverse vetenskapliga studier<br />
Mikroskopi för att ta reda på hur saker och ting ser ut<br />
Ljusmikroskopi, elektronmikroskopi<br />
Ett otal varianter på dessa finns i kombination med<br />
diverse infärgningsmetoder, antikroppar etc<br />
Biokemi för att bestämma det kemiska innehållet i diverse<br />
strukturer<br />
Fraktionering och separation<br />
Identifiering av makromolekyler och metaboliter<br />
Genetik för att förstå sambandet mellan den primära<br />
DNA strängen och de slutliga cellulära strukturerna<br />
Mutagenes, transgena system, genomik, etc<br />
Evolutionslära för utreda vad som uppstod av vad<br />
Paleontologi, fylogeni etc
Mikroskopi<br />
Robert Hooke ca. 1665<br />
Mycket gammal metod. Fortfarande aktuell. Kombineras ofta med<br />
specifika infärgningar (antikroppar, flourescence etc)
Modernt konfokalmikroskop
Mikroskopi i kombination med<br />
Hög-ß-glukan linjer av havre<br />
specifik infärgning<br />
1.9% 3.6% 4.9%<br />
7.1% 7.2% 7.8%
Hur smått<br />
kan vi se?
El-<br />
mikro<br />
bild av<br />
cellen
Lite större förstoring
Biokemi<br />
• Sönderdelning<br />
Snittning, hackning, malning, mortling, frys-tining, syra, bas etc<br />
• Extraktion<br />
Polära eller opolära lösningemedel<br />
• Separation<br />
Princip; Storlek, Densitet, Laddning, Polaritet,<br />
Affinitet, Ytegenskaper<br />
Apparatur<br />
Gelfores; Polyacrylamid, Agaros, Stärkelse<br />
Kolonn; Sepharos, Sephadex, Silikon, Hydroxyapatit, Jonbytare, etc.<br />
Tunnskiktsplattor<br />
Centrifugering; CsCl, Sukros<br />
Filtrering; Stål, Papper, Nitrocellulosa, Nylon<br />
Separationstratt (två-fas system); Buffert, Organiska lösningar, PEG<br />
Separationskraft ; Kapillärkraft, tyngdkraft, centrifugalkraft,<br />
tryck (vatten, luft), elektricitet, magnetism<br />
• Detektion och identifiering
Tryck<br />
Ström<br />
Gkrafter
Sammanfattning - cellens interna<br />
strukturer
Change language