Mikroförökning av rabarber - kort sammanfattning av resultat

Rapport för projektet
Utveckling av en effektiv metod för förökning av nya rabarbersorter
1
Li-Hua Zhu
Jessica Fajerson
Växtförädling och bioteknik
SLU, Alnarp
2011-12-18

Slutrapport
Projekttitel: Utveckling av en effektiv metod för förökning av nya rabarbersorter
Sökande: Li-Hua Zhu
Medsökande: Kimmo Rumpunen och Elisabet Nilsson
Exjobbare: Jessica Fajerson
Projektperiod: 2007-2008
Beviljat medel: 100 000 SEK
Vetenskaplig redovisning
Introduktion
Rabarber (Rheum rhaponticum) är en flerårig och tålig växt som klarar sig bra i de flesta
svenska växtzoner. Den är en robust och lättodlad medicinal- och köksväxt som ger en hög
avkastning och har en karaktäristisk arom. Intresset för att använda rabarber i olika
livsmedelsprodukter och som färskvara ökar, i både de nordiska länderna och många andra
länder i världen. I till exempel Tyskland ökade produktionen, från 652 till 724 ha, och
efterfrågan, på i första hand färsk rabarber kraftigt år 2005. Detta innebär en ökad efterfrågan
på billiga plantor och bra sorter, något som också märkts i Sverige. Det finns stora
sortskillnader när det gäller olika egenskaper hos rabarber (Rumpunen och Henriksen 1999).
Nyligen har man även visat att rabarber, i förhållande till övriga grönsaker, har relativt höga
halter antioxidanter, i form av olika fenoler (Zhou et al. 2006). De sorter som idag förökas är i
första hand utvalda för hemträdgårdsodling och har inte de egenskaper som krävs vid
kommersiell rabarberproduktion.
Rabarber kan förökas genom delning av äldre plantor men detta tar lång tid och är
arbetskrävande, vilket i sin tur ger dyra plantor. Mikroförökning har emellertid visat sig vara
en effektiv och användbar metod för att föröka rabarber (Lepse 2007; Roggemans och Claes
1979; Rumpunen 1990, 1996; Zhao et al. 2005) men idag saluförs endast ett begränsat antal
sorter, eftersom förökningsbarheten varierar med sorten. Många äldre sorter har dessutom en
mycket stor benägenhet att producera blomstjälkar som måste avlägsnas manuellt för att inte
stjäla kraft från plantorna. Det har därför varit motiverat att ta fram nya rabarbersorter med
bättre egenskaper. Vid SLU på Balsgård har därför ett mindre rabarberförädlingsprogram
bedrivits sedan 1990. Detta har resulterat i ett antal nya selektioner, varav F101, F104, F106,
F108 och F112, valts ut på grund av bra smak, hög avkastning, låg blomningsbenägenhet samt
motståndskraft mot svampsjukdomar, som annars drabbar bladen (svartfläcksjuka, Ramularia
rhei). Smaktester, som genomförts tillsammans med Procordia Food AB i Tollarp och Eslöv,
har visat en utsökt smak hos dessa selektioner. Utöver detta växtmaterial har även olika kloner
av Canada Red funnits vara mycket odlingsvärda, med olika goda egenskaper. Dock är
mikroförökningsbarheten okänd för det ovannämnda växtmaterialet och det är därför
angeläget att testa denna egenskap, eftersom förökningsbarheten är en mycket viktig faktor
som påverkar möjligheten att producera billiga plantor för kommersiell produktion.
Mikroförökning är en vanlig metod för att snabbt massföröka växtmaterial på kort tid och
denna metod är särskilt användbar för nya förädlade sorter, där man initialt endast har tillgång
till en begränsad mängd växtmaterial. Dessutom kan mikroförökning göra det möjligt att
effektivt producera sjukdomsfria och sortäkta plantor (Lepse 2007; Roggemans och Claes
1979). Traditionell mikroförökning kräver stora arbetsinsatser, eftersom växtdelarna odlas på
fast medium i små burkar, vilket orsakar en hög produktionskostnad. Däremot erbjuder
2

ioreaktorproduktion ett bättre alternativ genom att producera växter i flytande medium i
stora kärl, till exempel stora flaskor (Etinne H. och Berthouly 2002; Zhu et al. 2005). I våra
tidigare studier har vi testat massförökning av blåbär, jordgubbar, hallon med flera växtslag i
bioreaktorer och fått mycket positiva resultat, i de flesta fall. Vi har således framgångsrikt
producerat blåbärsplantor i bioreaktorer under flera år. Vi har också upptäckt att i vissa fall
kan växling mellan fast och flytande medium effektivt reducera hyperhydricitet, som ofta
orsakar abnorma skott, ett mycket vanligt problem som förekommer när kulturer odlas i ett
flytande medium. Eftersom tillväxt och utveckling av mikroplantor påverkas av
mikroförökningsförhållanden, är det viktigt att utvärdera mikroplantor i växthus. För att på så
sett kunna välja ut de bästa förhållandena för kommersiell mikroförökning.
Syftet med detta projekt var att utvärdera förökningsbarheten in vitro hos nytt växtmaterial av
rabarber, samt utvärdera etableringen av mikroförökade rabarberplantor i växthus. Projektet
genomfördes delvis av en exjobbare. Vi producerade över 10 000 rabarberplantor i bioreaktor
genom att använda protokollet som utvecklats i detta projekt. Dessa mikroplantor användes
sedan som moderplantor på Elitplantstationen i Balsgård, till odlare för kommersiell
produktion.
Material
Rabarberklonerna som användes i försöket är sex nya kloner (0132 Canada Red 3, 0223 röd
Elmsblitz, F0302 F101, 0217 F104, 0211 F106 och 0208 F108) som kom från SLU i
Balsgård. Dessa kloner odlades i stora krukor i växthuset inför in vitro etablering (se figur
1A).
Metoder
Etablering in vitro
Både vilande och växande knoppar (se figur 1B) samt meristem, från alla sex kloner,
användes som explantat för in vitro etablering. Rhizombitar där knoppar fanns skars bort från
moderplantorna och tvättades grundligt under rinnande kranvatten (se figur 1C). Därefter
ytsteriliserades de med 6% kalciumhypoklorit med 2 droppar Tween 20 i 15 minuter, under
skakning. Sedan sköljdes de 6 gånger med sterilt vatten. Mediet för etablering innehöll MS,
20 g L -1 glukos, 1 mg L -1 BAP, 1 mg L -1 IBA och 7 g L -1 agar. pH justerades till 5.7.
Explantaten flyttades till nytt medium var 3-4 vecka.
Skottproduktion på fast medium
Fem kloner användes för skottproduktionsförsök. Klon 0211 F106 växte för långsamt och
kunde inte uppförökas i tillräckligt stor mängd för detta ändamål. För skottproduktion
användes mediet innehållande MS, 20 g L -1 glukos, olika koncentrationer av BAP (1.5, 2.5,
3.5, 4.5 och 5.5 mg L -1 ) i kombination med 0.5 mg L -1 IBA och 6 g L -1 agar. pH justerades
5.7. För varje kombination användes 30 skott per klon. Efter 4 veckor registrerades antal nya
skott som producerats. Försöket upprepades minst 2 gånger.
Effekt av paclobutrazol på skottillväxt
För att vidare öka förökningshastigheten har vi testat tillväxtretardanten paclobutrazol och
dess effekt på skottillväxten. I detta försök var försökningsmediet samma som för
3

skottproduktion, men innehöll 3.5 mg L -1 BAP och 2 mg L -1 paclobutrazol. Detta försök
genomfördes endast med klonen 0217 F104 och skotten som användes kom från
förökningsmedier med olika BAP koncentrationer. Två burkar, en med och en utan tillsatt
paclobutrazol, med 5 skott i vardera användes i försöket och skottillväxten registrerades efter
3 och 6 (2x3) veckor.
Rotning på fast medium
Rotningsmedium var halvt MS innehållande 20 g L -1 glukos, 0.1 mg L -1 IBA, 6 g L -1 agar och
pH justerades till 5.7. Alla fem kloner som användes i skottproduktionsförsöket inkluderades i
rotningsförsöket. En mörkerbehandling, under 3,5 dagar, testades på klon 0217 F104 och
0208 F108. Skotten kom från alla undersökta BAP koncentrationer. För varje koncentration
användes minst 12 skott.
Skottproduktion och rotning i bioreaktor
Skottproduktion i bioreaktorer genomfördes med klonerna 0132 Canada Red 3 och 0223 röd
Elmsblitz, som är väl efterfrågade på marknaden. Mediet innehöll 20 g L -1 glukos eller 30 g L -
1 sackaros, 1 mg L -1 BAP och 1 mg L -1 IBA. Skottproduktion registrerades efter 3 veckor.
Rotning genomfördes i bioreaktor med samma rotningsmedium som det fasta mediet, i ljus.
In vitro odlingsförhållanden
Alla in vitro kulturer i denna rapport odlades i en klimatkammare med dagslängden 16
timmar, temperatur 21/18 ° C (dag/natt) och ljusintensiteten 33 µmol m 2 s -1 .
Etablering av mikroplantor i växthus/utomhus
Välrotade mikroplantor, från både fast medium och bioreaktor, planterades i krukor med
planteringsjord blandad med perlit (1:1) i växthus. Från början täcktes mikroplantorna med
plastmuggar för att undvika uttorkning. Plastmuggarna öppnades efter 1-2 veckor och togs
bort efter 2-3 veckor, när mikroplantorna började visa ny tillväxt.
Resultat och diskussion
In vitro etablering
Alla sex kloner lyckades etableras in vitro, på samma etableringsmedium, oavsett typ av
explantat (se tabell 1 och figur 1D). Etableringsgraden ligger mellan 27-100 %, men de flesta
kloner visade över 80 % etablering. Infektionsgraden ligger mellan 0-28 % för vilande och
växande knoppar där klonen 0217 F104 hade den högst infektionsgraden, medan kloner
F0302 F101 och 0208 F108 samt meristemexplantaten, från alla andra kloner, inte visade
någon infektion alls (se tabell 1 och figur 2). Detta tyder på att meristem är den bästa typen av
explantat för etablering in vitro, utan någon infektion, för vissa kloner. Infektion skedde efter
1-3 veckor och var mest från svamp och lite från bakterier. Dock visade i stort sett vilande
och växande knoppar en lik hög etableringsgrad, som är högre än för meristem. In vitro
etablering av rabarber har tidigare rapporterats av Rumpunen (1990), Roggemans och Claes
(1979) och Lepse (2007). Vi har lyckats med att etablera alla kloner med en låg
infektionsgrad, medan Lepse (2007) rapporterade en infektionsgrad på 25-53 %. Detta kan
naturligtvis bero på skillnader i genotyp och ursprung av växtmaterial, för in vitro etablering,
4

men kan också bero på att vi grundligt tvättade rhizombitarna innan de ytsteriliserades.
Tillväxthastigheten in vitro mellan de olika rabarberklonerna skiljde sig åt, där klonen 0211
F106 växte betydligt långsammare och visade en låg förökningshastighet. Denna klon
inkluderades därför inte i de senare försöken.
Tabell 1. Resultat av in vitro etablering av de sex olika rabarberklonerna
Klon Antal
växande
knoppar
(vk)
Etablering (vk)
%
Antal
meristem
(m)
Etablering
(m) %
Antal vilande
knoppar
(vik)
Etablering
(vik) %
0217 F104 21 51 21 81 25 36 28
0132 Canada
Red 3
0223 röd
Elmsblitz
12 75 14 57 12 83 13
18 89 16 31 9 100 11
F0302 F101 14 93 15 27 11 91 0
0211 F106 10 90 12 67 9 67 21
0208 F108 19 89 20 45 10 80 0
5
Infektion
% (vk+vik)
A B C D
E F G
Figur 1. Moderplanta och olika faser av mikroförökning av rabarber. A: Moderplanta i
kruka. B: Växande skott på rhizomet. C: Vältvättade icke sterila skott med en bit av rhizomet.
D: In vitro etablering av en knopp. E: Växande skott i provrör. F: Skott förökade i burk. G:
En färdig rabarberplanta för ex vitro etablering. H: Väletablerade rabarberplantor i växthus.
H

Figur 2. Meristemexplantat som användes för in vitro etablering av rabarber. Meristem
som fortfarande sitter på rhizomet (vänster) och meristemet med en bit av rhizomvävnaden,
som skars bort för in vitro etablering (höger).
Skottproduktion på fast medium
Efter etablering odlades knopparna eller meristemen på etableringsmediet tills fina skott hade
utvecklats (se figur 1E och 1F). För att undersöka cytokinins inverkan på
förökningshastigheten testades olika koncentrationer av BAP. Resultaten från denna test
presenteras i tabell 2. De fem olika rabarberklonerna kan i princip delas upp i två grupper
baserat på förökningshastighet, det vill säga den ena gruppen visade en lägre
förökningshastighet än den andra. Klon 0217 F104 och F0302 F101 tillhör den första
gruppen, i vilken förökningshastigheterna inte skiljde sig åt mellan de olika BAP
koncentrationerna och en förökningshastighet på lite över 2 förekom. Detta tyder förmodligen
på att man behöver testa andra typer av cytokininer eller andra komponenter i mediet för att få
upp förökningshastigheten. De resterade tre klonerna tillhör den andra gruppen, som visade en
högre förökningshastighet än den första gruppen, men ingen direkt skillnad mellan de olika
BAP koncentrationerna upptäcktes heller här. I denna grupp var förökningshastigheten upp
till 3.62 hos klonen 0208 F108, vid BAP koncentrationen 2,5 mg L -1 . Generellt kan man
konstatera att en BAP koncentration på högre än 2.5 mg L -1 i princip inte hjälper för att öka
förökningshastigheten. Man kanske behöver justera andra mediumkomponenter. Lepse (2007)
har också rapporterat en förökningshastighet på 2 och Rumpunen (1990) hade en
förökningshastighet på mellan 1.4 och 3.5.
Tabell 2. Antal skott som producerades per explantat från de olika rabarberklonerna på
medium innehållande olika koncentrationer av BAP.
Klon BAP (mg L -1 )
1.5 2.5 3.5 4.5 5.5
0217 F104 2.32 2.15 2.12 2.24 2.23
0132 Canada
Red 3
0223 röd
Elmsblitz
3.34 3.22 3.27 3.03 3.12
3.05 3.50 3.02 3.34 3.18
F0302 F101 2.47 2.52 2.60 2.50 2.29
0208 F108 3.17 3.62 3.12 3.39 3.33
6

När det gäller utseende av skott på medierna med olika BAP koncentrationer, visade det sig
att skotten hos klon F0302 F101 blev kortare med BAP koncentrationer 4.5 och 5.5. Särskilt
för skotten som förökats på 5.5 mg L -1 jämfört med dem som förökats på medium med lägre
BAP koncentration (se figur 3). Bladstjälken och bladytan hos denna klon blir också mindre
vid högre BAP koncentrationer (4.5 och 5.5 mg L -1 ) jämfört med de på lägre BAP
koncentrationer. Dock fanns ingen skillnad mellan de olika BAP koncentrationerna för de
övriga klonerna (se tabell 3).
BAP 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 mg L -1
Figur 3. Skott från klon F0302 F101, som förökats på skottproduktionsmedium med
olika BAP koncentrationer, efter 4 veckor.
Tabell 3. Bladstjälkslängden (cm) (BS) och bladyta (cm 2 ) (BY) hos rabarberkloner som
förökats på skottproduktionsmedium med olika BAP koncentrationer.
Klon BAP (mg L -1 )
1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 Noteringar
(BS/BY)
om skotten
0217 F104 4/1.5 4/1.5 4/1.5 4/1.5 4/1.5 Oftast ett
dominerande
0132 Canada
Red 3
0223 röd
Elmsblitz
1/0,5 1/0.5 1/0.5 1/0.5 1/0.5 Små
kompakta
4/1.5 4/1.5 4/1.5 4/1.5 4/1.5
F0302 F101 5/6 5/5 5/4 4/3 3/2 Kraftiga
0208 F108 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 Små
kompakta
7

Effekt av paclobutrazol på skottillväxt
Paclobutrazol hämmade kraftligt skottillväxten, huvudsakligen på grund av minskad
bladstjälkssträckning (se figur 4). Den inhiberade effekten observerades efter 3 veckor och
effekten var ännu tydligare efter dubbla kulturtiden (se figur 4B). Efter 3 veckor blev blad på
skott med behandlingen mindre och mörkare jämfört med kontrollen. Vid slutavläsningen var
skotten som behandlats med paclobutrazol mer kompakta och bladstjälklängden var efter 3
veckor 1.5 cm och 0.5 cm efter dubbla kulturtiden jämfört med 4 cm för kontrollen (se figur
5C). Skotten förökade sig dock inte alls (se figur 4A och 4B), vilket tyder på att paclobutrazol
negativt påverkade skottmultipliceringen. Paclobutrazol är en välkänd tillväxtretardant som
har motsatt funktion som gibberelliner och kan reducera stamlängden in vitro, genom att
reducera cellexpansion och celldelning genom blockering av gibberellins aktivitet (Smith et
al., 1990).
V M H V M H 1 2 3 4 5 6
Figur 4. In vitro odlad rabarber i burkar som behandlats med tillväxtretardanten
paclobutrazol. A: Rabarberskott i burkar (V: vänster, kontrollen. M och H: mitten och höger,
behandlade efter 3 respektive 2x3 veckor). B: Skott (V: kontrollen. M och H: behandlade
efter 3 respektive 2x3 veckor). C: Blad (1-2: kontrollen. 3-4: behandlade efter 3 veckor. 5-6:
behandlade efter 2x3 veckor).
Rotning på fast medium
Generellt kom rotning igång tidigare på de skott som förökades på skottproduktionsmedium
med lägre BAP koncentration. Dock hade ca 80-90 % av skotten producerat rötter (se figur
1G) efter 12 veckor (de flesta efter ca 6 veckor). Slutavläsning visade en rotningsgrad på
mellan 67-100 % och de flesta kloner hade en rotningsgrad över 80 % (se tabell 4).
Rotinduktion i mörker och ljus resulterade i en lika hög rotningsgrad. En del skott rotade sig
redan på förökningsmediet. Detta visar att rabarberplantor är lätta att rota och har också
rapporterats av Lepse (2007).
Skottproduktion och rotning i bioreaktor
A B C
Föröksningsprotokollet för bioreaktorproduktion av rabarber fungerade för de två
rabarberklonerna som testades (se figur 5A) och har använts för att producera 10 000
rabarberplantor till Elitplantstationen i Balsgård. Förökningshastigheten var lika hög som på
fast medium. Skotten var rotinducerade innan de planterades i växthus, med en rotningsgrad
på nästan 100 %.
8

Tabell 4. Rotningsgrad för skotten från skottproduktionsmedier innehållande olika BAP
koncentrationer.
Klon BAP (mg L -1 )
1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 Noteringar
om rötter
0217 F104 100 83 92 100 100 Få
0132 Canada
Red 3
0223 röd
Elmsblitz
100 100 92 100 67 Kraftiga
100 92 92 100 100 Långa,
många och
tunna
F0302 F101 92 83 100 100 100 Mycket
långa och
tunna
0208 F108 92 100 83 100 100 Ganska
kraftiga
Etablering i växthus
Mikroplantor, både från fast medium och bioreaktor, etablerades till 100 % i växthus (se figur
1H) i Alnarp. De flesta mikroplantor som levererades har etablerats väl på Elitplantstationen i
Balsgård (se figur 5B och 5C). Dessa plantor har sedan använts som moderplantor och
levererats till rabarberodlare.
A B C
Figur 5. Bioreaktorproduktion av rabarber (A) samt etablering i växthus (B) och
utomhus (C) i Balsgård.
Referenser
Etinne H. och Berthouly M. 2002. Temporary immersion systems in plant
micropropagation. Plant Cell, Tissue and organ culture 69: 215-231.
Lepse L. 2007. Comparison of In Vitro and Traditional Propagation Methods of Rhubarb
(Rheum rhabarbarum) according to Morphological Features and Yield. Acta Hort. 812:
265-270.
Roggemans J. och Claes M.C. 1979. Rapid clonal propagation of rhubarb by in vitro culture
of shoot-tips. Scientia Horticulturae 11: 241-246.
Rumpunen K. 1990. Mikroförökning av rabarber. Examensarbete, SLU, Alnarp.
Rumpunen K. 1996. Rabarber en robust kultur. Fakta Trädgård Fritid, SLU, nr 12.
9

Rumpunen K. och Henriksen K. 1999. Phytochemical and morphological characterization of
seventy-one cukltivars and selections of culilnary rhubarb (Rheum spp.) J. Hort. Sci &
Biotechnology. 74: 13-18.
Smith E.F., Roberts A.V. och Mottley J. 1990. The preparation in vitro of chrysanthemum for
transplantation to soil. 2. Improved resistance to desiccation conferred by paclobutrazol.
Plant Cell Tiss. Org. Cult. 21: 133-140.
Zhao Y., Grout B.W.W. och Roberts A.V. 2005. Abnormal chromosomes and DNA in
micropropagated rhubarb (Rheum rhaponticum L.) PC49. Plant Cell, Tissue and Organ
Culture 83: 335-338.
Zhou K. och Yu L. 2006. Total phenolic contents and antioxidant properties of commonly
consumed vegetables grown in Colorado. LWT 39: 1156-1162.
Zhu L.H., Li X.Y. och Welander M. 2005. Optimisation of growing conditions for the apple
rootstock M26 grown in RITA containers using temporary immersion principle. Plant Cell,
Tissue and Organ Culture 81: 313-318.
10