Rening av proteiner: hur och varför?
Rening av proteiner: hur och varför?
Rening av proteiner: hur och varför?
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Prokaryoter<br />
Eukaryoter<br />
<strong>Rening</strong> <strong>av</strong> <strong>proteiner</strong>:<br />
<strong>hur</strong> <strong>och</strong> <strong>varför</strong>?<br />
En cell = en individ<br />
miljarder celler = individ<br />
(<strong>och</strong> lite biologiska grunder)<br />
Joakim Norbeck<br />
norbeck@chalmers.se<br />
4.6 miljoner bp =<br />
ca 3000 gener<br />
Otroligt stor skillnad på organismers komplexitet,<br />
men grunderna är ändå dom samma!<br />
Alla har DNA, RNA <strong>och</strong> Protein!<br />
ca 2 miljarder bp/cell =<br />
30000 gener<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
1
DNA molekyler har en riktning. Man läser ALLTID sekvens från 5’ till 3’ ände!<br />
5’ ände (= fosfat)<br />
Riktningar <strong>och</strong> begrepp.....<br />
5’-GATCTCTGTGACGAAAGTACCTCCCCG-3’<br />
3’-CTAGAGACACTGCTTTCATGGAGGGGC-5’<br />
kodon<br />
Transkription<br />
5’-GAUCUCUGUGACGAAAGUACCUCCCCG-3’<br />
Translation<br />
(ribosomer+tRNA+aminosyror)<br />
3’ ände (OH)<br />
N -AspLeuCysAspGluSerThrSerPro- C ”tre-bokst<strong>av</strong>skod”<br />
N L C N E S T S P ”en-bokst<strong>av</strong>skod”<br />
Promotor + kodande region + terminator = Gen!<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
2
RNA <strong>av</strong>läses till Protein m h a den genetiska koden som (nästan) är universell:<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Studiet <strong>av</strong> <strong>proteiner</strong> (20 OLIKA byggstenar) är svårare än studier <strong>av</strong> nukleinsyror (4 liknande byggstenar).<br />
Dessutom kan många <strong>av</strong> aminosyrorna bli modifierade ≈ oerhört stort antal möjliga <strong>proteiner</strong>....<br />
(2 aa > 400 olika, 3 aa > 8000 olika.... 10 aa > 10 12 olika , 500 aa > 10 104 ≈ oändligt....)<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
3
Många möjligheter till variation på protein-strukturnivå!<br />
Amino-terminal = N-terminal<br />
Carboxyterminal = C-terminal<br />
N- -C<br />
Primär- Sekundär-<br />
Tertiär-<br />
Kvartär-<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Alla <strong>proteiner</strong> har en isoelektrisk punkt (pI) där nettoladdning är noll.<br />
Net Charge<br />
+<br />
-<br />
NH3 +<br />
COOH -<br />
Net Charge = 0<br />
(pI)<br />
pI = 4.5<br />
NH3 +<br />
COO -<br />
MW = 30 kDa<br />
modifieringar kan ofta förändra pI!<br />
(<strong>och</strong> storlek...)<br />
NH2<br />
COO -<br />
pH<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
4
Fosfolipid-membran<br />
Fosforylerat protein, potentiellt reglerat.<br />
Antagligen lätt att extrahera, men beroende<br />
<strong>av</strong> <strong>hur</strong> starkt associerat det är med sina<br />
interaktioner.<br />
Proteiner är mycket variabla i sina egenskaper!<br />
Detta påverkar möjligheten att rena....<br />
Glycosylation<br />
Glycosylation(s) (s)<br />
Glycosylation<br />
(s)<br />
Phosphate<br />
<strong>Rening</strong>ar <strong>av</strong> <strong>proteiner</strong> involverar ett antal steg:<br />
Glykosylerat membranprotein.<br />
Svårt att extrahera, svårt att studera.<br />
Phosphate<br />
Protein som binds till membran<br />
<strong>av</strong> lipidsvansar, potentiellt en reglerad<br />
process. Hjälpligt lätt att extrahera.<br />
”idealt” protein,<br />
lätt att extrahera <strong>och</strong> omodifierat!<br />
val <strong>av</strong> källa till proteinet:<br />
- naturliga celler eller vävnad (ni ska använda färs <strong>av</strong> oxhjärta för rening <strong>av</strong> cytokrom C)<br />
- genmanipulerade celler/organismer (ni undersöker en plasmid i DNA-labben)<br />
Provberedning<br />
val <strong>av</strong> renings-metodik:<br />
- olika typer <strong>av</strong> kromatografi eller fällningar<br />
verifiering <strong>av</strong> renhet:<br />
- aktivitet<br />
- absorbans/reagens<br />
- gel-elektrofores<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Huvudsakliga skäl att rena <strong>proteiner</strong> är att vi vill förstå proteinets egenskaper eller använda det<br />
för att förstå andra system (forskningssyften),<br />
eller så vill vi rena fram industriella mängder <strong>av</strong> protein<br />
för användning i t ex tvättmedel eller som läkemedel...<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
5
organism<br />
Källa till proteinet:<br />
1. Naturliga källor<br />
organ<br />
Källa till proteinet:<br />
2. Genmodifierade organismer<br />
Vi vill ofta uttrycka ”syntetiska” gen-konstruktioner<br />
t ex från plasmider innehållande PCR-produkter.<br />
(viktigt att få med alla delar <strong>av</strong> en gen för att få uttryck!)<br />
cell-odling<br />
organell<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
6
Plasmider är små cirkulära bitar <strong>av</strong> DNA som kan replikeras i cellen.<br />
Krävs att de har ett Ori.<br />
Bakterier har cirkulära kromosomer med ett Ori,<br />
Eukaryoter har linjära kromosomer med många Ori<br />
Ori<br />
Hit binder DNA-polymeras <strong>och</strong> andra enzymer<br />
när DNA ska replikeras.<br />
För att vi ska kunna veta vilka celler som innehåller vår plasmid så sätter vi ofta in<br />
en eller flera markörgener (t ex resistens mot antibiotika).<br />
Den vanligaste markörgenen är penicillin (ampicillin)- resistens, AmpR.<br />
Detta protein är ett beta-lactamase som kan inaktivera penicillin-strukturen<br />
(bakterier med plasmid kan växa i närvaro <strong>av</strong> Amp).<br />
Ori<br />
Markör<br />
Endast i prokaryoter (bakterier), andra markörgener finns för användning i eukaryoter.<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
7
För att plasmiden ska kunna användas praktiskt på lab så finns ofta ett multiple cloning site (MCS)<br />
MCS innehåller ett antal unika restriktionsenzym-igenkännings-sites.<br />
MCS<br />
Ori<br />
Markör<br />
Restriktions-enzymer<br />
(egentligen Restriktions-endonukleaser)<br />
kan användas för att klippa specifikt i DNA-sekvenser (tillämpa på lab!).<br />
Ligas kan sammanfoga DNA-ändar med ”passform”.<br />
5’ TGGCGTAGAGCCTGAATTCGCTGAAAATTGAAAA 3’<br />
3’ ACCGCATCTCGGACTTAAGCGACTTTTAACTTTT 5’<br />
Restriktions-enzym<br />
(EcoRI)<br />
5’ TGGCGTAGAGCCTG AATTCGCTGAAAATTGAAAA 3’<br />
3’ ACCGCATCTCGGACTTAA GCGACTTTTAACTTTT 5’<br />
Ligas<br />
5’ TGGCGTAGAGCCTGAATTCGCTGAAAATTGAAAA 3’<br />
3’ ACCGCATCTCGGACTTAAGCGACTTTTAACTTTT 5’<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
8
Så här kan en liten typisk E.coli plasmid se ut.<br />
pUC19<br />
Ori<br />
MCS<br />
Vi använder plasmiden genom att stoppa in en eller flera bitar DNA i MCS.<br />
Då använder vi ofta(st) PCR-produkter<br />
Primers<br />
(20-25 bp homologi)<br />
Templat (=”mall”) dubbelsträngat DNA<br />
95° (smältning <strong>av</strong> DNA)<br />
50-60° (”annealing” = ihopkoppling)<br />
~70° (kedjeförlängning)<br />
Kör 25-30 såna cykler. En fördubbling <strong>av</strong> mängden DNA i varje cykel.<br />
Primers <strong>av</strong>gör vilken region <strong>av</strong> DNA som ska förstärkas!<br />
Replikation utförs <strong>av</strong> värmestabilt DNA-polymeras.<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
PCR<br />
(Polymerase chain reaction)<br />
Används för att förstärka specifika<br />
DNA-sekvenser.<br />
Produkten <strong>av</strong> PCR kan t ex<br />
klippas med lämpliga<br />
restriktionsenzymer <strong>och</strong><br />
m h a ligas infogas i plasmid.<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
9
Det är ofta svårt att manipulera den kromosomala arvsmassan<br />
(men det går hyfsat i t ex jäst-svampar <strong>och</strong> bakterier)<br />
Det är lätt att manipulera DNA som sitter i plasmider<br />
Användningsområden för plasmider:<br />
-överuttryck <strong>av</strong> <strong>proteiner</strong><br />
-reglerat uttryck <strong>av</strong> <strong>proteiner</strong><br />
-uttryck <strong>av</strong> muterade <strong>proteiner</strong><br />
-uttryck <strong>av</strong> <strong>proteiner</strong> med renings-/lokaliserings-domän<br />
Exempel på tillämpningar som involverar plasmider:<br />
Ersätt original-promotor<br />
med en reglerbar promotor<br />
Ersätt en del <strong>av</strong> din f<strong>av</strong>oritgen<br />
med en muterad region.<br />
F<strong>av</strong>orit-gen<br />
Promotor<br />
Infoga en reningsdomän (t ex 6xHis)<br />
på genens/proteinets C-terminal.<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
10
Provberedning:<br />
Metoder för rening <strong>av</strong> protein:<br />
Provberedning (<strong>och</strong> Dialys)<br />
Selektiva fällningar/precipitering<br />
Kromatografi<br />
* jonbyteskromatografi (proteinets laddning)<br />
* gel-filtrering (proteinets storlek)<br />
* affinitets-kromatografi (proteinets specifika egenskaper)<br />
Oftast måste man på nåt sätt få ut proteinet ur sitt material<br />
- mekaniskt (t ex kvarnar, mortel, skaka med glaspärlor/metallkulor)<br />
- kemiskt (t ex Detergenter, enzymatisk behandling..)<br />
Proteinet bör finnas i lösning för att kunna renas vidare.<br />
Partiklar blir man ofta <strong>av</strong> med genom att centrifugera eller filtrera provet.<br />
Ibland kan det finnas störande lösta ämnen. Dessa kan t ex dialyseras bort...<br />
(även små <strong>proteiner</strong> kan dialyseras bort genom att välja membran med rätt por-storlek)<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
11
Fällningar/Precipitering/Salt-fraktionering<br />
Proteiner har olika hydrofobicitet på ytan, dessa hydrofoba ytor maskeras<br />
vanligen <strong>av</strong> vatten.<br />
Tillsats <strong>av</strong> salt (ofta ammoniumsulfat) binder först upp fritt vatten i lösning,<br />
när detta vatten är slut så binds vattnet som funnits kring <strong>proteiner</strong> upp.<br />
När <strong>proteiner</strong>na blir <strong>av</strong> med sitt omgivande vatten frigörs mer <strong>och</strong> mer hydrofoba ytor<br />
vilka kommer att aggregera <strong>och</strong> falla ut som protein-komplex.<br />
Olika <strong>proteiner</strong> har olika mängd hydrofoba aminosyror.<br />
pH påverkar också <strong>proteiner</strong>s löslighet (kom ihåg isoelektrisk punkt, laddning=0)<br />
low medium high very high<br />
Jonbyteskromatografi<br />
Proteiner binds in till jonbytarmaterialet beroende <strong>av</strong> sin laddning.<br />
anjonbytare renar negativt laddade molekyler<br />
katjonbytare renar positivt laddade molekyler<br />
Principen är att succesivt konkurrera bort bundet material genom att antingen<br />
öka salthalten i elueringslösning eller genom att ändra pH <strong>och</strong> på så sätt ändra<br />
laddningen/inbindningen <strong>av</strong> det inbundna materialet.<br />
Jonbyteskromatografi är en koncentrerande teknik.<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
12
Buffertkärl<br />
Styr-enhet<br />
Gelfiltrering<br />
Separation <strong>av</strong> <strong>proteiner</strong> på basis <strong>av</strong> storlek.<br />
Resulterar i relativt utspädda prover.<br />
Pumpar<br />
Kolonn<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Fraktionssamlare<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
13
Principen för gel-filtrering<br />
Affinitets-kromatografi<br />
Ni 2+ -kolonn (IMAC): renar upp 6xHis-tag<br />
Glutathione-kolonn: renar GST-taggat protein<br />
Antikroppar: kan rena specifika <strong>proteiner</strong><br />
(Det finns många andra typer <strong>av</strong> affinitetsrening)<br />
IgG-kolonn renar Protein A-taggat protein<br />
Calmodulin-kolonn renar CBP-taggat protein<br />
Tandem-affinity purification<br />
(kombination <strong>av</strong> två olika reningstaggar)<br />
Stora <strong>proteiner</strong> elueras tidigt därför att de<br />
inte fångas in <strong>av</strong> gel-porerna.<br />
Små <strong>proteiner</strong> passar in i gel-porerna vilket<br />
leder till senare eluering.<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
14
Protein<br />
som ska<br />
renas...<br />
Kolonnmaterial<br />
Divalenta metall-joner binder kolonn-material<br />
en ”svans” <strong>av</strong> 6-10 histidiner som adderats till f<strong>av</strong>oritproteinet binder till<br />
de divalenta metall-jonerna.<br />
eluera med höga koncentrationer <strong>av</strong> Imidazole (eller lågt pH eller EDTA).<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Glutathione S-transferase (GST) är ett protein som<br />
binder till Glutathione (en tripeptid som är<br />
mycket vanlig i celler).<br />
Koppling <strong>av</strong> GST till f<strong>av</strong>oritproteinet gör det<br />
möjligt att rena på en kolonn där man bundit<br />
in glutathion (stark bindning!).<br />
Tvätta bort förorenande <strong>proteiner</strong> <strong>och</strong><br />
eluera med en gradient <strong>av</strong> glutathione.<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
15
immunoprecipitering<br />
(rening m h a specifika antikroppar)<br />
Protein-extraktion<br />
Tillsätt specifik antikropp (IgG)<br />
Tillsätt protein A-kopplat till agaroskulor<br />
Centrifugera ner protein A-agaros-kulorna, släng supernatant.<br />
Tandem Affinity Purification (TAP)-tag<br />
Tvätta (flera gånger)<br />
Extrahera protein m h a SDS-buffert.<br />
Kör extrakt på gel<br />
Y<br />
ProteinA<br />
Agaros<br />
Y<br />
ProteinA<br />
Agaros<br />
Y<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Y<br />
16
Protein-interaktions-karta från EN betingelse... DYNAMIK!<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Hur ska vi detektera våra <strong>proteiner</strong> efter rening?<br />
Färg (om man har tur! t ex i er lab renar ni ett gult protein)<br />
Proteinbestämning (reagens eller absorbans)<br />
Aktivitet<br />
Gel-elektrofores<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
17
Absorbans vid 280 nm kan användas för att bestämma proteinhalt i lösningar<br />
Färgningsmetoder för att detektera protein:<br />
Ex: Bradford metoden för att bestämma proteinkoncentration<br />
När Coomassie Brilliant Blue G-250 binder till protein i sur miljö<br />
så ändras dess absorbansmaximum från 465 till 595 nm.<br />
(Coomassie blå kan också användas för att färga in protein som<br />
man separerat på gel)<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
18
Kromatografisk rening på aktivitet:<br />
exemplet glycerol 3-fosfatas (följ närvaro <strong>av</strong> enzym-aktivitet) Jästceller krossas m h a glaspärlor<br />
Centrifugera bort partiklar<br />
Gel filtrering<br />
(fraktioner med<br />
aktivitet sparas)<br />
aktiva fraktioner<br />
körda på anjonbyteskromatografi<br />
med stigande pH <strong>och</strong> KCl gradient<br />
Gel-elektrofores <strong>av</strong> <strong>proteiner</strong><br />
- SDS-PAGE<br />
- Isoelektrisk fokusering (IEF)<br />
- 2D-PAGE<br />
Detektionsmetoder<br />
aktiva fraktioner<br />
körda på anjonbyteskromatografi<br />
med ökande NaCl-koncentration<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
19
Ammonium-persulfat<br />
Poly-akrylamid är det mest använda gelmaterialet för protein-separation<br />
Acrylamid<br />
Polyacrylamid<br />
SDS-polyacrylamid gel-elektrofores (SDS-PAGE)<br />
Natrium dodecyl-sulfat (SDS)<br />
SDS binder in till <strong>proteiner</strong> med ett bestämt antal molekyler/aminosyra.<br />
Effekten blir att laddning/massa blir konstant.<br />
O<strong>av</strong>sett <strong>hur</strong> stort ett protein är så kommer det att vandra lika fort i en<br />
lösning över vilken en spänning är lagd.<br />
I SDS-PAGE orsakas storleks-separationen <strong>av</strong> <strong>hur</strong> tätt nätverket <strong>av</strong><br />
akrylamid är. Stora <strong>proteiner</strong> bromsas upp mer än små, <strong>och</strong> vandrar<br />
därför långsammare.<br />
TEMED katalyserar<br />
”bis-”<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
20
BSA<br />
SDS-polyacrylamid gel-elektrofores (SDS-PAGE) med ”stacking gel”.<br />
Ofta kör man SDS-PAGE i ett två-fas system:<br />
överst har man en ”stacking gel” med tris-glycin buffert pH 6.8<br />
(oftast 4 procent acrylamid),<br />
under detta är separationsgel med tris-glycin buffert pH 8.8<br />
(variabel procenthalt acrylamid <strong>av</strong>gör separation).<br />
Prover<br />
pH 6.8<br />
pH 8.8<br />
Innan spänning<br />
94 -<br />
67 -<br />
43 -<br />
30 -<br />
20 -<br />
Kloridjoner vandrar fortare<br />
än glycin, skapar en zon<br />
mellan två fronter med ett<br />
kraftigt spänningsfält.<br />
Proteiner ordnar sig i skarpa band!<br />
Detektion <strong>av</strong> <strong>proteiner</strong> på gel:<br />
för att möjliggöra kvantifiering <strong>av</strong> detekterade <strong>proteiner</strong>!<br />
(studera expressions-förändringar)<br />
- färgningar<br />
- Coomassie blå (okänslig, god linjär respons)<br />
- silverfärgning (känslig, snabbt mättad respons)<br />
- fluorescenta färger (känslig, bra linjär respons)<br />
- autoradiografi <strong>av</strong> radioaktivt inmärkta <strong>proteiner</strong> (mycket god linjär respons)<br />
- western blotting (specifik detektion med god linjär respons)<br />
803033<br />
(Duracryl, Mattias silver stain)<br />
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.<br />
94 -<br />
67 -<br />
43 -<br />
30 -<br />
20 -<br />
803034<br />
(Duracryl, Coomassie stain)<br />
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.<br />
(detektionsgräns för BSA-protein är ca 34 ng med Coomassie-blå<br />
<strong>och</strong> ca 3 ng med silverfärgning)<br />
glycin är zwitterjoniskt vid pH 6.8,<br />
negativt laddat vid pH 8.8.<br />
När glycinfronten når in i separationsgel<br />
så vandrar den ikapp kloriden <strong>och</strong><br />
<strong>proteiner</strong>na separeras efter storlek.<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Wells contain:<br />
1. 2000 fmol BSA =135 ng<br />
2. 1000 = 68 ng<br />
3. 500 = 34 ng<br />
4. 250 = 17 ng<br />
5. 100 = 7 ng<br />
6. 50 = 3.5 ng<br />
7. 20 = 1.4 ng<br />
8. 10 = 0.7 ng<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
21
Western blotting: antikropps-detektion <strong>av</strong> <strong>proteiner</strong> på membran<br />
första detektion med specifik primär-antikropp. Denna antikropp detekteras sedan<br />
med en enzym-kopplad sekundär-antikropp som känner igen primär-antikroppen.<br />
Principen för isoelektrisk fokusering:<br />
<strong>proteiner</strong> vandrar i en pH gradient till sin isoelektriska punkt (pI).<br />
(primär-antikropp)<br />
(sekundär-antikropp<br />
- ofta länkad till HRP)<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Genom att välja olika gradienter<br />
kan man få olika bra separation.<br />
(finns också icke linjära gradienter)<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
22
(Kombination <strong>av</strong> SDS-PAGE <strong>och</strong> IEF!)<br />
two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis<br />
1 DIMENSION<br />
pH<br />
10<br />
3<br />
2 DIMENSION<br />
large<br />
SDS<br />
small<br />
2D-PAGE<br />
2D-PAGE gel med 3 miljoner dpm <strong>av</strong> radioaktivt inmärkt jästprotein laddat.<br />
kDa<br />
100<br />
70<br />
50<br />
30<br />
20<br />
5.0 6.0 7.0 8.0 9.0<br />
pI (pH)<br />
Isoelektrisk fokusering,<br />
möjligt att välja pH gradient<br />
SDS-PAGE<br />
separera <strong>proteiner</strong> efter storlek<br />
beroende <strong>av</strong> acrylamidkoncentration<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
23
Mass spektrometri ger oss identitet på många fläckar....<br />
kDa<br />
100<br />
70<br />
50<br />
30<br />
20<br />
Hsp82<br />
Hsc82<br />
Ssa2<br />
Sse1<br />
Vma1 Sti1<br />
Met6<br />
Ssa1 Ssb1/2 Pab1<br />
Hsp60<br />
Ctt1<br />
Dak1 Ald6<br />
Pdc1<br />
Hxk2<br />
Thr4 Pdc5<br />
Pyk1<br />
Pgi1<br />
Gdh1<br />
Atp2<br />
Ald3<br />
Sam1<br />
Arg1<br />
Lys9 Eno2 Met17 Eno1 Smh2<br />
Tef1/2<br />
Gpd1<br />
Sam2<br />
Tuf1<br />
Gln1<br />
Pgk1<br />
Yil041w Act1<br />
Adh1<br />
Psa1<br />
Fba1<br />
Ilv5<br />
Rnr4<br />
Yjr105w<br />
Tal1<br />
Tdh3<br />
Ipp1<br />
Thi5/11/12, Ydl244w<br />
RplA0<br />
Pdb2<br />
Mol1<br />
Tdh2<br />
Efb1<br />
Bmh2<br />
Yst1 Bmh1<br />
Ymr116c<br />
Tdh1<br />
Gpp1<br />
Bgl2 Yst2<br />
Gpp2<br />
Ykl056c<br />
Ylr109w<br />
Tsa1<br />
Hsp26<br />
Adk1<br />
Sod1<br />
Tpi1<br />
5.0 6.0 7.0 8.0 9.0<br />
pI (pH)<br />
Gpm1<br />
Proteins in blue were recently identified by MS-MALDI ,<br />
Proteins marked in red were identified by sequencing.<br />
bildanalys används för att<br />
detektera <strong>och</strong> katalogisera<br />
punkterna.<br />
Idealt ska <strong>proteiner</strong> vandra<br />
som normalfördelade toppar.<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
24
Vi kan jämföra flera geler <strong>och</strong> när vi har använt mass-spektrometri för att identifiera <strong>proteiner</strong>na<br />
så blir det roligare data.<br />
tpk1w1 35 -<br />
TPK1<br />
bcy1∆<br />
The change in relative abundance can be determined<br />
with the aid of image analysis software.<br />
35 -<br />
35 -<br />
Tdh3<br />
Tdh2<br />
..som vi kan använda för att bygga<br />
upp en förståelse <strong>av</strong> <strong>hur</strong> hela<br />
flödesvägar i cellen regleras.<br />
0M 0M NaCl NaCl 1M 1M NaCl NaCl<br />
Tdh1<br />
7.0 7.0<br />
The influence of salt and<br />
PKA activity on the expression<br />
of enzymes in glycolysis<br />
Trehalose<br />
Glycerol<br />
PDB1<br />
Glucose<br />
1<br />
0<br />
HXK2<br />
PGI1<br />
PFK1<br />
- -<br />
FBA1<br />
PGK1<br />
GPM1<br />
ENO1 ENO2<br />
PYK1<br />
GLK1<br />
TDH1 TDH2 TDH3<br />
PDC1<br />
Acetate<br />
TDH1<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
ADH1<br />
Ethanol<br />
ALD3 ALD6<br />
Joakim Norbeck vt-08<br />
25
Change language