LABORATION 1 - Högskolan i Kalmar

För biokemisk analys nyttjas därför den sk UV/synligt ljus spektrofotometern, figur 4,
vanligen i området från ca 240 till ca 700 nm. Proteiners absorption ses i två
våglängdsområden, kring 200 nm respektive 280 nm. Det är dock 280 nm som rutinmässigt
nyttjas för koncentrationsbestämning av proteiner, eftersom vatten som ofta är närvarande
absorberar vid 200 nm. Absorptionen vid 280 nm beror bl.a. på delokaliserade elektroner i
de aromatiska aminosyrorna fenylalanin, tyrosin och tryptofan. Eftersom olika proteiner
har olika innehåll av aromatiska aminosyror, absorberar proteiner olika starkt vid 280 nm.
Absorption vid 200 nm orsakas däremot av bl.a. delokaliserade elektroner i
peptidbindningen i polypeptidkedjan. Nukleinsyror med sitt innehåll av puriner och
pyrimidiner har absorptionsmaximum kring ca 260 nm. Kolhydrater liksom fetter
absorberar i samma område som vatten och ex etanol och lösningar av dessa är därför svåra
att direkt analysera spektrofotometriskt.
UV- synligt ljus- spektrofotometern
En UV/synligt ljus spektrofotometer, figur 4 och 5, består generellt av en ljuskälla,
(vätgas eller wolframlampa), en monokromator (bryter/sprider ljuset i olika våglängder), en
slit (skärmar av intilliggande våglängder), ett kyvetthus (där kyvett med prov placeras), en
detektor samt en potentiometer (skrivare, printer) som registrerar uppkommen potential
över detektorn.
Figur 4. Schematisk skiss över mätning av absorption med en UV/synligt ljus
spektrofotometer.
Ljuskällan
Ljuskällan skall ge maximal ljusenergi inom ett önskvärt våglängdsområde, vilket i
efterföljande led reducerar nödvändig förstärkning. UV-lampan som vanligen är en
vätgaslampa (D2-lampa) utsänder våglängder i intervallet 190 - 360 nm. Wolframlampan
utsänder ljus från ca 320 till drygt 900 nm.
Monokromatorn
Monokromatorn, som kan utgöras av ett gitter, ett prisma eller annan typ av
ljusspridningsutrustning skall som namnet anger kunna separera upp infallande ljus så att
monokroma (1 färg) strålar bildas. Dessa ljusstrålar skall således innehålla ett så snävt
våglängdsintervall som möjligt, dvs önskad våglängd skall vara väl skiljd från intilliggande
våglängder. Samtidigt skall de ha kvar hög intensitet. En spektrofotometers upplösning är
ett mått på monokromatorns kvalitet (högskolans Varian 634 S spektrofotometer har en
upplösning på 0,2 nm, medan Hitachi U-2000 endast har en upplösning på 2 nm). En
upplösning på 0,2 nm innebär att den inställda våglängden motsvarar den faktiska med ±
10