moleküler biyolojide kullanılan yöntemler

More documents

Recommendations

Info

• Biyolojik örneklerin hazırlanmasında orta ya da yüksek hızlı santrifüjlerin kullanımı gereklidir. • Bu santrifüjlerle, parçalama sürecinden sonra hücresel atıklar yok edilebildiği gibi hücre organelleri (nukleus, mitokondri,kloroplast gibi) ve kimyasal uygulamalar sonrasında makromoleküller (nükleik asitler, proteinler vb) çöktürülebilir. 55 57 59 • Günümüzde rotorlar daha çok karbon-fiber karışımı malzemelerden imal edilmektedir. • Bunlar hafif olduklarından hızlanma ve durma süreleri kısadır. • Bu santrifüjler içinde en çok kullanılanları orta hızda dönüm yapan mikrosantrifüjlerdir • Maksimum hızları genellikle 12.000-15.000 rpm dir (11.000-12.000 xg) 56 Ultrasantrifüjler • En karmaşık yapılı olan santrifüjlerdir. • Ultrasantrifüjlerle çok yüksek devirlere ulaşılabilmesi nedeniyle rotorda yüksek derecede ısı artışı oluşacağından çalışma sırasında cihazın içinin soğutulması ve sürtünmenin engellenmesi için yüksek vakumda tutulması gerekir. • Metal rotorların yüksek basınç etkisiyle nadir de olsa parçalanma tehlikesi olduğundan aletin içi çelik tabaka ile kaplidir. Ultrasantrifüjler; • hücre bileşenlerinin ayrılmasında (organel veya moleküllerin) • saflaştırılmış moleküllerin analitik ölçümlerinin yapılmasında kullanılır. Örn. saflık derecesi, molekül ağırlığı, yoğunluğu, biçimi, bileşenlerin özellikleri ve oranlarının belirlenmesi gibi. 2/21/2013 58 60 10
Santrifüjleme uygulamaları Hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi • Üzerinde çalışılan örneğin ilk aşamada belli bir süre uygun hızda döndürülmesiyle elde edilen iki ayrı fazda (çökelti ve üst sıvı) preparatif amaçlı olarak daha ileri düzeyde ayırım yapmak üzere hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi kullanılır. • Bu santrifüjlemede, kaba çökeltilerden hücre organellerine ve makromoleküllere kadar farklı boyuttaki partiküller birbirinden ayrılır. • Diferansiyel santrifüjleme kullanılarak partiküllerin çökelme hızını ifade eden çökelme katsayıları (s) hesaplanabilir. • Birimi saniye olan s terimi genellikle standart koşullarda, 20 C de ortam olarak su kullanılarak yapılır. • S değeri, biyolojik makromolekülleri ve hücre organellerini sınıflanddırmada kullanılan bir özelliktir. Bir molekülün ya da organelin boyutunu (molekül ağırlığı, baz çifti vb) hesaplamakta kullanılır. Yoğunluk derecelenmesi santrifüjleme (density gradient) • Örnek yoğunluğu tüpün tepesinden dibine doğru giderek artan akışkan bir ortamda santrifüjlenir. • Differansiyel santrifüjlemeden farklı olarak, bu yöntemde değişik boyutttaki partikullerin tek bir santrifüjleme ile ayrılması mümkün olur. 61 63 65 • Bu temele dayalı olarak hücre bileşenlerinin daha özgül biçimde ayrılmasını sağlamak üzere farklılığa bağlı (differential) santrifüjleme geliştirilmiştir. • Bu yöntemde giderek artan hızlarda ardışık santrifüjleme uygulanır. • Santrifüjlemenin başında, tüm partiküller homojen şekilde dağılmıştır. • İşlem devam ederken partiküller sedimantasyon derecelerine göre çökerler • Çökelme katsayıları 1x10 -13 -10.000x10 -13 arasında değişir. • Sayısal açıdan kolaylık sağlamak için çökelme katsayıları Svedberg birimi (S) ile ifade edilir. • 1S= 1x10 -13 saniyedir. • Bu yöntem biyolojik makromoleküllerin ayrılması ve saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. • Bu yöntemle s ölçümü de yapılabilir. • Özellikle nükleik asitler bu yöntemlerin kullanımıyla ayrıntılı şekilde araştırılabilmektedir. • DNA ve RNA s değerlerine göre sınıflandırılabilir ve DNA’nın farklı yapısal biçimleri ayırt edilebilir. • Bu yöntem ayrıca, ribozom, mitokondri, kloroplast gibi hücre bileşenlerinin izolasyonu ve saflaştırılmasında da kullanılmaktadır. 2/21/2013 62 64 66 11
Page 1 and 2: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN
Page 3 and 4: • Bu yöntemin en basit uygulama
Page 5 and 6: • Bir makromolekülün homojenatt
Page 7 and 8: • Dengeye ulaşıldıktan sonra,
Page 9: • Genellikle ortalama RCF’nin h

moleküler biyolojide kullanılan yöntemler

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?