Moleküler Patoloji Laboratuarında Kontaminasyon ve Alınacak ...

Moleküler Patoloji LaboratuarındaKontaminasyon ve AlınacakÖnlemlerÖnder Bozdoğan

Kontaminasyon“Hekimden sorma, çekenden sor”**Türk Atasözü

Kontaminasyon• Tanım:– Sözlük anlamı: kirletme, kirlenme, bulaşma,bulaştırma.– Türkçe sözçük: Bulaş?– Bilimsel alana ve teknik disipline göre anlamfarklılığı.– Biyolojik bilimlerde:• Biyolojik deneyin sonuçlarını etkileyecek yabancımaddenin deneye karışması:– Yabancı madde kimyasal yada biyolojik olabilir.

Moleküler Patoloji LaboratuarındaKontaminasyon• Bir PCR reaksiyonuna, genomik DNA, amplikon,dışarıdan DNA karışması, sonucunda ortaya çıkanyalancı pozitif sonuç.

Kontaminasyon Kaynakları• Laboratuar personeline ait çeşitli biyolojik materyaller(Saç, tükürük, ter vb.)• Çevresel DNA kaynakları (Su, havalandırma).• Daha önce incelemesi yapılan biyolojik örnekler vekalıntıları.• Daha önceki deneylere ait amplikonlar.(PCR ürünleri)*• Firmalar tarafından kitlerle verilen pozitif kontroller.• Kitlerin ve kimyasaların üretimi sırasında üretim hattınagiren biyolojik materyaller.

Kontaminasyon Tipleri• Örnek kontaminasyonu.• Laboratuar (yüzey) kontaminasyonu.• Taşıma (carry‐over) kontaminasyon.• Kimyasal(Kit) kontaminasyonu.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu• Çok hassas ve verimli bir yöntemdir.• Teorik olarak bir DNA molekülü 35. çevrimden sonrasonra >10 9 molekül düzeyine ulaşır.• Testin bu kadar etkin olması kontaminasyon sıklığınıartıran önemli bir nedendir.• Üç aşamada da kontaminasyon olabilir .Bu aşamalar .• Örnek hazırlama(DNA ekstraksiyonu vb)‐PrePCR• PCR amplifikasyon‐PCR• Analiz, ürünün incelenmesi.(Jel yürütme, görüntüleme,hibridizasyon vb.) ‐PostPCR.• Pre ve post PCR aşamalarının her ikisinde desterilizasyon önlemleri almak zorunludur.

Real‐Time PCR, Dean Fraga, Tea Meulia, and Steven Fenster. Current Protocols Essential Laboratory Techniques.2008

Kontaminasyon• Hastaların yanlış tanı ve tedavileriylesonuçlanabilir.• Bilimsel çalışmalarda önemli hatalara yolaçabilir. Çalışmanın geri çekilmesiylesonuçlanabilir.• Önemli ölçüde maddi kayıplara yol açabilir.• Laboratuarın ün kaybına yada resmi olarakhizmet verilmesinin durdurulmasıylasonuçlanabilir.

Kontaminasyonu engellemeye yönelikyöntemlerde amaç?• Kontaminasyona sebep olacak her büyüklüktekiDNA fragmanlarını ortadan kaldırmak ancak PCRperformansını etkilememek.

Sorunlar• PCR yöntemlerinin etkinliği.• DNA’nın dayanıklı yapısı.• Testlerin çok fazla sayıda basamak içermesi.• Kontaminasyonu engellemede kullanılanyöntemlerin küçük (

Kontaminasyonun Saptanması• Kontaminasyon bazı durumlarda gözden kaçabilir.• Tipik şüphe NTC(No template control) dapozitivite ortaya çıkmasıyla oluşur.• Ancak artmış pozitivite oranlarında daşüphelenilmelidir.• “Wipe test” yüzeylerin kontaminasyonunugösterebilir.• Primer dimer oluşumu Syb‐Green’le Real‐timePCR’da kontaminasyon görüntüsü verebilir.!!!

• Mekanik önlemler• Kimyasal önlemler• Diğer– UV– γ radyasyon.– Otoklavlama– Urasil N‐glikosilaz.– İsopsoralen, psoralen.+UV– Hidroksilamine hidroklorid.– Etidyum Monoazid(EMA)– Nükleazlar– Restriksiyon enzimleri• Eğitim• DenetimNeler yapılabilir?

Mekanik Önlemler• Laboratuarın dizaynı.– PCR öncesi– PCR– PCR sonrası alanlar ayrılmalı.• Materyal akışı:– Kimyasalların hazırlandığı alandan PCR alanına, PCR alanından analizalanına yönelik tek yönlü olmalı.– Amplikon asla sterilize edilmeden PCR öncesi alanlara ve PCR alanınageri alınmamalıdır.• Her alanda ayrı cihazlar ve sarflar bulunmalı. (Pipet setleri,pipetuçları, vorteks, santrifüj vb.)• Teknisyenlerin üzerlerinde kirli materyal taşımaları engellenmeli.Gözlükler, değiştirilmeyen eldivenler, giysiler üzerinden amplikontaşınabilir.

KimyasalDeposuKimyasalHazırlamaPCR öncesiMastermiksKimyasal Hazırlama odası/alanıÖrnek GirişiDNA/RNAÇıkarımıPCRKurulumÖrnek Hazırlama odası/alanıPCRPCR Post PCR odası/alanıÜrün SaptamaPostPCRhttp://www.clinicallabconsulting.com/Contamination.pdf yararlanılmıştır.

Mekanik Önlemler• UV lamba içeren laminar flow kabinlerinde PCR kurulmalıdır.• Otomatik pipetleme ve örnek hazırlama cihazları tercih edilmelidir.• Sık sık eldiven değiştirilmelidir.• Çöp atım kutuları uygun olmalı sık sık değiştirilmelidir.• Sıvılar, kitler etiketlenmeli, açılış tarihleri üzerlerine yazılmalıdır.• Pipetler "positive‐displacement“ tipte olmalıdır.• Filtreli pipet uçları kullanılmalıdır.• DNAaz ve RNAaz –free, steril tek kullanımlık tüpler kullanılmalıdır.• Tüplerin tipi, kapak özellikleri kontaminasyonu azaltabilir veya artırabilir.• Mikrotüpler açılmadan (Özellikle DNA içeren) hafifçe santrifüjlenmelidir.• PCR suyu küçük alikotlara ayrılmalıdır.‐Ben derin dondurucuda tutuyorum.• PCR kurulumunda DNA en son eklenmelidir.

Yüzey Kontaminasyonu

Sodyum hipoklorid(NaClO)• Çamaşır suyunun etkin maddesidir.• Çamaşır suyunda sıklıkla %3‐8 konsantrasyondabulunur.• % 10 luk sodyum hipoklorid.– Ucuz etkin bir malzeme.– Tüm yüzeylerin temizliğinde, pipetlerin uç kısımlarınınsilinmesinde kullanılabilir.– Silindikten sonra yüzeyler %70 lik alkolle silinmelidir.– Nükleik asitlerde oksidatif hasar oluşturur.Böylelikleamplikonun veya DNA fragmanının yapısı değişir.

• Hidrojen peroksid güçlüoksidizan bir maddedir.• DNA elimininasyonuyaptığı bilinmektedir.• 2007 yılında patent altınaalınmıştır.!!!!!• %3’lük konsantrasyondauygulanmaktadır.• Yüzey temizliğinde vepipet temizliğindekullanılabilir.• Aşındırıcıdır.H 2 0 2

CoPA solusyonu• Bakır‐bis‐sülfat/H202 solusyonu.• Patentli bir solusyondur. US patent no 5858650.• Yüzey temizliğindeki etkinliği oldukçayüksektir.

Ticari Ürünler• Yüzey, pipet temizliğinde kullanılan ticariürünlerde mevcuttur.• Bu ürünlerin bir kısmı DNAaz ve RNAaz gibienzimleri de etkisiz hale getirir.• RNAaz’ ı etkisiz hale getiren solüsyonlar RNAekstraksiyonu sırasında yararlı olabilir.• Ticari ürünler sodyum hipoklorid ve hidrojenperoksitle karşılaştırıldığında test sayısı fazlaolan merkezlerde maliyeti artırır.

Ultraviyole (254 nm)• Sterilizasyonda UVC kullanılır.• Etkisi lamba ile sterilize edilecek malzeme arasındaki mesafenin karesiyle tersorantılıdır.• DNA’da timidin türevleri ve diğer değişiklikler oluşturması önemli etkimekanizmasıdır.• Primidin‐primidin eklentileri(photoadducts)• Siklobutilprimidin dimerleri.• Bazların oksidasyonu.• Tek zincir kırıkları.• Çift zincir kırıkları.• Sıklıkla 5‐20 dk önerilir.Yeterli ??• Ucuz bir yöntemdir.• Ancak 300 bazdan küçük sekanslarda ve G‐C’den zengin sekanslarda etkinliği dahadüşük olduğu ileri sürülmüştür.• Materyalin kaynaktan uzaklığı da önemlidir. Mümkün oldukça yakın.• Kurumuş materyalde etkinliği azalır.

Ultraviyole (254 nm)• Pratikte :– Çalışma alanı‐En çok önerilen.– Pipet uçları– Pipetler– Tüpler– “Plate”ler– PCR suyu– PCR mix(Taq polimeraz ve primerler olmadan)‐Ben uygulamıyorum.UV ile sterilize edilebilir.• Kullanırken, kullanıcı için önlemleralınmalıdır.• Kabinlerin içerisinde veya tezgahların üzerinekonulabilen basit düzeneklerle kullanılabilir.• Malzeme sterilizasyonunda UV croslinkerlerönerilebilir.• Ölçüm yapılarak etkinliklerini saptamakpratik olmadığından, kullanım süresine göredüzenli değişim önerilir.

Otoklavlama• Temel olarak mikroorganizmalara etkilidir.• Özellikle filtre uçları, pipetler, tüpler vb. sarflarınsterilizasyonunda kullanılır.• DNA‐free, steril malzeme kullanılmasıotoklavlama ihtiyacını ortadan kaldırabilir.• Bir çalışmada UV göre daha üstün olduğugösterilmiştir. (121 o / 2 saat uygulandığında).*• Küçük DNA fragmanlarına etki yapabilir. 200bp

Taşıma KontaminasyonveKimyasal Kontaminasyonu

Urasil N‐glycosylase(UNG)• DNA tamir enzimidir.• Görevi sitozinin spontandeaminasyonu sonucu oluşan urasilinDNA’dan uzaklaştırılmasınısağlamaktır.• Longo(1990) ve takipçileri bu yöntemiileri sürmüştür.• Bugün birden çok ticari kit mevcuttur.• Ticari kitlerin köken aldığı bakteriveya canlıya göre optimize edilmesigereklidir.• Amplicon üründe bulunan Urasilietkilemesi mantığına dayanır.• Öncelikli kullanım alanıtaşıma(Carry‐over) kontaminasyonuönlemektir.http://www.clinicallabconsulting.com/Contamination.pdf

Urasil N‐glycosylase(UNG)• Enzim oda ısısında aktiftir ve 10dakika inkubasyon ürünü sterilizeeder.• İlk siklusta 95 o dereceye ulaşmasıenzimi büyük orandainaktifleştirir.• Ancak bazı durumlarda enzimtam inaktive edilemediği için sonürünlerin hızlı bir şekilde alınarak‐20 de veya +72’de tutulmasıönerilir.• Timinden fakir G+C’den zenginsekanslarda etkinliği düşer.• Urasil içeren ürünler Southernblot yönteminde ve restriksiyonendonükleazların kullanıldığıtekniklerde sorunlar çıkarabilir.http://www.roche‐applied‐science.com/sis/amplification/pcr_amplification_051100.html

FurocoumarinlerPsoralenIsopsoralenJournal of Chromatography A 2004; 1055: 135‐140.

Furocoumarinler• Bitkilerden çıkarılan organik kimyasalürünlerdir.• İki molekül sterilizasyon içinkullanılabilir.• Psoralen‐Amplicon analizini etkileyebilir.• İsopsoralen• UV radyasyonla karşınca DNA ilekovalent bağlarla bağlanırlar.• Oldukça etkin bir yöntemdir. Ancak– Yöntem optimizasyona ihtiyaç duyar.PCR’ı inhibe etme potansiyelleri vardır.– Psoralen‐Amplicon analizinietkileyebilir.– Karsinojeniktir.– G+C zengin sekanslarda ve kısasekanslarda(

Primer Hidrolizi• Amplikonlarda bulunan riboz residülerinin alkalinhidrolizine dayanıksız olması temel etkimekanizmasıdır.• PCR ürünleri 1M NaOH’e 30 dakika inkube edilir.• Ürünler hidrolize olduğu zaman amplikonun primerbağlanma alanı ortadan kalkar.• Böylece yeni PCR’la aynı alandan primerlerle çoğaltmayapılamaz.• Etkinliği diğer yöntemlere göre daha düşüktür(10 6 ) ,NaOH katılması sırasında amplicon damlacıkları ortamasaçılabilir.• G+C zengin ampliconlarda etkindir.

Hidroksilamine• “Hidroksilamine hidroklorid eklenmesiylesitozinleri kimyasal olarak modifiye etmesimantığına dayanır.• Ucuz bir yöntemdir.• Kısa ve G+C zengin ampliconlara da etkindir.• Karsinojeniktir, PCR sonrası analizlerdesorunlar yaratabilir.

Etidyum Monoazid(EMA)/PropidyumMonoazid(PMA)• Yeni bir yöntemdir.• Görünür ışıkta belirtilen kimyasalların DNA ile kovalenbağlar yapmasına ve böylece PCR’da çoğaltılamamasımantığına dayanır.• Konsantrasyona dikkat etmek gerekir. Yüksekkonsantrasyonlarda PCR’ın etkinliğini azaltır.• EMA 12.37 μM ve PMA 6.26 μM konsantrasyonuaşmaması önerilmekte.*• Klasik PCR ve Teksas Redle işaretli problardauygulandığı gösterilmiş ancak Syb‐ Green boyasınaetkisi bilinmemektedir.*I. Hein et al. / Journal of Microbiological Methods 71 (2007) 336–339

DNAazlar• Restriksiyon endonükleazlar denenmiş olmakla beraber her ürüniçin farklı nükleazların kullanımının zorunluluğu, optimizasyon,inhibisyon sorunları yüzünden yaygın kullanım alanı bulamamıştır.• Kullanılabilecek spesifik olmayan DNAazlar:– DNAaz I :• Özellikle çift zincir DNA’yı keser.• PCR öncesi 95 0 inaktive edilmesi gereklidir.• Bu ısı artışı Taq polimerazın erken aktivasyonu ile sonuçlanabilir ve PCR’ınetkinliği düşebilir.• Primerlerin dekontaminasyonunda kullanılamaz.– hl‐ dsDNAaz:• Etkin olarak çift sarmal DNA’ya afinite gösterirler.• Daha etkin ve daha özgündür.• 55 0 de inaktive edilmesi nedeniyle Taq etkinliğine azalması beklenmez.• Primerlere önemli bir etki yapmadığına dair deneysel bulgular vardır.

Yöntemlerin Karşılaştırılması

Lalueza‐Fox C, Champlot S, Berthelot C, Pruvost M, Bennett EA, Grange T, et al. An Efficient Multistrategy DNA Decontamination Procedure of PCR Reagents forHypersensitive PCR Applications. PLoS ONE 2010;5(9):e13042.

Konuşmacıdan bir kaç deneyim.• Real time PCR’da ve diğer PCR yöntemlerinde ürüne ek bir işlem yapılmayacaksa20‐30 mikrolitre mineral oil kontaminasyonu azaltır.• Real time platelerini kestiğinizde tasaruf edebilirsiniz ancak kontaminasyon artar.• Real time platelerde filmle kapatma yerine optical cap içeren kapaklarkontaminasyonu azaltır.• Tüpleri seçerken kontaminasyonu engelleyen kapaklı olan ve kaliteli malzemetercih edilmelidir.• Kontaminasyonun yoğunluğu önemlidir. Örn:Real time PCR’da pozitif sonuçtan 10siklus sonra ortaya çıkan kontaminasyon gözardı edilebilir.• Fiziki şartları çok iyi olmayan bir laboratuarınız varsa mümkün olduğu kadar azişlem gerektiren yöntemler seçilmelidir.• PCR suyu en sık kontamine olan materyaldir, küçük alikotlara ayrılmalı vedondurulmalıdır.• Buz üzerinde çalışmak yerine soğutucu tablalar tercih edilmelidir.• Her teknisyene ait bir pipet seti oluşturulmalıdır, bazı teknisyenler kontaminasyonaeğilimlidir.• Yöneticilere moleküler yöntemlerin özel alanlara ihtiyacı olduğu anlatılmalıdır.• Pipet kullanmak bir sanattır ancak öğrenilebilir.

Sonuç• Kontaminasyonla az karşılaşmak için:– İyi laboratuar uygulamaları, uygun laboratuarortamı, iyi yetişmiş teknisyen.– Pozitif olguların sıklığını takip, negatif ve pozitifkontrol kullanımı.– Kalite kontrol uygulamaları ve denetim.– Yüzey temizliği.– UNG vb. amplicon kontaminasyonunu önleyenyöntemlerin kullanımı.– Kapalı sistemler kullanımı.

Hiç bir önlem özenli, dikkatli yapılan bir tekniğin,özenli ve dikkatli çalışan eğitimli birteknisyenin yerini tutamaz.

Kaynaklar1. Añez‐Lingerfelt M, Fox GE, Willson RC. Reduction of DNA contamination in RNA samples for reverse transcriptionpolymerasechain reaction using selective precipitation by compaction agents. Analytical Biochemistry2009;384(1):79‐85.2. Gefrides LA, Powell MC, Donley MA, Kahn R. UV irradiation and autoclave treatment for elimination of contaminatingDNA from laboratory consumables. Forensic Science International: Genetics 2010;4(2):89‐94.3. Hein I, Schneeweiss W, Stanek C, Wagner M. Ethidium monoazide and propidium monoazide for elimination ofunspecific DNA background in quantitative universal real‐time PCR. Journal of Microbiological Methods2007;71(3):336‐39.4. Lalueza‐Fox C, Champlot S, Berthelot C, Pruvost M, Bennett EA, Grange T, et al. An Efficient Multistrategy DNADecontamination Procedure of PCR Reagents for Hypersensitive PCR Applications. PLoS ONE 2010;5(9):e13042.5. Mohammadi T, Reesink HW, Vandenbroucke‐Grauls CMJE, Savelkoul PHM. Removal of contaminating DNA fromcommercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods 2005;61(2):285‐88.6. Rueckert A, Morgan HW. Removal of contaminating DNA from polymerase chain reaction using ethidium monoazide.Journal of Microbiological Methods 2007;68(3):596‐600.7. Yang Q, Xu J, Qian X, Zhang K, Lei X. Eliminating nucleic acids contaminants by hydrogen peroxide‐induced freeradicals during the preparation of proteins. Biochemical Engineering Journal 2006;29(1‐2):23‐26.8. Aslanzadeh J. Preventing PCR amplification carryover contamination in a clinical laboratory. Ann Clin Lab Sci2004;34(4):389‐96.

Sabrınız İçin Teşekkür Ederim