Protein Ekstraksiyonu

Protein EkstraksiyonuDr.Gaye Güler TezelHacettepe Üniversitesi Tıp FakültesiPatoloji Anabilim Dalı

• Proteinler tüm canlı organizmalar için en önemlimakromoleküllerden biridir.• Bazıları yapısal komponentleri oluştururken, diğerleriise iletişim, savunma, hücre düzenlenmesi ve enzimfonksiyonlarını gerçekleştirir.• Yaşamla ilgili hiçbir işlem protein olmaksızıngerçekleşemez.

• Proteinin şekli biyolojik aktivitesini belirler.Tek bir protein değişik yapıda ve birden fazlafonksiyona sahip olabilir.

• İlgilenilen biyolojik molekül grubununizolasyonu amacıyla gerçekleştirilenekstraksiyon işlemleri parçalama (lizis) veayırma (saflaştırma) aşamalarından oluşur.

• Ekstrakte edilecek protein membrana bağlıveya sitoplazmik bir proteinse önce hücreçeperi aşılmalıdır• Bu aşamada kullanılabilecek uygun teknikseçilmeli ve protein yapısının zarar görmesiengellenmelidir

• Membran proteinlerinin ekstraksiyonunda(hücre membranı veya organellerinmembranlarında) farklı yöntemler mevcut• Özellikle organel membran proteinleri içinönce organel izolasyonu daha temiz ekstresağlar

• Dokuya ve organele uygun izolasyon yapılarakorganelin zarar görmemesi ve proteinin membrandakalması önemli• Diferansiyel santrifüj kullanımı yaygın(düşük hızlarda önce nukleus, sonra artan hızlardamitokondri ve son olarak da ribozom gibi en küçükmoleküller çöktürülür)

• Aşırı ısınma önlenmelidir• Parçalama sırasında ortaya çıkacakproteazların etkisinden korunmalıdır

• Parçalama sonunda elde edilenhomojenattaki çözünmeyen materyalsantrifüjlenerek uzaklaştırılır• Önemli olan istenilen proteinin hementamamının sıvı faza (supernatant) geçmesidir

• Sıvının bir kısmı çözünmeyen hücreselartıklar ile kaybedilir• Karaciğer, kalp veya kas dokusu ileçalışıldığında doku ağırlığının 1.5-2 katıkadar ekstraksiyon (lizis) tamponu ilebaşlanmalıdır

Total hücre liziti hazırlama (taze doku)• SDS lizis buffer%2 SDS25mM Tris-HCl (pH 6.8)5mM EDTA1mM PMSF (proteaz inhibitörü-en son ekle)• Protein ekstraksiyonu yapılacak doku alınır, buzüzerinde 1gr doku başına yaklaşık 2-3 hacim bufferile homojenizasyon tüpünde ezilir

Pistonlu teflon homojenizatör

• Temiz bir ependorfa aktarılır• Ultrasonikatörde homojenizasyona devamedilir (bu sırada ısı artışı kontrol edilerekişlem durdurularak tüp buz üzerine alınır)

Ultrasonikatör

• 15000rpm da 1-2 saat santrifüj yapılır• Supernatant dikkatlice temiz bir tübe alınır• Her bir 1 ml örnek için; 2μl bromfenol blue50 μl DTT50 μl Gliserol eklenir

• 100°C de kapaklar açık olarak 3-5 dakikatutulur• Elektroforez için kullanılabilir• Hemen kullanılmayacaksa -20°C de hızladondurmak veya -80 °C de saklamakuygundur

• Dondurulmuş örneklerin kullanılacaklarızaman hızla çözünmeleri önemlidir, buamaçla su banyosunda (40-50 °C) sık sıkkarıştırarak çözünme uygundur

• Proteinler çok sayıda sekonder ve tersiyer yapılariçerirler, ve her zaman negatif yüklü olmazlar.• Bu yapıların uzaklaştırılması ve proteinlerinnegatif yüklü olmaları için SDS (sodyum dodesilsülfat) deterjanı ile muamele edilirler.

• PMSF (fenilmetilsülfonilfluorid) serin proteazinhibitörü olarak eklenir• Suda çok az çözündüğünden aseton veyaetanol*de hazırlanır• Hızla hidrolize olduğundan hazırlandıktanhemen sonra kullanılmalıdır• Son konsantrasyonu 1mM olacak şekildelizis buffera son anda eklenmelidir

• Metalloproteinazlar aktiviteleri için ikideğerlikli metallere ihtiyaç duyar, EDTAmetal iyonlarıyla kompleks oluşturarakproteinlerin stabilizasyonunu sağlar• Son konsantrasyonu 2-5mM olacak şekildelizis buffera eklenmelidir

• Gliserol örneğe running bufferdan yüksekdansite kazandırır, bu da kuyucuğun dibinegömülmesine izin verir• Bromfenol blue düşük molekül ağırlıklı birboyadır, elektroforezin takibini kolaylaştırır• DTT indirgeyici ajandır, protein örneğindekidisülfit bağlarını azaltır

• Protein denatürasyonundan korunmak içinher aşamada pH ve ısı kontrol altında tutulur• İşlemler soğuk ortamda +4°C de buz üstündegerçekleştirilir• pH ise uygun tamponların kullanımı ilekontrol edilir• Tris bu amaçla kullanılır

• Protein boyanması– Protein Coomassie Blue (CB) ile boyanır.Protein-CB kompleksi koyu mavidir ve normalışıkda görülebilir

Moleküler Ağırlık• Protein: Dalton ya da Da, veya sıklıklakiloDalton (1000Da), ya da kDa olarak ifadeedilirler.