Analisis Protein

Maria Fransisca Sumual
6. ANALISIS KADAR PROTEIN

Pengantar
• Protein: Polimer asam amino
• Jumlah dan jenis asam amino
• Protein penting sebagai:
Sumber asam amino esensial (lysin, tryptophan,
metionin, leusin, isoleusin dan valin)
Struktur utama komponen makanan -- tekstur
Sumber energ

• Isolat protein sifat fungsional pada makanan
(tekstur, stabilitas emulsi dll) digunakan dalam
pembentukan gel, emulsifier, pembentukan busa
dan pengental
• Protein sebagai enzim menyebabkan reaksi
yang diinginkan maupun yg tidak diinginkan
Food analyst tertarik untuk mengetahui konsentrasi
total, jenis, struktur molekul dan sifat fungsional
protein dalam makanan

METODE KJELDAHL
• Dikembangkan oleh Johann Kjeldahl pada tahun
1883
• Prinsip: makanan yang dihancurkan dengan asam
kuat akan menghasilkan Nitrogen titrasi
• Kadar protein dihitung dari konsentrasi nitrogen
dalam makanan
• Faktor konversi 6.25 (setara dgn 0.16 g nitrogen per
gram protein)
• Faktor konversi berbeda untuk protein yang berbeda
komposisi as. Amino
• 3 tahap utama: destruksi, distilasi, titrasi (DDT)

Prinsip analisis:
1. Destruksi
• Sampel ditimbang dalam tabung destruksi
• Asam sulfat pekat sebagai agen pengoksidasi
• Natrium sulfat (anhydrous) untuk
meningkatkan titik didih percepat reaksi
• Cu, Se, Titanium, atau Hg sebagai katalis
percepat reaksi
• Nitrogen diubah menjadi gas amonia
• Bahan organik lain diubah menjadi CO 2 dan
H 2 O

• Gas amonia tinggal dalam larutan asam dlm
bentuk ion amonium (NH 4+ ) yang terikat pada
ion sulfat (SO 4
2-
)
N(makanan) (NH 4 ) 2 SO 4 (1)

Prinsip analisis:
2. Distilasi
• Hasil destruksi dinetralkan dengan
menambahkan NaOH (basa)
• Amonium sulfat gas amonia
(NH 4 ) 2 SO 4 + 2 NaOH 2NH 3 + 2H 2 O + Na 2 SO 4 (2)
• Gas amonia ditangkap oleh larutan asam borat
(konsentrasi berlebih, pH rendah) ion
amonium dan ion borat
NH 3 + H 3 BO 3 NH 4
+
+ H 2 BO 3
-
(3)
gas amonia + as. Borat ion amonium + ion borat

Prinsip analisis: 3. Titrasi
• Titrasi amonium borat dengan standard as.
Sulfat atau as. Hidroklorat (H 2 SO 4 atau HCl)
dengan indikator untuk menentukan titik
akhir reaksi
H 2 BO 3
-
+ H + H 3 BO 3 (4)
• Konsentrasi ion H (mol) yg dibutuhkan untuk
mencapai titik akhir reaksi = konsentrasi N yg
terdapat dalam sampel (persamaan 3)

Perhitungan: m mg sampel
dititrasi dgn x N HCl
% N = (A – B) x N HCl x 14,007 x 100
m mg sampel
Ket. :
A = vol (ml) HCL sampel
B = vol (ml)HCl blanko
% Protein = % N x faktor konversi

• Sample kosong (blanko) dikerjakan bersama
untuk mengeliminasi residu N yg mungkin
terdapat dalam reagen
• Kadar protein dihitung sbb:
%Protein = F x %N

Keuntungan dan Kerugian
• Keuntungan.
Metode Kjeldahl merupakan metode standar dengan
tingkat ketepatan tinggi dan dapat diulang sebagai
metode utama untuk estimasi protein dalam
makanan.
• Kerugian.
Tidak mengukur protein yg sebenarnya (hanya
mengukur N yg tidak semuanya berasal dari protein)
butuh faktor konversi berbeda untuk protein
berbeda.
As. Sulfat pekat pada suhu tinggi dan katalis sangat
berbahaya.
Teknik analisis membutuhkan waktu panjang

METODE DUMAS
• Sampel dipanaskan pada suhu 900 o C dalam
keadaan beroksigen CO 2 , H 2 O and N 2 .
• CO 2 dan H 2 O (gas) ditangkap oleh kolom khusus
• Kadar nitrogen diukur dgn menggunakan kolom
dengan detektor konduksi panas pada ujungnya
(Kolom memisahkan N dari CO 2 dan H 2 ).
• Perlu dikalibrasi menggunakan bahan dengan
konsentrasi N yg diketahui , contoh EDTA (=
9.59%N).
• Faktor konversi digunakan seperti pada metode
Kjeldahl.

Keuntungan dan Kerugian
• Keuntungan:
Lebih cepat daripada metode Kjeldahl (< 4 menit : 1 – 2
jam).
Tidak menggunakan bahan kimia atau katalis berbahaya.
Banyak sampel dapat dianalisis secara otomatis.
Mudah dilakukan
• Kerugian:
Biaya awal tinggi
Tidak mengukur protein sebenarnya
Membutuhkan faktor konversi yg berbeda
Sampel yg digunakan terlalu sedikit tidak representatif.

Metode UV-visible spectroscopy
• Perlu kurva standar untuk kalibrasi absorbansi
(atau turbiditas) vs konsentrasi protein
menggunakan larutan protein pada konsentrasi
seri yang berbeda, diukur pada panjang
gelombang yg sama.
• Konsentrasi protein ditentukan menggunakan
kurva standar
• Perbedaan disebabkan oleh gugus kimia yg
menyebabkan absorpsi atau pembiasan radiasi
(ikatan peptida, gugus samping aromatik, gugus
dasar, dan agregat protein).

Pengukuran langsung
λ = 280 nm
• Kadar triptofan dan tirosin berbagai jenis
protein konstan
• Keuntungan: sederhana, non destruktif, tidak
butuh reagen khusus
• Kerugian: asam nukleat juga terukur pada
panjang gelombang yang sama
• Modifikasi: menggunakan 2 panjang
gelombang berbeda sebagai koreksi

Metode Biuret
• Prinsip: Warna ungu terbentuk jika ion Cupri (Cu 2+ )
berinterkasi dengan ikatan peptida dalam kondisi
basa
• Reagen Biuret dicampur dengan larutan protein,
didiamkan selama 15-30 menit, kemudian
absorbansi dibaca pada λ = 540 nm.
• Keuntungan:
tidak ada gangguan dari bahan lain yg terabsorbsi pada
panjang gelombang lebih rendah
Absorbsi karena reaksi pada ikatan peptida tidak perlu
faktor konversi
• Kerugian: Sensitivitas rendah dibandingkan
metode UV-visible yang lain.

Metode Lowry
• Menggunakan reagen Biuret dan reagen Folin-
Ciocalteau phenol yg bereaksi dengan tyrosin
dan tryptophan pada protein.
• Menghasilkan warna kebiruan
• Dibaca antara λ= 500 - 750 nm 500 nm utk
menentukan konsentrasi protein yg tinggi (peak
kecil); 750 nm utk menentukan konsentrasi
protein rendah (peak tinggi).
• Lebih sensitif pada makanan dengan
konsentrasi protein rendah (dibandingkan met.
Biuret)

Metode Pengecatan (Dye binding)
• Pewarna anionik (bermuatan negatif)
dicampurkan pada larutan protein yg bermuatan
positif (<titik isoelektrik)
• Terbentuk endapan berwarna karena adanya
daya elektrostatik antara molekul
• Pewarna yang tidak diikat tetap dalam larutan
• Pewarna anionik diikat pada gugus kation residu
asam amino basa (histidin, arginin dan lisin) dan
pada gugus amino terminal yg bebas

• Jumlah pewarna yg sisa setelah sentrifugasi
ditentukan dengan mengukur absorbansi
• Jumlah protein dalam larutan protein = jumlah
pewarna yang terikat
dye terikat = dye awal - dye bebas

Keuntungan dan Kerugian
• Keuntungan:
Cukup cepat dan mudah dilakukan
Sensitif terhadap konsentrasi protein yg rendah
• Kerugian:
Membutuhkan pengenceran
Membutuhkan preparasi sampel seperti homogenasi,
ekstraksi, sentrifugasi, filtrasi waktu panjang
Kadang sulit untuk menghitung jumlah protein yg
diekstraksi dari makanan tertentu (terutama makanan
yang diproses)
Absorbansi tergantung pada jenis protein yg diuji
karena protein yg berbeda mempunyai sekuens asam
amino yang beda