подсекция «цикл наук о живом

Ломоносов-2008 «Химия» Цикл наук о живом
Клонирование, экспрессия в клетках E.coli и свойства рекомбинантной
формиатдегидрогеназы из Staphylococcus aureus
Войнова Наталья Сергеевна, Тишков Владимир Иванович
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
E–mail: vojnovanatalya@gmail.com
Анализ данных по секвенированию геномов патогенных микроорганизмов показал,
что во многих патогенах, в том числе Staphylococcus aureus, Mycobacterium avium subsp.
Paratuberculosis, Bordetella bronchiseptica, Legionella содержатся гены, которые
кодируют белки, гомологичные NAD + -зависимой формиатдегидрогеназе. Особый
интерес представляет формиатдегидрогеназа из Staphylococcus aureus (SauFDH).
Оказалось, что аминокислотная последовательность SauFDH имеет самую низкую
гомологию с формиатдегидрогеназами из других источников и эволюционно отдалена
от них. Таким образом, изучение механизма действия ФДГ из Staphylococcus aureus
может прояснить каталитические особенности формиатдегидрогеназ из других
источников. С другой стороны, недавно было показано, что формиатдегидрогеназа
играет ключевую роль при росте Staphylococcus aureus в виде биопленок. В этих
условиях количество мРНК SauFDH находится на третьем месте по сравнению со
другими мРНК. Уровень экспрессии данного фермента в стафилококковых биопленках в
20 раз выше, чем при росте клеток в виде бульона. Известно, что биопленки S.aureus
обладают повышенной резистентностью к антибиотикам и борьба c ними в условиях
клиник является трудоемкой и дорогой задачей. Можно полагать, что поиск сильных
специфических ингибиторов формиатдегидрогеназы из S.aureus поможет создать новые
высокоэффективные лекарственные препараты для борьбы с биопленками этих
патогенных бактерий.
В данной работе ген формиатдегидрогеназы из Staphylococcus aureus был
клонирован из геномной ДНК с помощью ПЦР. Фермент был экспрессирован в клетках
E.coli в активной и растворимой форме. Затем рекомбинантная ФДГ из S.aureus была
получена в виде гомогенного препарата и были изучены ее кинетические свойства и
термостабильность.
Было показано, что по сравнению с формиатдегидрогеназами из других источников
ФДГ из Staphylococcus aureus имеет более высокие значения KM по формиату и NAD + .
Методом стационарной кинетики по начальным скоростям реакции найдено, что
ферментативная реакция в случае этого фермента включает образование тройного
фермент-субстратного комплекса. Также было изучено действие ряда ингибиторов ФДГ
– азида, роданида и нитрита. Показано, что во всех случаях реализуется случай полного
конкурентного ингибирования по отношению к субстрату – формиат-иону. Азид-ион
оказался самым сильным ингибитором SauFDH. Его константа ингибирования Ki
составила 8·10 -7 М, что в 8 раз больше, чем для формиатдегидрогеназы из бактерий
Pseudomonas sp.101.
Для изучения термостабильности был использован подход, основанный на
изучении кинетики термоинактивации при различных температурах. Показано, что
процесс термоинактивации протекает в соответствии с кинетикой реакций первого
порядка. Оказалось, что ФДГ из S.aureus обладает высокой термостабильностью,
сравнимой с ФДГ из Pseudomonas sp.101 и превышающей стабильность ФДГ из
растений A.thaliana.
В настоящее время проводятся эксперименты по кристаллизации рекомбинантной
ФДГ из S.aureus для определения трехмерной структуры с помощью
рентгеноструктурного анализа.
Работа выполнена в рамках проекта РФФИ 08-04-01589.
266