подсекция «цикл наук о живом

Ломоносов-2008 «Химия» Цикл наук о живом
Взаимодействие ДНК метилтрансферазы Dnmt3a мыши с 2-аминопуринсодержащей
ДНК: удаление 6-оксогруппы гуанина не влияет на связывание ДНКсубстрата
Рахимова Алина Рифатовна, Черепанова Наталья Александровна
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
E–mail: alinarar@mail.ru
Метилирование ДНК, которое осуществляется ДНК-метилтрансферазами
(МТазами), является эпигенетической модификацией генома и играет важную роль в
регуляции многих клеточных процессов. В эукариотах метилирование происходит по
атому углерода С5 остатков цитозина преимущественно в CpG-последовательностях.
Метилированные CpG-участки расположены в ДНК определенным образом, формируя
профиль (рисунок) метилирования. Установление нового профиля метилирования
(метилирование de novo) ДНК в эукариотах происходит на стадии раннего эмбриогенеза.
Одной из МТаз млекопитающих, осуществляющих метилирование de novo, является
МТаза Dnmt3a. Эукариотические МТазы являются малоизученными ферментами.
Практически ничего не известно о том, как происходит узнавание такой короткой СpGпоследовательности
этими ферментами.
Целью данной работы явилось изучение роли 6-оксогруппы остатка гуанина на
стадии связывания ДНК каталитическим доменом МТазы Dnmt3а мыши (Dnmt3а-CD) с
помощью 2-аминопурин-содержащей ДНК.
2-аминопурин (AP) является аналогом гуанина, в котором отсутствует 6оксогруппа.
Были сконструированы флуоресцентно меченные полуметилированные 30звенные
ДНК-дуплексы содержащие AP (AP-ДНК). AP вводили в CpG-участок (в
позицию C или G), а также рядом с ним (в позицию с 5’-стороны в метилированную
либо неметилированную цепь). Методом поляризации флуоресценции были получены
изотермы связывания Dnmt3а-CD с немодифицированной ДНК и AP-ДНК в присутствии
аналога кофактора S-аденозил-L-гомоцистеина. Они имели кооперативный характер.
Кривые были описаны уравнением Хилла, учитывающим кооперативность связывания.
Коэффициент кооперативности для немодифицированного субстрата составил 1.9 , а для
AP-ДНК изменялся от 1.6 до 2.8. Были определены константы диссоциации (Кd) ДНКбелковых
комплексов: в случае немодифицированной ДНК Кd составила 9 нМ, а в
случае AP-ДНК получены Кd 11-18 нМ. Следовательно, удаление 6-оксогруппы остатков
гуанина в участке узнавания или рядом с ним практически не влияет на эффективность
связывания Dnmt3а-CD с ДНК.
Таким образом, взаимодействие Dnmt3а-CD с ДНК является кооперативным
процессом, в ходе которого с ДНК связываются 2-3 молекулы фермента. По-видимому,
контакты Dnmt3а-CD с О6-атомами остатка гуанина в большой бороздке ДНК не важны
на стадии связывания субстрата ферментом, но нельзя исключить участие этих
контактов в процессе катализа.
________________________________________________________________________
Поддержано грантами РФФИ № 07-04-00583-а и 08-04-01096-а
295