подсекция «цикл наук о живом

Ломоносов-2008 «Химия» Цикл наук о живом
Аптамерные вставки в теломеразной РНК для выделения и изучения теломеразы
дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Щербакова Д.М. (докладчик), Соколов К.А., Зверева М.Э., Донцова О.А.
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
E-mail: scherbakova@genebee.msu.ru
Теломераза – сложный рибонуклеопротеид (РНП), достраивающий теломерные
концы хромосом, укорачивающиеся из-за недорепликации ДНК [1]. Ее активность
детектируется в большинстве раковых клеток млекопитающих и иммортализованных
клеточных линиях, а также в клетках низших эукариот. Данная работа посвящена
изучению теломеразы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Основные компоненты
теломеразы - это белковая каталитическая субъединица (Est2p) и теломеразная РНК
(TLC1 РНК), небольшой фиксированный участок которой служит матрицей для синтеза
теломерных повторов. В комплекс входят также вспомогательные белки (Est1p, Est3p и
др.).
Введение аптамерных вставок в молекулу РНК для их выделения с помощью
аффинной хроматографии и изучения является интересной альтернативой введению
аффинных эпитопов в белки, входящие в состав РНП. В данной работе использованы
вставки в TLC1 РНК, являющиеся аптамерами к белку стрептавидину [2]. Эти вставки
успешно применяются для выделения различных РНП с использованием коммерчески
доступной смолы стрептавидин-сефарозы.
Сложность в разработке методики выделения РНП с использованием аптамерной
вставки состоит в выборе места ее введения так, чтобы она была экспонирована для
связывания с аффинной смолой и не нарушала структуру и функциональность РНК в
составе РНП. Для теломеразной РНК дрожжей на сегодняшний момент нет данных о ее
третичной структуре, которые облегчили бы задачу.
В нашей лаборатории были выбраны места в структуре TLC1 РНК и введены
несколько аптамерных вставок, по одной в каждом случае. Задачей данной работы
является тестирование функциональности РНК со вставками, а также разработка
методики выделения активной теломеразы. Нами получен штамм дрожжей на основе
DBY-746, в котором экспрессируется TLC1 РНК со вставкой. Этот штамм дал нам
возможность, проанализировав фенотип клеток, исключить то, что введение данной
вставки нарушает функциональность теломеразы. Ген TLC1 РНК введен на
низкокопийной центромерной плазиде под эндогенным промотером и терминатором, то
есть количество РНК близко к природному. Такая плазмида с геном дикого типа была
любезно предоставлена нам нашими коллегами из Америки [3]. В нашей системе,
основанной на методе замены плазмид в дрожжах, можно проверить на
функциональность TLC1 РНК с любыми мутациями.
Мы также проверили и показали, что с помощью аффинной хроматографии за
аптамерную вставку выделяется активный фермент. Полученная активность
принадлежит теломеразе и по характеру совпадает с активностью фермента,
выделенного классическим способом с использованием ионообменной хроматографии.
Литература
1. Greider C.W., Blackburn E. H. (1987) The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a
ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity // Cell, v. 51(6), р. 887-898
2. Srisawat C., Engelke D.R. (2001) Streptavidin aptamers: affinity tags for the study of RNAs and
ribonucleoproteins // RNA, v. 7(4), p. 632-641
3. Singer M.S., Gottschling D.E. (1994) TLC1: template RNA component of Saccharomyces
cerevisiae telomerase // Science, v. 266(5184), p. 404-409
310