DIPLOMOVÁ PRÁCE - Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V 

PRAZE 

Fakulta potravinářské a biochemické technologie 

Ústav biochemie a mikrobiologie 

DIPLOMOVÁ PRÁCE 

Studium struktury mutantu T41I/T78I matrixového proteinu 

Mason-Pfizerova opičího viru 

Vypracoval: 

Vedoucí diplomové práce: 

Konzultant: 

Studijní obor: 

Studijní zaměření: 

Jan Prchal 

Ing. Richard Hrabal, CSc. 

Ing. Jan Lipov, PhD. 

Obecná a aplikovaná biochemie 

Obecná biochemie 

Prohlašuji, že jsem v předložené diplomové práci použil jen pramenů, které cituji 

a uvádím v seznamu použité literatury. 

V Praze dne 9. května 2007 

podpis 

I

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracoval samostatně s vyznačením všech použitých 

pramenů a spoluautorství. Souhlasím se zveřejněním diplomové práce podle zákona č. 

111/1998 Sb., o vysokých školách, ve znění pozdějších předpisů. Byl jsem seznámen s tím, 

že se na moji práci vztahují práva a povinnosti vyplývající ze zákona č. 121/2000 Sb., 

autorský zákon, ve znění pozdějších předpisů. 

Praha, 2. 5. 2007 

Jan Prchal 

.................................................................................................. 

II

SOUHRN 

Mason-Pfizerův opičí virus (M-PMV) je prototypem D typu retrovirů. U retrovirů typu B a 

D se nezralá virová částice skládá v cytoplasmě, zatímco u retrovirů typu C (HIV) je Gag 

směřován na cytoplasmatickou membránu, kde probíhá skládání nezralé virové částice. N- 

terminální doména proteinu Gag - matrixový protein - hraje hlavní roli v určení tohoto rozdílu. 

Bylo popsáno několik mutantů, ovlivňujících různé fáze životního cyklu M-PMV. Naší 

snahou je charakterizovat vliv mutantních proteinů v M-PMV na molekulární úrovni studiem 

jejich struktury. Doposud jsou známy struktury divokého typu a mutantu R55F, který způsobuje 

změnu skládání nezralých virových částic z typu D na typ C. 

V této práci se zaměřujeme na určení třírozměrné struktury dvojitého mutantu T41I/T78I, 

který neovlivňuje skládání ani transport nezralých virových částic. Tyto částice však nejsou 

schopny pučet skrz cytoplasmatickou membránu a místo toho se na ní akumulují. Třírozměrnou 

strukturu mutantu matrixového proteinu jsme určili pomocí heteronukleární NMR spektroskopie.Srovnání 

struktury mutantu a struktury divokého typu ukazuje, že mutace pozměnila 

úhly mezi jednotlivými helixy proteinu, ale celková struktura zůstala nezměněna. 

Narozdíl od divokého typu jsou zmutované isoleuciny 41 a 78 orientovány do jádra proteinu, 

kde mohou interagovat se zbytkem kyseliny myristové, připojené na N-konec. Tyto výsledky 

podporují hypotézu, že změna fenotypu mutantu je způsobena zesílenou interakcí zbytku 

kyseliny myristové s jádrem proteinu, která brání vazbě nezralé virové částice na cytoplasmatickou 

membránu. 

III

SUMMARY 

The Mason-Pfizer Monkey Virus (M-PMV) is a prototype of D type retroviruses. In type B 

and D retroviral immature virus particles pre-assemble in cytoplasm, whereas in type C retroviruses 

(HIV) Gag is targeted to the plasma membrane, where the particle formation occurs. 

The N-terminal domain of Gag, the matrix protein (MA), plays a critical role in determining 

this morphogenic difference. Several single- or multi-point mutations of MA have 

been described that alter various stages of the M-PMV life cycle. Our goal is to characterize 

the influence of M-PMV mutant proteins on the molecular level by studying their structures. 

The three- dimensional structures of the wild-type and R55F mutant, a mutant which changes 

capsid assembly from D type to C type, are known so far. 

In this work we focus on the determination of the three-dimensional structure of the doublemutant 

T41I/T78I, which doesn`t affect assembly and transport of immature virus particles. 

However, these particles are unable to bud through the cytoplasmatic membrane and rather 

accumulate on it. We have determined the three-dimensional structure of the MA mutant 

using heteronuclear NMR spectroscopy. Comparison of the calculated structure and the 

structure of the wild-type proteins shows that the mutation altered angles between protein 

helices, but overall structure remained unchanged. In contrast to wild-type proteins, mutated 

isoleucines 41 and 78 are oriented inside the protein core where they may interact with a 

myristic acid which is linked to the N-terminus. This finding supports a hypothesis that the 

phenotypic change of the mutant is caused by enhanced interaction of the myristic acid with 

the protein core, which prevents association of immature viral particles with the cytoplasmatic 

membrane. 

IV

Obsah 

1. Úvod.................................................................................................................................. 1 

2. Současný stav řešené problematiky .................................................................................. 2 

2.1 Retroviry ................................................................................................................... 2 

2.1.1 Struktura virionu ........................................................................................................4 

2.1.2 Hlavní strukturní proteiny ........................................................................................5 

2.1.3 Životní cyklus retrovirů ............................................................................................6 

2.2 HIV a M-PMV .......................................................................................................... 8 

2.2.1 Virus HIV ...................................................................................................................8 

2.2.2 Virus M-PMV ............................................................................................................9 

2.3 Matrixový protein ................................................................................................... 11 

2.3.1 Významné modifikace matrixového proteinu......................................................12 

2.3.2 Funkce MA proteinu ...............................................................................................18 

2.3.3 Struktura matrixového proteinu .............................................................................19 

2.4 Významné mutace v MA proteinu.......................................................................... 22 

2.4.1 Významné mutace v HIV-1 MA............................................................................23 

2.4.2 Významné mutace v M-PMV MA ........................................................................25 

3. Experimentální část......................................................................................................... 27 

3.1 Materiál ................................................................................................................... 27 

3.1.1 Chemikálie................................................................................................................27 

3.1.2 Roztoky .....................................................................................................................28 

3.1.3 Buněčný materiál .....................................................................................................32 

3.1.4 Použité plasmidové expresní vektory....................................................................32 

3.1.5 Přístroje .....................................................................................................................32 

3.2 Metody .................................................................................................................... 33 

3.2.1 Příprava kompetentních buněk ..............................................................................33 

3.2.2 Transformace kompetentních buněk .....................................................................34 

3.2.3 Produkce rekombinantního matrixového proteinu M-PMV v E. coli ..............34 

3.2.4 Desintegrace buněk E. coli obsahujících rekombinantní protein ......................35 

3.2.5 Metaloafintiní chromatografie ...............................................................................35 

V

3.2.6 Gelová permeační chromatografie ........................................................................36 

3.2.7 Elektroforesa v polyakrylamidovém gelu obsahujícím SDS (SDS-PAGE) ....36 

3.2.8 Koncentrování roztoků proteinu ............................................................................36 

3.2.9 Příprava vzorků pro NMR experimenty ...............................................................37 

3.2.10 NMR spektroskopie.................................................................................................37 

3.2.11 Výpočet struktury ....................................................................................................38 

3.2.12 Interpretace a srovnání struktur .............................................................................39 

3.2.13 Residuální dipolární interakční konstanty............................................................39 

4. Výsledky ......................................................................................................................... 40 

4.1 Příprava rekombinantního proteinu ........................................................................ 40 

4.2 Přiřazení chemických posunů atomů proteinu........................................................ 41 

4.2.1 Porovnání chemických posunů atomů HN a N mutantu a divokého typu .......43 

4.3 Výpočet struktury.................................................................................................... 45 

4.3.1 Odhad sekundární struktury pomocí výpočtu indexu chemických posunů (CSI) ......45 

4.3.2 Výpočet struktury ....................................................................................................47 

4.3.3 Zhodnocení kvality vypočtených struktur ............................................................51 

4.4 Porovnání struktur mutantu T41I/T78I a divokého typu MA proteinu .................. 56 

5. Diskuze ........................................................................................................................... 59 

5.1 Příprava rekombinantního proteinu ........................................................................ 59 

5.2 Výpočet a zhodnocení struktury T41I/T78I mutantu.............................................. 60 

5.3 Odhad pozice zbytku kyseliny myristové............................................................... 61 

6. Závěr ............................................................................................................................... 63 

7. Literatura......................................................................................................................... 65 

8. Seznam použitých symbolů a zkratek............................................................................. 75 

9. Přílohy............................................................................................................................. 78 

VI

1. Úvod 

HIV je dnes, vzhledem k pandemii AIDS podrobován intenzivnímu zkoumání. Mason- 

Pfizerův opičí virus je modelovým organismem nejen pro HIV, ale obecně pro výzkum retrovirů. 

Oproti HIV má výhodu, že je nepřenosný na člověka. V celém životním cyklu retrovirů 

hraje významnou roli matrixový protein. V matrixovém proteinu Mason-Pfizerova opičího 

viru bylo identifikováno několik bodových mutací, které ovlivňují různé fáze životního 

cyklu viru. Studium těchto mutantů metodami molekulární biologie nám umožňuje popsat 

účinek těchto mutací na molekulární úrovni. 

Doposud byla určena třírozměrná struktura divokého typu matrixového proteinu Mason- 

Pfizerova opičího viru a také struktura mutantu R55F, který způsobuje změnu morfogenického 

typu z D na C. 

V této práci se zabýváme určením struktury dvojitého mutantu T41I/T78I matrixového proteinu 

Mason-Pfizerova opičího viru. Tato mutace brání viru pučet skrz cytoplasmatickou 

membránu ven z buňky. Použitím nukleární magnetické resonance se mi podařilo určit strukturu 

zmutovaného proteinu, kterou jsem porovnal se známou strukturou divokého typu matrixového 

proteinu. 

1

2. Současný stav řešené problematiky 

2.1 Retroviry 

Retroviry tvoří skupinu virů s diploidním RNA genomem tvořeným dvěma identickými kopiemi 

RNA. Hlavním znakem retrovirů je, že během replikace jejich genomu je RNA přepsána 

do DNA pomocí virem kódované RNA dependentní DNA polymerasy (reversní transkriptasa, 

RT) a tato DNA je poté inkorporována do genomu hostitelské buňky pomocí dalšího 

virového enzymu, integrasy. Dalším charakteristickým znakem retrovirů je jejich maturace 

mimo hostitelskou buňku. Retroviry patří do čeledi Retroviridae. Do této čeledi patří 

DNA a RNA viry s reversní transkriptasou. Další členění je odvozeno od struktury genomu, 

morfogenese virionu a způsobu tvorby kapsidy. Z hlediska struktury genomu se retroviry dělí 

na jednoduché a komplexní. Genom komplexních retrovirů oproti jednoduchým obsahuje 

geny pro různé regulační proteiny, vznikající po alternativním sestřihu m-RNA, které ovlivňují 

průběh infekce. 

Z hlediska tvorby retrovirových kapsid jsou známy dvě základní skupiny retrovirů (Obr. 1). 

Do první spadají retroviry typů A, B a D a vyznačuje se tím, že se nezralá virová částice 

skládá uvnitř buňky. Nezralé částice typů B, D a intracytoplasmatického podtypu typu A se 

skládají z bílkovinných prekursorů v cytoplasmě, a poté jsou transportovány 

k cytoplasmatické membráně. Retroviry intracysternálního podtypu typu A skládají částice 

podobným mechanimem jako typ C s tím rozdílem, že virus pučí do endoplasmatického retikula. 

Mezi nejznámější zástupce patří MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus, typ B) a M- 

PMV (Mason-Pfizer Monkey Virus, typ D). Druhou skupinu tvoří typ C. U tohoto typu se 

nezralá virová částice skládá na cytoplazmatické membráně a současně pučí ven z buňky. Do 

této skupiny patří několik lidských patogenů, například HIV (Human Imunodeficiency virus) 

a HTLV (Human T-cells Leukemia Virus) 1 . 

2

Obr. 1. Elektronmikroskopické snímky dokumentující skládání virové částice různých 

retrovirů, převzato z knihy 7 . 

A) HIV-1 jako zástupce C-typu retrovirů. Skládání i pučení probíhá na membráně, poslední 

snímek v řadě je zralý virion 

B) MMTV jako zástupce D-typu retrovirů. Skládání proběhlo v cytoplasmě, poslední snímek 

zralý virion s typickým excentrickým core 

Retroviry se dnes člení do 7 rodů (Tab. I) 2 . 

3

Tab. I Rozdělení retrovirů a typičtí zástupci 

Rod Morfogenese Typičtí zástupci 

Alpharetrovirus 

Avian Leukosis Virus 

C typ Rous Sarcoma Virus jednoduché 

Betaretrovirus Mouse Mammary Tumor Virus retroviry 

B/D typ Mason-Pfizer Monkey Virus 

Gammaretrovisus 

Murine Leukemia Virus 

C typ Viper Retrovirus 

Deltaretrovirus 

Bovine Leukemia Virus 

C typ Human T-Lymphotic Virus 1 

Epsilonretrovirus C typ Walleye Dermal Sarcoma Virus 

Lentivirus Human Imunodeficiency Virus 1 komplexní 

C typ Simian Imunodeficiency Virus retroviry 

Spumavirus 

Simian Foamy Virus 

B/D typ Feline Foamy Virus 

2.1.1 Struktura virionu 

Struktura virové částice je v základních rysech společná všem retrovirům. Má sférický tvar o 

průměru 80-120 nm. Vnější obal je tvořen fosfolipidovou membránou, která pochází 

z hostitelské buňky. Do této membrány je zakotven transmembránový glykoprotein (TM) a 

na něj je nekovalentně vázán povrchový glykoprotein (SU), který je zodpovědný za vazbu na 

receptory hostitelské buňky. Organizace proteinů uvnitř virové membrány je odlišná u zralé a 

nezralé virové částice. Nezralá částice je tvořena polyproteinovými prekurzory Gag, Gag-Pro 

a Gag-Pro-Pol. Ty jsou ukotveny v membráně N-koncovou doménou Gag, tj. matrixovým 

proteinem (MA), který je kladně nabitý a na N-konci má navázán zbytek kyseliny myristové. 

Uvnitř nezralé částice jsou 2 molekuly genomové RNA nekovalentně vázané na molekuly 

Gag. 

Ve zralé virové částici jsou naproti tomu polyproteinové prekurzory již rozštěpeny na jednotlivé 

proteiny virovou proteasou 3 . Přímo pod membránou je vrstva tvořená MA vázaným 

k membráně stejným způsobem jako nerozštěpený Gag. MA se pravděpodobně vyskytuje ve 

formě trimeru 4 a nekovalentně interaguje s TM 5 . Hlavní část virionu – jádro (core) je tvořeno 

kapsidovým proteinem (CA). Tvar jádra je jedním z kritérií klasifikace, např. u HIV je 

4

kónický 6 , u M-PMV je válcový 7 . Uvnitř jádra je komplex genomové RNA se silně bazickým 

nukleokapsidovým proteinem (NC), dále reversní transkriptasa, integrasa (IN) a proteasa 

(PR). Dále se ve virionu vyskytují virové proteiny specifické pro jednotlivé retroviry, m- 

RNA a některé buněčné proteiny (Obr. 2) 8 . 

Obr. 2. Schéma nezralé (a) a zralé (b) virové částice. 1-povrchový glykoprotein, 2- 

transmembránový glykoprotein, 3-dvojvrstva fosfolipidů, 4-polyproteinový prekurzor Gag, 

5-prekurzor Gag-Pro-Pol, 6-genomová RNA, 7-matrixový protein, 8-core tvořené kapsidovým 

proteinem, 9-proteasa, 10-integrasa, 11-reversní transkriptasa. Převzato ze článku 1 

2.1.2 Hlavní strukturní proteiny retrovirů 

Polyproteinový prekurzor Gag je sám o sobě schopen vytvářet nezralé kapsidy, které pučí 

ven z buňky a podílí se na inkorporaci dalších virových komponent (RNA, TM). Po jeho 

rozštěpení vzniká několik maturních proteinů. Dosud není známa kompletní prostorová 

struktura Gag proteinu žádného retroviru, ale u mnoha z nich jsou známy jak struktury, tak 

funkce některých domén. Ve zralé virové částici jsou hlavními strukturními proteiny vznikajícími 

štěpením proteinu Gag, matrixový protein, kapsidový protein a nukleokapsidový protein. 

Matrixový protein je středem mého zájmu, a proto mu bude věnována vlastní kapitola 

(viz. kap. 2.3.). Kapsidový protein tvoří ve virionu hydrofobní schránku tzv. „core“, což je 

obal nukleoproteinového komplexu a dalších proteinů. Nukleokapsidový protein je vysoce 

basický protein, který tvoří součást ribonukleotidového komplexu. Ve zralém virionu je 

5

pevně nekovalentně vázán na genomovou RNA. U většiny retrovirů se vyskytuje jedna nebo 

dvě Cys-His domény, které spolu se zinečnatými ionty tvoří tzv. domény zinkového prstu 9 . 

2.1.3 Životní cyklus retrovirů 

Obr. 3. Životní cyklus retrovirů. Převzato ze článku 1 6

Životní cyklus viru (Obr. 3) lze rozdělit na dvě fáze: časnou a pozdní. Časná fáze zahrnuje 

procesy od vstupu viru do buňky až po integraci virové DNA do genomu hostitelské buňky. 

Prvním krokem je vazba povrchových glykoproteinů SU na příslušné receptory na povrchu 

hostitelské buňky (Obr. 3, krok 1) a následná fúze membrán (Obr.3, krok 2). Poté dojde 

k rozpadu core (krok 3) a vznikne komplex genomové RNA, reversní transkriptasy, integrasy, 

CA a MA, takzvaný preintegrační komplex (PIC) (krok 4), který je transportován do 

jádra 10 . Dalším krokem je reversní transkripce, kdy je virová RNA přepsána do lineární dvojřetězcové 

DNA. Původní genomová RNA je v průběhu reversní transkripce degradována 

RNasovou aktivitou RT 11 . Reversní transkripce probíhá většinou v cytoplasmě (u ALV až 

v jádře) v PIC. Reversní transkripce je ve srovnání s běžnou replikací značně nepřesná a je 

zdrojem mnoha mutací, což vede k problémům s rezistencí proti léčivům. Posledním krokem 

časné fáze je integrace virové DNA do genomu hostitelské buňky enzymem integrasou (krok 

5). Poté virus přejde do latentní fáze a v ní zůstane, dokud není aktivován. Pozdní fáze začíná 

transkripcí provirové DNA buněčnou RNA polymerasou II (krok 6). Část vzniklé RNA je 

sestřižena (krok 7) a veškerá RNA je transportována do cytoplasmy (kroky 8 a 9). Zde je 

nesestřižená RNA inkorporována do vznikajících virionů nebo slouží jako templát pro 

syntézu polyproteinových prekursorů Gag, Pro a Pol (krok 10). Sestřižená RNA slouží jako 

m-RNA pro translaci genu env, případně genů pro regulační proteiny komplexních retrovirů. 

Gen env je translatován na drsném endoplasmatickém retikulu za vzniku proteinu Env (krok 

11). Ten je poté transportován do Golgiho komplexu (kroky 13 a 15), kde probíhá jeho 

glykosilace a štěpení buněčnou proteasou na SU a TM, které jsou následně vystaveny na 

povrch buňky (krok 18). Vnitřní proteiny virové kapsidy jsou naproti tomu syntetizovány na 

volných ribosomech (krok 10) 12 . Nejčastěji vzniká jen protein Gag, ale s frekvencí 5-20 % 

dochází k posunu čtecího rámce a syntéze proteinu Gag-Pro nebo Gag-Pro-Pol. Tímto 

mechanismem je regulován poměr proteinů Gag, Pro a Pol. Další osud proteinu Gag závisí na 

morfogenickém typu. U virů typu C je Gag transportován k membráně, zde agreguje za 

vzniku nezralé virové částice a současně s tím pučí ven z buňky (krok 17). U typu B/D je 

Gag transportován do pericentriolární oblasti v cytoplasmě, zde se složí nezralá částice (krok 

12) a ta je poté transportována k membráně, skrz kterou pučí (krok 16). Při tomto ději hraje 

klíčovou roli N-koncová doména proteinu Gag – matrixový protein. V případě viru M-PMV 

7

ylo prokázáno, že záměna jedné aminokyseliny (R55F) v MA vede ke změně morfogenese 

z typu D na typ C 13 . 

Retroviry typu A s intracisternálním pučením se skládají na membráně Golgiho komplexu 

podobným způsobem jako typ C na cytoplasmatické membráně (krok 14). 

Pučením získávají retroviry svůj vnější obal – fosfolipidovou dvouvrstvu pocházející 

z cytoplasmatické membrány buňky. Posledním krokem životního cyklu retrovirů je proteolytické 

štěpení proteinu Gag a následná reorganizace produktů do podoby struktury zralého 

virionu. Toto štěpení probíhá záhy po opuštění hostitelské buňky a je nezbytné pro infektivitu 

virové částice. 

2.2 HIV a M-PMV 

2.2.1 Virus HIV 

Virus lidské imunodeficience (HIV) je horizontálně přenášený exogenní retrovirus patřící do 

rodu lentivirů. Poprvé byl izolován v roce 1983 ve Francii (tehdy byl nazván 

lymphadenopathy-associated virus - LAV). Jsou známy dva vzdálené subtypy: HIV-1 

převažující ve většině oblastí světa a HIV-2, který se vyskytuje převážně v západní Africe. 

HIV-1 je více virulentní a snadněji přenosný než HIV-2. 

HIV je původcem AIDS (syndrom získaného selhání imunity). Toto onemocnění přenášené 

krví a sexuálním stykem způsobuje postupné selhání imunitního systému vedoucí k úmrtí na 

jiné infekce. Infekce HIV je dnes pandemická a podle odhadů WHO AIDS zabilo k 1.1.2006 

více než 25 milionů lidí. Z tohoto důvodu je dnes HIV nejstudovanějším retrovirem. 

HIV napadá primárně CD4 positivní T-lymfocyty, protože povrchový glykoprotein (SU) 

interaguje s CD4 receptorem na T-lymfocytu. Většina kmenů HIV-1 je také schopna napadnout 

makrofágy pomocí vazby na CCR5 receptor. Virová infekce ničí napadené buňky třemi 

způsoby: přímým zničením v souvislosti s virovou infekcí, zvýšenou frekvencí apoptosy infikovaných 

buněk a zabitím infikovaných buněk CD8 cytotoxickým lymfocytem, který rozezná 

nakaženou buňku. Při velké ztrátě CD4+ T-buněk se vytrácí buněčná imunita a organismus 

je prakticky nechráněn proti jakékoliv infekci 14 . Symptomatickou léčbu ztěžuje vysoká 

8

frekvence mutací během replikace viru a z toho plynoucí rychlá selekce resistentních mutantů. 

Virus HIV patří mezi komplexní retroviry, což znamená, že kromě genů gag, pro, pol a env 

obsahuje ještě geny pro další proteiny, které jsou translatovány ze sestřižených forem 

mRNA. Jsou to: Vif, který je nutný pro produkci infekčních částic v některých buněčných 

liniích, Vpr nezbytný pro replikaci viru a směrování provirové DNA do jádra, Tat,který se 

váže na specifickou strukturu u 5` konce RNA a zvyšuje produkci virové RNA, Nef způsobující 

odstranění CD4 z povrchu napadené buňky a tím bránící opětovné infekci, Rev, který se 

váže na specifické místo virové RNA a reguluje její sestřih a Vpu, integrální membránový 

protein, který způsobuje disociaci komplexů SU-TM-CD4 v endoplasmatickém retikulu 1 . 

Proteiny Tat, Nef a Vpr navíc způsobují apoptosu infikovaných buněk. Dále bylo zjištěno, že 

exprese samotného proteinu Nef v transgenních myších vede k podobným symptomům jako 

má onemocnění AIDS 14 . 

2.2.2 Virus M-PMV 

Mason-Pfizerův opičí virus (M-PMV) je horizontálně přenášený exogenní retrovirus patřící 

do rodu betaretrovirů. Poprvé byl izolován v roce 1970 z prsního nádoru makaka červeného 

(macaca mulatta), přesto patří do skupiny neonkogenních retrovirů, neboť po infekci buňky 

nedochází k její transformaci. Infekce M-PMV u makaků způsobuje fatální imunodeficienci, 

dříve nazývanou SAIDS (Simian AIDS). Přesto není příbuzný s SIV (Simian Immunodeficiency 

Virus). Z hlediska složitosti řadíme M-PMV, na rozdíl od HIV, mezi jednoduché retroviry, 

neboť jeho genom neobsahuje geny regulující transkripci či translaci. 

Slouží jako prototyp B/D typu retrovirů, u kterých jsou tvorba nezralých částic, jejich intracelulární 

transport a pučení skrz cytoplasmatickou membránu časově i prostorově odděleným 

dějem. Díky tomu představuje M-PMV vhodný model pro studium skládání, pučení 

a maturace virionu. Další výhodou M-PMV jako modelového organismu je, že není přenosný 

na člověka. V budoucnu by se strukturní proteiny M-PMV také mohly použít jako nosiče 

DNA při genové terapii. 

9

Proteiny M-PMV 

Na volných ribosomech jsou syntetizovány tři polyproteinové prekurzory Gag, Gag-Pro a 

Gag-Pro-Pol. Z nich se v pericentriolární oblasti hostitelské buňky skládá nezralá virová 

částice. Jednu částici tvoří 1500-2000 těchto molekul 15 . Po vypučení virionu z buňky dochází 

k proteolytickému štěpení prekurzorů na jednotlivé strukturní proteiny a enzymy. Protein 

Gag (Pr78) je štěpen na šest maturních proteinů (Obr. 4): MA (p10), fosfoprotein (PP, 

pp16/pp24), p12, CA (p27), NC (p14) a p4 16 . Funkce MA, CA a NC již byly popsány (viz. 

kapitoly 2.3.a 2.1.2.). PP obsahuje doménu zodpovědnou za správné odpojení nově vznikajícího 

virionu od cytoplasmatické membrány 17 , p12 obsahuje doménu usnadňující skládání 

kapsidy 18 . Úloha proteinu p4 není dosud objasněna, pravděpodobně usnadňuje skládání nezralé 

kapsidy 19 . 

Z polyproteinu Gag-Pro kromě výše zmíněných proteinů vzniká dUTPasa (DU) 20 a proteasa 

(PR) 21 . Z Gag-Pro-Pol vzniká navíc reversní transkriptasa a integrasa. Všechny tyto polyproteinové 

prekurzory jsou na N-konci myristoylovány 22 a v oblasti PP fosforylovány 16 . 

Obr. 4. Schéma Gag proteinu M-PMV. Převzato ze článku 23 . 

Prekurzor obalových glykoproteinů Env vzniká na drsném endoplasmatickém retikulu. Molekula 

je poté v Golgiho komplexu glykosylována na serinových a glutaminových zbytcích 24 . 

V průběhu transportu k membráně je štěpen buněčnou proteasou furinem na gp70 (SU) a 

gp22. Glykoprotein gp22 je v průběhu maturace štěpen virovou proteasou na gp20 (TM) a 

gp2 24 . 

10

2.3 Matrixový protein 

Matrixový protein tvoří N-koncovou doménu polyproteinového prekurzoru Gag. Během maturace 

virionu je odštěpen virovou proteasou a zůstává asociován s virovou membránou (MA 

pochází z Membrane Associated). MA je téměř u všech retrovirů na N-konci kotranslačně 

kovalentně modifikován připojením zbytku kyseliny myristové, která je zodpovědná 

za interakci Gag proteinu s buněčnou membránou a za interakci MA, s fosfolipidovým obalem 

virionu 25 . MA také hraje ústřední roli při transportu Gag na místo skládání kapsidy. U 

M-PMV bylo prokázáno, že mutace v MA způsobí změnu morfogenese z typu D na typ C 13 . 

Dále se podílí na inkorporaci komplexu SU-TM a pravděpodobně hraje roli ve směrování 

preintegračního komplexu do jádra infikované buňky. 

Doposud byla určena struktura nemyristoylovaných MA HIV-1, M-PMV, SIV, HTLV-II, 

BLV a RSV. Přestože sekvenční homologie mezi MA různých savčích retrovirů je nízká, 

jejich struktura je velmi podobná (viz. kapitola 2.3.3.). 

V primární struktuře MA byly nalezeny následující oblasti: 

M doména – série basických aminokyselin argininu a lysinu. Díky kladnému náboji jejich 

postranních řetězců interaguje MA s fosfolipidy a spolu se zbytkem kyseliny myristové 

zprostředkovávají vazbu na membránu. 

CTRS sekvence – signál pro cílení polyproteinu Gag do cytoplasmy (Cytoplasmatic Targeting-Retention 

Signal) se vyskytuje pouze u B/D typů retrovirů. Je zodpovědná za transport 

molekul Gag na specifické místo v cytoplasmě, kde probíhá skládání kapsidy. 

NLS – signál pro cílení do jádra (Nuclear Localization Signal) pravděpodobně hraje roli při 

cílení preintegračního komplexu do jádra infikované buňky. 

11

2.3.1 Významné modifikace matrixového proteinu. 

2.3.1.1 Myristoylace 

Myristoylace, tj. kotranslační připojení 14 uhlíkaté nasycené mastné kyseliny na N- 

terminální glycin je spolu s palmitoylací nejčastější modifikací proteinů mastnou kyselinou 26 , 

a to i přes to, že kyselina myristová tvoří méně než 1% mastných kyselin v buňce 27 . Je to 

důležitá modifikace mnoha eukaryotních a virových proteinů a také několika bakteriálních 

proteinů 28 . Způsobuje jejich směrování k membráně a napomáhá interakci proteinmembrána. 

Myristoylová kotva se také podílí na některých interakcích protein-protein, stabilizaci 

struktury modifikovaného proteinu a má i některé další role 29 . Analýzou několika eukaryotních 

genomů bylo zjištěno, že 0.5-0.8% proteinů může sloužit jako substrát pro N- 

myristoyltransferasu (NMT). Nejčastěji se jedná o GTP-vazebné proteiny (např. některé podjednotky 

G-proteinů), serin/threonin kinasy, tyrosinové kinasy a Ca-vazebné proteiny s „EFhand“ 

motivem (např. rekoverin nebo aktivátory guanylát cyklasy) 28 . 

V eukaryotních buňkách je myristoylace katalyzována N-myristoyltransferasou (myristoyl- 

CoA:glycylpeptidN-myristoyltransferasa, E.C. 2.3.1.97) a většinou probíhá kotranslačně 30 , 

ale může proběhnout i na původně vnitřním glycinu, který se stal N-koncovým po proteolytickém 

štěpení. NMT rozeznává 17 aminokyselin dlouhou sekvenci začínající na N-konci 

sekvencí M-G-X-X-X-S/T 31 . Iniciační methionin je kotranslačně odstraněn pomocí methionyl 

aminopeptidasy (methionylpeptid methionylhydrolasa, E.C. 3.4.11.18) 32 a NMT poté 

připojí amidickou vazbou myristoyl na N-terminální glycin. 

2.3.1.1.1 Funkce myristoylace proteinů 

Vazba na membránu 

Zbytek kyseliny myristové často slouží jako hydrofobní kotva umožňující interakci s membránou. 

Tato vazba není tak pevná jako u delších mastných kyselin, díky tomu je však vratná 

a je regulována několika mechanismy (viz. kap. 2.3.1.1.2.). Protože myristoylace nestačí 

12

k stabilnímu udržení proteinu na buněčné membráně, je potřeba, aby protein interagoval 

s membránovými fosfolipidy ještě jiným způsobem 33 . Tím může být buď vratná modifikace 

blízkého cysteinu zbytkem kyseliny palmitové nebo přítomnost shluku basických aminokyselin. 

U virových proteinů se jedná o druhý případ. Buď se jedná o sekvenci bazických 

aminokyselin blízko u sebe i v primární struktuře nebo jsou tyto aminokyseliny rozptýleny a 

k sobě se dostanou až po složení celého proteinu (např. u MA RSV a HTLV-I) 34 . Při vazbě 

na membránu se myristoyl zanoří přibližně deseti uhlíky do lipidové dvojvrstvy 35 . Bazické 

aminokyseliny poté interagují se záporně nabitými hlavicemi fosfolipidů na vnitřní straně 

buněčné membrány (hlavně fosfatidylserin a fosfatidylinositol). Ani hydrofobní, ale ani elektrostatické 

interakce nejsou samy o sobě dostatečně silné pro udržení proteinu na membráně. 

Jejich společný efekt je však pro stabilní interakci dostatečný. Někteří autoři ovšem uvádějí, 

že za určitých podmínek (hlavně iontová síla) je i nemyristoylovaný Gag protein schopen 

vazby na kyselé liposomy 36 . 

Cílení k membráně 

Z některých studií vyplývá, že myristoylace nejen způsobuje vazbu na membránu, ale také 

slouží jako signál pro směřování proteinu k membráně. Důkazem bylo přenesení N- 

terminální sekvence z Gag a její připojení na GFP (Green Fluorescence Protein), který se 

běžně nachází v cytoplasmě, což způsobilo jeho cílení na cytoplasmatickou membránu 37 . Na 

druhou stranu je známo několik myristoylovaných proteinů lokalizovaných volně v cytoplasmě 

28 . U M-PMV je myristoylace nezbytná pro transport nezralé virové částice 

k cytoplasmatické membráně 22 . 

Strukturní role 

U mnoha proteinů je zbytek kyseliny myristové zanořen do hydrofobní kapsy proteinu, kde 

stabilizuje celkovou terciární strukturu 38 . Slouží tedy jako intramolekulární chaperon. U proteinu 

Nef (HIV) je prokázáno, že myristoylace je nezbytná pro oligomeraci a následnou interakci 

s aktinem 39 . 

13

Autoregulace enzymatické aktivity 

Abelsonova kinasa (Abl) je tyrosinová proteinkinasa regulující buněčný cyklus. Její aktivita 

je regulována orientací myristátu na jejím N-konci. Pokud je myristoyl zanořený v hydrofobní 

kapse Abl, pak stabilizuje protein v neaktivní konformaci, kdy je aktivní místo blokováno 

a některé aminokyselinové zbytky důležité pro katalýzu jsou z něj odkloněny změněnou 

konformací molekuly 40 . Když byla připravena nemyristoylovaná forma Abl, vykazovala 

několikanásobně vyšší aktivitu než divoký typ 41 . Předpokládá se, že enzymatická aktivita Abl 

je regulována fosforylací tyrosinů. Fosforylace tyrosinových zbytků způsobí uvolnění zbytku 

kyseliny myristové z hydrofobní kapsy, což vede k rozvolnění celkové struktury a obnažení 

aktivního místa. Zároveň aktivní místo zaujme správnou konformaci 40 . Onemocnění zvané 

chronická myelogenní leukémie je způsobeno narušením tohoto mechanismu. Při chromosomální 

translokaci mezi 22. a 9. chromosomem je na místo části exonu, kódujícího N-konec 

Abl připojen gen pro BRC protein, což vede ke vzniku hybridního proteinu BRC-Abl. Tato 

mutace zabraňuje připojení zbytku kyseliny myristové a vede k velmi aktivní formě Abl, 

která způsobuje nekontrolované množení buněk 40 . 

2.3.1.1.2 Regulace vazby myristoylovaných proteinů na membránu 

U některých proteinů je vazba na membránu regulována hydrolytickým odštěpením zbytku 

kyseliny myristové od proteinu 42,43 . 

Daleko častěji využívaným mechanismem je tzv. myristoylový přepínač (angl. myristoyl 

switch). Proteiny, které ho využívají se vyskytují ve dvou konformacích. V jedné z nich je 

myristoylový zbytek zanořen v hydrofobní kapse proteinu a ve druhé je vynořen ven z proteinu 

a může se účastnit interakce s membránou. Tento mechanismus je typický pro proteiny 

vratně se vážící na membránu. Myristoylový přepínač je mechanismem regulujícím přechod 

mezi stavem volným a vázeným. Přepínač je spouštěn několika způsoby: 

Prvním z nich je spuštění přepínače elektrostatickou interakcí. Příkladem proteinu s myristoylovým 

přepínačem řízeným elektrostatickou interakcí je Abelsonova kinasa nebo myristoylovaný 

substrát kinasy C (MARCKS - Myristoylated Alanine-Rich C Kinase Substrate). 

MARCKS je vázán na membránu synergickým působením zbytku kyseliny myristové 

zanořeného v membráně a bazické domény interagující se záporně nabitými fosfolipidy. Uv- 

14

nitř této domény jsou také zbytky aminokyselin, které mohou být fosforylovány. Pokud k 

fosforylaci dojde, záporně nabité fosfáty značně zeslabí interakci s fosfolipidy a způsobí desorbci 

MARCKS od cytoplasmatické membrány 44 . 

Druhým mechanismem je spuštění přepínače vazbou ligandu. Modelovým proteinem pro 

tento typ myristoylového přepínače je recoverin. Jedná se o inhibitor rhodopsin kinasy, který 

se vyskytuje v buňkách sítnice a váže vápenaté ionty. Ve stavu s nízkou koncentrací 

Ca 2+ iontů je zbytek kyseliny myristové zanořen v hydrofobní kapse proteinu a recoverin je v 

cytoplasmě. Pokud se koncentrace Ca 2+ zvýší, naváží se na recoverin dva ionty do vazebných 

míst typu „EF-hand“. Tato vazba vede ke změně konformace, která má za následek vynoření 

myristoylového zbytku z proteinu a vazbu recoverinu na membránu (Obr. 5.) 45 . 

A 

B 

Obr. 5. Myristoylový přepínač u recoverinu. Pokud je recoverin v prostředí s nízkou koncentrací 

Ca 2+ , zbytek kyseliny myristové (šedivý) je zanořen do hydrofobní kapsy v proteinu 

(A). Při zvýšení koncentrace Ca 2+ iontů se dva z nich se naváží na recoverin, což vede ke 

změně konformace a uvolnění myristoylového zbytku do rozpouštědla (B). Může tak fungovat 

jako kotva pro udržení proteinu u cytoplasmatické membrány. 

Třetím možným mechanismem je proteolytické spuštění myristoylového přepínače. 

Tento typ je jedním z předpokládaných mechanismů u molekul proteinu Gag. Gag, tedy i 

MA, jsou vázány k membráně kombinací myristoylu a domény bazických aminokyselin. Gag 

je ovšem vázán k membráně silněji než MA vznikající jeho štěpením, přestože v oblasti MA 

nedojde ke změně primární struktury 46 . Předpokládá se, že za touto změnou stojí myristoylový 

přepínač. V molekule Gag je myristoyl exponován ven z molekuly a po proteolytickém 

štěpení Gagu na jednotlivé proteiny se opět zanoří do hydrofobní kapsy proteinu. Byl také 

15

navržen mechanismus, kdy je myristoyl uvolněn z jádra molekuly Gag až po transportu k 

cytoplasmatické membráně, a tím brání interakci s vnitřními buněčnými membránami 47 . 

Posledním známým způsobem fungování myristoylového přepínače je jeho spuštění změnou 

entropie (entropic switch). U MA HIV-1 bylo zjištěno, že změna orientace myristoylu nevede 

k významné změně terciární struktury 48 . Spolu s tím bylo zjištěno, že pokud je MA 

v monomerní formě, tak je myristoylový zbytek skryt, zatímco pokud MA ztrimerisuje, je 

zbytek uvolněn. Tyto dvě formy jsou v rovnováze a spouštěčem myristoylového přepínače 

by mohla být oligomerace Gag proteinu během skládání nezralé virové částice nebo naopak 

rozpad kapsidy při vstupu do hostitelské buňky 48 . 

2.3.1.1.3 Další funkce myristoylace matrixového proteinu 

Myristoylace je nezbytná pro transport proteinu Gag k cytoplasmatické membráně. U retrovirů 

typu C mutace bránící myristoylaci Gag zabraňuje tvorbě nezralých kapsid, neboť proteiny 

Gag nejsou transportovány do místa skládání a ani nejsou schopny interagovat s membránou 

49 . U retrovirů typu B a D ke složení nezralé kapsidy dojde, neboť skládání probíhá v 

cytoplasmě. Tyto kapsidy jsou ovšem neschopny transportu k cytoplasmatické membráně a 

akumulují se v cytoplasmě 22 . 

Myristoylace je také nezbytná pro interakci Gag s cytoplasmatickou membránou a pučení 

viru ven z buňky. To je významné hlavně u retrovirů B/D typu, protože namísto postupného 

vychlipování membrány během stavby kapsidy jako u C typu musí být celá kapsida obalena 

lipidovou dvouvrstvou, což vyžaduje silnou interakci s membránou. U M-PMV byly připraveny 

mutanty se zvýšenou hydrofobicitou jádra MA proteinu, jejichž kapsidy se skládají a 

jsou transportovány k cytoplasmatické membráně, ale nejsou schopny skrz ni pučet a akumulují 

se na ní 50,51 . 

Ne zcela objasněn je vliv myristoylace na aktivaci virové proteasy. Bylo prokázáno, že mutace 

blokující transport a vazbu na membránu zároveň brání aktivaci proteasy 49,52 . U HIV-1 v 

některých buněčných liniích dochází k aktivaci proteasy i po odstranění myristoylačního 

signálu (ovšem nikoliv v přirozených hostitelských buňkách) 53,54 . 

16

Pro časnou fázi životního cyklu je naopak nezbytné, aby vazba MA byla vratná a po vstupu 

virionu do buňky se z membrány uvolnil, protože MA je součástí preintegračního komplexu 

a je zodpovědný za cílení tohoto komplexu do jádra 55 . 

Z jediné známé struktury myristoylovaného MA (HIV-1) vyplývá, že myristoylace nemá 

podstatný vliv na terciární strukturu 48 . 

2.3.1.2 Fosforylace 

Matrixový protein zajišťuje v průběhu životního cyklu dvě protichůdné funkce. V pozdní fázi 

je zodpovědný za transport polyproteinu Gag, jehož je součástí k cytoplasmatické membráně. 

Naproti tomu v časné fázi cyklu, bezprostředně po infekci je součástí preintegračního komplexu 

a zodpovídá za jeho cílení do jádra. Mnoho autorů předpokládá, že fosforylace slouží 

jako přepínač mezi těmito dvěma funkcemi, ale názory na to nejsou jednotné. Někteří autoři 

dokonce předpokládají, že fosforylace MA reguluje vazbu na membránu podobně jako v 

případě MARCKS 56 . K fosforylaci dochází na serinových a threoninových zbytcích aminokyselin 

proteinkinasami asociovanými s membránou. U mnoha retrovirů má MA primární 

strukturu zakončenu zbytkem aminokyseliny tyrosinu 57 . Ve zralém virionu je zhruba 1% 

těchto tyrosinů fosforylováno. Podle některých autorů je tato fosforylace nezbytná pro vazbu 

MA do preintegračního komplexu a brání jeho vazbě na buněčné membrány 58 . Existují 

ovšem autoři, kteří důležitost fosforylace Tyr131 popírají 59 . 

Poněkud jasnější je situace u serinových zbytků. V MA HIV-1 bylo nalezeno 5 serinů 

v pozicích 6, 9, 67, 72, 77 a 111, které mohou být fosforylovány. Serin 6 je součástí myristoylačního 

signálu a jeho mutace tedy brání skládání kapsid. Mutace serinů 9, 67, 72 a 77 

vedly ke vzniku neinfekčních virových částic. Všechny tyto seriny jsou na povrchu proteinu 

v oblasti, kterou se MA dotýká membrány. Jejich fosforylace zřejmě zabraňuje jejich interakci 

s membránou a umožňuje tak asociaci s integrasou již ve virionu 60 . 

Není také příliš jasné, jakou roli hraje fosforylace u jiných retrovirů. RSV má signál pro 

cílení do jádra v integrase a mutace zabraňující fosforylaci MA nemá na infektivitu viru 

vliv 61 . Gag M-PMV je sice také fosforylován, ovšem cílem fosforylace je pp16/pp24 16 . 

17

2.3.2 Funkce MA proteinu 

2.3.2.1 Cílení molekul Gag a jejich vazba na cytoplasmatickou membránu 

U retrovirů typu C probíhá skládání na cytoplasmatické membráně současně s pučením. Pro 

transport Gag k cytoplasmatické membráně je nezbytné, aby byl Gag na svém N-konci 

myristoylován. Pokud bylo mutací v MA doméně Gag zabráněno myristoylaci, nedocházelo 

ke vzniku nezralých virových částic, protože protein Gag nebyl transportován k membráně a 

ani s ní neinteragoval 49 . 

U retrovirů typu B/D myristoylace nemá vliv na skládání, ale zodpovídá za transport nezralé 

kapsidy k cytoplasmatické membráně 22 . MA proteiny těchto virů obsahují sekvenci zodpovědnou 

za transport Gag proteinů do periplasmatického prostoru, kde probíhá skládání. Jedná 

se o CTRS (Cytoplasmatic Targetig/Retention Signal) sekvenci, u M-PMV je v oblasti 

Pro43-Gly60. Bodová mutace argininu v pozici 55 na fenylalanin nebo tryptofan způsobí 

změnu morfogenetického typu z D na C 13 . Bylo zjištěno, že prostřednictvím CTRS sekvence 

MA a potažmo Gag interaguje s proteinem Tctex-1, který je součástí buněčného motoru 

dyneinu. Mutace v 55 aminokyselině vede k zanoření části CTRS sekvence do nitra proteinu 

a tak blokuje interakci s Tctex-1 23 . 

U retrovirů typu B a D je možné sledovat sledovat skládání nezralé kapsidy a vazbu Gag 

k cytoplasmatické membráně odděleně, neboť jsou časově i prostorově oddělené. U M-PMV 

jsou známy mutanty, ve kterých záměna hydrofilní aminokyseliny za hydrofobní brání vazbě 

nezralé virové částice na membránu 13,51 . 

2.3.2.2 Inkorporace Env 

Během pučení získává virus kromě fosfolipidové membrány také své povrchové glykoproteiny 

SU a TN. Interakce MA s cytoplasmatickou membránou naznačuje, že by MA mohl 

také interagovat s cytoplasmatickou doménou TM. Tato doména je typicky 20-40 aminokyselin 

dlouhá, ovšem u lentivirů dosahuje délky 150 aminokyselin. 

18

Některé mutace v MA jak u HIV-1 tak u M-PMV vedou ke ztrátě schopnosti inkorporace 

obalových glykoproteinů 12,62,63 . 

2.3.2.3 Cílení preintegračního komplexu 

Lentiviry jsou schopny, na rozdíl od onkogenních retrovirů, infikovat i pomalu proliferující 

nebo nedělící se buňky. V takovýchto buňkách musí být preintegrační komplex (PIC) aktivně 

transportován do jádra pomocí MA, který je spolu s RT a IN součástí PIC 64 . 

Nejlépe je důležitost MA pro transport PIC do jádra prozkoumána na HIV-1. V něm byly 

lokalizovány dvě oblasti, které slouží jako signál pro cílení do jádra 65,66 . 

U jiných retrovirů je nukleární lokalizační signál umístěn v integrase (RSV) 67 nebo chybí 

zcela a tyto retroviry jsou schopny napadat jen dělící se buňky (M-PMV nebo MLV). 

2.3.3 Struktura matrixového proteinu 

HIV 

HTLV 

MMLV 

RSV SIV M-PMV 

Obr. 6. Srovnání známých struktur retrovirových matrixových proteinů. N-konec znázorněn 

červeně. 

Do dnešní doby byla vyřešena struktura matrixových proteinů sedmi retrovirů (Obr. 6). Pomocí 

nukleární magnetické resonance (NMR) byly určeny struktury MA proteinů HIV-1 68 , 

19

BLV 69 , HTLV-II 70 a M-PMV 4 . Struktury MA proteinů RSV 71 , MoMLV (Moloney Murine 

Leukemia Virus) 72 , SIV 73 a HIV-1 74 byly určeny pomocí rentgenové krystalografie. 

Přestože primární struktura matrixových proteinů nevykazuje vysokou homologii sekundární 

a terciální struktury jednotlivých proteinů si jsou vzájemně podobné. Skládají se ze čtyř nebo 

pěti α-helixů propojených smyčkami nebo oblastmi extendované struktury. U MA s pěti 

helixy (HIV-1 a SIV) poloha prvních čtyř helixů velmi dobře odpovídá poloze helixů čtyřhelixových 

MA proteinů. Navíc u všech MA je většina bazických aminokyselinových zbytků 

na jedné straně molekuly, což umožňuje interakci s fosfolipidovou membránou 75 . 

Samozřejmě lze mezi jednotlivými MA proteiny nalézt i odlišnosti. Jak již bylo zmíněno MA 

protein SIV a HIV-1 má na svém C-konci další α-helix. V těchto dvou proteinech se jako v 

jediných nachází krátký region v konformaci β-skládaný list. N-terminální helix má v 

různých proteinech odlišnou pozici oproti zbytku molekuly. Na druhou stranu kromě HIV-1 48 

nejsou známy struktury myristoylovaných MA a je možné, že myristoylace má jistý vliv na 

zafixování pozice 1. helixu. 

2.3.3.1 Struktura HIV a M-PMV MA 

Obr. 7. Struktura nemyristoylovaného matrixového proteinu HIV-1. N-konec znázorněn červeně 

20

Matrixový protein HIV-1 obsahuje 132 aminokyselinových zbytků. Sekundární struktura je 

tvořena pěti α-helixy, smíšeným třířetězcovým β-motivem skládaného listu a krátkým úsekem 

3 10 helixu, které jsou navzájem propojené smyčkami. Helixy I, II, III a V jsou poskládány 

okolo dlouhého centrálního helixu IV a vytváří tak globulární protein z jedné strany 

uzavřený β-listem. V oblasti β-listu se nachází oblast bazických aminokyselin orientovaných 

ven z proteinu, které se účastní interakce s cytoplasmatickou membránou. Struktura HIV-1 

(Obr. 7) byla zkoumána jak pomocí NMR 68 tak pomocí rentgenové krystalografie 74 . 

U HIV-1 byla jako u jediného retroviru určena struktura myristoylovaného MA proteinu 

(Obr. 8). Vliv myristoylace na celkovou strukturu není velký, nedošlo ke změně postavení 

hlavních strukurních prvků, významnější strukturní změny jsou patrny jen poblíž N-konce. 

Myristoyl není zcela zanořen do proteinu jako u rekoverinu, ale zhruba ze 40% je přístupný 

rozpouštědlu. Na základě struktury myristoylovaného MA byl také navržen jeden z typů 

myristoylového přepínače 48 (viz. kap. 2.3.1.1.2). 

Obr. 8. Srovnání struktur myristoylovaného (červený) a nemyristoylovaného (modrý) HIV 

matrixového proteinu. 

21

Obr. 9. Struktura matrixového proteinu M-PMV. N-konec je znázorněn červeně, C-konec je 

znázorněn modře. Červeně jsou zvýrazněny threoniny 41 a 78. 

Matrixový protein M-PMV (Obr. 9) je o něco ktratší než HIV-1 MA. Je tvořen 100 aminokyselinami. 

Jeho sekundární struktura se skládá ze čtyř α-helixů propojených krátkými smyčkami 

uspořádaných podobně jako první čtyři helixy HIV-1 MA. V M-PMV MA se nachází 

dvě oblasti bazických aminokyselin. První je analogická N-terminálním bazickým doménám 

MA ostatních retrovirů. Druhá oblast se nachází na druhé straně proteinu a nemá obdobu u 

jiných MA, její funkce není známa. Struktura byla určena pomocí NMR 4,23 . 

Kromě struktury divokého typu (wt) byla určena struktura mutantu, který má arginin na posici 

55 nahrazen fenylalaninem. Sruktura mutantu se od divokého typu liší změnou úhlu, který 

spolu svírají helixy II a III, a tím dochází k reorientaci celé C-koncové domény 23 . Tato mutace 

způsobuje změnu morfogenetického typu z D na C (viz. kapitola 2.4) 13 . 

2.4 Významné mutace v MA proteinu 

Vzhledem k malé homologii v primárních strukturách matrixových proteinů jednotlivých 

retrovirů, není mnoho bodových mutací, které by měly stejný efekt u všech retrovirů. Příkladem 

mutace, která ovlivňuje všechny retroviry stejným způsobem, je poškození myristoylačního 

signálu například záměnou glycinu na pozici 2 za alanin (G2A). Mutace znemožní 

transport proteinů Gag k cytoplasmatické membráně 49 (viz. kapitola 2.3.1.1). 

22

2.4.1 Významné mutace v HIV-1 MA 

Matrixový protein viru HIV-1 byl podroben celé řadě mutačních studií. V následující tabulce 

jsou shrnuty výsledky nejdůležitějších z nich. 

Tab. III shrnutí fenotypů významných mutantů HIV-1 MA 

Mutace Stabilita proteinu 

Schopnost 

skládat 

Schopnost 

uvolnit 

Infektivita vzniklých 

Gag 

virovou částici 

virovou částici z 

částic 

buňky 

wt + + + + 

L8A + - - - 

S9A + + + - 

L13E + + - - 

W16A + ++ + - 

K18I + + - - 

R20G + + - - 

L21S/K + ++ + - 

R22A + + - - 

L31E + + - - 

K32L + + - - 

W36A + ++ + - 

R39E/R43E + I - - 

A45I + + + - 

L50A/L51A - - - - 

G56E - - - - 

C57D/S + - - - 

I60E + - - - 

23

Mutace Stabilita proteinu Schopnost skládat 

Gag 


Schopnost uvolnit 


buňky 


částic 

S67A + + + - 

T70E/E74K - - - - 

S72A + + + - 

S77A + + + - 

L85R + I - - 

Y86G + I - - 

C87D + I - - 

V88E + I - - 

H89G + I - - 

(I-skládá se na vnitřních membránách) 

Mutace v oblasti aminokyselin 85-89 vedou ke ztrátě infektivity a k pučení virionů do vakuol 

Golgiho aparátu 76 . Stejný efekt má také dvojitá mutace R39E/R43E 77 . 

Je známo mnoho mutací, které brání skládání nezralé virové částice. Některé způsobují 

nestabilitu celého Gag proteinu (L50A/L51A, G56E, T70E/E74K). Jiné pravděpodobně brání 

vazbě Gag na membránu (L8A, C57S, I60E) 77 . 

Velmi zajímavé jsou mutanty W16A, W36A a L21K. Ty způsobují naopak silnější vazbu 

Gag na membránu a tím rychlejší pučení než v případě divokého typu. Zároveň vykazují také 

nižší infektivitu. Tyto mutace jsou také schopny potlačit účinek některých mutací znemožňujících 

vazbu Gag na cytoplasmatickou membránu (například L8A) 47 . Společným rysem 

těchto mutací je, že nahrazují zbytky hydrofobních aminokyselin hydrofilnějšími. Změna 

fenotypu je tedy pravděpodobně způsobena snížením hyrofobicity jádra proteinu, která usnadňuje 

uvolnění myristoylového zbytku pro integraci s membránou. Tím by se kompenzoval 

vliv mutací, které naopak interakci s membránou brání a lze tím také vysvětlit snížení 

infektivity, neboť myristoyl se nezanoří zpět do proteinu a neuvolní MA z membrány, aby se 

mohl stát součástí PIC. 

24

Mutace L13E, K18I, R20G, R22A, L31E a K32L znemožňují inkorporaci molekul Env do 

virionu, ovšem nebrání inkorporaci molekul Env z jiných retrovirů s krátkými cytoplasmatickými 

doménami 63,77 . 

Mutace serinů 9, 67, 72 a 77 brání jejich fosforylaci a vedou ke ztrátě infektivity 60 (viz. kapitola 

2.3.1.2.). 

Mutace narušující myristoylaci nejsou v tabulce uvedeny (viz. kapitola 2.3.1.1.) 

2.4.2 Významné mutace v M-PMV MA 

Marixový protein M-PMV byl také podroben mnoha mutačním studiím 50 . 

Tab. IV shrnutí fenotypů mutantů M-PMV MA 

Mutace Stabilita proteinu 

Schopnost 

skládat 

Schopnost 

uvolnit 


Gag 



částic 

buňky 

bez mutace +++ +++ +++ +++ 

P43L + + - 

P72S + + - 

P43L/S81F + + - 

R55F +++ M +++ - 

A18V +++ +++ - 

A79V +++ +++ + - 

T69I +++ +++ +++ + 

T41I/T78I +++ +++ ++ + 

(M-nezralá virová částice se skládá na membráně) 

Mutace v prolinových zbytcích 43 a 72 ukazuje na jejich důležitost pro sbalování Gag proteinu, 

protože jejich záměna vede k snížení účinnosti skládání a snížení stability celého Gag. 

Mutanty A18V, A79V a T69I jsou defektní v transportu virové částice. Tyto mutace neovlivňují 

skládání virové částice, ovšem znemožňují nebo alespoň výrazně zpomalují její transport 

25

k cytoplasmatické membráně. Tím se ve svém účinku velmi podobají mutantům zabraňujícím 

myristoylaci. Mutant R55F je unikátní tím, že neovlivňuje infektivitu, ale mění místo 

skládání nezralé virové částice. Částice se neskládá v cytoplasmě, ale na cytoplasmatické 

membráně podobně jako je tomu u retrovirů typu C 13 . Arginin 55 je součástí CTRS sekvence, 

která je zodpovědná za interakci s proteinem Tctex-1 což je lehký řetězec retrográdního buněčného 

motoru dyneinu. Mutace způsobí ukrytí části této sekvence pod povrch, čímž omezí 

interakci MA s Tctex-1 23 . 

Dvojitý mutant T41I/T78I je defektní v interakci s cytoplasmatickou membránou. Nezralé 

kapsidy se skládají v periplasmatické oblasti a jsou transportovány k cytoplasmatické membráně 

stejně jako u wt. U membrány se ale viriony akumulují a jsou jen minimálně uvolňovány 

ven z buňky (Obr. 10). Pokud se ovšem provede mutace jen v threoninu 41, k 

zablokování pučení nedojde, ale mutace v threoninu 78 má menší účinek než mutace 

T41I/T78I 13 . Tato změna se vysvětluje tím, že hydrofobní isoleuciny se zanoří do jádra proteinu, 

čímž zvýší jeho hydrofobicitu a znemožní uvolnění zbytku kyseliny myristové pro 

interakci s membránou. Tuto hypotézu potvrzují také mutanty Y11F, Y28F a Y67Y , připravené 

za tímto účelem, a které se chovají stejně jako mutant T41I/T78I. Druhým možným 

vysvětlením změny fenotypu je, že mutace způsobí konformační změnu proteinu, která 

zabrání interakci s membránou 51 . 

Obr. 10. Elektronmikroskopický snímek nezralých virových částic M-PMV, nesoucích mutaci 

T41I/T78I. Částice se akumulují na cytoplasmatické membráně a nepučí skrz ni. 

Převzato z článku 50 26

3. Experimentální část 

3.1 Materiál 

3.1.1 Chemikálie 

Bio-Rad: bis-akrylamid, molekulové standardy pro SDS PAGE 

Biotika Slovenská Ľupča: ampicilin 

Fluka: lysozym 

Oxoid: technický agar 

Penta: ethanol, glycerol 

Qiagen: Ni–NTA agarosa 

Roche: COMPLETE směs inhibitorů, DNasa I, RNasa A 

Sigma: akrylamid, Coomassie Briliant Blue R-250, Coomassie Briliant Blue G, deuterium 

oxid, dimethylsulfoxid (DMSO), dithiothreitol (DTT), dodecylsulfát sodný (SDS), 

glycin, imidazol, isopropyl-D-thiogalaktopyranosid (IPTG), kvasničný autolysát – 

Serva, SRN, N, N, N´, N´ tetramethylethylendiamin (TEMED), peroxodisíran 

amonný (APS), thiamin, tricin, Tris base 

Spectra Stable Isotopes: D-glukosa nespecificky obohacená 13 C, chlorid amonný nespecificky 

obohacený 15 N, L-isoleucin nespecificky obohacený 13 C a 15 N 

Všechny ostatní běžné chemikálie byly od firem Sigma a Lachema 

Peptidový inhibitor M-PMV proteasy PYVPstAMT pocházel z ÚOCHB, AV ČR 

Plasmid pEMAPPHis vytvořený na základě komerčního plasmidu pET-22b pochází od Dr. 

Lipova, UBM, VŠCHT Praha 

27

3.1.2 Roztoky 

LB médium (Luria-Bertani médium), 1 litr 

10 g trypton 

10 g NaCl 

5 g kvasničný autolyzát 

200 µl 5M NaOH 

LB agar 

1 l LB médium 

18 g agar technický 

M9 minimální médium, 1litr 

1 ml 1M MgSO 4 

1 ml 0,1M CaCl 2 

1 ml 1M thiaminu 

10 ml 20% glukosy (w/w) 

10 ml 50% NH 4 Cl (w/w) 

100 ml roztoku 10 x M9 soli 

Roztok 10 x M9 soli, 1 litr 

75 g Na 2 HPO 4 .2H 2 O 

30 g KH 2 PO 4 

5 g NaCl 

pH 7,4 

Fosfátový lyzovací pufr: 

50 mM fosfátový pufr 

300 mM NaCl 

10 mM imidazol 

pH 8 

28

Roztoky pro tricin - SDS PAGE 

Vzorkový pufr: 

100 mM Tris base 

200 mM dithiothreitol 

8 % SDS (w/v) 

24 % glycerol (w/v) 

0,02 % Coomassie Blue G-250 (w/v) 

pH 6,8 

Anodový pufr: 


pH 8,9 

Katodový pufr: 


100 mM tricin 

0,1 % SDS (w/v) 

pH neupravováno 

Pufr pro přípravu gelu: 

3 M Tris base 

0,3 % SDS (w/v) 

pH 8,45 

Roztok akrylamidu: 

29 g akrylamidu 

1g bis-akrylamidu 

100 ml vody 

29

Roztok Coomassie Blue (barvení gelů po SDS PAGE) 

0,25 g Coomassie Briliant Blue R-250 

45 ml CH 3 OH 

10 ml CH 3 COOH 

45 ml H 2 O 

Roztok byl zfiltrován. 

Odbarvovací roztok 

250 ml CH 3 OH 


Objem byl doplněn do 1 litru destilovanou vodou. 

Sušící roztok 



30 ml glycerolu 

Objem byl doplněn destilovanou vodou do 1 litru. 

Roztoky pro barvení stříbrem (barvení gelů po SDS PAGE): 

Roztok I 

5,7 ml CH 3 COOH 

32 ml CH 3 OH 

0,5 ml 37% HCHO 

Objem doplněn do 0,5 l destilovanou vodou. 

Roztok II 


250 ml H 2 O 

Roztok III 

1 g Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O 


30

Roztok IV 

1 g AgNO 3 

0,38 ml 37% HCHO 


Roztok V 

30 g Na 2 CO 3 

2 mg Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O 

0,25 ml 37% HCHO 


Roztok VI 

32 ml CH 3 OH 

5,7 ml CH 3 COOH 


Pufr pro M-PMV proteasu: 


900 mM NaCl 

pH 6,25 

Pufr pro gelovou permeační chromatografii 


100 mM NaCl 

0,01 % merkaptoethanol 

0,05 % azid sodný 

pH 6,5 

31

Vzorkový pufr pro NMR spektroskopii 


200 mM NaCl 

5 mM dithiotreitol 

10% deuterium oxid 

0.05% azid sodný 

Complete inhibitory proteas 

pH 6 

Polymerační směs pro 4,5% akrylamidový gel 

53,2 µl zásobního roztoku akrylamidu (22% akrylamid, 0,96% bis-akrylamid) 

204 µl vody 

2,6 µl 10% peroxodisíranu amonného 

0,26µl TEMED 

3.1.3 Buněčný materiál 

produkce rekombinantních proteinů – E. coli BL21(DE3) - mikrobiologická sbírka Ústavu 

biochemie a mikrobiologie VŠCHT v Praze, Invitrogen, USA 

3.1.4 Použité plasmidové expresní vektory 

pEMAPPHis (T41I/T78I) 

Plasmid na bázi komerčního vektoru pET22b s vloženým genem pro MA s mutací 

T41I/T78I, částí genu pro PP tak, že výsledný protein je ve fúzi s histidinovou kotvou na C- 

konci. 

3.1.5 Přístroje 

analytické váhy - Sartorius, SRN 

aparatura pro elektroforetickou separaci proteinů - MiniProtean III, Bio-Rad, USA 

inkubační blok - Thermolyne17600, USA 

32

laminární box - Clean air Woerden, Nizozemí 

nízkotlaký chromatograf - Biologic LP, Biorad, USA 

odstředivka - Beckman J2-MC, USA 

odstředivka - Eppendorf 5415 C, SRN 

odstředivka - Hettich EBA 12 R, SRN 

orbitální inkubátor - Gallenkamp, USA 

pH metr - inoLab pH Level1, WTW, SRN 

předvážky – AND, Japonsko 

sonikátor – Microson, UL, USA 

spektrofotometr - Unicam Helios α, UK 

spektrometr pro NMR - Avance DRX500, Brüker, USA 

třepačka gelů - KS 125, IKA Labortechnik, SRN 

vortex - IKA Labortechnik, SRN 

3.2 Metody 

3.2.1 Příprava kompetentních buněk 

Kompetentní buňky, tedy buňky schopné přijmout plasmidovou DNA, byly připraveny 

metodou dle Cohena s použitím chloridu vápenatého 78 . Buňky Escherichia coli kmene 

BL21 (DE3) byly rozetřeny ze zásobní kultury na pevné LB médium a kultivovány při 37 

°C přes noc. Jedna isolovaná kolonie byla použita pro přípravu 5 ml inokula. Inokulum 

bylo připraveno kultivací při 37 °C v orbitálním inkubátoru při otáčkách 250 rpm přes noc. 

Část inokula byla převedena do 200 ml LB media a buňky byly kultivovány při teplotě 37 

°C, 250 rpm do doby, kdy optická denzita (OD), měřená při vlnové délce 590 nm, dosáhla 

hodnoty 0,4. Po aseptickém převedení do předchlazených sterilních zkumavek byly buňky 

odděleny od živného média centrifugací (1500 × g, 10 min, 4 °C, nízký stupeň brždění). 

Všechny následující operace byly prováděny pokud možno v chladové místnosti nebo 

alespoň na ledu. Peleta buněk byla resuspendována v 50 ml vychlazeného sterilního 

100mM roztoku CaCl 2 . Suspenze byla ihned centrifugována (1500 × g, 10 min, 4 °C, nízký 

33

stupeň brždění) a supernatant byl opět odstraněn. Peleta byla resuspendována v 2,7 ml 

vychlazeného roztoku CaCl 2 a inkubována na ledu 4 – 6 hodin. Poté bylo přidáno 2,3 ml 

sterilního vychlazeného 50% roztoku glycerolu. Suspenze byla pipetována po 100 či 150 µl 

do sterilních vychlazených mikrozkumavek na ledu. Takto připravené zkumavky byly poté 

rychle zmraženy ponořením do tekutého dusíku či ethanolu o teplotě -80 °C. Buňky byly 

skladovány v hlubokomrazícím boxu při teplotě - 80 °C. 

3.2.2 Transformace kompetentních buněk 

Mikrozkumavka se zmraženou buněčnou suspenzí byla přesunuta z mrazícího boxu na led a 

zde ponechána rozmrznout. Poté k ní bylo přidáno potřebné množství DNA (obvykle 1,5 µl). 

Suspenze byla poté ponechána 30 minut na ledu. Následoval tepelný šok ponořením mikrozkumavky 

na 2 minuty do vodní lázně o teplotě 42°C. Poté bylo k suspenzi přidáno 800 µl LB 

média a byla inkubována 1h při 37°C. Takto získaná suspenze byla poté rozetřena na Petriho 

misky s LB agarem obsahujícím ampicilín o koncentraci 100 mg/l a inkubována přes noc při 

37°C. 

3.2.3 Produkce rekombinantního matrixového proteinu M-PMV 

v E. coli 

Transformované kolonie E. coli byly resuspendovány v LB médiu s ampicilínem o koncentraci 

100 mg/l tak, aby optická densita měřená při 590 nm byla přibližně 0,1. Buněčná suspenze 

byla poté inkubována v orbitálním inkubátoru do OD 590 ~ 0,5. Poté byl do média 

přidán induktor exprese IPTG do výsledné koncentrace 0,4 mM. Po čtyřech hodinách byly 

buňky odděleny od zbytku média centrifugací (11800 g, 10 minut, 4°C). Peleta byla resuspendována 

ve fosfátovém lysovacím pufru a poté zamražena. 

34

3.2.3.1 Produkce izotopově obohaceného rekombinantního matrixového 

proteinu M-PMV v E. coli 

Pro měření proteinu pomocí NMR spektroskopie je nutné připravit protein uniformě obohacený 

o izotopy 13 C a 15 N. Tato příprava se od předešlé odlišuje pouze růstovým médiem, 

ostatní podmínky zůstaly stejné. Bylo použito M9 minimální médium, ve kterém byl NH 4 Cl 

nahrazen 15 NH 4 Cl a glukosa byla nahrazena uniformně 13 C obohacenou glukosou. 

3.2.4 Desintegrace buněk E. coli obsahujících rekombinantní 

protein 

Zamražená buněčná suspenze byla pomocí horké vody rozmražena a byl k ní přidán komerční 

inhibitor proteas. Poté bylo přidáno 30 mg lysozymu a směs byla inkubována za stálého 

míchání 30 minut při pokojové teplotě. Následovala sonikace 3x 1,5 min při výkonu 20W na 

ledu. Poté byl přidán deoxycholát do výsledné koncentrace 0,1%, směs byla poté inkubována 

30 min při pokojové teplotě za stálého míchání. Poté byla přidána DNasa I do koncentrace 1 

mg/ml a RNasa do koncentrace 2 mg/ml a směs byla zamíchána a inkubována při 37°C 30 

min. Následovala druhá sonikace. Nerozpustné zbytky buněk byly poté odděleny centrifugací 

(15 000 g, 15 min, 4°C). Pro ověření účinnosti desintegrace byla peleta resuspendována ve 

fosfátovém lysovacím pufru a spolu se supernatantem nanesen na SDS PAGE. 

3.2.5 Metaloafintiní chromatografie 

Matrixový protein byl produkován jako fůzní polyprotein MAPPHis, přičemž PP je N- 

terminální část fosfoproteinu a His je histidinová kotva. Takto bylo vytvořeno mezi MA a 

histidinovou kotvou štěpné místo pro M-PMV proteasu, umožňující odštěpení samotného 

MA od histidinové kotvy. 

Po desintegraci buněk byly k supernatantu přidány 4 ml suspenze Ni-NTA agarosy a směs 

byla inkubována za stálého míchání 1 hodinu při 4°C. Poté byla agarosa promyta 20 ml fosfátového 

lysovacího pufru a 20 ml pufru pro M-PMV proteasu. Agarosa byla resuspendována 

ve 4 ml proteasového pufru a 1 ml roztoku rekombinantní M-PMV proteasy (0,4 

35

mg/ml). Štěpění probíhalo 1 hodinu při pokojové teplotě za stálého míchání. Poté byl supernatant 

oddělen od agarosy a agarosa byla promyta 5 ml pufru pro gelovou chromatografii. 

V této fázi je možné orientačně zjistit koncentraci proteinu měřením absorbance při 280 nm 

s využitím vypočteného extinkčního koeficientu 79 . 

3.2.6 Gelová permeační chromatografie 

Pro gelovou permeační chromatografii byla použita kolona HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 

HR (Pharmacia) s dělícím rozsahem 1-100 kDa o objemu 320 ml. Chromatografie byla provedena 

na přístroji BioLogic (Bio-Rad), při konstantním průtoku mobilní fáze (pufr pro gelovou 

chromatografii) 1,3 ml/min. Frakce byly jímány po 4 ml. Průběh chromatografie byl 

zaznamenáván UV detektorem v podobě elučních pásů. 

3.2.7 Elektroforesa v polyakrylamidovém gelu obsahujícím SDS 

(SDS-PAGE) 

Analýza proteinů byla prováděna pomocí SDS elektroforesy v polyakrylamidovém gelu 

v tris-tricinovém uspořádání. Separace probíhala 40 minut při napětí 40 V a poté 50 minut při 

napětí 150 V. Gely byly poté nejčastěji obarveny v roztoku Comassie blue (30 minut) a poté 

odbarveny v odbarvovacím roztoku do dostatečného odbarvení pozadí. Pro vyšší citlivost 

bylo použito barvení stříbrem. 

3.2.8 Koncentrování roztoků proteinu 

Roztoky proteinů byly koncentrovány centrifugační ultrafiltrací pomocí filtračních 

kyvet Centricon (Amicon, Millipore, USA) s vylučovacím limitem 3 kDa při 6 800 g, 15 

°C do požadované koncentrace minimálně 1 mmol/l. Přibližná koncentrace byla stanovena 

měřením absorbance při 280 nm. Během koncentrování byl protein převeden do pufru pro 

NMR měření. 

36

3.2.9 Příprava vzorků pro NMR experimenty 

Určení chemických posunů vodíků na aromatických kruzích aminokyselin fenylalaninů, tryptofanů 

a tyrosinů ztěžuje to, že mají podobné chemické posuny jako vodíky amidických 

skupin. Pro určení jejich chemických posunů je proto potřeba připravit vzorek v němž jsou 

amidické vodíky vyměněny za deuterium. Za tímto účelem byl vzorek dvakrát lyofilizován a 

rozpuštěn v 99,9% těžké vodě. Mezi lyofilizacemi byl protein ponechán 3 dny při 4°C. 

Pro přesné měření orientace isoleucinů byl připraven vzorek, v němž byly izotopově obohaceny 

13 C/ 15 N pouze isoleuciny. Příprava vzorku se odlišovala pouze přídavkem 40 mg takto 

obohaceného isoleucinu na litr minimálního média. 

Pro měření residuálních dipolárních interakcí bylo nutné protein měřit v anizotropním 

prostředí. Tím byl stlačený 4,5% polyakrylamidový gel. Polymerační směs zpolymerovala 

v polymerační komůrce. Gel byl přes noc promyt v deionizované vodě a poté vysušen cca na 

10% původního objemu. Poté k němu bylo přidáno 250 µl vzorku proteinu a přes noc se nechal 

nasáknout. Poté byl gel příčně stlačen a umístěn do NMR kyvety pro měření. 

3.2.10 NMR spektroskopie 

NMR spektra byla snímána na spektrometru Avance DRX 500 firmy Bruker při 25°C. Pro 

měření 1 H spektra byla použita pracovní frekvence 500,132 MHz a pro 15 N spektrum 50,684 

MHz. Spektra byla zpracována pomocí programu NMRPipe 80 a analyzována pomocí programu 

Sparky 81 . 

Pro základní zhodnocení správného sbalení proteinu bylo u každého vzorku obohaceného 15 N 

měřeno 1 H- 15 N HSQC spektrum, protože změna struktury se v něm projeví posunem signálů 

ve spektru. Prvním krokem pro určení struktury proteinu je přiřazení chemických posunů 

jednotlivých atomů proteinu. Přiřazení chemických posunů 1 H, 15 N a 13 C páteře proteinu bylo 

provedeno na základě souboru experimentů: HNCO, HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, 

CBCA(CO)NH a HB(CB)HA(CA)(CO)NH 82 . Pro přiřazení chemických posunů atomů 

postranních řetězců aminokyselin byla změřena spektra H(C)CH-TOCSY a (H)CCH-COSY. 

Vzdálenostní omezení pro výpočet struktury byla získána z editovaného ( 13 C a 15 N) 3D NO- 

ESY spektra. Pro přiřazení chemických posunů aromatických vodíků aminokyselin Phe, Tyr 

37

a Trp bylo změřeno 13 C-NOESY spektrum. Typické nastavení pro sběr dat pro experimenty s 

trojitou resonancí bylo: 1 H spektrální šířka 7000 Hz, velikost dat 1024 komplexních bodů; 

15 N spektrální šířka 1500 Hz, velikost dat 92 komplexních bodů; 13 C (oblast CB + CA) spektrální 

šířka 8100 Hz, velikost dat 64 komplexních bodů. V doménách 13 C a 15 N byla pro 

zvětšení velikosti dat použita lineární predikce. 

3.2.11 Výpočet struktury 

Na základě znalosti chemických posunů atomů páteře proteinu lze předpovědět oblasti 

s pravidelnou sekundární strukturou. Polohu α-helixů a β-skládaných listů je možné odhadnout 

z chemických posunů atomů Hα, Cα, Cβ a C‘ a pomocí tzv. indexu chemických posunů 

(Chemical shift index CSI). Výpočet CSI je založen na porovnání chemického posunu těchto 

atomů v proteinu s tabelovanými chemickými posuny pro strukturu náhodného klubka. Pokud 

má aminokyselina v proteinu vyšší chemický posun, než horní mez v referenčním intervalu 

pak pravděpodobně leži v β-skládaném listu. Pokud má naopak chemický posun nižší, 

pak pravděpodobně leží v α-helixu. Výpočet byl proveden pomocí programu CSI 83 . Na základě 

znalosti přibližné pozice α-helixů byly pro výpočet struktury v těchto oblastech aplikovány 

omezení vodíkovými vazbami pro snazší konvergenci výpočtu. 

Na podobném principu je založen odhad omezení páteřních dihedrálních úhlů. Chemické 

posuny atomů 1 Hα, 13 Cα, 13 Cβ a 13 C‘jsou porovnány s databází chemických posunů atomů 

páteře proteinů se známou strukturou a z tohoto porovnání jsou vypočteny rozmezí povolených 

dihedrálních úhlů φ a ψ. Pro tento odhad byl použit program TALOS 84 . 

Základem pro výpočet struktury byla omezení meziprotonových vzdáleností vycházející 

z NOESY spekter. NOE interakce vznikají mezi dvojicemi vodíkových atomů vzdálených od 

sebe méně než 5,5 Ǻ, bez ohledu na jejich vzdálenost v primární struktuře. Intenzita signálu 

NOE je úměrná inverzní šesté mocnině vzdálenosti mezi interagujícími atomy. 

Z jednotlivých NOE interakcí se vytvoří síť strukturních omezení, ze kterých je možno vypočítat 

strukturu proteinu. Pro přiřazení jednotlivých „kross-píků“ v NOESY spektru, kalibraci 

strukturních omezení a výpočet předběžné struktury byl použit softwarový balík Aria 

(verze 2.0 alpha) 85 . Vzdálenostní omezení, omezení dihedrálních úhlů, vodíkové vazby a 

38

esiduální dipolární kaplingy byly poté použity jako vstup do programu NIH-XPLOR 86 . 

Tento program byl použit pro konečné přiřazení strukturních omezení a výpočet finálního 

souboru 

struktur. 

3.2.12 Interpretace a srovnání struktur 

Vizualizace vypočtených struktur a jejich vzájemné porovnání bylo prováděno pomocí programu 

VMD 87 a programu PyMOL 88 . Blízkost struktur byla hodnocena výpočtem faktoru 

RMSD (Root Mean Square Deviation – střední kvadratická odchylka) mezi atomy páteře 

proteinu. RMSD je definována jako 

N 

∑ 

i=1 

2 

[ x − y ] 

i 

N 

kde N je počet srovnávaných atomů a x i a y i jsou pozice i-tého atomu ve struktuře x a y a 

udává se v Ǻngströmech. Pro výpočet úhlů, které mezi sebou svírají jednotlivé helixy byl 

použit program MOLMOL 89 . Pro analýzu získaných struktur byl použit program 

PROCHECK 90 . 

i 

3.2.13 Residuální dipolární interakční konstanty 

Residuální interakční konstanty (RDC z angl. residual dipolar coupling) je možné měřit 

v prostředí, kde jsou molekuly částečně uspořádané vůči magnetickému poli. Jejich velikost 

závisí na orientaci vazby vůči vnějšímu magnetickému poli a tím i vůči zbytku molekuly. 

Uspořádání molekul proteinu bylo docíleno umístěním vzorku do polyakrylamidového gelu, 

který byl poté příčně stlačen, čímž došlo k částečnému uspořádání molekul matrixového proteinu 

v prostoru. RDC lze použít k zpřesnění celkové struktury, obzvláště pro upřesnění 

vzájemné orientace nezávislých domén, mezi kterými často není dostatek signálů NOE, protože 

poskytují informaci o úhlových orientacích vazeb. Spektra byla měřena pomocí pulsní 

sekvence H-N HSQC IPAP 91 . Získané RDC byly analyzovány v programu Igor 6.0 a v tomto 

programu byly i vypočteny RDC z již vypočtených struktur. 

39

4. Výsledky 

4.1 Příprava rekombinantního proteinu 

Pro přípravu rekombinantního proteinu byl použit postup použitý pro přípravu divokého typu 

a mutantu R55F MA, také vektor pro expresi proteinu je prakticky totožný. Exprese 

v buňkách E. coli probíhala velmi dobře, protein tvořil velkou část všech buněčných proteinů 

a pro přípravu vzorku postačovalo použít 0,5 l média. Z tohoto množství bylo možné připravit 

dva NMR vzorky. Purifikace pomocí metaloafinitní chromatografie poskytovala již 

dostatečně čistý protein pro NMR, ovšem z důvodu precipitace během zahušťování na koncentraci 

potřebnou pro měření byl zařazen ještě další purifikační krok, a to gelová permeační 

chromatografie. Průběh purifikace je dokumentován na gelu z PAGE (Obr. 11). 

kDa 1 2 

200 

116,3 

97,4 

66,2 

45 

31 

21,5 

14,4 

3 4 5 6 

7 

6,5 

Obr. 11 Průběh přípravy rekombinantního matrixového proteinu. Gel po tris-tricinové SDS 

PAGE, barveno koloidním stříbrem. 

Dráha 1 Buňky před indukcí IPTG 

Dráha 2 Buňky 4 h po indukci 

Dráha 3 Nerozpustná peleta po lýzi 

40

Dráha 4 Supernatant po lýzi 

Dráha 5 Proteiny nezachycené na Ni-NTA agarose 

Dráha 6 Matrixový protein po metaloafinitní chromatografii 

Dráha 7 Matrixový protein po gelové permeační chromatografii 

Poté byly frakce obsahující MA zahuštěny do finální koncentrace alespoň 1 mmol/l. Přibližná 

koncentrace MA byla určována měřením absorbance při 280 nm v nezahuštěných frakcích 

po gelové chromatografii. Během zahušťování občas docházelo k částečné precipitaci proteinu, 

ovšem v porovnání s divokým typem i mutantem R55F MA byl mutant T41I/T78I stabilnější 

a precipitoval méně. Z 0,5 l média bylo průměrně získáno 22 mg purifikovaného rekombinantního 

proteinu. Správná konformace proteinu a jeho dostatečná koncentrace byla u 

každého 15 N-značeného proteinu ověřována změřením 1 H- 15 N HSQC spektra a porovnáním 

chemických posunů jednotlivých signálů s dříve naměřenými spektry. U všech čerstvě 

připravených vzorků MA proteinů byly pozorovány ve spektru další signály, které však během 

několika dnů vymizely. 

4.2 Přiřazení chemických posunů atomů proteinu 

Přiřazování resonancí probíhalo ve dvou fázích. V první fázi byly naměřeny experimenty pro 

sekvenční přiřazení chemických posunů atomů páteře proteinů, tj. N, H N , C α , H α , C β a H β . Ve 

druhé fázi byly potom naměřeny experimenty, které umožňovaly na základě znalosti chemických 

posunů atomů páteře přiřadit chemické posuny atomů postranních řetězců jednotlivých 

aminokyselin. 

Pro přiřazení chemických posunů atomů páteře proteinu byla použit soubor experimentů 

HNCO, HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, CBCA(CO)NH a HBHA(CBCA)(CO)NH. Pro 

sekvenční přiřazení je nejprve nutné identifikovat počáteční aminokyselinu pomocí unikátního 

chemického posunu např. glycin, alanin, serin nebo threonin. Problém při tomto způsobu 

přiřazování představují proliny, neboť všechny tyto experimenty, jak je patrné z jejich 

názvu, vyžadují H N skupinu, a protože prolin H N neobsahuje, dojde k přerušení sekvenčního 

přiřazování a je tedy nutné identifikovat počáteční aminokyselinu v každém úseku odděle- 

41

ném prolinem. V případě mutantu T41I/T78I byla situace usnadněna znalostí chemických 

posunů atomů N a H N divokého typu MA. V oblastech, kde nedochází k překryvu jednotlivých 

signálů, bylo možno předpokládat, že signál se stejným chemickým posunem patří 

stejné aminokyselině. Tímto způsobem se podařilo identifikovat cca 30% signálů amidických 

skupin, což významně usnadnilo přiřazení celé páteře proteinu. 

Celkem se podařilo přiřadit 94,7% chemických posunů H N atomů, 92,5% chemických posunů 

N atomů, 100% chemických posunů C α atomů a 96,8% chemických posunů C β atomů. 

Všechny chemické posuny jsou uvedeny v příloze. 

Pro přiřazení chemických posunů atomů vodíku a uhlíku postranních řetězců nearomatických 

aminokyselin byly použity experimenty (H)CCH-COSY a H(C)CH-TOCSY. Pro využití 

těchto experimentů je nutné znát chemické posuny C α a H α nebo C β a H β atomů. Chemické 

posuny některých atomů postranních řetězců aminokyselin byly též určeny pomocí experimentů 

NOESY, kde jsou interakce mezi atomy ze stejné aminokyseliny často velmi silné. 

Pro výpočet struktury jsou významné hlavně chemické posuny atomů postranních řetězců 

hydrofobních aminokyselin, které jsou obvykle zanořeny do proteinu a poskytují 

informace o interakcích mezi vzdálenými částmi molekuly. Z těchto aminokyselin bylo 75% 

signálů vodíkových a uhlíkových atomů přiřazeno zcela a zbytek alespoň částečně. 

Přiřazení chemických posunů postranních řetězců aromatických aminokyselin je většinou 

komplikováno malou disperzí chemických posunů jak ve vodíkovém, tak i uhlíkovém 

spektru. Proto se využívá napojení signálů aromatických atomů na poměrně dobře oddělené a 

již přiřazené signály C β . Nevýhodou těchto experimentů je ovšem velmi nízká citlivost a tudíž 

nutnost pracovat se vzorky o velmi vysoké koncentraci (3-5 mM) nebo mít k dispozici 

výkonější NMR spektrometr vybavený kryosondou. Vzhledem k tomu, že takový přístroj 

nebyl k dispozici, byly chemické posuny aromatických vodíků určovány pouze z NOESY 

spekter. Pro rozlišení aromatických a amidických vodíků byl připraven protein, v němž byly 

amidické vodíky nahrazeny deuteriem. Dvě lyofilisace s následným rozpuštěním v D 2 O byly 

dostačující a pouze I86 H N nebyl zcela vyměněn (viz. Obr. 12). 13 C editované NOESY spektrum, 

naměřené v D 2 O, bylo využito pouze jako referenční spektrum pro rozhodnutí, zda 

daný signál odpovídá amidickému nebo aromatickému vodíku z důvodů jeho nižší kvality. 

42

A 

B 

Obr. 12 Srovnání HN-HSQC T41I/T78I mutantu MA v H 2 O (A) a D 2 O (B). Úbytek signálů 

je způsoben náhradou vodíku deuteriem. 

4.2.1 Porovnání chemických posunů atomů HN a N mutantu a 

divokého typu 

Chemické posuny atomů H N a N jsou velmi výhodné pro sledování strukturních změn pro 

jejich velkou disperzi (malé překryvy signálů) a nezávislost na typu aminokyselinového 

zbytku. Změna chemického okolí se projeví změnou chemického posunu atomu. Protože 

chemický posun amidických dusíků je zhruba pětkrát vyšší než chemický posun amidických 

vodíků, byl pro výpočet rozdílu chemických posunů mezi T41I/T78I a divokým typem MA 

15 

⎛ ω N ⎞ 

∆ ⎜ 5 ⎟ . 

⎝ ⎠ 

1 

použit vzorec: = ⎜ ⎟ + ( ω H ) 2 

2 

Na obrázku 13 je srovnání 1 H– 15 N HSQC spekter obou proteinů a na obrázku 14 vyhodnocení 

rozdílů v jejich chemických posunech. 

43

Obr. 13 Porovnání H-N HSQC spekter mutantu T41I/T78I (červeně) a divokého typu (zeleně) 

MA. 

44

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

2 12 22 32 42 52 62 72 82 92 

Obr. 14 Histogram rozdílů chemických posunů amidických atomů mezi divokým typem a 

mutantem T41I/T78I. Pozice mutovaných aminokyselin jsou znázorněny červeně. 

Z histogramu rozdílů chemických posunů vyplývá, že k největším změnám chemického posunu 

došlo v okolí mutací a v oblastech aminokyselin 26-34, 63-79 a 83-86. 

4.3 Výpočet struktury 

4.3.1 Odhad sekundární struktury pomocí výpočtu indexu 

chemických posunů (CSI) 

Po přiřazení chemických posunů bylo možno pomocí výpočtu CSI odhadnout sekundární 

strukturu proteinu. V diagramu na obrázku 16 je vynesen tzv. „konsensuální“ index 

chemických posunů, vycházející z chemických posunů atomů N, H N , H α a H β . Oblasti α- 

helixu odpovídá index -1, oblasti extendované struktury (β-skládaného listu) odpovídá index 

+1 a index 0 přísluší oblastem s neuspořádanou strukturou. Pro srovnání je na obrázku 15 

index chemického posunu wt MA. 

45

1 

0 

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 

-1 

Obr. 16 Histogram indexu chemických posunů mutantu T41I/T78I M-PMV MA 

1 

0 

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 

-1 

Obr. 15 Histogram indexů chemických posunů divokého typu M-PMV MA. 

Výpočtem indexu chemických posunů se podařilo identifikovat 4 α-helixy v oblastech aminokyselin 

7-21, 28-40, 55-70 a 79-89. Oproti CSI divokého typu MA se CSI mutantu odlišuje 

zkrácením II., III. a IV. helixu o aminokyseliny 41, 54, 78 a 90. U mutovaného proteinu 

také není náznak β-skládaného listu na začátku III. helixu. Pro následující výpočet 

struktury byla v takto identifikovaných oblasti helixů aplikována omezení vodíkovými vazbami. 

46

4.3.2 Výpočet struktury 

Základem výpočtů struktury byla vzdálenostní omezení získaná z experimentů 15 N- a 13 C- 

editované NOESY spolu s omezeními dihedrálních úhlů φ a ψ, získaných z programu TA- 

LOS a vodíkovými vazbami, udržujícími oblasti α-helixů získanými z CSI. Pro základní 

přiřazení NOE interakcí a výpočet počátečního souboru struktur byl použit program Aria 2.0. 

V tomto programu bylo provedeno celkem 12 cyklů výpočtů, mezi kterými bylo manuálně 

upravováno jak přířazení NOE interakcí, tak přiřazení resonancí, eventuálně jejich korekce. 

Pro finální stádia výpočtu byl využit program NIH-XPLOR. V tomto programu bylo provedeno 

31 cyklů výpočtů struktury a přiřazení dalších signálů NOE. Finální výpočet struktury 

byl proveden celkem se 1442 NOE interakcemi, poskytujícími stejný počet vzdálenostních 

omezení. 

Aby bylo možné získat detailnější informaci o eventuálních strukturních změnách v okolí 

obou mutací, byl připraven vzorek, ve kterém byly selektivně značeny uhlíkem 13 C pouze 

isoleuciny. Toho jsme docílili přidáním uniformně 13 C/ 15 N-značeného L-isoleucinu do 

minimálního média. Značení bylo dostatečně specifické a nedocházelo k biotransformaci 

isoleucinu na jiné aminokyseliny (Obr. 16), což vedlo k značnému zjednodušení a zpřehlednění 

13 C-NOESY spektra, ve kterém byly viditelné pouze NOE interakce vycházející 

z isoleucinů (Obr. 17). Tímto způsobem bylo získáno dalších 89 vzdálenostních omezení. 

47

A 

B 

Obr. 16 Porovnání H-C HSQC spekter uniformně 13 C značeného T41I/T78I mutantu (A) a 

T41I/T78I mutantu se selektivně 13 C značeným pouze isoleucinem (B). 

48

A 

B 

Obr. 17 Porovnání 13 C-NOESY spekter uniformně 13 C značeného T41I/T78I mutantu MA 

(A) a T41I/T78I mutantu MA se selektivně 13 C značeným pouze isoleucinem (B). 

Finální běh výpočtu byl proveden se všemi získanými experimentálními omezeními, tj. 

s 1442 vzdálenostními omezeními, 39 vodíkovými vazbami, 69 omezeními dihedrálních úhlů 

a 43 RDC. Celkem bylo vypočteno 100 struktur, z nichž byl vybrán soubor 18, které nejlépe 

odpovídaly jak z hlediska energetických parametrů, tak měly minimální problémy 

s experimentálními parametry (NOE interakce….). Superpozice těchto struktur je na obrázku 

18. Podle předpokladů se vypočtená struktura (Obr. 19) skládá ze čtyř α-helixů v oblastech 

aminokyselin 5-22, 28-44, 53-70 a 79-91, které jsou navzájem propojeny smyčkami. Ve 

většině struktur se vyskytuje, na rozdíl od divokého typu, krátká α-helikální otáčka mezi 

aminokyselinami 72-74. 

49

Obr. 18 Superposice 18 nejlepších struktur přes zarovnaných dobře definované oblasti. 

Barevně jsou zvýrazněné jednotlivé helixy (první modře, druhý azurově, třetí oranžově a 

čtvrtý červeně) a volná smyčka mezi II a III helixem (zeleně). 

Při superpozici 18 nejlepších struktur přes sebe je patrné, že oblasti α-helixů se mezi jednotlivými 

strukturami neliší, naopak největší variabilitu vykazují (kromě volných konců) ve 

smyčce mezi helixy II a III, která je součástí CTRS sekvence. 

50

Obr. 19 Průměrná struktura dvojitého mutantu T41I/T78I matrixového proteinu M-PMV, N- 

konec je znázorněn modře, C-konec je červený. 

4.3.3 Zhodnocení kvality vypočtených struktur 

Struktury proteinů získané pomocí NMR lze zhodnotit podle počtu experimentálních parametrů 

použitých při výpočtu, počet těchto parametrů, které jsou ve struktuře porušené a 

podle odchylek od ideální struktury. Tyto parametry jsou shrnuty v tabulce V. 

Počet vzdálenostních omezení odpovídá proteinu této velikosti. Počet porušených parametrů, 

stejně jako odchylek od idealizované geometrie je velmi malý, podobně jako u struktur divokého 

typu. 

Dalším způsobem posouzení struktury je Ramachandranův diagram (Obr. 20). V tomto diagramu 

jsou vůči sobě vyneseny dihedrální úhly φ a ψ a jsou zde vyznačeny nejvýhodnější 

oblasti. V Ramachandranově diagramu spočteném pro jednu ze struktur je většina dvojic dihedrálních 

úhlů v oblasti odpovídající α-helixu a žádná dvojice není v nedovolené oblasti ani 

ve „velkoryse“ povolené oblasti (s výjimkou glycinů a prolinů). Statistické rozdělení dihedrálních 

úhlů v jednotlivých strukturách je v tabulce V. 

51

Tab V. Statistické údaje získané z programů X-PLOR NIH a Procheck charakterizující 18 

nejlepších vypočtených struktur 

Omezení vzdáleností a dihedrálních úhlů 

Vzdálenostní omezení 

Celkový počet NOE 1442 

Intra-residuální 596 

Inter-residuální, z toho: 

sekvenční (|i-j| = 1) 494 

na střední vzdálenost (|i-j| ≤ 5) 275 

na dlouhou vzdálenost (|i-j| > 5) 77 

Počet omezení dihedrálních úhlů 

Φ 69 

Ψ 69 

Statistika struktury 

Počet porušených parametrů průměr sm. odchylka 

Vzdálenostní omezení 4,6 2,8 

RDC 8,5 5,6 

Odchylky od idealizované geometrie 

Délka vazby (Ǻ) 0,0019 0,00096 

Vazebné úhly (°) 0,41 0,04 

Dihedrální úhly (°) 1,02 0,27 

Odchylka od planarity 0,426 0,077 

Statistiky z Ramachandranova diagramu 

Nejvýhodnější oblast (%) 90,4 2,1 

Dodatečná povolená oblast (%) 7,1 2,2 

“Velkoryse” povolená oblast (%) 1,8 1,3 

Nepovolená oblast (%) 0,68 0,68 

Průměrná RMSD (Å)* 

Přes všechny těžké atomy 0.7312 

Přes těžké atomy páteře 1,3606 

* RMSD byly vypočteny jako průměr odchylek pozic příslušných atomů všech 18 struktur a průměrné struktury 

pro dobře definované oblasti (aminokyseliny 7-41 a 53-91). 

52

Obr. 20 Ramachandranův diagram pro jednu z vypočtených struktur. 

53

4.3.3.1 Validace struktury pomocí residuálních dipolárních interakčních 

konstant 

Residuální dipolární interakční konstanty (RDC) podávají informaci o orientaci vektoru vazby 

vůči směru externího magnetického pole a poskytují tak prostorovou informaci zcela nezávislou 

na NOE interakcích. Tento experimentální parametr není pozorovatelný v kapalné 

fázi za běžných podmínek, neboť v isotropním prostředí je jeho střední hodnota rovna nule 

díky rychlým fluktuacím molekul. Je proto nutné provádět měření v anisotropním prostředí 

tak, aby došlo k částečné orientaci molekuly vzhledem ke směru externího magnetického 

pole. Na rozdíl od NOE nejsou závislé na svém okolí a mohou být proto využity především 

pro určení úhlů, které mezi sebou svírají jednotlivé domény proteinu (např. i helixy), ale lze 

je také použít ke zpřesnění výpočtu struktur jako další experimentální omezení nebo jako 

prostředek k ověření správnosti vypočtené struktury. Nejčastěji jsou měřeny 1 H- 15 N RDC na 

15 N obohaceném vzorku. 

V případě MA proteinů bylo možné naměřit RDC pouze v polyakrylamidovém gelu, nejprve 

o koncentraci 5,5% polyakrylamidu. Tato koncentrace se však ukázala jako příliš vysoká, 

neboť došlo ke zrychlení spin-spinové relaxace, což v konečném důsledku vedlo k rozšíření 

signálů a ztrátě rozlišení jednotlivých resonancí. Takto se podařilo odečíst pouze 25 interakcí. 

Proto byl připraven nový vzorek, který byl umístěn do 4,5% ního polyakrylamidového 

gelu. Zde již byly signály užší a intenzivnější a podařilo se odečíst 43 hodnot. Získané RDC 

byly použity pro výpočet struktury, ale jejich použití strukturu nezměnilo, což svědčí o jejich 

velmi dobré shodě s již vypočtenými strukturami. 

54

Obr. 21 Srovnání změřených (červeně) a vypočtených (modře) reziduálních kaplingů 

v závislosti na poloze aminokyseliny v sekvenci. Vypočtené reziduální kaplingy byly získány 

pomocí programu Igor Pro 6.0 ze souboru struktur vypočtených bez dipolárních kaplingů 

Ověření správnosti struktury T41I/T78I mutantu bylo provedeno porovnáním experimentálně 

získaných RDC a RDC vypočtených na základě určené struktury. Jak je vidět 

z obrázku 21, teoreticky vypočtené RDC se až na výjimky velmi dobře shodují 

s experimentálními hodnotami pro rigidní oblasti. Z grafu byla odstraněna oblast aminokyselin 

42-56, protože je flexibilní a tudíž experimentální RDC neodpovídají vypočteným 

hodnotám. Graf obsahuje více experimentálních hodnot, než bylo ve skutečnosti naměřeno, 

shoda experimentálních dat se strukturami je natolik dobrá, že chybějící RDC pro rigidní 

oblasti bylo možné bez problémů dopočítat. Na obrázku 22 je též vidět perfektní shoda experimentálních 

a vypočtených RDC. 

55

Obr. 22 Srovnání změřených reziduálních kaplingů a vypočtených z jedné struktury. 

4.4 Porovnání struktur mutantu T41I/T78I a divokého typu MA 

proteinu 

Stejně jako struktura divokého typu i struktura mutantu je tvořena čtyřmi α-helixy propojenými 

smyčkami. Mutace nezpůsobila významnou změnu celkové struktury (Obr. 23), avšak 

způsobila změnu úhlu, který svírá IV. helix s II. a v menší míře i III. helix s II Odlišný úhel 

také svírá I. helix se zbytkem molekuly (Tab. VI). 

56

T41I/T78I 

Divoký typ 

Obr. 23 Srovnání struktury mutantu T41I/T78I (zelený) a divokého typu (azurový) matrixového 

proteinu M-PMV ve stejné orientaci jako na obr 18. 

Tab. VI Interhelikální úhly v divokém typu a T41I/T78I mutantu MA 

divoký typ směr. odch. T41I/T78I směr. odch. 

I. – II. helix 123,1 2,5 104.2 4,7 

II. – III. helix 103,1 2,9 98,7 2,4 

III. – IV. helix 169,0 2,2 167,0 3,4 

Poměrně významné změny nastaly v místech mutací. Isoleuciny 41 a 78 jsou na rozdíl od 

threoninů 41 a 78 u divokého typu orientované dovnitř molekuly (Obr. 24). Postranní řetězec 

isoleucinu 41 směřuje do hydrofobní kapsy tvořené aminokyselinami F37, V38, F45, V59 a 

F63 a zvyšuje tak její hydrofobicitu. Také došlo k prodloužení II. helixu o jednu otáčku až 

k 44. aminokyselině (oproti divokému typu, u kterého II. helix končí 41. aminokyselinou). 

Isoleucin 78 je orientován směrem ke druhému helixu, konkrétně k aminokyselině F34 a jejímu 

okolí. Výchylka 78. aminokyseliny je větší než u 41 a I78 není součástí IV. helixu jako 

v případě T78 ve struktuře wt MA. 

57

A - T41I/T78I 

I41 

I78 

T41 

B -divoký typ 

T78 

Obr. 24 Porovnání pozice mutovaných aminokyselin mezi mutantem T41I/T78I (A) a divokým 

typem (B) MA. Aminokyselina 41 je znázorněna zeleně, aminokyselina 78 je 

znázorněna oranžově. Na tomto obrázku je také dobře patrné prodloužení II. helixu o jednu 

otáčku. 

58

5. Diskuze 

5.1 Příprava rekombinantního proteinu 

Příprava matrixového proteinu pro měření NMR spekter byla optimalizována pro přípravu 

divokého typu MA 23 . V případě mutantu T41I/T78I nebylo nutné protokol upravovat, naopak 

protein byl i přes to, že mutací byly do molekuly zavedeny dvě hydrofobní aminokyseliny, 

lépe rozpustný a NMR vzorek bylo možné zahustit na vyšší koncentraci než v případě divokého 

typu. Vysvětlením může být, že isoleucin 41 přispívá ke stabilizaci hydrofobního 

jádra proteinu , do kterého je zanořen (Obr. 25), a brání tak ostatním hydrofobním aminokyselinám 

v orientaci jejich postranních řetězců na povrch proteinu. 

Obr. 25 Hydrofobní kapsa, do které je zanořen isoleucin 41 tvořená aminokyselinami F37, 

V38, F45, V59 a F63. 

59

Co způsobuje vznik dalších signálů bezprostředně po přípravě, není zatím objasněno. Předpokládáme, 

že tyto signály mohou být způsobeny molekulami proteinu, u kterého neproběhla 

plně renaturace, a která byla dokončena během stání proteinu při laboratorní teplotě po několika 

dnech. 

5.2 Výpočet a zhodnocení struktury T41I/T78I mutantu 

Z porovnání chemických posunů divokého typu MA a mutantního MA vyplývá, že oblasti 

největších změn jsou lokalizované okolo mutací, neboť zde došlo k výměně aminokyseliny a 

chemické posuny atomů sousedních aminokyselin jsou ovlivněny jinými atomy. K velkým 

změnám chemického posunu došlo na konci druhého helixu (aminokyseliny 39-45), kde se 

nachází jedna z mutací a také zde došlo k prodloužení II. helixu o jednu otáčku, a v oblasti 

okolo aminokyseliny 32, k níž je orientován postranní řetězec isoleucinu 78. Další oblastí, 

kde došlo k větší změně chemických posunů, je spojka mezi III. a IV. helixem. V této oblasti 

je oproti struktuře divokého typu patrná helikální otáčka v oblasti 71.-74. aminokyseliny, 

která se ve struktuře divokého typu nevyskytuje. Poslední oblastí větších změn chemických 

posunů amidických atomů je IV. helix, který má oproti divokému typu jinou orientaci vůči 

druhému helixu. 

Mutace výrazně nezměnily pozice a orientace helixů oproti divokému typu. Došlo pouze ke 

změnám v délce helixů v okolí mutací (ve struktuře divokho typu jsou obě mutované aminokyseliny 

posledními aminokyselinami na okrajích příslušných helixů). Mutace T41I vedla 

k prodloužení helixu II o jednu otáčku. Pravděpodobnou příčinou je hydrofobní interakce 

mezi isoleucinem 41 a fenylalaninem 45, která tuto otáčku stabilizuje. Naopak isoleucin 78 

není součástí helixu IV, neboť je značně vychýlen směrem k helixu II. 

Ze superpozice vypočtených struktur je patrné, že nejflexibilnější oblastí je kromě N a C 

konce smyčka mezi helixem II a III, což koresponduje se strukturami divokého typu i mutantu 

R55F MA. Nejrigidnější částí strukturního motivu jsou naopak oblasti všech α-helixů. 

RDC se podařilo naměřit až po přiřazení signálů NOE, a nebyly proto použity pro výpočet 

struktury. Byly však využity pro zhodnocení správnosti vypočtené struktury, neboť RDC jsou 

nezávislé na NOE interakcích a velmi citlivě reagují na jakoukoliv změnu orientace struk- 

60

turních prvků proteinu. Z minimálních odchylek mezi změřenými a teoreticky vypočtenými 

RDC vyplývá, že vypočtená struktura velmi dobře odpovídá skutečnosti. 

5.3 Odhad pozice zbytku kyseliny myristové 

Zatím se nám dosud nepodařilo připravit vzorek myristoylovaného matrixového proteinu, 

který by byl vhodný pro měření NMR. Z publikovaných údajů o struktuře myristoylovaného 

MA HIV-1 však vyplývá, že prakticky nedochází ke změně struktury MA oproti nemyristoylovanému 

proteinu 48 , a tak je možné se pokusit o návrh pozice zbytku kyseliny myristové 

v MA proteinech M-PMV. V programu Pymol 88 byl k N-konci struktury mutantu T41I/T78I 

MA připojen zbytek kyseliny myristové a změnou dihedrálních úhlů ve volné smyčce na N- 

konci byl orientován tak, aby jeho pozice zhruba odpovídala pozici zbytku kyseliny myristové 

v myristoylovaném MA HIV-1 a zároveň aby nekolidoval s postranními řetězci aminokyselin 

v jádře proteinu. Ve struktuře nemyristoylovaného proteinu je patrná mezera mezi 

helixem IIa IV, do které by mohl být orientován zbytek kyseliny myristové. Okolí této mezery 

je tvořeno hydrofobními aminokyselinami a končí u isoleucinu 78 (Obr. 28). Za předpokladu, 

že M-PMV MA myristoylací významně nezmění celkovou strukturu proteinu stejně 

jako u HIV MA, je toto jediná orientace myristoylu, kdy je možné jej zanořit do jádra proteinu. 

Toto řešení podporuje pracovní hypotézu o zvýšené hydrofobicitě jádra proteinu a 

znemožnění uvolnění zbytku kyseliny myristové pro interakci s plasmatickou membránou 51 . 

Isoleucin 78 je blízko konce zbytku kyseliny myristové. U divokého typu se v této oblasti 

nacházejí spíše hydrofilní aminokyseliny, zatímco v mutantu je zde vysoce hydrofobní isoleucin, 

který může zesilovat hydrofobní interakci kyseliny myristové s jádrem proteinu. Isoleucin 

41 je na opačném konci molekuly než je předpokládaná pozice zbytku kyseliny myristové 

(Obr. 26 A), což je v souladu s tím, že mutace T41I sama o sobě nezabrání viru 

v pučení. Skutečnost, že mutace T41I/T78I má silnější efekt než jen mutace T78I, je pravděpodobně 

způsobena tím, že isoleucin 41 stabilizuje celkovou strukturu proteinu a tím udržuje 

hydrofobní oblast, do které je myristoyl zakotven, pohromadě. 

61

A 

B 

Obr. 26 Struktura mutantu T41I/T78I M-PMV MA s připojeným myristoylem se znázorněným 

povrchem proteinu. Povrch je barven podle typu aminokyseliny (hydrofobní šedé, 

bazické modré, kyselé červené, hydrofilní zelené) Myristoyl je obarven žlutě, isoleucin fialově. 

62

6. Závěr 

• Podařilo se připravit vzorek uniformě 13 C a 15 N-značeného mutantu T41I/T78I M- 

PMV MA v dostatečné koncentraci pro měření NMR exprimentů. 

• Pomocí experimentů s trojnásobnou resonancí byly přiřazeny chemické posuny 

atomů páteře proteinu a poté i atomů postranních řetězců. 

• Pro přiřazení chemických posunů aromatických vodíků byl připraven vzorek v němž 

byly amidické vodíky nahrazeny deuteriem. 

• Z porovnání chemických posunů amidických atomů mutantu a divokého typu vyplynulo, 

že největší změny jsou v okolí mutací a také v oblastech, kde došlo k lokálním 

změnám struktury. 

• Z chemických posunů byl vypočten index chemických posunů CSI, pomocí něhož 

byly odhanuty pozice helixů. Porovnáním se strukturou divokého typu bylo zjištěno, 

že jsou shodné. 

• Pro určení struktury proteinu byla změřena 15 N a 13 C editovaná NOESY spektra a 

získaná vzdálenostní omezení byla využita pro výpočet struktury. 

• Pro přesné určení signálů NOE ze zmutovaných aminokyselin byl připraven protein, 

ve kterém byly selektivně 13 C značeny pouze isoleuciny. 

• Byl vypočten soubor 100 struktur, ze kterých bylo vybráno 18, které nejlépe splňovaly 

experimentální omezení. 

• Validací struktur bylo zjištěno, že mají jen velmi malé odchylky od ideální geometrie 

a malý rozptyl mezi sebou. 

• Správnost vypočtených struktur byla dále ověřena změřením zbytkových bipolárních 

interakčních konstant RDC, které byly porovnány s vypočtenými. Z tohoto srovnání 

vyplývá, že vypočtená struktura je správná. 

• Mutace nezpůsobila významnou změnu celkové struktury oproti divokému typu. MA 

Došlo pouze ke změně úhlů, které mezi sebou svírají jednotlivé helixy. Zmutované 

isoleuciny jsou orientovány směrem do jádra proteinu. Helix II je oproti divokému 

63

typu prodloužený o jednu otáčku. Ve smyčce mezi helixem III a IV je jedna helikální 

otáčka, která nebyla zjištěna ve struktuře divokého typu. 

• Orientace postranních řetězců isoleucinů 41 a 78 podporuje hypotézu, že změna fenotypu 

mutantu je způsobena zvýšenou hydrofobicitou jádra proteinu. Odhad možné 

pozice zbytku kyseliny myristové bylo potvrzeno, že s myristoylem by mohl přímo 

interagovat pouze isoleucin 78. Isoleucin 41 je od místa, kde se pravděpodobně 

myristoyl nachází poměrně vzdálen, což souhlasí s předchozím pozorováním, že mutant 

T41I sám o sobě změnu fenotypu nezpůsobuje. 

64

7. Literatura 

1. Strnad P, Haubová Š. & Ruml,T. Genom retrovirů a fyziologická funkce jeho produktů 

Chem. Listy 97, (2003). 

2. Fauquet,C.M., Mayo,M.A., Maniloff,J., Desselberger,U. & Ball,L.A. Virus Taxonomy, 

VIIIth Report of the ICTV. 1258. 2004. Elsevier/Academic Press. 

3. Vogt,V.M. Proteolytic processing and particle maturation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 

214, 95-131 (1996). 

4. Conte,M.R., Klikova,M., Hunter,E., Ruml,T. & Matthews,S. The three-dimensional 

solution structure of the matrix protein from the type D retrovirus, the Mason-Pfizer 

monkey virus, and implications for the morphology of retroviral assembly. EMBO J. 

16, 5819-5826 (1997). 

5. Song,C., Dubay,S.R. & Hunter,E. A tyrosine motif in the cytoplasmic domain of mason-pfizer 

monkey virus is essential for the incorporation of glycoprotein into virions. 

J. Virol. 77, 5192-5200 (2003). 

6. Briggs,J.A., Wilk,T., Welker,R., Krausslich,H.G. & Fuller,S.D. Structural organization 

of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003). 

7. Coffin,J., Hughes,S. & Varmus,H. Retroviruses. 1997. Cold Spring Harbor Laboratory 

Press. 

8. Ott,D.E. Potential roles of cellular proteins in HIV-1. Rev. Med. Virol. 12, 359-374 

(2002). 

9. Summers,M.F. et al. Nucleocapsid zinc fingers detected in retroviruses: EXAFS studies 

of intact viruses and the solution-state structure of the nucleocapsid protein from 

HIV-1. Protein Sci. 1, 563-574 (1992). 

65

10. Enquist L.W., Krug R.M., Racaniello V.R., Skalka A.M. & Flint S.J. Principles of 

Virology. 1-1-2001. The American Society for Microbiology. 

11. Gotte,M., Li,X. & Wainberg,M.A. HIV-1 Reverse Transcription: A Brief Overview 

Focused on Structure-Function Relationships among Molecules Involved in Initiation 

of the Reaction. Archives of Biochemistry and Biophysics 365, 199-210 (1999). 

12. Rhee,S.S. & Hunter,E. Structural role of the matrix protein of type D retroviruses in 

gag polyprotein stability and capsid assembly. J. Virol. 64, 4383-4389 (1990). 

13. Rhee,S.S. & Hunter,E. A single amino acid substitution within the matrix protein of a 

type D retrovirus converts its morphogenesis to that of a type C retrovirus. Cell 63, 

77-86 (1990). 

14. Green,W.C. & Peterlin,M.B. Molecular Insights Into HIV Biology. HIV InSite . 

2005. 

15. Parker,S.D., Wall,J.S. & Hunter,E. Analysis of Mason-Pfizer monkey virus Gag particles 

by scanning transmission electron microscopy. J. Virol. 75, 9543-9548 (2001). 

16. Bradac,J. & Hunter,E. Polypeptides of Mason-Pfizer monkey virus. I. Synthesis and 

processing of the gag-gene products. Virology 138, 260-275 (1984). 

17. Yasuda,J. & Hunter,E. A proline-rich motif (PPPY) in the Gag polyprotein of Mason- 

Pfizer monkey virus plays a maturation-independent role in virion release. J. Virol. 

72, 4095-4103 (1998). 

18. Sommerfelt,M.A., Rhee,S.S. & Hunter,E. Importance of p12 protein in Mason-Pfizer 

monkey virus assembly and infectivity. J. Virol. 66, 7005-7011 (1992). 

19. Hong,S. et al. Type D retrovirus Gag polyprotein interacts with the cytosolic chaperonin 

TRiC. J. Virol. 75, 2526-2534 (2001). 

66

20. Barabas,O. et al. dUTPase and nucleocapsid polypeptides of the Mason-Pfizer monkey 

virus form a fusion protein in the virion with homotrimeric organization and low 

catalytic efficiency. J. Biol. Chem. 278, 38803-38812 (2003). 

21. Zabransky,A. et al. Three active forms of aspartic proteinase from Mason-Pfizer 

monkey virus. Virology 245, 250-256 (1998). 

22. Rhee,S.S. & Hunter,E. Myristylation is required for intracellular transport but not for 

assembly of D-type retrovirus capsids. J. Virol. 61, 1045-1053 (1987). 

23. Lipov,J. Disertační práce. 2006. 

24. Bradac,J. & Hunter,E. Polypeptides of Mason-Pfizer monkey virus. II. Synthesis and 

processing of the env gene products. Virology 150, 491-502 (1986). 

25. Krausslich,H.G. & Welker,R. Intracellular transport of retroviral capsid components. 

Curr. Top. Microbiol. Immunol. 214, 25-63 (1996). 

26. Resh,M.D. Fatty acylation of proteins: new insights into membrane targeting of 

myristoylated and palmitoylated proteins. Biochim. Biophys. Acta 1451, 1-16 (1999). 

27. Khandwala,A.S. & Kasper,C.B. The fatty acid composition of individual phospholipids 

from rat liver nuclear membrane and nuclei. J. Biol. Chem. 246, 6242-6246 

(1971). 

28. Maurer-Stroh,S. et al. MYRbase: analysis of genome-wide glycine myristoylation 

enlarges the functional spectrum of eukaryotic myristoylated proteins. Genome Biol. 

5, R21 (2004). 

29. Maurer-Stroh,S. & Eisenhaber,F. Myristoylation of viral and bacterial proteins. 

Trends Microbiol. 12, 178-185 (2004). 

30. Wilcox,C., Hu,J.S. & Olson,E.N. Acylation of proteins with myristic acid occurs cotranslationally. 

Science 238, 1275-1278 (1987). 

67

31. Maurer-Stroh,S., Eisenhaber,B. & Eisenhaber,F. N-terminal N-myristoylation of proteins: 

prediction of substrate proteins from amino acid sequence. J. Mol. Biol. 317, 

541-557 (2002). 

32. Hirel,P.H., Schmitter,M.J., Dessen,P., Fayat,G. & Blanquet,S. Extent of N-terminal 

methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain 

length of the penultimate amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86, 8247-8251 

(1989). 

33. Peitzsch,R.M. & McLaughlin,S. Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid 

vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry 32, 10436- 

10443 (1993). 

34. Zhou,W., Parent,L.J., Wills,J.W. & Resh,M.D. Identification of a membrane-binding 

domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 

Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J. Virol. 68, 2556-2569 

(1994). 

35. Murray,D. et al. Electrostatics and the membrane association of Src: theory and experiment. 

Biochemistry 37, 2145-2159 (1998). 

36. Ehrlich,L.S., Fong,S., Scarlata,S., Zybarth,G. & Carter,C. Partitioning of HIV-1 Gag 

and Gag-related proteins to membranes. Biochemistry 35, 3933-3943 (1996). 

37. Zhou,W. & Resh,M.D. Differential membrane binding of the human immunodeficiency 

virus type 1 matrix protein. J. Virol. 70, 8540-8548 (1996). 

38. Zheng,J. et al. Crystal structures of the myristylated catalytic subunit of cAMPdependent 

protein kinase reveal open and closed conformations. Protein Sci. 2, 1559- 

1573 (1993). 

39. Fackler,O.T. et al. Association of human immunodeficiency virus Nef protein with 

actin is myristoylation dependent and influences its subcellular localization. Eur. J. 

Biochem. 247, 843-851 (1997). 

68

40. Nagar,B. et al. Structural Basis for the Autoinhibition of c-Abl Tyrosine Kinase. Cell 

112, 859-871 (2003). 

41. Hantschel,O. et al. A myristoyl/phosphotyrosine switch regulates c-Abl. Cell 112, 

845-857 (2003). 

42. da Silva,A.M. & Klein,C. A rapid posttranslational myristylation of a 68-kD protein 

in D. discoideum. J. Cell Biol. 111, 401-407 (1990). 

43. Manenti,S., Sorokine,O., Van Dorsselaer,A. & Taniguchi,H. Demyristoylation of 

myristoylated alanine-rich C kinase substrate. Biochem. Soc. Trans. 23, 561-564 

(1995). 

44. McLaughlin,S. & Aderem,A. The myristoyl-electrostatic switch: a modulator of reversible 

protein-membrane interactions. Trends Biochem. Sci. 20, 272-276 (1995). 

45. Ames,J.B. et al. Molecular mechanics of calcium-myristoyl switches. Nature 389, 

198-202 (1997). 

46. Spearman,P., Horton,R., Ratner,L. & Kuli-Zade,I. Membrane binding of human immunodeficiency 

virus type 1 matrix protein in vivo supports a conformational 

myristyl switch mechanism. J. Virol. 71, 6582-6592 (1997). 

47. Paillart,J.C. & Gottlinger,H.G. Opposing effects of human immunodeficiency virus 

type 1 matrix mutations support a myristyl switch model of gag membrane targeting. 

J. Virol. 73, 2604-2612 (1999). 

48. Tang,C. et al. Entropic switch regulates myristate exposure in the HIV-1 matrix protein. 

PNAS 101, 517-522 (2004). 

49. Bryant,M. & Ratner,L. Myristoylation-dependent replication and assembly of human 

immunodeficiency virus 1. PNAS 87, 523-527 (1990). 

69

50. Rhee,S.S. & Hunter,E. Amino acid substitutions within the matrix protein of type D 

retroviruses affect assembly, transport and membrane association of a capsid. EMBO 

J. 10, 535-546 (1991). 

51. Stansell,E., Tytler,E., Walter,M.R. & Hunter,E. An early stage of Mason-Pfizer monkey 

virus budding is regulated by the hydrophobicity of the Gag matrix domain core. 

J. Virol. 78, 5023-5031 (2004). 

52. Rein,A., McClure,M.R., Rice,N.R., Luftig,R.B. & Schultz,A.M. Myristylation site in 

Pr65gag is essential for virus particle formation by Moloney murine leukemia virus. 

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 83, 7246-7250 (1986). 

53. Gottlinger,H.G., Sodroski,J.G. & Haseltine,W.A. Role of capsid precursor processing 

and myristoylation in morphogenesis and infectivity of human immunodeficiency virus 

type 1. PNAS 86, 5781-5785 (1989). 

54. Yuan,X., Yu,X., Lee,T.H. & Essex,M. Mutations in the N-terminal region of human 

immunodeficiency virus type 1 matrix protein block intracellular transport of the Gag 

precursor. J. Virol. 67, 6387-6394 (1993). 

55. Dupont,S. et al. A novel nuclear export activity in HIV-1 matrix protein required for 

viral replication. Nature 402, 681-685 (1999). 

56. Bukrinskaya,A.G. et al. Phosphorylation-dependent human immunodeficiency virus 

type 1 infection and nuclear targeting of viral DNA. PNAS 93, 367-371 (1996). 

57. Camaur,D., Gallay,P., Swingler,S. & Trono,D. Human immunodeficiency virus matrix 

tyrosine phosphorylation: characterization of the kinase and its substrate requirements. 

J. Virol. 71, 6834-6841 (1997). 

58. Gallay,P., Swingler,S., Aiken,C. & Trono,D. HIV-1 infection of nondividing cells: C- 

terminal tyrosine phosphorylation of the viral matrix protein is a key regulator. Cell 

80, 379-388 (1995). 

70

59. Freed,E.O., Englund,G., Maldarelli,F. & Martin,M.A. Phosphorylation of residue 131 

of HIV-1 matrix is not required for macrophage infection. Cell 88, 171-173 (1997). 

60. Kaushik,R. & Ratner,L. Role of human immunodeficiency virus type 1 matrix phosphorylation 

in an early postentry step of virus replication. J. Virol. 78, 2319-2326 

(2004). 

61. Nelle,T.D., Verderame,M.F., Leis,J. & Wills,J.W. The major site of phosphorylation 

within the Rous sarcoma virus MA protein is not required for replication. J. Virol. 72, 

1103-1107 (1998). 

62. Freed,E.O. & Martin,M.A. Virion incorporation of envelope glycoproteins with long 

but not short cytoplasmic tails is blocked by specific, single amino acid substitutions 

in the human immunodeficiency virus type 1 matrix. J. Virol. 69, 1984-1989 (1995). 

63. Freed,E.O. & Martin,M.A. Domains of the human immunodeficiency virus type 1 

matrix and gp41 cytoplasmic tail required for envelope incorporation into virions. J. 

Virol. 70, 341-351 (1996). 

64. Bukrinsky,M.I. et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 

preintegration complexes. PNAS 89, 6580-6584 (1992). 

65. Bukrinsky,M.I. et al. A nuclear localization signal within HIV-1 matrix protein that 

governs infection of non-dividing cells. Nature 365, 666-669 (1993). 

66. Haffar,O.K. et al. Two nuclear localization signals in the HIV-1 matrix protein regulate 

nuclear import of the HIV-1 pre-integration complex. J. Mol. Biol. 299, 359-368 

(2000). 

67. Hatziioannou,T. & Goff,S.P. Infection of nondividing cells by Rous sarcoma virus. J. 

Virol. 75, 9526-9531 (2001). 

68. Massiah,M.A. et al. Three-dimensional structure of the human immunodeficiency 

virus type 1 matrix protein. J. Mol. Biol. 244, 198-223 (1994). 

71

69. Matthews,S., Mikhailov,M., Burny,A. & Roy,P. The solution structure of the bovine 

leukaemia virus matrix protein and similarity with lentiviral matrix proteins. EMBO 

J. 15, 3267-3274 (1996). 

70. Christensen,A.M., Massiah,M.A., Turner,B.G., Sundquist,W.I. & Summers,M.F. 

Three-dimensional structure of the HTLV-II matrix protein and comparative analysis 

of matrix proteins from the different classes of pathogenic human retroviruses. J. 

Mol. Biol. 264, 1117-1131 (1996). 

71. McDommell,J.M. et al. Solution structure and dynamics of the bioactive retroviral M 

domain from Rous sarcoma virus. J. Mol. Biol. 279, 921-928 (1998). 

72. Riffel,N. et al. Atomic resolution structure of Moloney murine leukemia virus matrix 

protein and its relationship to other retroviral matrix proteins. Structure. (Camb. ) 10, 

1627-1636 (2002). 

73. Rao,Z. et al. Crystal structure of SIV matrix antigen and implications for virus assembly. 

Nature 378, 743-747 (1995). 

74. Hill,C.P., Worthylake,D., Bancroft,D.P., Christensen,A.M. & Sundquist,W.I. Crystal 

structures of the trimeric human immunodeficiency virus type 1 matrix protein: implications 

for membrane association and assembly. PNAS 93, 3099-3104 (1996). 

75. Conte,M.R. & Matthews,S. Retroviral matrix proteins: a structural perspective. Virology 

246, 191-198 (1998). 

76. Freed,E.O., Orenstein,J.M., Buckler-White,A.J. & Martin,M.A. Single amino acid 

changes in the human immunodeficiency virus type 1 matrix protein block virus particle 

production. J. Virol. 68, 5311-5320 (1994). 

77. Cannon,P.M. et al. Structure-function studies of the human immunodeficiency virus 

type 1 matrix protein, p17. J. Virol. 71, 3474-3483 (1997). 

78. Sambrook,J. & Russell,R. Molecular Cloning A Laboratory Manual. (2001). 

72

79. Gasteiger,E. et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. 

Walker, J. M ed. The Proteomics Protocols Handbook , 571-607. 2005. Humana 

Press. 

80. Delaglio,F., Grzesiek,S., Vuister,G.W. & Zhu,G. NMRPipe: a multidimensional spectra 

processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR 6, 277-293 (1995). 

81. Goddard,T.D. & Kneller,D.G. Sparky 3. 2006. University of California, San Francisco. 

Ref Type: Computer Program 

82. Sattler,M. & Schleucher,J. Heteronuclear multidimensional NMR experiments for the 

structure determination of proteins in solution employing field gradients. Prog. NMR 

Spectrosc. 34, 93-158 (1999). 

83. Wishart,D.S. & Sykes,B.D. The 13C chemical shift index. A simple method for the 

identifikation of protein secondary structure using 13C chemical shift data. J. Biomol. 

NMR 4, 171-180 (1994). 

84. Cormilescu,G., Delaglio,F. & Bax,A. Protein backbone angle restraints from searching 

a database for chemical shift and sequence homology. J. Biomol. NMR 13, 289- 

302 (1999). 

85. Rieping,W. et al. ARIA2: automated NOE assignment and data integration in NMR 

structure calculation. Bioinformatics (2006). 

86. Schwieters,C.D., Kuszewski,J.J., Tjandra,N. & Clore,G.M. The Xplor-NIH NMR 

Molecular Structure Determination Package. J. Magn. Res. 160, 66-74 (2003). 

87. Humphrey,W., Dalke,A. & Schulten,K. VMD - Visual Molecular Dynamics . J. 

Molec. Graphics 14, 33-38 (1996). 

88. DeLano,W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. 2002. 

73

89. Koradi,R., Billeter,M., Yasuda,J. & Wüthrich,K. MOLMOL: a program for display 

and analysis of macromolecular structures. J. Molec. Graphics 14, 51-55 (1996). 

90. Laskowski,R.A., MacArthur,M.W., Moss,D.S. & Thornton,J.M. PROCHECK: a program 

to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst. 26, 

283-291 (1993). 

91. Cordier,F., Dingley,A.J. & Grzesiek,S. A doublet-separated sensitivity-enhanced 

HSQC for the determination of scalar and dipolar one-bound J-couplings. Journal of 

Biomolecular NMR 13, 175-180 (1999). 

74

8. Seznam použitých symbolů a zkratek 

Abl 

AIDS 

ASV 

BLV 

CA 

COSY 

CSI 

CTRS 

DU 

Gag, Pro a Pol, Env 

GFP 

HBV 

HIV 

HSQC 

HTLV 

Abelsonova kinasa 

syndrom získaného selhání imunity, z angl. Acquired Immunodeficiency 

Syndrome 

z angl. Avian Sarkoma Virus 

obdoba HIV-1 u skotu (z angl. Bovine Leukemia Virus), lentivirus 

kapsidový protein 

NMR experiment, z angl. COrrelation SpectroscopY 

index chemických posunů, z angl. Chemical Shift Index 

oblast v matrixovém proteinu, která je zodpovědná za cílení 

strukturních polyproteinů k místu skládání u B/D typů retrovirů 

(z angl. Cytoplasmic Targeting Retention Signal) 

dUTPasa 

retrovirové polyproteiny, obsahující strukturní (Gag) proteiny, 

proteasu (Pro), reversní transkriptasu a integrasu (Pol) či obalové 

glykoproteiny (Env) 

zeleně fluoreskující protein, používaný jako značka proteinů pro 

určení jejich lokalizace v živých buňkách (z angl. Green Fluorescent 

Protein) 

virus lidské hepatitidy typu B 

virus lidské imunodeficience, z angl. Human Immunodeficiency 

Virus 

NMR experiment, z angl. Heteronuclear Single Quantum Corelation 

virus lidské leukémie (z angl. Human T-cell Leukemia Virus), 

lentivirus 

75

IN 

integrasa 

IPAP 

způsob měření NMR experimentu, z angl. InPhase AntiPhase 

IPTG 

isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid 

LAV 

původní název viru HIV z angl. lymphadenopathy-associated 

virus 

M doména basická oblast v matrixovém proteinu která interaguje 

s fosfolipidy v cytoplasmatické memmbáně (z angl. Membrane 

domain) 

MA 

matrixový protein 

MARCKS 

z angl. Myristoylated Alanine-rich C Kinase Substrate 

MLV 

z angl. Murine Leukemia Virus, jednoduchý onkogenní retrovirus 

MMTV 

virus myšího prsního karcinomu (z angl. Mouse Mammary Tumor 

Virus), jednoduchý onkogenní retrovirus 

Mo-MLV 

z angl. Moloney-Murine Leukemia Virus, jednoduchý onkogenní 

retrovirus 

M-PMV 

z angl. Mason-Pfizer Monkey Virus 

NC 

nukleokapsidový protein 

Nef, Rev, Tat, Vif, Vpu, pomocné proteiny lentivirů 

Vpr 

NLS 

oblast v MA proteinu, zodpovědná za cílení do jádra, z angl. 

Nuclear Localisation Signal 

NMR 

nukleární magnetická resonance 

NMT 

N-myristoyltransferasa 

NOE 

Nukleární Overhauserův Efekt 

NOESY 

Vícerozměrný NMR experiment využívající NOE, 

z angl. Nuclear Overhauser Efect SpectrocopY 

PIC 

preintegrační komplex 

PP 

fosfoprotein 

PPT 

polypurinový trakt 

PR 

proteasa 

76

R55F 

mutant matrixového proteinu, vzniklý záměnou argininu 

v pozici 55 za fenylalanin 

RDC 

residuální dipolární interakční konstanta, 

z angl. Residual Dipolar Coupling 

RMSD 

střední kvadratická odchylka, z angl. Root Mean Square Deviation 

RSV 

virus způsobující sarkomy u kuřat, (z angl. Rous Sarcoma Virus), 

jednoduchý onkogenní retrovirus 

RT 

reversní transkriptasa 

SAIDS 

obdoba AIDS u opic z angl. Simian AIDS 

SDS-PAGE 

polyakrylamidová elektroforéza proteinů v přítomnosti SDS 

SIV 

obdoba HIV-1 u opic (z angl. Simian Imunodeficiency Virus), 

lentivirus 

SU 

povrchový glykoprotein (z angl. surface glycoprotein), též gp70 

T41I/T78I 

dvojitý mutant matrixového proteinu vzniklý záměnou threoninů 

41 a 78 za isoleuciny 

Tctex-1 z angl. t-complex testis expressed 1 

TEMED 

N,N,N’,N’-tetramethylendiamin 

TM 

transmembránový glykoprotein (z angl.transmembrane glycoprotein), 

též gp22 

TOCSY 

TOtal Correlated SpectroscopY 

77

9. Příloha 

Tabulka chemických posunů atomů dvojitého mutantu T41I/T78I matrixového proteinu 

M-PMV. 

78

DIPLOMOVÁ PRÁCE - Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?