Enzymy - Ústav lékařské chemie a biochemie

ÚSTAV LÉKAŘSKÉ BIOCHEMIE 1. LF UKEnzymyPraktické cvičení z lékařské biochemieVšeobecné lékařstvíJiří Kraml a Jiřina Crkovská2010/2011

V tomto cvičení bude prokazována bílkovinná povaha enzymů na příkladu sacharasy(invertasy) z kvasnic, specifičnosti vůči typu glykosidové vazby na příkladu sacharasy zkvasnic a amylasy.Z fyzikálně-chemických vlivů působících na aktivitu enzymů bude ukázán vliv pH naaktivitu pepsinu.Na příkladu laktátdehydrogenasy (EC 1.1.1.27). bude demonstrována závislost rychlostina výchozí koncentraci substrátu (při neměnné koncentraci enzymového preparátu), kde budeukázán také vztah K m a maximální rychlosti V.Dále bude ukázáno působení peroxidasy z brambor, kde donorem elektronů budederivát benzidinu (4,4´-diaminobifenylu), který se oxiduje na oxidovaný barevný produkt(modrý).1. Důkaz bílkovin v preparátu sacharasyPrincip:V pokuse bude použito preparátu sacharasy z kvasnic. Tento enzym, kterého se budepoužívat také v úloze 2, štěpí glykosidovou vazbu mezi glukosou a fruktosou v sacharose. Jdeo smíšenou vazbu α- (které se účastní 1. uhlík glukopyranosy) i β- (které se účastní 2. uhlíkfruktofuranosy). Sacharasa z kvasnic (invertasa) je zaměřena na β-glykosidovou vazbu (jde oβ-fruktofuranosidasu, její systematický název je β-D-fruktofuranosid-fruktohydrolasa, EC3.2.1.26). Tím se liší od sacharasové aktivity tenkého střeva savců, která patří meziα-glykosidasy. Pokus má demonstrovat přítomnost bílkoviny v enzymovém preparátubiuretovou reakcí a srážením.Reagencie:1) roztok sacharasy2) NaOH 80 g/l3) Fehling I: CuSO 4 . 5 H 2 O 70 g/l4) kyselina sulfosalicylová 200 g/lPracovní postup:a. Proveďte s roztokem sacharasy biuretovou reakci k cca 1 ml roztoku sacharasy přidejte2 ml NaOH a po kapkách přidávejte silně zředěný roztok CuSO 4 (Fehling I zřeďtealespoň 10x).b. Proveďte s roztokem sacharasy srážecí reakci s kyselinou sulfosalicylovou.2. Důkaz specifičnosti enzymůPrincip:Enzymy působí specificky jak vzhledem k typu katalyzované reakce, tak vzhledem ksubstrátu. Pokud jde o substrát, mají některé enzymy poměrně širokou specifičnost, např.2

Reagencie:1) škrobový maz 10 g/l (1 g škrobu třepat nebo zahřívat s vodou, suspenzi lít pomalu do100 ml vroucí vody, povařit 2 - 3 min)2) sacharosa 10 g/l (roztok denně čerstvý)3) sacharasa4) α-amylasa: sliny zředěné v poměru 1 : 10 (denně čerstvý roztok)5) Fehling I: CuSO 4 . 5 H 2 O 70 g/l6) Fehling II: NaOH 250 g a vinan draselno-sodný 350 g v 1 l deionizované vody7) Lugolův roztok I 2 20g a Kiv 1 l deionizované vodyPracovní postup:a. Připravte reakční směsi do 4 zkumavek podle tohoto schématu:1 2 3 4škrob 10 g/l 5 ml - 5ml -sacharosa 10 g/l - 5 ml - 5mlamylasa 1 ml 1 ml - -sacharasa - - 1 ml 1 mlb. Všechny zkumavky inkubujte 30 minut v termobloku při 37 °C.c. Určete, kde proběhlo štěpení substrátu, redukční zkouškou s Fehlingovým činidlem aoznačte specifický enzym pro každý substrát. Zároveň proveďte slepou zkoušku, zdaFehlingův roztok není redukován roztokem škrobu a sacharosy.d. Ve zkumavce, kde je škrob jako substrát, se přesvědčte také o štěpení zkouškou sLugolovým roztokem (silně zředit: cca 4 kapky/10 ml vody).Vyhodnocení:Výsledky štěpení uveďte do tabulky v protokolu symboly + (substrát rozštěpen) a −(substrát se neštěpí).3. Vliv pH na aktivitu enzymůPrincip:Vliv pH bude demonstrován na příkladu pepsinu. Jsou různé formy aktivního pepsinu,které se poněkud druhově liší a které jsou také různě označovány. Všechny patří dopodpodtřídy aspartátových endopeptidas (EC 3.4.23), tj. mají dva proti sobě orientovanézbytky kyseliny asparagové ve svém aktivním centru, podílející se na acidobazické katalýze,a mají kyselé pH optimum. Dalšími příbuznými vlastnostmi vytvářejí tzv. peptidasovourodinu A1 (EC 3.4.23.1, EC 3.4.23.2, EC 3.4.23.3). Původně udávaným vlastnostem lidskéhopepsinu odpovídá enzym charakterizovaný u vepřů jako pepsin A (EC 3.4.23.1), který setvoří v kyselém prostředí v žaludečním lumen limitovanou proteolýzou z neaktivníhoprekurzoru - pepsinogenu A, produktu hlavních (zymogenních) buněk žaludeční sliznicepředevším ve fundu, a to intramolekulární reakcí (autoaktivací) při pH nižším než 5, neboaktivním pepsinem (autokatalýza). Při pH vyšším než 2 uvolněné peptidy zůstávají navázány4

na pepsin a působí jako inhibitory pepsinové aktivity. Tato inhibice je odstraněna poklesempH pod hodnotu 2.Lidský pepsin A má 5 molekulárních forem. Je to hlavní pepsin v žaludeční šťávěobratlovců a jeho specifičnost je zaměřena na hydrofobní (Leu), přednostně aromatické (Phe)aminokyselinové zbytky před a za štěpenou vazbou (endohydrolýza). Pepsin B (EC 3.4.23.2)se tvoří obdobným mechanismem jako pepsin A, avšak z pepsinogenu B, oproti pepsinu A mámalou aktivitu vůči hemoglobinu jako substrátu a dobře štěpí želatinu. Je obsažen hlavněv pyloru. Pepsin C (EC 3.4.23.3) je u člověka označován jako gastriksin, tvoří sez prekurzoru progastriksinu, který je secernován ve fundu žaludku, v antru a v proximálnímduodenu. Štěpí endohydrolýzou přednostně peptidové vazby za zbytkem aminokyseliny Tyr,je méně specifický než pepsin A a má poměrně vysokou aktivitu vůči hemoglobinu jakosubstrátu.Je-li substrátem vaječný albumin, je optimální pH pepsinu A = 1,5, je-li substrátemkasein, optimální pH = 1,8 a pro hemoglobin jako substrát je optimální pH = 2,3. Gastriksinmá optimum pH pro štěpení hemoglobinu 3,2.V naší úloze bude demonstrováno působení pepsinu na bílkoviny vaječného bílku.Reagencie:1) roztok pepsinu 10 g/l2) HCl 0,1 mol/l3) suspenze vaječného bílku (vařený vaječný bílek se homogenizuje ve fyziologickémroztoku - konečná koncentrace asi 300 g/l)Pracovní postup:a. Do 4 označených zkumavek napipetujte roztoky podle tohoto schématu (objemy v ml)Výsledné pH: 1 ,2 1 ,5 2,5 kontr.roztok pepsinu 2,0 2,0 2,0 0HCl 0,1 mol/l 4,0 2,0 0,2 2,0deionizovaná H 2 O - 2,0 3,8 4,0suspenze vaječného bílku 1,0 1,0 1,0 1,0b. Inkubujte 20 min při 37 °C v termobloku.Vyhodnocení:Po skončení inkubace se hodnotí projasnění obsahu zkumavek natrávením bílkovinvaječného bílku. Hodnotí se: projasněné úplné (+), částečné (±) a neprojasnění (−).Výsledky zapište do tabulky v protokolu.Optimální pH je ve zkumavce s úplným projasněním obsahu.4. Vliv koncentrace substrátu na rychlost enzymové reakce MichaelisovakonstantaPrincip:V úloze bude použito preparátu laktátdehydrogenasy - L-Laktát: NAD + -5

oxidoreduktasa (EC 1.1.1.27). Jako substrátu bude použito laktátu, který je v přítomnostiNAD + jako koenzymu laktátdehydrogenasy (LD) přeměňován na pyruvát.CH 3 -CHOH-COOH + NAD + ←⎯⎯→ CH 3 -CO-COOH + NADH + H +Tato reakce se uplatňuje v glykolýze.Laktátdehydrogenasa má 5 isoenzymů (LD l - LD 5 ) jejichž distribuce v organismu seliší podle metabolické specializace orgánů, např. forma LD 1 převládá v srdci, forma LD 5převládá v kosterním svalu. Tato forma převládá i v játrech. Jednotlivé isoenzymy lze odlišitnapř. elektroforézou, což napomáhá orgánové diagnostice.V naši úloze však preparát laktátdehydrogenasy poslouží k demonstracikvantitativních vztahů mezi enzymem a substrátem (L-laktátem). Bude sledován vlivkoncentrace substrátu (S) na iniciální rychlost (v 0 ). Koncentrace laktátu se proto bude lišit (od12,5 - 200 mmol/l), zatímco ředění enzymu zůstane stálé.Měření iniciální rychlosti v 0 je založeno na fotometrii 2,4-dinitrofenylhydrazonupyrohroznové kyseliny, který vzniká reakcí oxoskupiny pyruvátu s volnou aminoskupinou2,4-dinitrofenylnydrazinu v kyselém prostředí (v kyselám prostředí se současně zastavíenzymová reakce). Vzniká 2,4-dinitrofenylhydrazon, který po alkalizaci dává hnědooranžovézbarvení vhodné k fotometrování při 505 nm.NOCOOH2COOHKondenzaceC O + H 2 N NH NO 2C N NHNO 2NO 2 + H 2 OCH 3Kyselinapyrohroznová2,4-dinitrofenylhydrazinCH 32,4-dinitrofenylhydrazonkyseliny pyrohroznovéReagencie:1) homogenát krysích jater.2) roztok natrium-laktátu 0,6 mol/l3) TRIS-HCI 0,05 mol/l pufr, pH 8,5 obsahujícím 1 mg hovězího sérového albuminu v 1 ml.4) roztok NAD + 3 mmol/l v TRIS-HCl pufru (viz bod 3). Každý den připravovat čerstvě!5) roztok 2,4-dinitrofenylhydrazinu (DNPH) v HCl 1 mol/l. Každý den připravovatčerstvě!6) NaOH 0,4 mol/lPracovní postup:a. Připraví se pomocné ředění natrium-laktátu (ze základního roztoku 0,6 mol/l)Zkumavka č.c (Na-laktát)pufr TRIS-HCIvýslednákoncentracemol/l ml ml mol/l1 0,6 zasobní roztok 1,0 - 0,62 0,6 zásobní roztok 1,0 1,0 0,33 0,3 (ze zkum. 2) 1,0 1,0 0,154 0,15 (ze zkum. 3) 1,0 1,0 0,0755 0,075 (ze zkum. 4) 1,0 1,0 0,03756

pozn.: Používá se postupně roztoků z předchozích zkumavek (ředění geometrickou řadou).b. Připraví se série šesti označených zkumavek, které se zpracují podle tohoto schématu:Zkumavkač.1 2 3 4 5 6substrát (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2NAD +(ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3Pokusný čas(min)Preinkubace 37°C ve vodní lázni - 5 min 0enzym (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 - 5Promíchat + inkubovat - přesně 15 min 20DNPH (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 20enzym (ml) - - - - - 0,1 21Nechat stát při laboratorní teplotě 35NaOH (ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 36Fotometrovat při 505 nm proti zk. č.6Poznámkyčasově nezávislé připravit mimo termoblokv termoblokuprovádět mimo termoblokPozn. : Čísla zkumavek 1 – 5 odpovídají koncentracím připraveným v tab. ředění substrátu.Pro zkumavku č. 6 zvolte nejnižší koncentraci substrátu = slepá zkouška.Při přidávání enzymu před inkubací a DNPH po inkubaci je nutné dodržovat 20 sinterval mezi jednotlivými vzorky.Výsledky:Výsledky zapište do tabulky v protokolu.Vyhodnocení:A. Z výsledků měřeni sestrojte graf závislosti 1/v na 1/S podle Lineweaver-Burka.Rychlost v je možno vynášet jako A 505 , neboť tato hodnota je při jednotlivýchkoncentracích přímo úměrná množství vytvořeného produktu v nanomolech. Je takémožné odečítat množství vytvořeného produktu v nanomolech z kalibračního grafu apřepočítat na 1 sekundu jako rychlost v vyjádřená v nanokatalech. Jeden posluchač zdvojice vynáší na milimetrový papír graf jako závislost 1/A 505 na 1/S . Druhý posluchačvynáší na ose y odpovídající hodnoty 1/v jako nanomoly vytvořeného produktu za 1sekundu (nkataly). Porovnáním se oba přesvědčí, že zjištěná hodnota K m (vyjádřená jakolátková koncentrace laktátu) je při obou způsobech totožná a nezávisí na zvolenýchjednotkách rychlosti.B. Přímé lineární vynesení (Eisenthal, Cornish-Bowden)a. Vyneste v proti S a proložte křivku (rovnoosá hyperbola).b. Pak vyneste jednu z hodnot S na osu x a odpovídající hodnotu v na osu y. Oběma bodyproložte přímku.7

c. Tento postup opakujte pro všechny dvojice hodnot S a jim odpovídajících naměřenýchhodnot v. Získáte n přímek pro n dvojic hodnot.d. Pokud by naměřené hodnoty přesně odpovídaly rovnici rovnoosé hyperboly, všechnypřímky by se protnuly v jednom bodě, jehož souřadnice y je V a souřadnice x je K m .e. Protože měření jsou zatížena experimentální chybou, v praxi se setkáváme většinou sesituací, kdy se přímky protnou ve více průsečících. Souřadnice y těchto průsečíků jsou V asouřadnice x K m .Tyto hodnoty seřadíme podle velikosti a určíme medián.C. Výpočet K m z naměřených hodnot.Vytvořte sadu dvojic hodnot s seřazených podle velikosti a jim odpovídajících hodnot v :S 1 v 1S 2 v 2S 3 v 3S 4 v 4S 5 v 5Pro každý pár z možných dvojic můžete vypočítat K m i V podle rovnic pro rovnoosouhyperbolu, uvedených v teoretickém úvodu.v2 - v1 S2 - S1Km= S1S2 V = v1v2Sv2 1-Sv1 2Sv2 1-Sv1 2Vypočtěte K m pro všechny možné páry dvojic a pak se určete jejich medián.pozn.Medián (označován Me nebo ) je hodnota, jež dělí řadu čísel podle velikosti seřazených hodnot nadvě stejně početné poloviny. Při lichém počtu hodnot se určí medián jako hodnota, která má nad seboui pod sebou stejný počet měrných hodnot. Při sudém počtu hodnot je medián aritmetickým průměremdvou středních hodnot, tj. nejnižší hodnoty horní poloviny a nejvyšší hodnoty dolní poloviny hodnotuspořádaných podle velikosti.5. Důkaz peroxidasy benzidinovou reakcíPrincip:Peroxid vodíku při oxidačních pochodech v buňce je rozkládán enzymy zvanýmiperoxidasy a katalasy. Patří do skupiny heminových enzymů (hemoproteinů). Průběh reakceje u obou enzymů rozdílný. Peroxidasy katalyzují oxidaci substrátu účinkem peroxidu vodíkuza vzniku vody (viz teoretický úvod). Peroxidasy (EC 1.11.1.7) jsou obsaženy v rostlinných iživočišných organismech. Katalasa (EC 1.11.1.6) jednak rozkládá peroxid vodíku na vodu amolekulární kyslík, jednak má peroxidasový účinek. Vyskytuje se ve větším nebo menšímmnožství ve všech tkáních (v tzv. peroxisomech) a v tekutinách organismu. Význam tkvíhlavně v rozkladu H 2 O 2 škodlivého pro organismus. V tomto cvičení bude prokazovánaperoxidasová reakce kvalitativně oxidací derivátu benzidinu na modré barvivo. (Dříve sepoužívalo k těmto důkazům benzidinu – 4,4´-diaminobifenylu , který je však kancerogenní.)Derivát benzidinu (tetramethylbenzidin nebo o-tolidin) se působením peroxidasy aperoxidu vodíku oxiduje na barevný oxidovaný produkt.H 2 NNH 2+ H 2 O 2PODHNNHC H 3CH 3H 3 CCH 3o-tolidin8

Reagencie:1) extrakt z brambor (extrakt s peroxidasou aktivitou)2) roztok o- tolidinu – 3,3´-dimethylbenzidinu 30 g/l v ledové kyselině octové3) peroxid vodíku 30 g/lPracovní postup:a. Reakční směsi se připraví do 4 zkumavek takto:Extrakt z brambor (ml) 1,0o-tolidin v kyseliněoctové1 2 3 41,0(povařený)- 1,04 kapky 4 kapky 4 kapky 4 kapkyH 2 O 2 4 kapky 4 kapky 4 kapky -Deionizovaná H 2 Opozn.: odečítat nutno ihnedVýsledky:Výsledky zapište do tabulky v protokolu(ml) - - 1,0 -Vyhodnocení:Porovnejte výsledek ve zkumavce č. 1 se zkumavkami č. 2, 3 a 4. Vysvětlete rozdíly.9