Enzymy - Ústav lékařské chemie a biochemie

na pepsin a působí jako inhibitory pepsinové aktivity. Tato inhibice je odstraněna poklesempH pod hodnotu 2.Lidský pepsin A má 5 molekulárních forem. Je to hlavní pepsin v žaludeční šťávěobratlovců a jeho specifičnost je zaměřena na hydrofobní (Leu), přednostně aromatické (Phe)aminokyselinové zbytky před a za štěpenou vazbou (endohydrolýza). Pepsin B (EC 3.4.23.2)se tvoří obdobným mechanismem jako pepsin A, avšak z pepsinogenu B, oproti pepsinu A mámalou aktivitu vůči hemoglobinu jako substrátu a dobře štěpí želatinu. Je obsažen hlavněv pyloru. Pepsin C (EC 3.4.23.3) je u člověka označován jako gastriksin, tvoří sez prekurzoru progastriksinu, který je secernován ve fundu žaludku, v antru a v proximálnímduodenu. Štěpí endohydrolýzou přednostně peptidové vazby za zbytkem aminokyseliny Tyr,je méně specifický než pepsin A a má poměrně vysokou aktivitu vůči hemoglobinu jakosubstrátu.Je-li substrátem vaječný albumin, je optimální pH pepsinu A = 1,5, je-li substrátemkasein, optimální pH = 1,8 a pro hemoglobin jako substrát je optimální pH = 2,3. Gastriksinmá optimum pH pro štěpení hemoglobinu 3,2.V naší úloze bude demonstrováno působení pepsinu na bílkoviny vaječného bílku.Reagencie:1) roztok pepsinu 10 g/l2) HCl 0,1 mol/l3) suspenze vaječného bílku (vařený vaječný bílek se homogenizuje ve fyziologickémroztoku - konečná koncentrace asi 300 g/l)Pracovní postup:a. Do 4 označených zkumavek napipetujte roztoky podle tohoto schématu (objemy v ml)Výsledné pH: 1 ,2 1 ,5 2,5 kontr.roztok pepsinu 2,0 2,0 2,0 0HCl 0,1 mol/l 4,0 2,0 0,2 2,0deionizovaná H 2 O - 2,0 3,8 4,0suspenze vaječného bílku 1,0 1,0 1,0 1,0b. Inkubujte 20 min při 37 °C v termobloku.Vyhodnocení:Po skončení inkubace se hodnotí projasnění obsahu zkumavek natrávením bílkovinvaječného bílku. Hodnotí se: projasněné úplné (+), částečné (±) a neprojasnění (−).Výsledky zapište do tabulky v protokolu.Optimální pH je ve zkumavce s úplným projasněním obsahu.4. Vliv koncentrace substrátu na rychlost enzymové reakce MichaelisovakonstantaPrincip:V úloze bude použito preparátu laktátdehydrogenasy - L-Laktát: NAD + -5