Indukovaná rezistence k chorobám a škůdcům - VÚRV, v.v.i.

Indukovaná rezistence k chorobám a škůdcůmSeminář pořádaný na Ministerstvu zemědělství ČR, Těšnov 65/17, Praha 1,místnost č. 101Datum a čas pořádání: 22. 9. 2010. v 9,15 hod.Program semináře:Věchet, L.: Indukovaná rezistence rostlin k chorobám a škůdcům.Vrchotová, N.: Ovlivnění syntézy sekundárních metabolitů v rostlinách.Věchet, L.: Indukovaná rezistence pšenice proti padlí travnímu.Šerá, B. : Potenciální využiti rostlin v indukované rezistenci.Havelka, F., Věchet, L.: Vliv induktorů rezistence na tvorbu infekčních strukturv procesu vývoje padlí travního.Burketová, L.: Využití indukované rezistence u řepky proti významnýmpatogenům.Věchet, L.: Vliv termínů ošetření pšenice induktory rezistence na sníženívýskytu padlí travního v polních podmínkách.Pořádající organizace:Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i.Ústav experimentální botaniky AV ČR, v. v. i.Ústav systémové biologie a ekologie AV ČR, v. v. i.Kontakt: Ing. Lubomír Věchet, CSc.; Email: vechet@vurv.cz1

Indukovaná rezistence rostlin k chorobám a škůdcům.Věchet, L.Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.Praha 6 - RuzyněPodle van Loona et al. (1998) je indukovaná rezistence fyziologický stav vytvořenýspecifickými vnějšími stimuly, který znamená zvýšenou obranyschopnost rostliny.Následnými biotickými změnami jsou zesíleny vrozené obranné mechanizmy rostliny. Tentostav zvýšené rezistence je účinný proti široké řadě patogenů, včetně hub, bakterií, virů,nematod, parazitických rostlin a dokonce býložravému hmyzu (Benhamou & Nicole, 1999;Kesler & Baldwin, 2002; McDowell & Dangl, 2000; Walling, 2000).Rezistenci rostlin indukovanou patogeny prvně rozpoznali Ray (1901) a Beauverie (1901).Chester (1933) potvrdil tyto studie a sumarizací polních pozorování předpokládal, že tatomyšlenka může hrát důležitou úlohu v ochraně rostlin v přírodě. Cruickshank and Mandryk(1960) byli první, kdo podali zprávu o SAR na tabáku indukovanou houbovými patogeny.Prvé vysvětlení systémové rezistence u rostlin inokulovaných mozaikovým virem tabákupředložil Ross (1961). Tato problematika se začala ve světě intenzivně studovat od roku 1993(Schönbeck et al., 1993). Systémová rezistence zahrnuje akumulaci antimikrobiálníchsloučenin v části rostliny, vzdálené od místa infekce. Existují čtyři hlavní třídy sloučenin,které mohou akumulovat hydrolázy: k patogenezi vztažené proteiny (PR-proteiny), defensiny(Broekaert et al., 1995), inhibitory proteináz (Schaller & Ryan, 1996) a komponenty buněčnéstěny, (Agrios, 1998) zvláště hydroxyprolinem bohaté glykoproteiny (HRGP), dále pak lignin(zpevňující polymer v rostlinách) a jeho prekurzory (Sticher et al., 1997). Podle van Loon etal.(2006) jsou známy čtyři typy indukované rezistence:A) Lokálně získaná rezistence (LAR - local acquired resistance)B) Systémově získaná rezistence (SAR - systemic acquired resistance)C) Indukovaná systémová rezistence (ISR - induced systemic resistance)D) Indukovaná rezistence proti poranění býložravým hmyzem (WIR - wound-inducedresistance)Lokálně získaná rezistence. Rezistence zahrnuje akumulaci antimikrobiálních sloučeninv části rostliny, vzdálené od místa infekce. V místě kontaktu mezi patogenem a rostlinou jsouelicitory patogena schopny vzájemně reagovat s receptory rostliny, jako jsou napříkladleucinem bohaté reprodukované proteiny, které nebyly nalezeny v živočišných buňkách.Samotné transdukční dráhy ještě nebyly vysvětleny, ale možná vyžadují tvorbu Ca 2+ neboproteinkinázy anebo je iniciována tvorba peroxidu vodíku. Peroxid vodíku zabíjí buňky a bylozjištěno, že indukuje syntézu kyseliny salicylové. Jestliže je kyselina salicylová produkovánav dostačujících koncentracích, může být schopna indukovat lokálně získanou rezistenci vokolních živých tkáních, bez potřeby skutečného systémového signálu zahrnutého v SAR.Z toho důvodu hypersenzitivní reakce vede k lokálně získané rezistenci, která sama iniciujesystémově získanou rezistenci.Systémově získaná rezistence. Je vyjádřená v rostlině jako úplná v reakci k napadenípatogenem. Je to rezistence tkání rostliny vzdálených od místa pokusu k penetraci patogena.Klasická forma SAR může být spuštěna vystavením rostliny virulentním, avirulentním anepatogenním mikrobům. Vyžaduje signální molekulu kyseliny salicylové a je spojenas akumulací k patogenezi vztažených proteinů. Může být spuštěna vystavením rostlinyvirulentním, avirulentním a nepatogenním mikrobům nebo uměle chemikáliemi, tak jako jsoukyselina salicylová, 2, 6-dichloro-isonicotinická kyselina nebo S-metylester kyseliny 1, 2, 3-2

enzotiazolové, BTH (benzothiadiazol). Tato rezistence je cílená k širokému spektrupotenciálních patogenů a ne pouze k jednomu patogenu, který tuto reakci inicioval. Hlavnísložkou SAR je akumulace PR proteinů. Vyžaduje signální molekuly kyseliny salicylové vevšech částech rostliny. Narušení schopnosti rostliny akumulovat kyselinu salicylovou končívětšinou ve ztrátě projevu k patogenezi vztažených genů a oslabení reakce SAR, a to zejména,když jsou pro indukci použity patogeny. PR proteiny se akumulují v obou, jednoděložných akrytosemenných rostlinách a ukázaly antimikrobiální aktivitu.Indukovaná systémová rezistence. Bakterie rhizosféry jsou přítomny ve velkém množství napovrch kořenů rostlin, kde jim exudáty a produkty lýzy poskytují živiny. Určité rasyrhizosférních bakterií stimulují růst rostliny a jsou tudíž nazývány rhizobakterie podporujícírůst rostliny. Rasy, které byly izolovány z půd přirozeně potlačující chorobu, jsou zejménafluorescenční Pseudomonas spp. Bylo demonstrováno, že redukují choroby rostlin potlačenímv půdě zrozených patogenů. Její funkce je obvykle spojena s dráhou kyseliny jasmonové,vedoucí k defenzinům a inhibitorům proteáz. Tento typ indukované rezistence byl prvněpopsán u rostlin Arabidopsis, inokulované nepatogenní bakterií Pseudomonas fluorescens,která kolonizuje kořeny. Listy těchto rostlin projevily rezistenci proti bakteriálnímu listovémupatogenu Pseudomonas syringae pv. Tomato. Okamžitě po infekci patogenem jsoustimulovány produkce kyseliny jasmonové a etylénu.Indukovaná rezistence proti poranění býložravým hmyzem. Napadení rostlin hmyzem vedek systémovému projevu inhibitorů proteinázy, které redukují aktivitu enzymů býložravéhohmyzu. Napadení hmyzími škůdci aktivuje dráhu octadecanoidu skrze kyseliny lipoxygenovéa linoleové, které následně vytvářejí kyselinu jasmonovou. Kyselina jasmonová slouží jakosignál pro projev množství sloučenin tak jako inhibitor protézy, polyfenol oxidázy asteoridních glycoalkaloidů, které se zdají, že přispívají k rezistenci rostliny proti mnohaškůdcům a některým patogenům. Infekce houbových, bakteriálních a virových patogenůindukuje odlišné biochemické dráhy, které produkují kyselinu salicylovou, jež následněsignalizuje informaci k patogenezi vztažených proteinů a fytoalexinů.Indukovaná rezistence se zkouší proti řadě původců chorob a škůdců na různýchplodinách. Je to zejména proti padlí travnímu, rzím, braničnatce pšeničné, fuzariózám uobilnin, ale i u jiných plodin, chorob a škůdců. Velké množství poznatků je hlášenov indukované rezistenci rostlin k patogenům (houby, bakterie, viry) způsobujícíhypersensitivní nekrotické reakce (HR); avirulentním patogenům; škůdcům (hmyz, nematody- hlístice). Jako prostředky indukované se zkoušejí elicitory (metabolity patogena, kteréstimulují v hostitelské rostlině produkci fytoalexinu) biologického původu; abiotické elicitory,tj. chemické produkty, jako benzothiadiazol (BTH), β-aminomáselná kyselina (BABA);dichloroisonikotinová kyselina (INA), kyselina salicylová (SA), anorganické soli, atd.(Kessman et al., 1994; Lyon et al., 1995; Benhamou and Picard, 1999; Cohen, 2001; Kuc,2001). Dále to je přípravek BABA, neproteinová aminokyselina, která se vyskytuje zřídkav přírodě. Byla zjištěna v kořenových exudátech rajčat na sluncem osvětlených půdách. Codělá tuto substanci zajímavou je její těsný vztah na vysoce bioaktivní substance. Mšicevystavené ošetření hostitelských rostlin BABA (buď před, nebo po kladení vajíček) mělysklon k větší mortalitě, když parazitovaly. Indukuje rezistenci proti chorobám způsobenýchplísní okurkovou (Pseudoperonospora cubensis), jakož i nekrotrofními houbami a bakteriemina mnoha plodinách. Proti rzi slunečnicové (Puccinia helianthi) postřikem na listy nebonamáčením kořenů byl nejvíce efektivní BABA a sodium salicylate – NaSA (salicylát sodný)byl nejméně efektivní. BABA neovlivnila klíčení uredospor, růst klíčku, tvorbu apresorianebo počáteční vstup P. helianthi, ale silně potlačila kolonizaci mycelia v mezofylu a3

následně tvorbu pustulí a uredospor. Postřikem rozpustných karbohydrátů na listy kukuřice,rajčat, brambor, rostlin fazolí a stromů jabloní. Na listech rajčat a fazolí byl pozorován vlivproti Botrytis cinerea. Nízká dávka postřiku listů a promáčení půdy také indukovala rezistenciproti několika druhům nematod napadající rajčata, brambory a zeleninu. Aplikace technologiev sadech jabloní a sadech zahrad po tři roky poskytla ochranu proti jejich hlavním škůdcůmCydia pomomella ( Lepidopera). Dále to je neurotransmiter γ-aminomáselná kyselina(GABA). Zkouší se také indukovaná rezistence pšenice proti fusariózám klasu (Fusariumculmorum, Fusarium graminearum) pomocí autoklávené biomasy tohoto patogena.Fungicidní aktivita Curcuma longa ,z rhizomů odvozený materiál kurkumin, byla testovánaproti Botrytis cineria, Erysiphe graminis, Phytopthtora infestans, Puccinia recondita,Rhyzoctonia solani.Napadení hmyzími škůdci aktivuje dráhu octadecanoidu skrze kyseliny lipoxygenové alinolenové (LOX), které následně vytvářejí kyselinu jasmonovou. Kyselina jasmonová sloužíjako signál pro projev množství sloučenin, tak jako inhibitoru proteázy (PINI), polyfenoluoxidázy a steoridních glycoalkaloidů, u kterých se zdá, že přispívají k rezistenci rostliny protimnoha škůdcům a některým patogenům.Byly studovány interakce mezi odrůdami bílého zelí (Brassica oleracea var. capitata) ahousenkou Pieris rapae a mšicí (Brevicoryne brassicae). Vodní extrakt listů neemu(Azadirachta indica (A. Juss )), velký východoindický strom, z jehož plodů se získává léčivýaromatický olej, poskytl kontrolu patogena listové pruhovitosti (Drechslera graminea) naječmeni. Přípravek byl efektivní jako fungicid Bavistin (Carbendazin). Na poli je projevindukované rezistence pravděpodobně ovlivněn vnějším prostředím, genotypem a výživouplodiny. Druhy běžných půdních hub Trichoderma jsou používány v biologické kontrolepatogenních hub rostlin. Je známo, že Trichoderma produkuje širokou rozmanitostmedicínských a zemědělsky důležitých sekundárních metabolitů. Tři druhy sloučenin jsouhlavně tvořeny různými druhy tohoto rodu: peptaibols (řada peptidů charakterizovanýchpřítomností AIB - amino kyselina izomáselná, acetylovaného N-terminus a hydroxylovanýchC-terminálních aminokyselin, polyketidy - přírodní sloučeniny obsahující karbonylové amethylové skupiny a terpeny - rozšířeny v přírodě, hlavně v rostlinách jako složky silic(vytvářeny rostlinami jako ochrana před býložravci - éterické oleje), z nichž některé majíantifungální aktivitu.LiteraturaAgrios G. N. (1988): Plant Patology. 3rd Ed. Academic Press Inc., San Diego, USA.Beauverie J. (1901): Essais d’immunisation des végétaux contre les maladies cryptogamiques.CR Acad. Sci. Paris. 133: 107-110.Benhamou N., Nicole M. (1999): Cell biology of plant immunization against microbialinfection: The potential of induced resistance in controlling plant diseases. PlantPhysiol. Biochem. 37, 703-719.Broekaert W. F., Teras F. R. G., Cammue B. P. A., Sborn R. W. (1995): Plant defensins:novel antimicrobial peptides as components of the defense system. Plant Physiol.108, 1353-1358.Cohen Y. (2001): The BABA story of induced resistance. Phytoparasitica. 29, 375-378.Chester K. S. (1933): The problem of acquired physiological immunity in plants. Quat. Rev.Biol. 8, 275-324.Cruickshank I. A.M., Mandryk M. (1960): The effect of stem infestations of tobacco withPeronospora tabacina Adam on foliage reaction to blue mold. J. Aust. Inst. Agric.Sci. 26, 369-372.4

Kessler, A., Baldwin I. T. (2002): Plant responses to insect herbivory: The emergingmolecular analysis. Annu. Rev. Plant Biol. 53, 299–328.Kessman H, Staub T, Hofman C, Maetzke T, Herzog J. (1994): Induction of systemicacquired disease resistance in plants by chemicals. Ann. Rev. Phytopathol. 32, 439-459.Lyon G. D., Reglinski T, Newton A. C.. (1995): Novel disease kontrol compounds: thepotential to “immunize” plants against infection. Plant Pathol. 44, 407-427.Kuc J. (2001): Concepts and direction of induced systemic resistence in plants and itsapplication. Eur. J. Plant. Pathol. 107,7-12.McDowell J. M., Dangl J. L. (2000): Signal transduction in the plant immune response.Trends Biochem. Sci. 25, 79-82.Ray J. (1901): Les maladies cryptogamiques des végétaux. Rev Gen Bot. 13: 145-151.Ross, A. F. (1961). Systemic acquired resistance induced by localized virus infections inplants. Virology, 14, 340-458.Schaller A., Ryan C. A. (1996): Molecular cloning of a tomato leaf cDNA encoding anaspartic protease, a systemic wound response protein. Plant Mol. Biol. 31, 1973-1977.Schönbeck F, Steiner U and Kraska T. (1993): Induzierte Resistenz:Kriterien, Mechanismen,Anwendung und Bewertung. J. Plant Dis. Protection. 100, 541-557.Schneider M, Schweizer P, Meuwly P, Métraux J. P.. (1996): Systemic acquired resistance inplants. In: Jeon KW, ed. International review of cytology, vol. 168. San Diego:Academic Press, 303-340.Sticher L., Mauch-Mani B., Metraux J. P. (1997): Systemic acquired resistence. Annu. Rev.Phytopathol. 35, 235-270.Walling, L. L. (2000): The myriad plant responses to herbivores. J. Plant Growth Regul. 19,195-216.van Loon, L. C., Bakker P. A. H. M, Pieterse C. M. J. (1998): Systemic resistance induced byrhizosphere bacteria. Annu. Rev. Phytopathol. 36, 453-483.van Loon L. C, van Oosten V. R., Ton J., de Vos M., Pieters C. M. J. (2006): Adaptiveinduced resistence response to pathogens and erbivorous insects. In: 8 th Conferenceof the European Foundation for Plant Pathology & British Society for PlantPathology Presidental Meeting 2006. 13-17 August KVL, Frederiksberg, Denmark.5

Ovlivnění syntézy sekundárních metabolitů v rostlinách.Vrchotová, N.Ústav systémové biologie a ekologie AV ČR, v.v.i., Branišovská 31, České BudějoviceTermíny sekundární a primární metabolity byly vytvořeny Albrechtem Kösselem (nositelNobelovy ceny za fyziologii a medicinu 1910). Primární metabolismus definoval jakometabolismus, který zajišťuje základní životní funkce organismu, sekundární metabolity jakometabolity, které nejsou sice pro buňku nezbytné, mohou být však užitečné pro organismusjako celek.Tyto termíny se používají dodnes, i když primární a sekundární metabolismus je navzájempropojený a nelze vždy striktně rozlišit, co je primární a co sekundární metabolit (např.některé fenolické kyseliny jsou součástí buněčné stěny).Primární metabolismus zajišťuje základní životní funkce organismu – reprodukce, stavbabuněk, fotosyntéza, zajišťování energie…Sekundární metabolity působí jako atraktanty, mají vlastnosti allelopatické (ovlivňujíklíčení a růst jiných rostlin tím, že např. uvolňují metabolity kořenovým systémem do půdy,také rozkladem nadzemních částí v půdě, uvolňování látek do ovzduší), antimikrobiální,insekticidní a fungicidní (obrana proti patogenům) a působí jako antioxidanty (ochrana protiUV záření).Všechny rostliny obsahují celkem asi 200 000 různých metabolitů.K primárním metabolitům patří nukleové kyseliny, bílkoviny, lipidy, aminokyseliny, cukry…Sekundární metabolity jsou velmi různorodé, řadíme k nim např.:• terpenické látky (29 000)• alkaloidy (12 000)• polyaminy• steroly• glukosinoláty• fenolické sloučeniny (8 000) - hydroxybenzoová a skořicová kyselina a jejich deriváty,kumariny, flavonoidy (katechiny, flavony a flavonoly, flavanony a flavanonoly,isoflavony, anthokyanidiny a anthokyaniny, chalkony a aurony), stilbeny, ligniny atřísloviny, chinony, …6

Obr. 1 a 2 znázorňují metabolické dráhy syntézy sekundárních metabolitů.CO 2FotosyntézaSacharidyPentózafosfátovýcyklusGlykolýzaErythróza 4-fosfátFosfoenolpyruvátCesta šikimovékyselinyAromatickéaminokyselinyDusíkatésekundárníproduktyAlifatickéaminokyselinyFenolické látkyAcetyl CoACyklustrikarboxylovýchkyselinCesta malonovékyselinyCestamevalonové kys.mevalonovéTerpény7

Obr. 1Schéma syntézy sekundárních metabolitů (Taiz and Zeiger 1991).Obr. 2Schéma syntézy fenolických látek: skořicová kyselina tvořená z fenylalaninufenylalaninamoniumlyasou (PAL) je prekurzorem řady fenolických látek. U některých rostlinse tvoří 4-hydroxyskořicová kyselina obdobnou drahou z tyrosinu. Další aromatický kruh setvoří, buď chalkonsynthasou nebo stilbensynthasou (Minami et al. 1989; Adámková et al.2006).8

Rostliny zvyšují produkci sekundárních metabolitů jako odpověď na stresové vlivyprostředí. Tyto vlivy jsou velmi různorodé, a to jak biotické (houby, plísně, viry, herbivorníživočichové), tak abiotické (UV záření, kvalita půdy, závlaha, množství ozónu, látkyznečišťující životní prostředí).Při poškození dochází v rostlině k uvolnění tzv. signálních molekul (např.hydroxyskořicová a salicylová kyselina), které aktivují enzymy účastnící se biosyntézysekundárních metabolitů. Klíčovým enzymem je L-fenylalaninamoniumlyasa (PAL), dále jeto např. chalkonsynthasa a stilbensynthasa (Adámková et al. 2006). Dochází také k aktivacisyntézy bílkovin (enzymů), které se podílejí na syntéze sekundárních metabolitů. Existuje izpětná vazba, nahromaděné metabolity inhibují enzymatickou aktivitu.Vzhledem k tomu, že rostlinné sekundární metabolity se široce využívají ve farmakologii,je snaha ovlivnit syntézu metabolitů jak v buněčných kulturách, tak i v polních podmínkách.A poněvadž sekundární metabolity mají antimikrobiální, insekticidní a fungicidní vlastnostizkoumá se, které typy rostlinných metabolitů by byly vhodné k ochraně zemědělských plodina vedly by ke snížení toxických syntetických pesticidů apod. K elicitaci jsou používány např.salicyláty, bakteriální a rostlinné extrakty, extrakty z plísní, linolová kyselina, chitosan,alginát, pektiny. K indukci sekundárních metabolitů se však také využívají ionty titanu,lanthanu, benzothiadiazol, UV záření.Existuje celá řada studií zabývajících se stimulací sekundárního metabolismu. Níže jsouuvedeny některé z nich.Tkáňové kultury:Tkáňová kultura Rheum palmatum – elicitor (salicylová kyselina) - indukována zvýšenásyntéza anthracenových derivátů (Kašparová et al. 2002).Tkáňová kultura Trifolium pratense – elicitor (síran měďnatý) - indukována zvýšená syntézaflavonoidů a isoflavonoidů (Kašparová et al. 2007).Tkáňová kultura Taxus spp. – elicitor (ionty lanthanu) - stimulace produkce taxolu (Wu et al.2001).Celé rostliny, polní pokusy:Echinacea purpurea (třapatka nachová) – elicitory (acetylsalicylová kyselina, salicylovákyselina, methylsalicylát, askorbát titanu) - zvýšená syntéza kaftarové a cichorové kyseliny(Kužel et al. 2009).9

Vitis vinifera (réva vinná) – elicitory (extrakty bohaté na anthrachinony z Rheum palmatum aFrangula alnus) - zvýšená syntéza stilbenů, které působí proti plísni Plasmopara viticola nalistech révy (Godard S. et al. 2009).Vitis vinifera – elicitory (chlorid hlinitý) - zvýšená syntéza stilbenů (Adrian et al. 1996).Cucumis sativus (okurka setá) – elicitor (extrakt z Reynoutria sachalinensis) - stimulacesyntézy hydroxyskořicových kyselin, zvýšila se odolnost proti padlí (Daayf et al. 1997, 2000).Triticum (pšenice) – elicitory (extrakty z křídlatky sachalinské, zázvoru a kurkumy, salicylovákyselina, benzodithiazol) - sledování vlivu elicitorů na odolnost proti padlí travnímu (Věchetet al. 2006, 2009a, 2009b).Literatura:Adámková et al. (2006): Chem. Listy 100: 486-494.Daay, F. F. et al. (1997): Plant Physiology 113: 719-727.Daay, F. F. et al. (2000): J. Chem. Ecol. 26: 1579-1593.Godard, S. et al. (2009): Plant Physiology and Biochemistry 47: 827-837.Kašparová, M. et al. (2002): Čes. Slov. Farm. 4: 177-181.Kašparová, M. et al. (2007): Čes. Slov. Farm. 56: 225-229.Kužel, S. et al. (2009): J. Agric. Food Chem. 57: 7907-7911.Minami, E. et al. (1989): Eur. J. Biochem. 185: 19-25.Taiz, L. et al. (1991): Plant Physiology.Věchet, L. et al. (2009a): Aktuální poznatky v pěstování, šlechtění, ochraně rostlin azpracování produktů, Vědecká příloha časopisu Úroda.Věchet, L. et al. (2009b): Crop Protection 28: 151-154.Věchet, L. et al. (2006): 8th Conference of the European Foundation for Plant Pathology &British Society for Plant Pathology Presidential meeting,Wu et al. (2001): Journal of Biotechnology 85: 67-73.Další literatura k tématu:Adrian, M. et al. (1996): Flavonoids and Other Polyphenols: In Methods in Enzymology (ed.Parker L.), vol. 335, Academic Press 2001. J. Agric. Food Chem. 44:1979-1981.Harborne, J. B. (1993): Introduction to Ecological Biochemistry, Academic Press.Havsteen, B. H. (2002): Pharmacology and Therapeutic 96: 67-202.Lunerová, K. a kol. (2003): Přírodní látky jako chemoprotektiva, Čes. Slov. Farm. 52:126-13010

Macholán, L. (2002): Sekundární metabolity, Brno.Míka, V. a kol. (2001): Fenolické látky v lučních rostlinách. VÚRV Praha.Moravcová, J. (2003): Biologicky aktivní přírodní látky, Praha.Procházka, S. a kol. (1998): Fyziologie rostlin, Academia Praha.Velíšek, J. (1999): Chemie potravin, OSSIS Tábor.Vodrážka, Z. (2002): Biochemie, Academia Praha.11

Indukovaná rezistence pšenice proti padlí travnímu (Blumeria graminisf.sp. tritici).Věchet, L.Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.Praha 6 - RuzyněAbstraktInduktory biologického a chemického původu snížily napadení pšenice v přirozenýchpodmínkách padlím travním a to v průměru mezi 35% až 54% závažnosti chorobyv porovnání s neošetřenou kontrolou. Nejvíce účinný byl přípravek BION, křídlatkasachalinská, v některém roce glycin betain a kurkuma. V posledním roce pokusů byly vysoceúčinné extrakty z netýkavky žlaznaté a kopřivy dvoudomé. Induktory rezistence potvrdilydlouhodobý účinek na snížení závažnosti choroby.Klíčová slova: padlí travní; pšenice; induktory rezistence; závažnost chorobyÚvodStrategie rezistence k chorobám je důležitým komponentem moderního, udržitelnéhozemědělství. Pochopení mechanizmů, kterými rostliny tolerují napadení patogeny, hmyzemnebo snášejí abiotické stresy je rozhodující část znalostí, jak zvýšit produkci rostlin a výnosplodin, ve výrazu poklesu globálních zemědělských zdrojů. Indukovaná rezistence ve svémnejširším smyslu znamená kontrolu patogenů a hmyzu předchozí aplikací genetickyprogramovaných obranných drah rostliny. Je třeba zkoumat schopnost rostlin tolerovat takovánapadení a stresy a zjišťovat v podrobnostech různé stránky rezistentních reakcí amechanizmů rezistence. Systémová rezistence je charakterizována lokální hypersensitivníreakcí vedoucí k programovému odumření buňky kolem infikovaných buněk (Kombrink aSchmelzer, 2001), lokálními změnami ve struktuře buněčné stěny a složení, které zabraňujedalší penetraci patogena, lokální a systémovou expresí k patogenezi vztažených (PR) proteinů(van Loon, 1997). Uměle vytvořený elicitor rezistence BION, indukuje rezistenci k chorobámu 18 druhů rostlin (Heil, Ploss, 2006). BION může být aplikován zevně na rostliny a indukujerezistenci k chorobám u jednoděložných a krytosemenných rostlin. Indukovaná rezistenceproti padlí travnímu, biotrofnímu patogen, se začala u nás (VÚRV) sledovat ve spoluprácis ÚEB AV od roku 2004. Za sedm let maloparcelkových pokusů byly dosaženy a publikoványzajímavé výsledky.Cílem pokusů bylo zjistit časovou účinnost induktorů rezistence, účinnost jednotlivýchinduktorů proti padlí travnímu v polních podmínkáchMetodyV letech 2008 – 2010 byly založeny maloparcelkové pokusy ve dvou opakováních, délkařádku 1m. Dva sousední řádky byly ošetřeny induktorem, pět řádků bez ošetření. V pokusechbyla použita odrůda pšenice ozimé Kanzler, náchylný standard k padlí travnímu. Ošetřeníinduktory bylo provedeno v roce 2008: 1. ošetření 6. 12. 2007, 2. ošetření 28. 4, 2008, 3.ošetření 15. 5. 2008; v roce 2009: 1. ošetření 1. 12. 2008, 2. ošetření 1. 4. 2009 a 3. ošetření25. 5. 2009; v roce 2010 bylo provedeno pouze 1. ošetření 7. 12. 2009. Hodnocení chorobybylo provedeno v roce 2008 ve dnech 3., 5. a 6. 6., v roce 2009 ve dnech 11., 15., 17., 18. 6. av roce 2010, ve dnech10. a 11. 6. Infekce padlím travním (Blumeria graminis f.sp. tritici) bylapřirozená. Hodnotilo se napadení všech živých listů na rostlině, ve dvou opakováních,12

v každém opakování 15 rostlin. Závažnost choroby byla hodnocena podle devítibodovéstupnice (Saari & Prescott, 1975). Z dat závažnosti napadení bylo vypočteno kumulativníprocento napadení – CPLAD (napadení všech listů na rostlině), které vyjadřuje napadení celérostliny (Věchet & Kocourek, 1987; Briére et al., 1994). V roce 2009 byly použity induktory(Věchet et al, 2005) chemického původu: benzothiadiazol (BTH), kyselina salicylová (SA) ainduktory biologického původu: glycin betain, extrakty z dubové kůry (OB, Quercus roburL.), křídlatka sachalinská (RS, Reymoutria sacchalinsis L.), kurkuma (CU, Curcuma longaL.), zázvor (GI, Zingiber officinale Roscoe). Jedna varianta, neošetřená induktory, bylazařazena jako kontrola (KO).Jako induktory byly použity v roce 2008 a 2009:Benzothiadiazol (BTH) - S-metylester kyseliny 1,2,3 -benzotiazolové, komerčnípřípravek Bion® (SYNGENTA).Kyselina salicylová (SA) funguje jako hormon rostlin.Glycin betain (GB) (N,N,N-trimethylglycin) látka, která hraje důležitou úlohuv rostlinách při různých stresech (vysoké množství solí v půdě, nízké teploty).Dubová kůra (DK) (Quercus robur L.) je používána v biologicko-dynamickém zemědělství.Podporuje odolnost rostlin k chorobám.Křídlatka sachalinská (KS) (Reynoutria sacchaliensis L.) patří do čeledi rdesnovitých(Polygonaceae) extrakty z listů mají preventivní ochranný efekt proti padlí travnímu u mnohaplodin.Kurkuma (KU) tropická rostlina z čeledi zázvorovitých (Curcuma longa L.) obsahuje účinnousložku kurkumin a kurkumol (kurkumový olej) připravený z jejich rhizomů.Zázvor (ZA) (Zingiber officiinale Roscoe) tropická rostlina z čeledi zázvorovitých, rodZinginber. Oddenky obsahují zingiberelin, zingeron, fellandren, kamfen, zingiberol a jehoestery.V roce 2010 jsme do pokusů zařadili:Kopřiva dvoudomá (KD) (Urtica dioca) je zdrojem léčivých účinků. Hojně rozšířená plevelnárostlina.Netýkavka žláznatá (NZ) (Impatiens gladilufera), jednoletá rostlina, původem z Kašmíru aNepálu. K nám se dostala na počátku 20. stol. Okrasná a medonosná rostlina.VýsledkyVýskyt padlí travního ve třech letech pokusů by rozdílný. Nejnižší byl v roce 2010 anejvyšší v roce 2009. Ošetření induktory rezistence ve třech odlišných termínech aplikacepřineslo ve dvouletých pokusech rozdílné výsledky. V roce 2008 (Tab. 1) se závažnostchoroby oproti kontrole (100%) v jednotlivých termínech ošetření pohybovala od 43,97 do49,78%. Nejlepší průměr ze třech ošetření byl u benzothiadiazolu (BTH), křídlatkysachalinské (KS) a kyseliny salicylové (SA). Nejhorší průměr byl po ošetření glycin betainem(GB). Efektivnější bylo druhé ošetření induktory u 4 induktorů (BTH, SA, GB a KS). Prvníošetření bylo nejvíce efektivní u dvou induktorů (KU, ZA). V souběžných pokusech bylaTab. 1. Účinek induktorů rezistence na závažnost napadení pšenice, odrůdy Kanzler, padlímtravním. 1. ošetření - 6. 12. 2007, 2. ošetření – 28. 4.2008, 3. ošetření – 15. 5. 2008.Induktor% napadeníKO 13,10BTH 1. ošetření 5,4013

2. ošetření 1,253. ošetření 5,10průměr 3,92SA 1. ošetření 5,252. ošetření 3,903. ošetření 4,65průměr 4,60GB 1. ošetření 13,752. ošetření 7,603. ošetření 7,90průměr 9,75DK 1. ošetření 5,202. ošetření 5,353. ošetření 5,15průměr 5,23KS 1. ošetření 3,052. ošetření 2,803. ošetření 6,70průměr 4,18KU 1. ošetření 4,702. ošetření 9,453. ošetření 8,20průměr 7,45ZA 1. ošetření 6,502. ošetření 9,953. ošetření 7,00průměr 7,82Průměr induktory 1. ošetření 6,262. ošetření 5,763. ošetření 6,39Procento induktory ke kontrole 1. ošetření 47,782. ošetření 43,973. ošetření 49,78sledována u odrůdy Vlasta, se specifickými geny rezistence Pm2 a Pm6, vysoce odolnák padlí travnímu, kde závažnost choroby byla 2,6% a odrůdy Mikon, standard s částečnourezistencí k padlí travnímu, kde závažnost choroby byla 9,7%. Toto srovnání ukazuje, žedruhé ošetření BTH dalo lepší výsledek, než odrůda se specifickou rezistencí k padlítravnímu. Druhé ošetření KS bylo podobné jako závažnost padlí travního u odrůdy Vlasta.Efektivita ošetření induktory znamenala ve většině případů nižší závažnost choroby, než bylazjištěna u odrůdy s částečnou rezistencí Mikon.V roce 2009 (Tab. 2), kdy byl nejvyšší výskyt choroby a závažnost choroby po ošetřeníinduktory se pohybovala v rozmezí 8% až 25%, oproti kontrole (100%), kde byla téměř 27%.Nejnižší průměr mělo první ošetření induktory, následovalo druhé a třetí ošetření. Průměrnéprocento závažnosti ošetření induktory se pohybovalo od 43,56% u prvního ošetření až do53,93% u třetího ošetření ve vtahu ke kontrole. Nejnižší závažnost napadení byla v průměruzaznamenána po ošetření kurkumou (KU) a nejvyšší po ošetření kyselinou salicylovou (SA).První ošetření bylo nejúčinnější u třech induktorů (BTH, SA a GB), druhé ošetření u dvou14

induktorů (DK, KS). Třetí ošetření bylo nejméně úspěšné u čtyř induktorů (BTH, GB, DK,ZA).Tab. 2. Účinek induktorů rezistence na závažnost napadení pšenice, odrůdy Kanzler, padlímtravním. 1. ošetření 1. 12. 2008, 2. ošetření 1. 4. 2009, 3. ošetření 25. 5. 2009.Induktor% napadeníKO 26,70BTH 1. ošetření 8,362. ošetření 12,553. ošetření 16,75průměr 12,53SA 1. ošetření 10,852. ošetření 25,363. ošetření 16,35průměr 17,52GB 1. ošetření 8,352. ošetření 12,553. ošetření 16,75průměr 12,55DK 1. ošetření 14,302. ošetření 12,653. ošetření 14,40průměr 13,78KS 1. ošetření 12,352. ošetření 11,703. ošetření 9,80průměr 11,28KU 1. ošetření 13,152. ošetření 8,603. ošetření 11,20průměr 9,98ZA 1. ošetření 13,652. ošetření 13,603. ošetření 15,55průměr 14,27Průměr induktory 1. ošetření 11,632. ošetření 13,863. ošetření 14,40Procento induktory ke kontrole 1. ošetření 43,562. ošetření 51,913. ošetření 53,93Jediné ošetření induktory v roce 2010 (Tab. 3), provedené jako první koncem roku 2009,mělo v průměru závažnost choroby 34,60% ve vztahu ke kontrole(100%). Celkový průměrošetření induktory byl ve vztahu ke kontrole téměř třetinový. Nejnižší závažnost choroby byla15

po ošetření netýkavkou žláznatou (NZ), kopřivou dvoudomou (KD) a benzothiadiazolem(BTH). Naopak nejvyšší závažnost choroby byla po ošetření glycin betainem (GB).Tab. 3. Účinek induktorů rezistence na závažnost napadení pšenice, odrůdy Kanzler, padlímtravním. 1. ošetření 7. 12. 2009.Induktor% napadeníKO 3,70BTH 0,68SA 1,84GB 2,74DK 1,40KS 1,30KU 0,42ZA 1,84KD 0,68NZ 0,64Průměr induktory 1,28Procento induktory ke kontrole 34,60DiskusePoužití induktorů rezistence proti padlí travnímu na pšenici snížilo závažnost padlítravního od 34,60% (2010) do 53,93% v průměru s neošetřenou kontrolou. Efektivita termínůošetření kolísala s rokem pokusů a s typem induktoru. Byla potvrzena dlouhodobá účinnostprvního ošetření induktory v raných stádiích vývoje porostu pšenice ozimé, před nástupemzimy. V pokusech v roce 2010 je náznak úspěšného použití extraktů z netýkavky žláznaté akopřivy dvoudomé. Bude třeba dále prověřovat účinnost stávajících i dalších případnýchinduktorů rezistence a sledovat vliv počasí na závažnost padlí travního a na účinnostjednotlivých induktorů rezistence.PoděkováníTato práce byla finančně podpořena projektem Ministerstva zemědělství QH 72117.LiteraturaBrière S.C., Kushalappa A.C., Mather D.E. (1994): Screening for partial resistance to anisolate of crown rust (Puccinia recondita f.sp. avenae) race 264 in oat cultivarsand breeding lines. Can. J. Plant Pathol., 16: 4-55.Heil M., Ploss K. (2006): Induced resistance enzymes in wild plants-do „early birds“ escapefrom patogen attack? Naturwissenschften. DOI 10.1007/s00114-006-0129-7.Kombrink E., Schmelzer E. (2001): The hypersensitive response and its role in local andsystemic disease resistance. Eur. J. Plant Pathol., 107: 69-78.Saari E. E., Prescott J. M. (1975): A scale for appraising the foliar intensity of wheat diseases.Plant Dis. Rep. 59: 377-380.van Loon L. C. (1997): Induced resistence in plants and the role of pathogenesis-relatedproteins. Eur. J. Plant Pathol., 103: 753-765.Věchet L., Kocourek F. (1987): The effect of the time of treatment of Erysiphe graminis f.s.hordei and on it causes to spring barley. Ochrana Rostlin, 23: 117-124.16

Potenciální využití rostlin v indukované rezistenciŠerá, B.Ústav systémové biologie a ekologie AV ČR, Na Sádkách 7,České Budějovice, CZ-37005Stěžejním tématem společného výzkumu několika vědeckých institucí v rámci projektu“Biostimulátory a induktory rezistence biologického původu u obilovin a olejnin” bylo naléztinduktory rostlinného původu navozující systémově získanou rezistenci u pšenice seté a řepkyolejky. Na základě literární rešerše byly vytipovány druhy rostlin se specifickýmibiologickými a chemickými vlastnostmi, u kterých se předpokládal biochemický vliv na růstjiných rostlin. Testovány byly následující rostlinné druhy a jejich části.Dub letní (Quercus robur L.) - kůraDurman obecný (Datura stramonium L.) – nadzemní částJerlín japonský (Sophora japonica L.) - kůraKmín kořenný (Carum carvi L.) - plodyKopřiva dvoudomá (Urtica dioica L.) – nadzemní částKřídlatka japonská (Reynoutria japonica Houtt) - listKřídlatka sachalinská (Reynoutria sachalinensis (F. Schmidt) Nakai) - listKřídlatka x česká (Reynoutria x bohemica Chrtek at Chrtková) -listKurkuma dlouhá (Curcuma longe L.) – oddenek Netýkavka nedůtklivá (Impatiens nolitangereL.) – nadzemní částNetýkavka malokvětá (Impatiens parviflora DC.) – nadzemní částNetýkavka žláznatá (Impatiens glandulifera Royle) – nadzemní částŠalvěj lékařská (Salvia officinalis L.) – nadzemní částZázvor pravý (Zingiber officinale Roscoe) - oddenekPráce byla podpořena grantem NAZV č. QH72117 a výzkumným záměrem ÚSBE č.AV0Z60870520.17

Indukovaná rezistence k padlí travnímuBlumeria graminis f.sp. triticiHavelka, F. 1, 2 , Věchet, L. 22 VURV,v.v.i, OGŠKP, Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně,1 Česká zemědělská univerzita v Praze, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodníchzdrojů, Kamýcká 129, Praha 6 – Suchdol, 165 21,havelka@vurv.cz, vechet@vurv.czAbstraktV rámci testování biostimulátorů a induktorů k indukované rezistence u pšeniceTriticum aestivum L. byla zvolena odrůda Kanzler, standard, náchylný k padlí travnímu.K vlastnímu testování bylo vybráno čtrnáct látek, induktorů rezistence. Jedná se oinduktory jak živočišného původu, odpadu z jatek s odlišnou koncentrací dusíku,obsahem sušiny a přítomností enzymových, či neenzymových hydrolyzátů chromitýchpostružin a hydrolyzátů kolagenního materiálu, tak rostlinných produktů. Statistickyvýznamné účinnosti při inhibici jednotlivých infekčních fází vůči padlí travnímuprokázaly induktory netykavky žláznaté, glycin betain, křídlatky žláznaté etc.Klíčová slova: padlí travní; infekční struktury; induktory rezistence; odpady živočišnéhopůvoduÚvodPadlí travní Blumeria graminis f.sp. tritici patří mezi časté každoročni, tzv. biotrofnípatogeny pšenice i ostatních zástupců čeledi Graminea. Šíření padlí je uskutečňovánoasexuální cestou pomocí konidií unášených větrem /1/.Počáteční příznaky výskytu napadení se nejčastěji objevují na listové čepeli a pochvě veformě mycelia se sporami (konidie) /2/. Vývojové fáze padlí v období odnožování pšenice lzepozorovat, jako bělavé, mycelium. Změna barevnosti z bílé na šedohnědou, či béžovouprobíhá nejčastěji v době metání.Po ošetření stimulátory rezistence indukující obranné mechanizmy rostlin byly zjišťoványreakce v různých infekčních fázích: množství klíčících a neklíčících konidií, vliv induktorů na délky klíčků ve čtvrté hodině od inokulace, délku primárních a sekundárních hyf v sedmnácté a čtyřicáté osmé hodině.Získané údaje nám umožní rozšířit spektrum látek využitelných v integrované ochraněkulturních plodin.18

Materiál a MetodaU odrůdy Kanzler bylo, jako infekční inokulum zvoleno padlí travní Axminster s genemrezistence Pm1 získaný z oblasti Hadačka u Kralovic, Plzeň. Vybrané induktory rezistencebyly aplikovány na pšenici v květináčích ve stáří čtrnácti dní. Induktory pocházející zeživočišných odpadů byly značeny: vzorek A hydrolyzát kolagenního materiálu, obsah sušinymin.90%, dusík v sušině min. 17%.Vzorek B hydrolyzát enzymové hydrolýzy, sušina min.90%, dusík v suš. min. 14%. Vzorek C neenzymový hydrolyzát, sušina min. 90%, dusík 15%.Vzorek D enzymová hydrolýza, sušina max. 98%, dusík 16%. Sedm dní po ošetřenínásledovala inokulace čtrnácti denním padlím prostřednictvím sedimentační věže /3/. Ktestování účinnosti látek byla vybrána metoda listových segmentů umístěných nabenzothiadiazolovém agaru umístěných v plastových krabičkách.Monitoring infekčních fází probíhal pod mikroskopem ve 4 hod (klíčení konidií), 17 hod.(počátek tvorby apresoria a prim. hyf) a 48 hod. (tvorba sek. hyf) po inokulaciVýsledky a diskuseVe fázi čtvrté hodiny po počátku infekce bylo zjištěno:Tab.1InduktoryCelkemInfekčníchkonidií (%)4hodina infekceNeklíčící Klíčení Klíčení při tvorběapresoriaKontrola 75 25 68 1 6GB 7 93 7 0 0Netykavka 8,5 91,5 8 0,5 0Induktor C 12,5 87,5 12,5 0,5 0Křídlatka 18,5 81,5 18,5 0 0Kys. SA 20,5 79,5 20,5 0 0BTH 47,5 52,5 41,5 1,5 4,5Kopřiva 25 75 24,5 0 0,5Induktor A 26 74 12,5 2,5 11Kmín 26,5 73,5 24 2 0,5Jerlín 30 70 30 0 0Blín 33,5 66,5 33 0 0,5Kurkuma 40 60 40 0 0D 43 57 43 0 0Dubová kůra 47,5 52,5 41,5 4,5 1,5Šalvěj 50 50 50 0 0Zázvor 68,5 31,5 68,5 0 0B 78,5 21,5 49,5 12,5 16,5TvorbaapresoriaU vzorků ve čtvrté hodině po infekci statisticky významné inhibice vykázaly induktory GB:93 % neklíčících konidií, 7 % infekčních konidií. Impatiens glandulifera: 91,5% neklíčícíchkonidií, 8,5 % infekčních konidií. Induktor C: 87,5 % neklíčících konidií,12,5 % infekčních konidií.19

Reynoutria sachalinensis: 81,5 % neklíčících konidií, 18,5 % infekčních konidií. Neošetřenákontrola vykazovala za induktorem B druhého nejvyššího počtu klíčících konidií. viz. tab. 1.Lze tedy konstatovat, že výše jmenované induktory významně potlačují počátek infekční fáze,fázi klíčení konidie. Pozitivně tak přispívají k nižšímu listovému napadení v pozdější fázi.Ve fázi sedmnácté hodiny po počátku infekce bylo zjištěno:Tab. 217 hodina infekceInduktoryCelkemInfekčníchkonídií (%)Neklíčící Klíčící Klíčení přitvorběapresoriaTvorba ap.Tvorbaprim.hyfKmín 23,5 76,5 3,5 4,5 11,5 4 0Netykavka 27 73 7,5 6 12,5 1 0Induktor C 35 65 9,5 6,5 16 3 0Dubová kůra 47 53 5 11 20 11 0Blín 47,5 52,5 12 10,5 25 0 0Křídlatka 48,5 51,5 17 10,5 18,5 2,5 0Kurkuma 51 49 20 5 22,5 3,5 0Jerlín 56,5 43,5 11 19,5 20 6 0Šalvěj 63,5 36,5 20 10 25,5 4 4BTH 64 36 14,5 15,5 24,5 9,5 0Induktor A 65,5 34,5 16 12,5 28,5 8,5 0Zázvor 65,5 34,5 10,5 16 33 6 0Induktor B 73 27 13,5 19,5 38,5 1,5 0Induktor D 73 27 12,5 24 35,5 1 0Kys. SA 79 21 17,5 13,5 40 6,5 1,5Kopřiva 79,5 20,5 11 27 37,5 4 0Kontrola 87 13 12,5 40 32 2,5 0GB 89 11 8 29 39 13 0Tvorbasek.hyfV 17 h při tvorbě apresoria, primární hyfy nejlepších výsledků dosáhly:Carum carvi:76,5 % neklíčících konidií, 23,5 % infekčních konidií.Impatiens glandulifera: 73 % neklíčících konidií, 27 % neklíčících konidií.Induktor C:65% neklíčících konidií, 35 % neklíčících konidií.Hyoscyamus niger:52,5 % neklíčících konidií, 47,5 % neklíčících konidií.Testovaný induktor glycin betain vykázal vyššího počtu infekčních konidií 89%, kontrola 87%. Oproti předchozí fázi ve čtvrté hodině induktor GB neprokázal inhibiční účinky v 17hodině. Z předchozích výsledků je zřejmé, že účinnost induktoru glycin betainu leží převážněv počáteční fázi inhibice ve čtvrté hodině. 7 % výskyt klíčících konidií to jen potvrzuje.Sedmnáctá hodina, tak odkryla podstatu samotné efektivnostivýše jmenovaného induktoru i dalších, rozdílnou účinnost v iniciaci inhibice v pozdějšíchfází, jako např. tvorby apresoria a primárních hyf. viz. tab. 2.20

Naproti tomu induktory z netykavky žláznaté a křídlatky sachalinské prokázaly stabilníantifungální aktivitu v jednotlivých infekčních fází viz. tab. 1, 2.Ve fázi čtyřicáté osmé hodiny bylo zjištěno:Tab. 3InduktorCelkeminfekčních konídií(%)48 hodina infekceNeklíčícíKlíčícíKlíčenípři tvorběapresoriaTvorbaap.Tvorbaprim.hyfTvorbasekundárních hyfKřídlatka 20 80 18 0 0,5 0,5 1 1,5GB 25 75 3,5 5,5 7 6 3 9Jerlín 40 60 7,5 1 4,5 6 2 8Blín 43,5 56,5 11,5 7,5 15 8,5 1 9,5Kurkuma 45,5 54,5 18,5 4,5 15 6 1,5 7,5Dubová kůra 59,5 40,5 7 4 18 21 9,5 30,5Kopřiva 53 47 8,5 2 16,5 17 9 26Induktor B 62 38 9 8 18,5 6 20,5 26,5Kys. SA 63,5 36,5 11,5 4 16 9 23 32Induktor C 67 33 9 8,5 18,5 10 21 31Šalvěj 69,5 30,5 7,5 4,5 15,5 8,5 33,5 42Induktor A 69,5 30,5 15 10,5 18 14 12 26Kmín 73 27 14,5 6,5 19,5 11,5 21 32,5BTH 74,5 25,5 15 15 22,5 14,5 7,5 22Netykavka 77 23 4,5 5,5 21 23 23 46Induktor D 80 20 13 7 15,5 24,5 20 44,5Zázvor 80,5 19,5 11,5 5 12,5 13,5 38 51,5Kontrola 90,5 9,5 12,5 14 16 16,5 31,5 48Uvedené výsledky 48h charakterizovány typickou tvorbou primárních a sekundárních hyfpoodkryly vliv jednotlivých induktorů v čase. Statisticky významných výsledků bylodosaženo: Reynoutria sachalinensis: 80 % neklíčících konidií, 20 % infekčních konidií.GB:75 % neklíčících konidií, 25 % infekčních konidií.Sophora japonica:60 % neklíčících konidií, 40 % infekčních konidií.Hyoscyamus niger:56,5 % neklíčících konidií, 43,5 % infekčních konidií.Komerční přípravek glycin betain prokázal schopnost indukovat obranné mechanismyrostliny, jak ve 4 h, tak samotný přechod z primárních hyf na konečnou fázi tvorbysekundárních hyf, nikoliv však zabránit přeměnu apresoria v primární hyfu v 17 h.Povzbudivých výsledků bylo dosaženo u rostlinných induktorů křídlatky sachalinské, jerlínujaponského a překvapivě i u blínu. Induktory pocházející z živočišných odpadů dosáhlyprůměrných, až podprůměrných výsledků ve 48 h. Vysoké zastoupení dusíku v induktorechA,B,C,D je možnou příčinou možné iniciace rozvoje choroby padlí travního a jednotlivýchfází, nikoliv jejich inhibice viz tab. 3.Celkemprimárních asekundárních hyf21

Tab. 4 Vlivu induktorů na délku infekčních vlákenInduktor Délka klíčku(μm) Délka primární hyfy (μm) Délka sekundární hyfy (μm)A 15,5 22,9 52,75B 17,1 29 219,3C 6,9 28,45 127,15D 17,9 25,85 110,5Blín 9,1 21,7 69,9BTH 17,5 20,45 72,1Dubová kůra 9,75 26,5 100,9GB 15,5 31,3 151,23Jerlín 4,45 22,3 97,7Kopřiva 8,5 29,5 97,7Kmín 6,7 27,1 52,9Kurkuma 7,4 32,5 148,5Křídlatka 17,3 22,3 84,9Netykavka 4,2 31,3 129,7SA 4,6 27,7 190,5Šalvěj 5 29,5 212,9Zázvor 11,7 31,3 200,1Kontrola 15,5 31,3 193,7Vliv induktoru iniciovat rezistenci vůči padlí travnímu, tak jeho vlivu na délku infekčníchstruktur byl pozorován u řady testovaných látek s potenciálním využitím při indukovanérezistenci a naopak. Výše zmiňované induktory živočišného původu vykazovaly jednyz nejvyšších hodnot délek infekčních vláken. Přesahující hodnotu 10 (μm) u délky klíčkukonidie ve 4 h. Netykavka žlánatá statisticky významnou měrou inhibovala iniciaci délkyklíčku s délkou 4,2 (μm) viz. tab. 4. Naproti tomu křídlatka, účinný induktor stimulovalaklíček konidie k délce dosahující 17,3 (μm), spolu s dalšími induktory, jako např. BTH 17,5(μm) nebo glycin betain 15,5 (μm), které rovněž významnou měrou přesáhly nejnižšínaměřenou délku klíčku konidie s kontrolou 15,5 (μm). Obdobné výsledky bylyzaznamenány, jak při tvorbě primární hyfy, tak sekundární hyfy v 17 a 48h. Důležitéhoukazatele účinnosti induktoru vůči padlí travnímu. Nejnižší délky u sekundárních hyfvykazoval překvapivě induktor A 52,7 (μm), u kterého jsme nepředpokládaly výše zmiňovanévýsledky. Na základě již citovaného předpokladu vlivu obsahu dusíku i výsledkům ostatníchinduktorů B, C, D s délkou přesahující 100 (μm) viz. tab. 4.Kmín spolu s blínem zaznamenaly druhé a třetí nejnižší délky sekundárních hyf 52,9 a 69,9(μm) oproti kontrole 193,7(μm). Pozitivní vliv induktoru a samotný princip účinku na délkuinfekčních vláken nelze spolehlivě ze zjištěných dat potvrdit ani vyvrátit.Lze se domnívat, že se jedná o spíše kladný vedlejší efekt inhibice rozvoje a přechodujednotlivých infekčních fází.22

HodnoceníPoužité induktory naznačily jejich možné využití pro posílení obranných schopnostípšenice proti padlí travnímu. Bude ale nutné v tomto výzkumu dále pokračovat.PoděkováníTato práce byla finančně podpořena projektem Ministerstva zemědělství QH 72117.Literatura/1/ Daayf F. et al. (1995): The effects of plant extracts of Reynoutria sachalinensis onpowdery mildew development and leaf physiology of long english cucumber. Plantdinase. 79, no. 6: 577-580./2/ Garcion C. et al. (2007): Mechanism of defence to pathogens: biochemistry andphysiology. In: Walters D. et al. Induced resistance for plant disease control: Asustainable approach to crop protection. Oxford: Blackwell Publishing. 109-132./3/ Yamaoka N., Matsumoto I., Nishiguchi M. (2006),: The role of primary germ tubes (PGT)in the life cycle of Blumeria graminis: The stopping of PGT elongation is necessaryfor the triggering of appressorial germ tube (AGT) emergence. Physiological andmolecular plant pathology. 69, is. 4-6, 153-159./4/ Sarah E. P., Green R. J. (2001): Infection structures of biotrophic and hemibiotrophicfungal plant pathogens. Molecular plant pathology, vol.2, is. 2, 101–108./5. Carver T. L.W, Roberts P. C., Thomas B. J., Lyngkaer M. F. (2001): Inhibition ofBlumeria graminis germination and germling development within colonies of oatmildew. Physiological and molecular plant pathology, 58: 209-228.23

Využití indukované rezistence u řepky proti významným patogenůmBurketová, L. 1 , Špácová, M. 2 , Šašek, V. 1,3 a Valentová, O. 21 – Ústav experimentální botaniky AV ČR, Laboratoř patofyziologie, Praha2 – Vysoká škola chemicko-technologická, Fakulta potravinářské a biochemické technologie,Ústav biochemie a mikrobiologie, Praha3 – Česká zemědělská univerzita, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů,PrahalAbstraktMožnost využití indukované rezistence u řepky proti houbovým patogenům Leptosphaeriamaculans, původci fomové hniloby řepky, a Sclerotinia sclerotiorum, původci hlízenky bylasledována v v laboratorních podmínkách. Byly testovány jednak chemické induktory, jejichžúčinnost byla prokázána v jiných patosystémech, hydrolyzáty kolagenu a elicitoryprodukované L. maculans do kultivačního média. V inokulačních testech bylo zjištěno, žek oběma patogenům lze indukovat rezistenci chemickými induktory, v případě L. maculansbyly také účinné separované elicitory a hydrolyzáty kolagenu.Klíčová slova: Leptosphaeria maculans, Sclerotinia sclerotiorum, fomová hniloba, hlízenka,indukovaná rezistence, elicitor, hydrolyzáty kolagenu.ÚvodTrendem současného moderního zemědělství je snižovat vstupy cizorodých látek,které přecházejí do potravního řetězce. Vzhledem k tomu, že jsou hlavním zástupcem skupinytěchto nebezpečných látek pesticidy, je žádoucí věnovat pozornost alternativním metodámochrany rostlin. U řady patosystémů byla prokázána úspěšnost tzv. indukované rezistence.Jedná se o přístup, který využívá vlastního obranného potenciálu rostliny, kterým je rostlinavybavena. O tom, jestli se rostlina patogenu ubrání, rozhoduje rychlost, jakou je patogenrozpoznán a zda jsou bezprostředně aktivovány obranné arzenály napadené rostliny.Indukovaná rezistence využívá strategie přípravy rostliny na infekci ještě před výskytempatogena v porostu a to buď přímou aktivací obranných genů a tím spuštěním syntézyobranných proteinů a toxických sekundárních metabolitů, nebo určitým zcitlivěním rostliny,která na patogenní organismus reaguje mnohem rychleji než normálně (Chester 1933, Walterset al. 2005, Conrath 2006). K tomuto účelu lze využít látky produkované patogenem, složkyjeho buněčných stěn (Angelova et al. 2006), ale také signální látky, které se v rostlinách porozpoznání patogena syntetizují a signalizují napadení i v částech rostliny vzdálených odmísta napadení. Mezi tyto látky patří především rostlinné hormony, jejichž role bylaprokázána při obranné odezvě k různým typům patogenů.Cílem naší práce bylo nalézt látky indukující rezistenci k významným patogenůmřepky a popsat mechanismus jejich účinku. Zaměřili jsme se proto na houbové patogenyLeptosphaeria maculans, způsobující na řepce fómovou hnilobu, a Sclerotinia sclerotiorum,původce hlízenky obecné. L. maculans je hemibiotrofní patogen. Po infekci rostlinaskosporami brzy na podzim kolonizuje mezibuněčné prostory hostitele téměř bez příznakůchoroby. V pozdější fázi vegetace přechází v nekrotrofní stádium, na stonku se objevují léze adochází k trouchnivění bazální části stonku. Patogen dále přežívá na kořenovém krčkuodumřelé rostliny, kde dochází i k pohlavnímu rozmnožování (Howlett et al. 2001). Díkyněmu je L. maculans patogen s obrovským evolučním potenciálem a velmi rychle překonává24

monogenně založenou rezistenci získanou především introdukcí genů rezistence z druhuBrassica rapa (Rouxel a Balesdent 2005). S. sclerotiorum je nekrotrofní patogen, kterývyvolává nekrózy stonku a listů. Mrtvé pletivo je pak pro patogena zdrojem živin a umožňujemu dokončit jeho vývojový cyklus. V našich experimentech jsme jednak sledovali, které zeznámých signálních drah se obranné odezvy účastní a dále se pokusili nalézt induktory aelicitory rezistence vůči těmto patogenů.Materiál a metodyRostliny řepky olejky (odrůda Columbus) byly pěstovány hydroponicky za řízenýchpodmínek v kultivačním boxu (fotoperioda 16/8h; 22/18°C). Ve stáří 14 dnů byly ošetřenypostřikem induktory a elicitory. Jako chemické induktory rezistence byly použity látky seznámým účinkem u jiných patosystémů: benzothiadiazol (BTH) – 30 µM, kyselina salicylová(SA) – 3 mM, kyselina β- aminomáselná (BABA) – 10 mM, riboflavin – 1 mM, menadionbisulfit sodný (MSB) - 200 µM. Zdrojem elicitorů bylo kultivační médium L. maculans izolátJN2. Segmenty mycelia pěstovaného na zpevněném médiu V8 byly vloženy do tekutéhomédia Fries (Férézou et al. 1977) a kultivovány 14 dní ve tmě za stálého třepání (100 ot./min).Kultivační médium bylo poté odděleno od mycelia filtrací, dialyzováno proti vodě (cut offdialyzační membrány 8 kDa) a použito pro aplikaci na rostliny. Dále byly použity hydrolyzátykolagenu HCu, C1, C2 a K1 z UTB Zlín.72h po aplikaci induktorů a elicitorů byly děložní listy inokulovány suspensí konidií L.maculans izolátem JN2 (10 7 /ml), po dvou týdnech skenovány a velikost lézí stanovena nazákladě obrazové analýzy pomocí programu DPlan4Lab. Kontrolní rostliny byly ošetřenyvodou a kultivačním médiem bez L. maculans. Pro hodnocení rezistence k S. sclerotiorumbyly pravé listy řepky inokulovány připevněním terčíku mycelia o průměru 5 mm na adaxiálnístranu listu. Rostliny byly poté udržovány téměř ve 100 % vlhkosti vzduchu. 24 h poinokulaci byly listy skenovány a velikost lézí kvantifikována pomocí programu DPlan4Lab.Výsledky a diskuseÚčinnost indukované rezistence byla potvrzena u řady patosystémů, ale jednalo se převážně obiotrofy, tj. patogeny, kteří jsou závislí na metabolismu hostitelské rostliny a proto hostitelskébuňky neusmrcují. Pokud jde o patogeny s jiným životním stylem, je literárních údajůposkrovnu. V našich experimentech jsme hodnotili účinek látek, které byly dříve popsányjako induktory rezistence proti jiným patogenům. Děložní listy řepky byly ošetřeny induktorya s odstupem 72h inokulovány konidiální suspensí L. maculans, nebo byly pravé listyinokulovány terčíky mycelia S. sclerotiorum.Výsledky inokulačních testů (Obr. 1) potvrdily, že známé induktory rezistence BTH aSA vyvolávají rezistenci i v patosystému řepka - L. maculans v děložních listech. NaopakMSB, který byl dříve popsán jako účinný induktor rezistence k tomuto patogenu (Borges etal. 2003) elicitační účinek v našich experimentech neprokázal. Vzhledem k tomu, že patogeniprodukují řadu látek, které mají usnadnit patogenezi a současně v rostlině spouštějí obrannéreakce, analyzovali jsme látky produkované L. maculans do kultivačního média a hodnotilijejich schopnost indukovat rezistenci pomocí inokulačního testu. Protože L. maculansprodukuje do média i řadu nízkomolekulárních metabolitů včetně toxinů, které není možnéaplikovat na rostliny jako elicitor vzhledem k jejich vysoké fytotoxicitě, byly tyto látkynejprve odstraněny pomocí dialýzy. Výchozí filtrát kultivačního média a nízkomolekulárnífrakce výchozího filtrátu získaná při dialýze musely být 10x zředěny, aby je bylo možnék aplikaci na rostliny použít. Samotné kultivační médium bez L. maculans, které sloužilo jako25

kontrola, bylo zpracováno stejným způsobem. Z dosažených výsledků vyplývá, že výchozífiltrát kultivačního média L. maculans, stejně jako jeho vysokomolekulární (>8 kDa) anízkomolekulární ( 8 kDaL.m. > 8 kDaL.m. < 8 kDaObr.1. Vliv induktorů a elicitorů na retardaci růstu L. maculans v děložních listech řepky cv.Columbus. Induktory: BTH – benzothiadiazol (30 µM), SA - kyselina salicylová (3 mM), BABA -kyselina β- aminomáselná (10 mM), riboflavin (1 mM), MSB - menadion bisulfit sodný (200 µM);elicitory: médium - kultivační médium (kontrola), L.m. filtrát – filtrát kultivačního média po kultivaciL. maculans, a dále frakce nad a pod 8 kDa připravené dialýzou média, resp. filtrátu kultury L.maculans. Chybové úsečky značí interval spolehlivost.Při hledání dalších možných induktorů rezistence řepky k fomové hnilobě byly také testoványodpady kožedělného průmyslu a použity jak hydrolyzované postružiny, tak hydrolyzátyčistého kolagenu. Po jeich aplikaci na rostliny a následné inokulaci L. maculans jsme zjistilivýznamné snížení rozsahu nekrotických lézí na děložních listech (Obr. 2). Z tohoto výsledkulze usuzovat na perspektivní využití tohoto odpadu v ochraně rostlin.Obr. 2. Účinek hydrolyzátů kolagenu na rozvojpříznaků způsobených L. maculans. Rostlinybyly ošetřeny hydrolyzáty HCu. Kontrolnírostliny byly ošetřeny vodou. BTH - pozitivníkontrola benzothiadiazol. Chybové úsečkypředstavují střední chybu průměru. Hodnotyprůkazně se lišící od kontroly (voda) na základěnepárového t-testu jsou označeny * (p < 0,05) a** (p < 0,01).Experimenty s patogenem S. sclerotiorum demonstrovaly, že rezistenci lze indukovat ik nekrotrofním patogenům. Jako induktorů lze využít látky aktivující dráhu SA (tj. SA, BTH)i JA (MeJA) a ethylen (ACC) (Obr. 3).26

Obr. 3. Indukce rezistence k hlízence(Sclerotinia sclerotiorum) pomocíchemických induktorů. Plochanekrotických lézí 24h po inokulaci.Kontrola- ošetření vodou, ACC(prekursor ethylenu), BTH –benzothiadiazol, SA – kyselinasalicylová,DMSO-dimethylsulfoxid,MeJa – methyljasmonát.Naše výsledky nasvědčují možnosti uplatnění indukované rezistence v ochraně řepky protioběma studovaným patogenům.PoděkováníTato práce vznikla díky projektům MZe - NAZV QH72117 a QH81201.Použitá literaturaAngelova, Z., Georgiev, S., Roos, W. (2006): Elicitation of plants. Biotechnology andbiotechnological Equipment 20: 72-83.Borges, A. A., Cools, H. J., Lucas, J. A. (2003): Menadione sodium bisulphite: a novel plantdefence activator which enhances local and systemic resistance to infection byLeptosphaeria maculans in oilseed rape. Plant Pathol. 52: 429-436.Conrath, U. (2006): Priming: Getting Ready for Battle. Molecular Plant-MicrobeInteractions 19: 1062-1071Fitt B.D.L. et al. 1997. Prospects for developing aforecasting scheme to optimise use of fungicides for disease control on winteroilseed rape in the UK. Aspects of Applied Biology 48: 135–42.Chester, K. S. (1933): The Problem of Acquired Physiological Immunity in Plants. TheQuarterly Review of Biology 8: 275-324.Férézou, J. P., Riche, C., Quesneau-Thierry, A., Pascard-Billy, C., Barbier, M., Bousquet, J.F., Boudart, G. (1977): Structures de deux toxines isolées des cultures duchampignon Phoma lingam Tode: La sirodesmine PL et la desacetylsiradesmin PL.Journal de Chimie 1: 327-334.Howlett, B. J., Idnurm, A., Pedras, M. S. C. (2001): Leptosphaeria maculans, the CausalAgent of Blackleg Disease of Brassicas. Fungal Genetics and Biology 33: 1-14.Rouxel, T., Balesdent, M. H. 2005. The stem canker (blackleg) fungus, Leptosphaeriamaculans, enters the genomic era. Molecular Plant Pathology 6: 225-241.Walters, D., Newton, A. and Lyon, G. (2005): Induced resistance: helping plants to helpthemselves. Biologist 52: 28-33.27