Metodika kultivace a multiplikace česneku v podmínkách in vitro

Metodika kultivace a multiplikace česneku v podmínkáchin vitroBřetislav Křižan, Eva Ondrušiková, Martina Kudělková, Jana Krajíčková,Lenka Wasserbauerová, Kateřina Smékalová, Karel DušekCERTIFIKOVANÁ METODIKAMendelova univerzita v Brně, Zahradnická fakultaVýzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o.Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.2010

Autorský kolektiv:Ing. Břetislav Křižan, Ph.D.Ing. Eva Ondrušiková, CSc.Ing. Martina KudělkováIng. Lenka WasserbauerováMgr. Jana KrajíčkováIng. Kateřina Smékalová, Ph.D.Ing. Karel Dušek, CSc.© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2010ISBN:2

Název: Metodika kultivace a multiplikace česneku v podmínkách in vitroAutoři: Vypracoval kolektiv autorů pod vedením Ing. Břetislava Křižana, Ph.D.Ing. Břetislav Křižan, Ph.D., Ing. Eva Ondrušíková, CSc., Ing. MartinaKudělková - Mendelova univerzita v Brně, Zahradnická fakultaIng. Lenka Wasserbauerová, Mgr. Jana Krajíčková - Výzkumný ústavbramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o.Ing. Kateřina Smékalová, Ph.D., Ing. Karel Dušek, CSc. -Výzkumnýústav rostlinné výroby, v.v.i., Oddělení zelenin a speciálních plodinOlomoucVydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.Tisk: MediaDIDA s.r.o., OlomoucVyšlo v roce: 2010Vydáno bez jazykové úpravy.Kontakt na vedoucího autorského kolektivu: bretislav.krizan@seznam.czOponenti: Ing. Jaroslav Rod, CSc., Česká společnost rostlinolékařskáIng. Ivan Branžovský, CSc., MZe PrahaAutoři fotografií: Břetislav Křižan, Martina KudělkováFotografie na úvodní straně: Multiplikace rostliny česneku kultivovanéz meristémů, autorka Martina KudělkováDedikace:Metodika vznikla za finanční podpory Ministerstva zemědělství a jevýstupem řešení projektu NAZV QH 71228 s názvem „Ozdravenídomácích genotypů česneku za účelem jejich uchování metodoukryokonzervace“. Doba řešení 1.5.2007 – 31.12.2011© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2010ISBN:3

Metodika kultivace a multiplikace česnekuv podmínkách in vitroBřetislav Křižan, Eva Ondrušiková, Martina Kudělková, Jana Krajíčková,Lenka Wasserbauerová, Kateřina Smékalová, Karel DušekCERTIFIKOVANÁ METODIKAMendelova univerzita v Brně, Zahradnická fakultaVýzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o.Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.20105

Obsah 6Úvod 71 CÍL METODIKY 102 METODICKÝ POSTUP KULTIVACE A MULTIPLI-KACE ČESNEKU V PODMÍNKÁCH IN VITRO 102.1 Vybavení a chemikálie potřebné k in vitro množení 102.2 Příprava zásobních roztoků 112.3 Příprava kultivačního média 122.4 Založení kultur a kultivační podmínky 152.5 Převod rostlin do nesterilních podmínek 162.6 Závěr 173 SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPŮ 184 POPIS UPLATNĚNÍ CERTIFIKOVANÉ METODIKY 195 EKONOMICKÉ ASPEKTY 196 SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY 207 SEZNAM PUBLIKACÍ, KTRÉ PŘEDCHÁZELYMETODICE 228 PŘÍLOHY 246

Seznam zkratekBA (BAP) - 6-benzylaminopurinBDS - kultivační médium (Dunstan a Short, 1978)EDTA - kyselina etylendiamintetraoctováGA 3 - kyselina giberelováIAA - kyselina indolyl-3-octováIBA - kyselina indolyl-3-máselnáJA - kyselina jasmonováKIN - kinetinMENDELU - Mendelova univerzita v BrněMS - kultivační médium (Murashige a Skoog, 1962)MZe - Ministerstvo zemědělstviNAA - kyselina 1naftyloctováNAZV - Národní agentura pro zemědělský výzkumTDZ - thidiazuronÚvodČesnek kuchyňský (Allium sativum) patří k nejstarším kulturnímplodinám, které provázejí lidstvo již od dávných dob. Je ceněn jakozelenina, koření, ale také jako léčivá rostlina pro své antibiotické účinky.V podmínkách České republiky se rostliny česneku množí pouzevegetativně. Při tomto způsobu množení však snadno dochází k přenosuvirových chorob, a proto bývají rostliny česneku ozdravovány od virův laboratorních podmínkách. Výsledkem ozdravování je rostlinkapěstovaná v in vitro podmínkách, kterou je následně potřeba namnožit.Předkládaná metodika se nezabývá procesem ozdravování, ale klade si zacíl zvýšení multiplikačního koeficientu ozdravených rostlin česneku.Množení rostlin v in vitro podmínkách (mikropropagace) znamenávelké možnosti pro celou řadu druhů rostlin. Množení není závislé napočasí, rostliny jsou uniformní a touto metodou lze bez rizik množit iozdravený materiál, protože při dodržení správného postupu nemůže běhemmnožení dojít k opětovnému nakažení patogeny. Dosud byla popsána invitro kultivace u zhruba 500 druhů rostlin.Některé rostlinné druhy, mezi něž patří i česnek, se však při tomtozpůsobu pěstování a množení chovají značně specificky a jejichmikropropagace je obtížná. Tyto problémy jsou zpravidla způsobenyslabými reakcemi rostlin na dodané regulátory růstu. Rostliny domácíchgenotypů česneku byly ozdraveny v rámci projektu NAZV QH 71228s názvem „Ozdravení domácích genotypů česneku za účelem jejichuchování metodou kryokonzervace“. Jak název projektu napovídá, pro7

uchování tohoto cenného, pracně ozdraveného materiálu, byla vybrána a jeexperimentálně ověřována metoda kryokonzervace.Protože výsledkem ozdravení bývá zpravidla jen několik zdravýchrostlin (z důvodu pracnosti odběru meristémů, úhynu rostlin a finančnínákladnosti testů), je potřeba tento materiál nejprve namnožit (např. prokryokonzervaci je potřeba minimálně 160 rostlin od genotypu). Jesamozřejmě možné převézt do půdy rostliny ihned po jejich ozdravení adále je pak množit konvenčním způsobem v technické izolaci, ale z důvoduztrát během převodu a možnostem reinfekce není tento postup používán.Třetím rokem utvoří rostliny dělené cibule.Další možnou cestou namnožení ozdraveného materiálu jemikropropagace. Ačkoliv velmi záleží na množeném genotypu, lze obecněříci, že při použití zde publikovaného metodického postupu lze dosáhnoutrychlejšího namnožení rostlin za období jednoho roku.Metoda mikropropagace rostlin česneku už byla popsána pro některé(zvláště asijské) genotypy v pracích např.: (Abo El-Nil, 1977; Bhojwani,1980; Nagasawa, Finer, 1988, Moriconi et at., 1990; Nagakubo et al.,1993; Seabrook, 1994; Mohamed-Yassen et al., 1995; Haque et al., 1997;Ayabe, Sumi, 1998; Myers, Simon, 1998, 1999.) Vždy však záleží napoužitém genotypu. Informace o množení českých genotypů česnekuudržovaných v Genové bance v Olomouci obsahuje tato metodika.Metodika se na základě provedeného výzkumu jednotlivých postupůmnožení detailně zabývá složením živných médií a jejich přípravou,úpravou hormonální složky médií, kultivačními podmínkami a konečněpřevodem namnožených rostlin do nesterilních podmínek.Princip známých metod množení česneku v laboratorních podmínkách:Mechanické zásahyMechanickými zásahy označujeme pro účel množení většinou půlenía čtvrcení rostlin kultivovaných v podmínkách in vitro. Úspěšnost tétometody závisí na použitém genotypu. Prakticky je kultivovaná rostlinazakrácena na 2 cm a jsou odstraněny kořeny. Ze spodní strany podpučí jsourostliny nařezávány cca 2 mm hlubokým řezem na dvě poloviny, popř. načtvrtiny. Všechny části rostliny drží v celku, nejedná se o odříznutí žádnéčásti, a rostlina je dále kultivována ve zkumavce s médiem. Reakcegenotypů je velmi rozílná. Výsledkem bývají jak 4 výchozí rostliny (učtvrcení) tak velmi často úhyn materiálu. Praktický význam má tato metodapouze u velmi problematicky množitelných genotypů. Multiplikacev průměru dosahuje poměru 1:1,5.8

„Stem-disc dome culture“ - metoda stonkových diskůPodle Ayabe a Sumiho (1998) je možno množit česnek ze struktury„Stem - disc dome“ což je prakticky 2 mm tenký plátek obsahujícímeristém a svrchní část podpučí. Z jednoho „Stem-Disc“ segmentuvyrůstalo na médiu LS (Linsmaier, Skoog, 1965) dvacet až třicet novýchvýhonků. Stonkové disky se jeví jako explantáty s vysokým multiplikačnímpotenciálem. Více jak 90 % výhonků takto vzniklých, formovalo cibulky.Metoda byla vyvinuta na japonském genotypu Fukuchi-Howaito.Kultivace kořenůHaque et al., (2000) použili jako primární explantát při multiplikacikořeny. Povrchově desinfikované stroužky byly nejprve kultivovány 15 dníve zkumavkách na směsi destilované vody a 0,7 % agaru. Poté bylyodebrány kořenové špčky velkosti 2 mm a dále kultivovány na MS médius růstovými regulátory 2,2 mg.l -1 BA a 0,2 mg.l -1 NAA. Procentoexplantátů, které vytvořily výhonky, bylo v závislosti na odrůdě v rozmezí7,9 - 95, 2 %. Formování cibulek bylo zjevné u všech odrůd, ale značně selišily velikostí. Kultivovány byly odrůdy „Bangladesh local“ a „Whiteroppen“. Odrůda ´White roppen´, u které se multiplikace dařila nejvíce,byla následně převedena do podmínek ex vitro.Somatická embryogenezeJedná se o metodu, při které vzniká jedinec nepřímo (je spojenas předchozí tvorbou kalusu), z diploidní somatické buňky - vznik embryaz jiných buněk než zygot (Procházka et al., 2003). Explantátem (izolovanáčást z celistvého organismu) pro kultivaci in vitro mohou vegetativní agenerativní orgány, protoplasty, buňky a pletiva (Procházka et al., 2003;Šebánek, Sladký, 1988). Obecně platí, že mladá pletiva, u kterých probíháaktivní dělení, jsou pro embryogenezi vhodnější (Novák, 1990). U česnekubývají používány kořenové a listové explantáty (Havránek, 2005).Fereol et al., (2002) použil jako explantáty mladé vnitřní listyv bazální části rosliny z desinfikovaných stroužků. Byly vybrány česnekyvzniklé izolací meristému. Byly uloženy po dobu 4-5 měsíců od sklizně při15 °C, a převedeny na 3 týdny do 5 °C, aby překonaly dormanci. Listovéexplantáty vytvářely kalusové kultury a ty poté sloužily pro somatickouembryogenezi.Somatická embryogeneze ja také popsána v pracích Fereol et al.,(2005 a, b) a Mukhopadhyay et al., (2004).9

Fereol et al., (2002) použili jako explantáty pro somatickouembryogenezi kořeny i mladé listy. Produkce kalusu byla pozorována nakořenech i na mladých listech, ale u listů se projevil vyšší potenciál proembryogenezi. Až 75 % vzniklých kalusů diferencovalo somatická embrya.30 % z těchto embryí bylo převedeno do nesterilních podmínek. Rostlinytvořily výhony i kořeny.Somatická embryogeneze, jako velmi účinná metoda množení, kteráje některými autory doporučována, není vhodná pro množení ozdravenýchgenotypů k uchování v genových bankách, neboť je zde vysoké rizikosomaklonální variability.1 Cíl metodikyCílem předkládané „Metodiky kultivace a multiplikace česnekuv podmínkách in vitro“ je zveřejnit metodický postup, podle kterého jemožno genotypy česneku namnožit v laboratorních podmínkách.Zpřehlednit dostupné informace týkající se množení česneku a označitpostupy, které jsou při multiplikaci českých genotypů účinné. K in vitromnožení bývají použity zpravidla ozdravené genotypy česneku, které jepotřeba rychle rozmnožit k dalším činnostem, ať jde již o uchovávání, čidalší množení.2 Metodický postup kultivace a multiplikace česnekuv podmínkách in vitro2.1 Vybavení a chemikálie potřebné k in vitro množeníPřístrojové zabezpečeníChemická laboratoř a přípravna roztokůLaboratoř vybavená pro práci s in vitro kulturamiChladnička (+ 4 °C)Mraznička (-20 °C)AutoklávpH-metrLaboratorní váhyTermostatDestilační (popř. demineralizační) přístrojStudený skleníkTechnický izolát10

MateriálLaboratorní skloPěstební kontejneryPěstební rašelinové substrátyHnojiva (makro a mikroprvky)Skalpely, pinzety, očkovací jehlyChemikálieChemikálie pro in vitro množení:NH 4 NO 3 , KNO 3 , MgSO 4 · 7H 2 O, KH 2 PO 4 , CaCl 2 · 2H 2 O, FeSO 4 · 7H 2 O,Na 2 EDTA · 2H 2 O, MnSO 4 · H 2 O, ZnSO 4 · 7H 2 O, Na 2 MoO 4 · 2H 2 O,CuSO 4 · 5 H 2 O, H 3 BO 3 , KI, CoCl 2 · 6H 2 O, AlCl 3 · 6H 2 O, sacharóza, agar(B & V commercial agar S 1000, Itálie), BAP, GA 3 , NAA, thiamin,kyselina nikotinová, glycin, myo-inositol, HgCl 2 , etanol, NaOH, KOH.Přípravky ochrany rostlin a pomocné látky:Ridomil Gold Plus 42,5 WP (metalaxyl M + oxichlorid mědi)Rovral Flo (iprodione)Karben Flo Stefes (carbendazim)Silwet 77 (heptamethyltrisiloxan)Savo (5 % chlornan sodný)2.2 Příprava zásobních roztokůZásobní roztokyZásobní roztoky usnadňují celkový postup přípravy médií. Rozdělením najednotlivé roztoky je zabráněno vzájemnému vysrážení některých solí, cožznačně komplikuje příjem živin rostlinou. Každou chemikálii rozpustímezvlášť a teprve po úplném rozpuštění jednotlivých chemikálií v destilovanévodě smícháme vzniklé dílčí roztoky dle níže uvedeného pořadí a doplnímedestilovanou vodou na požadovaný objem. K přípravě kultivačního médiaMS použijeme následující zásobní roztoky:MakroelementyRoztok připravíme 20krát koncentrovaný (tj. na 20 l média). K přípravěpoužijeme 1000 ml odměrnou baňku. Navážíme: 33,00 g NH 4 NO 3 ; 38,00 gKNO 3 ; 7,40 g MgSO 4 · 7H 2 O a 3,40 g KH 2 PO 4 . Roztoku dávkujeme 50 mldo 1 l připravovaného média.11

Roztok chloridu vápenatéhoRoztok připravíme 50krát koncentrovaný (tj. na 50 l média). K přípravěpoužijeme 500 ml odměrnou baňku. Navážíme: 22,00 g CaCl 2 · 2H 2 O.Roztoku dávkujeme 10 ml do 1 l připravovaného média.MikroelementyRoztok připravíme 50krát koncentrovaný (tj. na 50 l média). K přípravěpoužijeme 250 ml odměrnou baňku. Navážíme: 845,00 mg MnSO 4 · H 2 O;430,00 mg ZnSO 4 · 7H 2 O; 310,00 mg H 3 BO 3 ; 41,50 mg KI; 12,50 mgNa 2 MoO 4 · 2H 2 O; 1,25 mg CuSO 4 · 5H 2 O; 1,25 mg CoCl 2 · 6H 2 O a 1,25mg AlCl 2 · 6H 2 O. Roztoku dávkujeme 5 ml do 1 l připravovaného média.VitamínyRoztok připravíme 25krát koncentrovaný (tj. na 25 l média). K přípravěpoužijeme 250 ml odměrnou baňku. Navážíme: 10,00 mg thiaminu, 50,00mg pyridoxinu; 50,00 mg kyseliny nikotinové a 200,00 mg glycinu.Roztoku dávkujeme 10 ml do 1 l připravovaného média.Roztoky růstových regulátorůRoztoky připravíme do 50 ml odměrných baněk. Koncentrace roztoku BAPje 1 mg.ml -1 . V případě kyselin NAA a GA 3 připravíme roztoky roztoky okoncentraci 0,1 mg . ml -1 . BAP a NAA rozpustíme napřed v malémmnožství 5 % NaOH a doplníme destilovanou vodou na požadovanýobjem. GA 3 je nutno napřed rozpustit v malém množství etanolu a pakdoplnit destilovanou vodou na požadovaný objem.Všechny zásobní roztoky skladujeme v temnu v ledničce při teplotě 4 °C.Roztoky makroelementů, mikroelementů a roztok chloridu vápenatého lzetakto skladovat až 1 rok, roztok vitamínů a roztoky regulátorů růstumaximálně 2 měsíce. Potom je nutno připravit roztoky čerstvé.2.3 Příprava kultivačního médiaPrvním krokem při přípravě média je dokonalé rozvaření agaru(v jedné čtvrtině celkového objemu média). Do rozvařeného agarupostupně přidáváme zásobní roztoky v pořadí: makroelementy, roztokdihydrátu chloridu vápenatého, mikroelementy, vitamíny, fytohormony.Vždy pečlivě zamícháme. Dále přidáme navážený FeSO 4 · 7H 2 O,Na 2 EDTA · 2H 2 O, myo-inositol a sacharózu. Tyto složky médií včetněvšech regulátorů růstu přidáváme před sterilizací autoklávováním. Pouzev případě médií pro chemoterapii přidáváme ribavirin do již sterilního12

média filtrací. pH upravíme 5 % vodným roztokem NaOH na hodnotystanovené v tabulce 1. Médium sterilizujeme párou v autoklávu 25 minutpři teplotě 120 o C a přetlaku 100 kPa.Tabulka 1.: Složení kultivačních médií C1, C2 a C3 (Modifikované MS)ZaloženíkulturMultiplikacekulturZmnožovánícibulekSložka (mg · l -1 )C1 C2 C3NH 4 NO 3 1 650 1 650 1 650KNO 3 1 900 1 900 1 900MgSO 4 · 7H 2 O 370 370 370KH 2 PO 4 170 170 170CaCl 2 · 2H 2 O 440 440 440FeSO 4 · 7H 2 O 27 27 27Na 2 EDTA · 2H 2 O 37 37 37MnSO 4 · H 2 O 16,9 16,9 16,9ZnSO 4 · 7H 2 O 8,6 8,6 8,6Na 2 MoO 4 · 2H 2 O 0,25 0,25 0,25CuSO 4 · 5 H 2 O 0,025 0,025 0,025H 3 BO 3 6,2 6,2 6,2KI 0,83 0,83 0,83CoCl 2 · 6H 2 O 0,025 0,025 0,025Sacharósa 20 000 20 000 110 000Agar 7 000 7 000 7 000BA 0,5 0,5 1GA 3 0,5 0,5 0NAA 0,1 0 0,1Thiamin 0,1 0,1 2Pyridoxin 0,5 0,5 0,5Kys. nikotinová 0,5 0,5 1Glycin 2 2 2Myo-inositol 100 100 100pH 5,8 5,8 6,0013

Tabulka 2.: Složení kultivačních médií C4 a C5 (Modifikované MS)Složka (mg · l -1 )MultiplikacekulturTvorbacibulekC4C5NH 4 NO 3 1 650 1 650KNO 3 1 900 1 900MgSO 4 · 7H 2 O 370 370KH 2 PO 4 170 170CaCl 2 · 2H 2 O 440 440FeSO 4 · 7H 2 O 27 27Na 2 EDTA · 2H 2 O 37 37MnSO 4 · H 2 O 16,9 16,9ZnSO 4 · 7H 2 O 8,6 8,6Na 2 MoO 4 · 2H 2 O 0,25 0,25CuSO 4 · 5 H 2 O 0,025 0,025H 3 BO 3 6,2 6,2KI 0,83 0,83CoCl 2 · 6H 2 O 0,025 0,025Sacharósa 20 000 120 000Agar 7 000 7 000TDZ 0,5 0GA 3 0 0NAA 0 0Thiamin 2 2Pyridoxin 0,5 0,5Kys. nikotinová 1 1Glycin 2 2Myo-inositol 100 100pH 6,00 5,814

2.4 Založení kultur a kultivační podmínkyPokud materiál pro množení prošel procesem ozdravování, a jeudržován v laboratoři již sterilní, bude použit pro množení v in vitropodmínkách bez další desinfekce. Jedná-li se o zakládání ozdravenýchkultur česneku ze stroužků či pacibulek, odstraníme zaschlé listy, astroužky povrchově desinfikujeme pomocí 0,2 % chloridu rtuťnatého(vysoce toxická látka, označení T+). Doba desinfekce je 17 minut. Potomstroužky umístíme do sterilní destilované vody na 10 minut a totoopláchnutí 3x opakujeme, vždy po deseti minutách.Ať už pochází primární explantát ze stroužku, pacibulky či je torostlinka kultivovaná z meristému je středem zájmu pro další množenímeristém s podpučím. Rostliny pěstujeme v mikrobiologickýchzkumavkách s hliníkovými uzávěry. Zkumavky s rostlinami jednotlivěoznačíme popisky na sklo zkumavky. Větší stroužky při použití zkumavekseřízneme z bočních stran a z vrchní strany, podpučí necháme vcelku.Segmenty uložíme na médium C1 s přídavkem hormonů 0,1 mg.l -1NAA, 0,5 mg.l -1 BA a 0,5 mg.l -1 GA 3 (složení média viz tabulka 1). Za 4týdny rostlinky přeneseme na multiplikační médium. Při pasážování(přenos rostlin na čerstvá média) zakracujeme rostliny na 3 cm. U rostlin,které multiplikují, nerozdělujeme trsy skalpelem, ale kultivujeme rostlinytak dlouho, dokud nedojde k samovolnému oddělení jednotlivých rostlin.V případě rozkrojení trsu skalpelem hrozí uhynutí namnoženého materiálu.V kultivační místnosti udržujeme teplotu 23 o C a fotoperiodu 16 hod.světlo/8 hod. tma. K osvětlení používáme zářivkové trubice Philips TL-D80 Super 58W / 865.V průběhu kultivace se u některých rostlin začne projevovatvodnatění. Je to děj, při kterém ve zkumavce dochází k hyperhydrataci(převodnění pletiv). Vodnatění může být způsobeno vysokou vzdušnouvlhkostí, mají na něj vliv osmotické látky (tedy sacharóza) v médiu,koncentrace agaru a cytokininy. U rostlin se projevuje špatným vývojempletiv, sklovitým a celkově nezdravým vzhledem světle zelené, někdy ažhnědé barvy. Průduchy vodnatěním napadených rostlin ztrácejí svoji funkci(Novák, 1990; Wu et al., 2009). U rostlin, které jsou jen lehce postiženy,odstraníme zvodnatělé vnější části, rostliny zakrátíme a dále kultivujeme.Tyto rostliny je potřeba častěji přenášet na čerstvé médium. Většina těchtorostlin poté projevuje normální vývoj. Silně vodnaté jedince zlikvidujeme.Jak stroužky, tak i izolované meristémy, mohou být v kultuřenapadány infekcemi. Bakteriální infekce řešíme přenesením rostlin namédium s přípravkem Proclin 400 (Supelco). Pokud se bakterie vyskytují inadále, použijeme médium s antibiotikem dvakrát po sobě.Když rostliny spontánně multiplikují na médiu C1, jako další postuppoužijeme kultivaci na médiu C2 (viz tabulka 1). Postup sledu15

multiplikačních médií C1 a následně C2 pro genotypy vnímavé k BA,nezatěžuje rostliny vysokými dávkami regulátorů růstu. Multiplikace jedána použitím 0,5 mg.l -1 BA (médium C1) a následnou absencí NAA(médium C2).V případě, že rostlinky českých genotypů na médiu C1nemultiplikují ani po dvou pasážích (rostlinky 2x přeneseny na čerstvémédium), tyto přeneseme na další médium C4 (médium založené na účinkucytokininu TDZ, s absencí jiných regulátorů růstu) viz tabulka 1. Na tomtomédiu však kromě množení dochází i k většímu výskytu vodnatění rostlin,proto stav kultur musíme kontrolovat častěji a rostliny častěji pasážovat.Pokud nelze rostliny donutit k množení pomocí TDZ, použijemedalší médium C3 (MS s 110 g.l -1 sacharózy, 0,1 mg.l -1 NAA s přídavkem1 mg. l -1 BA) k multiplikaci formou zmnožování cibulek. V tomto případěspolupůsobí na množení vysoká koncentrace sacharózy společně s BA.2. 5 Převod rostlin do nesterilních podmínekRostlinky určené k převodu do nesterilních podmínek kultivujeme 3měsíce na médiu C5 (MS bez regulátorů růstu s 120 g.l -1 sacharózy). Totomédium bylo převzato z komerční laboratoře Vivai piante Battistini s.s.z Itálie a je zajímavé právě vysokým obsahem sacharózy. Rostlinky natomto médiu vytvoří cibulku a následně zatáhnou. Cibulky vyjímámez kultivačních nádob a uchováváme v ledničce do doby výsadby, nebovysazujeme bezprostředně. Termín výsadby naplánujeme na jarní období,rostliny pak využijí celé vegetační období k růstu. Při výsadbě cibulkynamáčíme do vody za účelem odstranění zbytků agaru a uchránění předzavadnutím. Cibulky vysazujeme do multiplat s velikostí jamek 3,5 x 4,0cm (TEKU JP 3040/54). Použijeme již hotový substrát Steckmedium(Klasmann) který je už namíchán dohromady s agroperlitem. Plnámultiplata umístíme na množárnu s vysokou vzdušnou vlhkostí a sespodním vytápěním na 25 o C.Vysazené cibulky na množárně kryjeme fólií, aby byla udrženavysoká vzdušná vlhkost a aby byly napodobeny předchozí podmínkyv kultivační nádobě. Teplota vzduchu na množárně nesmí překročit 38 o C.Při převodu dochází k minimálnímu úhynu rostlin (cca 8 %). Tato fáze jecharakterizována snižováním vzdušné vlhkosti. Sedmý den po převodusejmeme fólii z rostlin na množárně 3 krát denně na cca 5 minut aby bylaumožněna výměna vzduchu. Intervaly větrání každý den prodlužujemev závislosti na počasí. Cibulky začnou velice rychle prorůstat. Veslunečných, horkých dnech interval větrání zkrátíme, protože rostlinyrychleji vadnou (vadnutí se projevuje kroucením vrcholku nejvyššího listu).Po čtyřech týdnech rostliny na množárně ponecháme zcela bez nadkrytí.16

Substrátové topení používáme pouze pro první týden převodu. Rostlinyv multiplatech po měsíci převezeme z množárny do skleníku. Zde rostlinydále pěstujeme až do výšky cca 12-15 cm a potom je umístíme dovenkovních prostor do síťovníku, kde je nahrnkujeme do kontejnerů P 9, dokterých použijeme substrát KTS 2 zásobený živinami na půl roku.K biologickému hubení smutnic (Sciara sp.), použijeme parazitickéhlístice Steinernema feltiae Filipjev. Třetí týden od převodu zakořeněnérostliny v multiplatech přihnojíme formou hnojivé závlahy na list hnojivemKristalon Start v dávce 1 g · l -1 . Pak pravidelně přihnojujeme stejnoudávkou 1x týdně. Ošetření fungicidy provádíme třetí den po převodu, a topřípravky: Ridomil Gold Plus 42,5 WP (oxichlorid mědi, metalaxyl-M)v koncentraci 0,1 % a Carben Flo Stefes (carbendazim) v koncentraci0,1 %. Pokud je potřeba další ošetření, kombinujeme přípravek RidomilGold Plus 42,5 WP s přípravkem Rovral FLO (iprodione) v koncentraci0,05 %. Všechny přípravky aplikujeme spolu se smáčedlem Silwet 77.2. 6 ZávěrŘada postupů, které byly experimentálně aplikovány české genotypyčesneku v průběhu let 2007-2010 byla hodnocena z hlediska multiplikacerostlin. Shrneme-li získané poznatky, docházíme ke stejnému závěru jakoSenula et al., (2000), kteří zkoušeli pro množení česneku celou řaduregulátorů růstu (IAA, NAA, KIN, BA, 2-iP). Při množení 87 genotypůzjistili, že vliv složení média je zanedbatelný při srovnání s vlivemgenotypu na multiplikaci. Rovněž Bertaccini et al., (2004) došli přimnožení 97 genotypů ke stejným závěrům.U námi zkoušených českých genotypů z genové banky se potvrdilaobecně známá větší závislost úspěchu množení na genotypu, než na složenímédií. Při vyzkoušení regulátorů růstu (IAA, NAA, BA, TDZ, JA, GA 3 ) sereakce jednotlivých genotypů značně liší. Z toho důvodu je publikovanámetoda tvořena postupnou obměnou regulátorů růstu v médiích, což jedáno postupným pořadím jednotlivých kultivačních médií, aby bylozajištěno namnožení rozdílně reagujících genotypů. I zde je však vlivgenotypu větší než např. vliv použitého regulátoru růstu.Na rozdíl od autorů, kteří uvádějí NAA jako složku multiplikačníhomédia (Fereol et al., 2002, Bertaccini et al., 2004, Kim et al., 2003) seneosvědčila přítomnost tohoto hormonu pro množení. NAA pozitivněovlivňuje adaptaci česneku v in vitro kultuře na začátku kultivace. Pozdějije však jeho vliv na množení bezvýznamný. Rovněž se potvrdila vhodnostmédia MS, jak ostatně uvádějí Bertaccini et al., (2004) a Kim et al., (2003)na rozdíl od média BDS doporučovaného autory Fereol et al., (2002) aLuciini et al., (2001). Všechna doporučovaná média v této metodice jsouzaložena na receptuře MS.17

3 Srovnání novosti postupůZ důvodu odlišného chování jednotlivých genotypů česnekuv podmínkách in vitro, nebyla dosud snaha o univerzální postup vhodnýpro všechny genotypy úspěšná. Ozdravování rostlin česneku v rámciprojektu NAZV QH 71228 s názvem „Ozdravení domácích genotypůčesneku za účelem jejich uchování metodou kryokonzervace“ s dobouřešení od 1.5.2007 do 31.12.2011, jehož náplní je ozdravení 50-ti genotypůčesneku pro potřeby uchování metodou kryoprezervace, umožnilo ověřit jižexistující postupy množení a na základě výsledků vyvinout postupy nové.Vývoj poznatků v oblasti in vitro kultur česneku, o němž svědčípublikované vědecké práce v posledních letech a množsví ozdravovanýchgenotypů udržovaných v in vitro podmínkách v rámci řešení projektu,umožnilo experimentálně ověřit postupy množení. Metodika, která vznikalaza spolupráce odborníků 3 pracovišť (Mendelova univerzita v Brně -Zahradnická fakulta, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. a Výzkumnýústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o.) přináší originální informace omnožení českých genotypů česneku metodou in vitro, které nebyly dosudna rostliny českých genotypů aplikovány.Množení pomocí moderních biotechnologických metod vlaboratorních podmínkách použitím in vitro kultur rostoucích na umělýchživných médiích, představuje velkou perspektivu pro množení. Vesterilním prostředí kultivačních nádob je minimalizováno riziko infekcehoubovými nebo bakteriálními chorobami a je vyloučeno napadeníživočišnými škůdci. Ve fázi množení je téměř vyloučeno riziko reinfekcejiž ozdraveného materiálu. In vitro kultury je možno pěstovat a množit vprůběhu celého roku.Experimentálně bylo ověřováno použití různých médií, za účelemdosažení vyššího koeficientu multiplikace, zvláště pak použití regulátorůrůstu a jejich kombinací. Bylo ověřováno použití médií o různém složení.Bylo použito univerzální médium MS (Murashige, Skoog 1962), dálemédium používané pro kultivaci kořenových špiček česneku publikovanév práci Haque et al., (2003), médiun s přídavkem kyseliny jasmonové,publikované pro ozdravování česneku v práci Ucman et al., (1998) amédium WPM (Lloyd, McCown, 1981).18

4 Popis uplatnění certifikované metodikyMetodika kultivace a multiplikace česneku v podmínkách in vitro, jeurčena zejména pracovištím genových bank, kde probíhá udržovánígenových zdrojů česneku, MZe, ÚKZÚZ, dále pro potřeby SRS, pěstitelůmčesneku a dalším zájemcům. Metodika bude využívána k rychlémunamnožení ozdraveného materiálu zejména českých genotypů česneku, a tojak pro jejich uchování metodou kryokonzervace, pro další bezpečnéuchovávání, tak pro rychlé namnožení množitelského materiálu, čimateriálu ve fázi šlechtění. Postupy popsané v metodice mohou být rovněžpři dalším výzkumu experimentálně aplikovány na další genotypy česneku,popř. ostatní cibuloviny.5 Ekonomické aspektyJednoznačným přínosem zveřejněného postupu množení je vyššímultiplikace, tedy efektivnější množení v rámci časového úseku. Znamenáto, že za stejnou dobu množení jako v polních podmínkách, je možnov laboratoři dosáhnout většího počtu jedinců. Bohužel, provedenéexperimenty týkající se českých genotypů česneku poukazují na vysokývliv genotypu na množení. Postupy v metodice tedy nemohou být vztaženyna všechny české genotypy, avšak je zde publikován postup, který byl poprovedení pokusů s vybranými genotypy nejefektivnější. V průběhuexperimentů bylo namnoženo 1207 rostlin.Ve sterilním prostředí kultivačních nádob je minimalizováno rizikoinfekce houbovými nebo bakteriálními chorobami a je vyloučeno napadeníživočišnými škůdci. Ve fázi množení je téměř vyloučeno riziko reinfekcejiž ozdraveného materiálu. In vitro kultury je možno pěstovat a množit vprůběhu celého roku.V podmínkách technické izolace při pěstování na poli je rizikoreinfekce až mnohonásobně vyšší. V průběhu množení in vitro tedyprakticky nemůže docházet k znehodnocení pracně ozdraveného cennéhomateriálu. Pro účely dlouhodobého uchovávání metodou kryokonzervace jebezesporu nutné použít množení rostlin v podmínkách in vitro, abyvyprodukovaný rostlinný materiál nebyl v průběhu množení znovunapaden, jak k tomu docházelo u ozdravených rostlin v minulosti.Ekonomický přínos je spatřován v důležitosti množení ozdravenéhomateriálu bez rizika reinfekce. Pokud by nebyl ozdravený materiál taktomnožen, budou nemalé náklady na ozdravování pohybující se od 21 000Kč do 36 000 Kč za jeden genotyp investovány zcela zbytečně.19

6 Seznam použité související literaturyAYABE, M., SUMI, S.: Establishment of a novel tissue culture method,stem-disc culture, and its practical application to micropropagation ofgarlic (Allium sativum L.), Plant Cell Reports (1998) 17: 773–779 s.AYABE, M., SUMI, S.: A novel efficient tissue culture method - “stem -disc dome culture“ - for producing virus - free garlic (Allium sativum L.),Plant Cell Rep (2001) 20:503 - 507 s.BERTACCINI, A., BOTTI, S., TABANELLI, D., DRADI, G., FOGHER,C., PREVIATI, A., DA RE, F. : Micropropagation and Establishment ofMite - Borne Virus - Free Garlic (Allium sativum), Acta horticulturae 631:201-206 s., ISHS 2004.BRUNA, A.: Effect of thermotherapy and meristem-tip culture onproduction of virus-free garlic in Chille, Acta Horticulturae. 1997, 433:631-634 s.FEREOL, L., CHOVELON, V., CAUSSE, S., KALUMVUEZIKO , M.L., KAHANE, R. : Embryogenic Cell Suspension Cultures of Garlic(Allium sativum L.) as Method for Mass Propagation and Potential Materialfor Genetic Improvement, Acta Horticulturae, 2005, 688: 65-74 s.FEREOL, L., CHOVELON, V., CAUSSE, S., MICHAUX-FERRIERE, N.,KAHANE, R.: Evidence of a somatic embryogenesis process for plantregeneration in garlic (Allium sativum L.), 2002, Plant Cell Rep 21: 197–203 s.FEREOL, L., CHOVELON, V., CAUSSE, S., TRIAIRE, D. :Establishment of embryogenic cell suspension cultures of garlic (Alliumsativum L.), plant regeneration and biochemical analyses, Plant Cell Rep(2005) 24: 319-325 s.HAQUE, M. S., WADA, T., HATTORI, K.: Garlic root formicropropagation through in vitro bulbet formation, 2000, ActaHorticulturae 520: 45-52 s.HAQUE M, S., WADA, T., HATTORI, K. : Shoot regeneration and bulbetformativ from shoot and root meristem of garlic cv. Bangladesh local,2003, Asian journal of plant science 2 (1) 23-2720

HAVRÁNEK, P.: Redakčně upravená závěrečné správa grantovéhoprojektu Ministerstva zemědělství ČR QE 1108. 2005. Systém produkcecertifikované sadby česneku.HAVRÁNEK, P.: Viruprosté klony česneku kuchyňského získanéz meristematických kultur. Sborník ÚVTI – Ochrana rostlin. 1972. vol. 8,p. 291 – 298.HAVRÁNEK, P.: Vliv virového onemocnění na výnosy česnekukuchyňského. Sborník ÚVTI – Ochrana rostlin. 1975. vol. 10, p. 251 – 256.KIM, E. K., HAHN, E. J., MURTHY, H, N., PAEK, K. Y. High frequencyof shoot multiplication and bulbet formativ of garlic in liquid cultures.KUDĚLKOVÁ, M.: Eliminace virů u odrůd česneku kuchyňskéhov podmínkách in vitro. Diplomová práce. Lednice: MENDELU v Brně,2010. p. 92.LINSMAIER, E. F., SKOOG, F.: Organic growth factor requirements oftobacco tissue cultures. 1965. Physiol Plant 18:1, p. 127.LLOYD, G., MCCOWN, B., Commercially-feasible micro-propagation ofMountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture. InternationalPlant Propagation. 1981, vol. 30, p. 421 – 427.LUCIANI, G. F., MARINANGELI, P. A., CURVETTO, N. R. Increasingnitrate/amonium ratio for improvement of garlic micropropagation. 2001,Scientia Horticulture 87, 11-20MUKHOPADHYAY, M. J., SENGUPTA, P., MUKHOPADHYAY, S.,SEN, S. : In vitro stable regeneration of onion and garlic from suspensionculture and chromosomal instability in solid callus culture, 2004, ScientaHorticulturae 104: 1-9 s.MURASHIGE, T. and SKOOG, F.: A revised medium for rapid growthand boi-assays with tobaco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 1962,vol. 15, p. 473 – 497.NOVÁK, F. J.: Explantátové kultury a jejich využití ve šlechtění rostlin,Academia Praha, 1990, ISBN 80-200-0344-4.SENULA, A., KELLER, E. R. J., LESEMAN, D. E. : Elimination ofviruses through meristem culture and thermotherapy for the establishment21

of an in vitro collection of garlic (Allium sativum), 2000, ActaHorticulturae 530: 121-128 s.UCMAN, R., ŽEL, J., RAVNIKAR, M.: Thermotherapy in viruselimination from garlic: influences on shoot multiplication from meristemsand bulb formation in vitro. Scientia Horticulturae. 1998. vol. 73, p.193–202WU, M., CHEN, L. J., LONG, Y. J.: Analysis of ultrastructure and reactiveoxygen species of hyperhydric garlic (Allium sativum L.) shoots. In vitroCell. Dev. Bol. Plant, 2009, vol. 45, p. 483-490.7 Seznam publikací, které předcházely metodiceKARLOVÁ, K., DUŠEK, K., STAVĚLÍKOVÁ, H.: Virové choroby ukolekce genetických zdrojů česneku v České republice. In: Hauptvogel, P.(ed.) Hodnotenie genetických zdrojov rastlín pre výživu apol´nohospodárstvo. Zborník abstraktov z 5. vedeckej konferencies medzinárodnou účasťou, 6. – 7. května 2008, Piešťany, Slovenskárepublika. str. 14, ISBN 978-80-88872-74-0KARLOVÁ, K., DUŠEK, K., STAVĚLÍKOVÁ, H.: Occurrence of virusdiseases in collection of genetic resources of garlic in the Czech Republic.In: Meglič, V.; Bastar, M.T. (eds.): Book of abstracts of 19 th EucarpiaConference, Genetic Resources Section, Ljubljana, Slovenia, May 26 th –29 th , 2009. p. 40, ISBN 978-961-6505-40-6.KARLOVÁ, K., DUŠEK, K., STAVĚLÍKOVÁ, H.: Virus diseases incollection of genetic resources of garlic in the Czech Republic. Agriculture(Poĺnohospodárstvo). 2009. 55(1): 58-60.KUDĚLKOVÁ, M.: Eliminace virů u odrůd česneku kuchyňskéhov podmínkách in vitro. Diplomová práce. Lednice: MENDELU v Brně,2010. p. 92.NAUŠOVÁ, O., KUČEROVÁ, Z., ONDRUŠIKOVÁ, E., KŘIŽAN, B.,WASSERBAUEROVÁ, L., SOUKUPOVÁ, J., KARLOVÁ, K.,STAVĚLÍKOVÁ, H., DUŠEK, K.: Zhodnocení účinnosti metody izolacemeristému při ozdravování 20 odrůd česneku. In ŘEHOUT, V.Biotechnology 2008. 1. vyd. České Budějovice: Scientific PedagogicalPublishing, 2008, s. 193--195. ISBN 80-85645-58-0.22

ONDRUŠIKOVÁ, E., SASKOVÁ, H., ČECHOVÁ, J., KŘIŽAN, B.: Theeffect of genotype on sanitation of garlic plants (Allium sativum L.) In Newdevelopments in green gene technology. 1. vyd. Szeged, Hungary:Biological Research Center, Hungarian Academy of Sciences, 2009.SMÉKALOVÁ, K., STAVĚLÍKOVÁ, H., DUŠEK, K.: Distribution ofviruses in the garlic germplasm collection of the Czech Republic. Journalof Plant Pathology, 2010, 96 (1): 273-274.23

8 Přílohy:Obr. 1. Rostliny česneku kultivované v mikrobiologických zkumavkách,pohled do kultivační místnosti.Obr. 2: Pracovní prostředí laminárního boxu pro sterilní práci s rostlinnýmmateriálem24

Obr. 3: Kultivace česneků pocházejících z meristémůObr. 4: Multiplikace rostlin na médiu C125

Obr. 5: Multiplikace rostlin na médiu C2Obr. 6: Rostliny česneku po aplikaci čtvrcení26

Obr. 7: Cibulky vytvořené v podmínkách in vitroObr. 8: Rostliny česneku postižené hyperhydratací pletiv (tyto rostliny jsounevhodné pro další multiplikaci)Obr. 9: Segment rostliny po aplikaci čtvrcení (na bazální části patrný řez)27

Obr. 10: Zmnožující se kultivovaná rostlina, v tomto případě je nutnopočkat až dojde k samovolnému oddělení rostlin28