Manual de Procedimientos de Laboratorio para el

Laboratorio Nacional de Parasitología y Entomología
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Elaborado por::
Dr. Sergio MOLLINEDO PEREZ
Jefe de la Unidad de Parasitología y Entomología del INLASA
Patólogo Clínico, Medico Tropicalista, Master en Parasitología
COLABORADORES: Laboratorio de Parasitología y Entomología INLASA
Dr. Edwing HOLGUIN
Lic. Lourdes ZEGARRA
Lic. Wilson GIRONDA
Lic. Boris BARROSO
Tec. Walter DELGADO
Tec. Victor DIAZ
Tec. Roberto ARANDA
Tec. Victor BALBOA
Tec. Hugo SELAEZ
Tec. Enzo GAMARRA
IRD
Dr. Laurent BRUTUS
Ing. Dominique SHCNEIDER
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PUBLICACION TECNICA N- 9
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
DE LABORATORIO PARA EL
DIAGNOSTICO DE
LAS LEISHMANIOSIS
UNIDAD DE PARASITOLOGIA Y ENTOMOLOGIA
INLASA
Primera Edición / La Paz 2.002
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A) Introducción
B) Métodos de Diagnóstico:
CONTENIDO
Leéis manía y Leishmaniosis
B.1. Introducción al diagnóstico de las Leishmaniosis
B.2. Frotis de la lesión
B.3. Cultivo de Leishmania
B.4. Inoculación a hámster
B.5. Diagnóstico histopatológico
B.6. Intradermoreacción de Montenegro (IDR)
B.7. Prueba Inmunoenzimática (ELISA)
B.8. Inmunofluorescencia indirecta (IF)
B.8. Envió de muestras y resultados
Merito fotográfico
Bibliografía
Anexos
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A) INTRODUCCIÓN:
Las Leishmaniosis son un complejo de Enfermedades que pueden infectar al humano que
vive o tiene actividades laborales en las áreas tropicales y sub tropicales del planeta; las
transformaciones ecológicas principalmente en los países en vías de desarrollo, suelen
condicionar la aparición de nuevos focos de la enfermedad, situación que hoy en día permite
a que estas enfermedades se presenten cada vez más expandidas y cobren mayor importancia
en la Salud Pública de los pueblos.
Se han descrito alrededor de 29 diferentes especias de Leishmanias, de las que 21 se han
aislado de humanos y son responsables de producirles diferentes formas clínicas de la
enfermedad con manifestaciones muy variadas: las formas viscerales pueden tener un
comportamiento epidémico, endémico u holoendémico, con formas inaparentes o sub clínicas
a casos graves mortales; las formas tegumentarias (que afectan a tegumentos: piel y mucosas)
presentan un largo espectro clínico que van desde la forma cutánea que curan
espontáneamente, hasta las formas incurables cutáneo difusas o formas cutáneo mucosas que
producen graves destrucciones faciales.
Para fines del siglo XX, según la Organización Mundial de la Salud (Desjeux, 1993), las
Leishmaniosis tiene una distribución mundial, están presentes en 4 de los 5 continentes del
planeta (África, Asia, América y Europa); extendiéndose por 88 países, (21 de América); la
población en riesgo es de aproximadamente 350 millones de habitantes y anualmente un
millón y medio de personas (adultos y niños) enferman de Leishmaniosis en todas sus
formas; estas cifras son de difícil evaluación debido a que su distribución es focal en zonas
alejadas y dispersas, existiendo casos no diagnosticados, casos asintomáticos, y por que los
Sistemas de Salud generalmente no consideran la declaración obligatoria de la enfermedad.
Bolivia, con una población de casi 8.350.000 (INE: censo 2001) de habitantes repartidos en
forma irregular en un territorio muy grande y geográficamente diverso (1.098.581 Km2); el
área endémica de la Leishmaniosis se extiende por más del 70 % del territorio, solamente
en 3 departamentos de los 9 (Oruro, Potosí y Chuquisaca) no se han reportado casos
autóctonos (17, 28, 30); el número de casos oficialmente reportados por año han aumentado
de 120 (1982) a 2310 (1996); por lo tanto podemos inferir, que las Leishmaniosis al igual
que otras enfermedades transmitidas por vectores (Malaria, Enfermedad de Chagas), tiende a
aumentar por influencias diversas, algunas de las cuales son las siguientes:
• Lucha química anti vectorial no integrada y dependiente de financiamiento
externo.
• Múltiples asentamientos (colonizadores) en zonas endémicas de los Valles
(Yugas), Amazonía y Chaco, antiguamente no poblada.
• Desarrollo de importantes Proyectos Agrícolas, Ganaderos, Industriales,
Auríferos, Petrolíferos, Gasíferos, de vinculación caminera, etc., en zonas
endémicas.
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• Migraciones temporarias a gran escala de la población Andina (Altiplánica)
debida a sequías, cierre de las Minas y búsqueda de mejores condiciones socio
económicas.
• Calentamiento global y fenómenos climáticos El Niño oscilación sur (ENOS).
• Urbanización rápida y no planificada de estos nuevos pueblos.
• Modificaciones ecológicas producidas por la población.
En Bolivia a pesar del conocimiento ancestral de estas enfermedades, las medidas para
enfrentar los requerimientos de investigación, diagnóstico oportuno, tratamiento precoz y
completo y educación para la Salud; las Leishmaniosis se están extendiendo, (Cochabamba,
Santa Cruz, Beni, Pando, La Paz) re-emergiendo (Tarija) y adaptándose al medio urbano
antropización del ciclo.
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B) MÉTODOS DIAGNÓSTICOS:
Los procedimientos de laboratorio utilizados para el diagnóstico de las Leishmaniosis han
sido y siguen siendo exhaustivamente revisados por diferentes autores (1, 12, 25, 26, 55,
62, 63), en el presente resumen pretendemos citar las partes más importantes de estas
técnicas y la relación con nuestra propia experiencia en la utilización de las mismas.
El diagnóstico acertado de un proceso infeccioso como son las Leishmaniosis, es la
demostración del agente patógeno (parásito) o de sus productos en los tejidos o fluidos del
huésped (anticuerpos), esta detección no siempre es posible. La detección de los parásitos
(amastigotos) agentes de la Leishmaniosis es frecuentemente complicado, en particular
cuando se trata de parásitos del complejo Leishmania (V.) braziliensis, (importante en
nuestro país), donde el número de amastigotes presentes en las lesiones es escaso; en
nuestra experiencia sobre terreno y tomando en cuenta las características e idiosincrasia de
nuestra población que recurre al centro médico rural solo después de haber fracasado en sus
métodos de curación empíricos, solamente en el 40% o menos de los casos con lesiones de
diferentes estadios se puede demostrar el parásito (Mollinedo S., datos no publicados),
similares observaciones fueron señaladas por Furuya et al. (20) y Mardsen, (34); sin
embargo se debe hacer notar que cuando se realizan exámenes en pacientes con lesiones de
corta evolución, sin infección agregada, sin tratamiento, la sensibilidad sube hasta el 90%;
debido a que las Leishmaniosis son enfermedades rurales los investigadores están
proponiendo alternativas de métodos de diagnóstico con mayor sensibilidad y
especificidad, recomendándose que sean simples, de corta ejecución y bajo costo
operacional.
El conocimiento de las técnicas de diagnóstico y su correcta interpretación, son
fundamentales para orientar las acciones de los médicos generales, tropicalistas,
dermatólogos, epidemiólogos, que asocian estos resultados a la signo sintomatología clínica
que presenta el paciente. La mayor parte del territorio de Bolivia es endémica a estas
enfermedades, en la actualidad el diagnóstico de las Leishmaniosis es realizado en base a
las manifestaciones clínicas; el frotis es deficientemente realizado y no se realizan
exámenes serológicos, que a su vez no son capaces de discriminar las infecciones recientes
de las antiguas y pueden ser falsos positivos, al presentar reactividad cruzada con la
enfermedad de Chagas, malaria, tuberculosis, lepra y brucelosis; por lo anotado es
imperioso mejorar estos con el estudio y la precisa realización de las técnicas descritas en el
presente manual.
En el diagnóstico de las Leishmaniosis se pueden presentar las siguientes situaciones
clínico epidemiológicas, para las cuales se deben tener en cuenta diferentes estrategias de
diagnóstico:
• Confirmación de un caso clínico sospechoso
• Descarte de un caso atípico
• Seguimiento de tratamiento
• Encuesta sero epidemiológica
• Investigación
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B.1. Introducción al Diagnóstico de las Leishmaniosis:
METODOS PARASITOLOGICOS:
• Métodos Parasitológicos Directos: Con estos exámenes se observa el agente
etiológico directamente, por lo que constituyen la base fundamental del diagnóstico
biológico de confirmación de la enfermedad, los principales son:
- Frotis: El parásito se lo detecta en forma amastigote en la muestra obtenida de la
lesión (úlcera) del paciente.
- Biopsia: El parásito también esta en forma amastigote en los tejidos y requiere
un proceso clásico histopatológíco.
• Métodos Parasitológicos especiales: La ejecución de estos exámenes en el caso del
cultivo y Xenodiagnóstico es limitada a laboratorios especializados (II y III Nivel),
debido a que no son métodos parasitológicos especiales y se los utiliza generalmente
para investigación.
- Cultivo: Generalmente se realiza de tejido cutáneo o mucoso (biopsia), aspirado
de lesión, material obtenido por punción de médula ósea o bazo.
- Xenodiagnóstico: Laboriosa técnica que requiere la crianza en laboratorio de
especies de Lutzomyias, con las que se hace picar al paciente sospechoso de la
enfermedad, presenta múltiples inconvenientes.
- Intradermoreacción de Montenegro (IDRM) o Leishmanina. Revela la respuesta
a mediación celular y se la emplea principalmente en I nivel.
METODOS SEROLOGICOS:
• Métodos Serológicos: Constituyen una herramienta valiosa para el diagnóstico de la
infección, se basan en la respuesta del organismo frente al parásito (antígeno
generalmente en forma promastigote); lo ideal de estos métodos es que sean fáciles de
realizar, que se obtengan resultados rápidos y confiables y que su lectura sea objetiva:
- Las pruebas Inmunoenzimáticas (ELISA), Inmunofluorescencia Indirecta (IFI);
Aglutinación Directa (AD); revelan la respuesta a mediación humoral
• Métodos serológicos especiales: Son aquellas pruebas que no han tenido una
validación suficientemente amplia, utilizan diferentes reactivos y mezclas de antígenos
que pretenden aumentar la especificidad del diagnóstico; se han propuesto diferentes
matrices para la inmovilización del antígenos como tiras reactivas (Dipstick); Westwern
blot, etc.
Algunas de estas pruebas han mostrado alta sensibilidad y especificidad, debiéndose
estandarizarlas como pruebas de rutina en los laboratorios regionales; la especificidad suele
variar considerablemente por lo que se recomienda que los límites de positividad deben
definirse localmente; sin embargo es necesario indicar que en la actualidad la prueba
serológica ideal no existe; las curvas de distribución de frecuencias de títulos en una
población dada se superponen, vale decir que vamos a encontrar un porcentaje de falsos
positivos y otro de falsos negativos, que no nos permiten diferenciar claramente entre los
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individuos infectados de los no infectados y discriminar las personas enfermas (que pueden
desarrollar la enfermedad) de las no enfermas (que no desarrollaran la enfermedad). Para
que haya confiabilidad, estas técnicas deben estandarizarse y tener un estricto control de
calidad en base a una “Red de Laboratorios”, que permita constantes intercambios de
experiencias y muestras de referencia y muestras problema.
El cuadro anterior resume las principales situaciones para utilizar estas técnicas y también
observamos en el Flujograma N- 1 y 2 las responsabilidades de realización de estas
técnicas por niveles :
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CASO PROBABLE

TEJIDO EXUDADO
SUERO
RASPADO BIOPSIA
FROTIS PCR
FROTIS
HISTOPATOLOGIA
INMUNOPATOLOGIA
PACIENTE CON SOSPECHA
CLÍNICO EPIDEMIOLOGICA
TOMA DE MUESTRA
- ASPIRADO
- MICROPIPETA
- CULTIVO
- INOCULACIÓN EN
HAMSTERS
AISLAMIENTO
DEL GERMEN
CARACTERIZACIÓN
- ELECTROFORESIS DE ISOENZIMAS
- ANTICUERPOS MONOCLONALES
- REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
- IFI
- ELISA
- DOT-ELISA
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IDRM
LESHMANINA
CASO CONFIRMADO
INVESTIGACION

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Ó
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LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA
LABORATORIO DE ENDEMIAS PARASITARIAS
TRANSMITIDAS POR VECTORES
- INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
- DIAGNOSTICO HISTOPATOLÓGICO
- INOCULACIONES EN HAMSTERS O RATONES
- CARASCTERIZACIÓN DE CEPAS (ISOENZIMAS)
- SUSCEPTIBILIDAD DEL PARASITO A LAS DROGAS
ANTILEISMANIASICAS
- ANTICUERPOS MONOCLONALES
- REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
ENVIO MUESTRAS PARA
- CONFIRMACIÓN
- DIAGNOSTICO
- CONTROL DE CALIDAD
LABORATORIO REGIONAL
- ELISA Y/O DOT ELISA
- PCR
- MANTENIMIENTO DE CULTIVOS DE LEISHMANIA
- IDENTIFICACIÓN TAXONOMICA DE Lutzomyia
- MANTENIMIENTO DE COLONIAS DE Lutzomyia
ENVIO DE MUESTRAS PARA
- ENTIFICACION
- DIAGNOSTICO
- CONTROL DE CALIDAD
LABORATORIO INTERMEDIO
- AISLAMIENTO PARASITO MEDIANTE CULTIVO
- ASPIRADO
- BIOPSIA
- RECONOCIMIENTO DEL VECTOR
ENVIO DE MUESTRAS PARA
- VERIFICACIÓN
- CONTROL DE CALIDAD
LABORATORIO LOCAL
- FROTIS
- INTRADERMORREACCIÓN (LEISHMANINA)
- CAPTURA DE Lutzomyia
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B.2. Frotis de la Lesión:
Fundamento:
Es el examen rápido, fácil, económico y de certeza, todos los demás exámenes son
complementarios; puede ser implementado inclusive a nivel de los recolectores de
muestras (Nivel I) para ser enviado a lectura donde exista un microscopio; consiste en
reconocer por examen microscópico las formas amastigotes teñidas dentro de los
macrófagos o fuera de estos, obtenidas de una muestra de sustancia intercelular de las
lesiones extendida en un portaobjeto (ver fotografías), la sensibilidad es variable del 30 al
90% y depende de la forma clínica; técnica empleada para la toma, procesamiento y lectura
de la muestra; tiempo de evolución de la lesión, tratamientos previos, existencia de
infección sobre añadida y experiencia del examinador.
Muestra requerida:
El frotis puede ser tomado de diferentes tejidos, dependiendo el tipo de leishmaniosis:
• Frotis directo del borde de la ulcera (punción extendida con palito)
• Frotis halo inflamatorio o rodete de la lesión cutánea (con bisturí)
• Frotis de la lesión secundaria activa
• Frotis de medula ósea
Equipo, materiales y reactivos:
• Laminas porta objetos
• Hoja de Bisturi 20 o 21 o palillos de maderas
• Gasa estéril
• Alcohol al 70 %
• Lápiz marcador
• Jeringa estéril de 1cc
• Anestésicos
• Giemsa
• Buffer pH 7.2
• Microscopio
• Aceite de inmersión
E.2.A. Procedimiento:
Frotis directo del borde de la lesión (úlcera):
• Selección del área de muestra. Si hay varias lesiones, debe escogerse la que tenga
menor tiempo de evolución y los bordes más indurados.
• Con una mano enguantada, lavar la zona de la lesión con abundante agua corriente. De
existir una costra deberá ser retirada; si existe pus se debe limpiar minuciosamente; si
existe sangrado se debe realizar una buena hemostasia.
• La muestra debe ser tomada de tres lugares diferentes, de la misma úlcera y escogiendo
áreas activas representativas o más sospechosas.
• Producir isquemia, presionando sostenidamente con el dedo un área adyacente al borde
de la lesión.
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• Con un palillo de madera (escarba dientes) previamente esterilizado se procede a
pinchar en el borde de la lesión y se hace girar (rotar) el mismo, evitando el excesivo
sangrado (1).
La muestra obtenida se extiende en tres lugares diferentes, en un porta objetos, rotando el
palillo, evitando pasar dos veces por el mismo sitio (2).
•
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Se repite el proceso en dos o tres lugares de la misma lesión
• Identificar la lamina con el código e iniciales del paciente y dejar secar a medio
ambiente.
• Fijar la muestra con alcohol corriente de 70 % y secar al medio ambiente
• Anotar los datos del paciente en el cuaderno de registro de muestras (Anexo No. ) y
en el formulario de remisión de láminas.
Isquemia:
Producir isquemia presionando sostenidamente en el borde de la lesión y lugar exacto
escogido.
Dadas las características de nuestros servicios de Nivel I, recomendamos esta técnica por su
sencillez, escasos requerimientos de material y buenos resultados, cuando se respetan
minuciosamente todos los pasos descritos.
E.2.B. Halo inflamatorio de la lesión:
• Se siguen las dos primeras citas descritos en F.2.A.
• Escoger un área representativa del borde de la ulcera (halo inflamatorio o rodete)
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• Presionar con firmeza el borde escogido de la lesión, hasta que se vuelva pálida
(isquemia)
• En la parte central del borde activo (paralelo a la úlcera) con la hoja de bisturí realizar
una pequeña incisión de 3 mm de longitud con 3 mm de profundidad.
• Secar la sangre con gasa seca y estéril
• Con la punta del bisturí raspar los bordes de la incisión tratando de obtener tejido
• Con el pequeño material sero hemático obtenido en la hoja de bisturí, hacer un frotis
delgado en una lámina porta objetos, evitando pasar dos veces por el mismo sitio.
• Identificar la lamina con el código e iniciales del paciente y dejar secar a medio
ambiente.
• Fijar la muestra con alcohol corriente de 70 % y secar al medio ambiente
• Anotar los datos del paciente en el cuaderno de registro de muestras (Anexo No. ) y en
el formulario de remisión de láminas.
Esta técnica es desconocida en nuestro medio pero con ella se suelen obtener mayor
número de parásitos.
E.2.C. Frotis de la lesión secundaria activa:
• Si las lesiones están en las fosas nasales, se invita al paciente a limpiarse la nariz para
retirar el mucus
• Con la mano enguantada se lava cuidadosamente la lesión secundaria con agua
corriente, retirando costras, evitar el sangrado, y si el mismo se produce, hacer una
buena hemostasia.
• Escoger un área activa (área ulcerada) de la lesión.
• Con un escarba dientes (palillo de madera) realizar un raspado fino y cuidadoso
• Con el escaso material obtenido, hacer un frotis delgado en una lámina porta objetos,
evitando pasar dos veces por el mismo sitio.
• Identificar la lamina con el código e iniciales del paciente y dejar secar a medio
ambiente.
• Fijar la muestra con alcohol corriente de 70 % y secar al medio ambiente
Anotar los datos del paciente en el cuaderno de registro de muestras (Anexo No. ) y en el
formulario de remisión de láminas.
E.2.D. Frotis de Médula ósea (sospecha de Leishmaniosis visceral):
• La toma de muestra debe realizarse de preferencia por personal capacitado en ambiente
hospitalario, con previo recuento de plaquetas (no inferior a 40.000 x mm3)
• Para garantizar la seguridad del examen y rapidez, debe prepararse al personal (1
operador y 2 asistentes que sujeten al paciente) y añadir al material mencionado líneas
arriba, lo siguiente:
- Aguja (tricar) 0,8 mm con jeringa de 5 mL (estéril)
- Medios de cultivo
- Una caja de curaciones
- Alcohol yodado
- Xilocaina al 2% con jeringa de 5 mL.
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• Al paciente en decúbito lateral, inmovilizado, tras el reconocimiento y palpación del
operador, se le realiza asepsia a nivel de la cresta iliaca antero superior.
• Se inyecta anestesia intradérmica en forma de abanico en el lugar escogido.
• Después de esperar entre 3 a 5 minutos, se hace un pequeño corte (1 cm), que facilite el
acceso a la cresta iliaca, realizando la hemostasia correspondiente.
• Con la herida abierta, se introduce el trocar al hueso y se aspira.
• El escaso material aspirado (de media a dos gotas) debe ser sembrado en medios de
cultivo inmediatamente, con el restante se realizan frotis (mínimo 3 láminas por
paciente).
• Obtenida la muestra, se procede a suturar la herida (1 o 2 puntos de sutura)
Procesamiento de la Muestra: La muestra obtenida por cualquiera de los métodos se la
procesa de la siguiente manera:
• Se procede a fijar la muestra con alcohol metílico (en nuestro país por costos se utiliza
alcohol etílico 96º) durante por lo menos 3 minutos; descartar el alcohol y secar a
temperatura ambiente.
• Cubrir la lámina con solución de trabajo Giemsa (una gota de solución Giemsa madre
por cada ml de solución buffer pH 7,2 a 7,4 por 30 minutos. Se pueden utilizar otros
colorantes: May Grundwald Giemsa, Wright.
• Descartar el colorante y lavar suavemente con agua corriente
• Secar al medio ambiente
• Observar a inmersión con microscopio
Envío de la muestra:
• En el puesto de salud, el RPS, o el sanitario en su recorrido deben realizar este examen
y debido a que NO cuenta con microscopio, deberá remitir la muestra (frotis) al
laboratorio más cercano de la red, teniendo el siguiente cuidado:
- Envolver la lámina (fijada y secada) en un papel en forma individual,
debidamente rotulada y envuelta en paquetes de no más de 10 láminas.
- El paquete debe ser colocado en una caja de cartón y adicionar las ficha
epidemiológicas respectivas.
- Cubrir la caja con un papel, rotular este y enviarlo al laboratorio de referencia
más cercano.
- Los laboratorios de mayor complejidad deberán enviar sus muestras en cajas
porta placas, debidamente identificadas y numeradas
Lectura e interpretación de resultados:
• Por medio del microscopio con objetivo 100 X y aceite de inmersión se debe observar
la lámina por no menos de 30 minutos.
• De encontrar elementos sospechosos de ser parásitos, lo primero que tenemos que hacer
es verificar su forma y tamaño.
• Los amastigotes generalmente están dentro de los macrófagos, también se los puede
encontrar fuera de estos (fotografías); se los reconoce por que tienen forma redondeada
u ovalada, miden de 2 a 6 micras de diámetro y dentro del citoplasma se observa 2
estructuras bien coloreadas al contener ADN:
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- El Núcleo, de forma redondeada, que ocupa 1/4 a 1/5 de la célula, esta pegada a
la membrana citoplasmática.
- El Kinetoplasto o Kinetonucleo, formación pequeña de forma de bastón,
ubicada a un costado del núcleo, se tiñe más intensamente que el núcleo
• En caso de que el resultado sea negativo y exista una fuerte sospecha de la enfermedad,
se recomienda repetir el examen de un sitio diferente de la misma lesión o de otras
lesiones.
Los resultados de laboratorio deben consignar obligatoriamente la densidad parasitaria que
observa según la siguiente escala propuesta por la OMS (45):
• Resultado Negativo: (-) No se observan formas parasitarias en 1.000 campos
observados, o en un mínimo de 30 minutos de observación.
• Resultado Positivo: (+) observación de ocasionales o escasos amastigotes solos o en
pequeños grupos en forma intracelular (Macrófagos) o extracelular,
• Negativo escaso múltiple: (-) 1 a 10 parásitos en 1.000 campos observados.
Fuentes de error limitación de procedimientos, interferencias y precauciones:
• Nuestros pacientes primero utilizan farmacopea empírica en sus enfermedades, por lo
que las lesiones frecuentemente están contaminadas con bacterias y/u hongos, después
que fracasan en su curación empírica, recién recurren al sistema de salud por lo que
recomendamos un buen lavado con agua corriente o agua y jabón, de acuerdo a criterio
médico se puede realizar tratamiento previo antimicrobiano.
• las úlceras que evolucionan mucho tiempo (crónicas), presentan un menor número de
parásitos.
• El frotis del lecho ulceroso sin limpieza previa, frecuentemente permite solo observar
detritus celular y no parásitos
• El uso de agua oxigenada, alcohol Iodado en la limpieza previa de las ulceras, también
elimina los parásitos por lo que no se recomienda su utilización
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E.3. Cultivo de Leishmania:
El material obtenido a partir de la Biopsia o aspirado de la lesión primaria o secundaria, se
incorpora al medio de cultivo in vitro, tradicionalmente se usa el medio bifásico con base
de agar sangre Medio Novy-Mac Neal-Nicolle (NNN); en la actualidad existen otros
medios, agar sangre, Drosophila de Schneider, RPMI, LIT, Seneckjie); el cultivo se utiliza
para identificar la especie del parásito, también puede emplearse para investigación de
mamíferos reservorios (roedores, perros), para potenciales vectores y como fuente de
antígeno para pruebas inmunológicas (Ver anexos).
El medio de Cultivo con relación al frotis, tiene la facilidad de que se observan
generalmente un número mayor de promastigotes móviles, mientras que en el frotis existen
generalmente escasas formas amastigotes; el inconveniente es que se requiere la instalación
de estufas de cultivo y un procedimiento con técnicas de asepsia rigurosas debido a la fácil
contaminación bacteriana de los medios.
CULTIVO DE ASPIRADO
• Muestra: biopsia, aspirado de médula ósea
• Material y Equipos requeridos:
- Jeringa de tuberculina (1 mL) con aguja 25 o 26
- Alcohol al 70%
- Suero fisiológico estéril
- Antimicrobianos en viales (Sulfato de Estreptomicina 1g y Penicilina Sódica
1’000.000 de Unidades).
- Tubos de medio de Cultivo NNN (2 a 4 por paciente)
- Gasa estéril
- Mechero de alcohol
- Microscopio de Luz
- Estufa de cultivo
• Procedimiento:
El material es obtenido de acuerdo al método descrito en 1.979 por Hendricks y Wright,
sigue los siguientes pasos:
- Lavar la lesión con abundante agua
- Elegir una zona representativa y desinfectar esta con el alcohol al 70%
- Se carga la jeringa de tuberculina con 0,2 ml de solución salina estéril más los
antimicrobianos; estando lista la jeringa, se escoge un área decolorada de la
pápula o del borde no necrotizado de la úlcera, procediéndose a punzar e
inyectar suavemente el contenido de la jeringa
- Inmediatamente se aspira, haciendo girar suavemente la aguja en abanico, la
obtención de escasas gotas debe manejarse cuidadosamente tratando de no
contaminarlas
- Se procede al sembrado en los tubos de cultivo, con la protección del mechero,
una gota por tubo con tapa rosca, a la cual se le añade 0,1 ml de solución salina
con antimicrobianos
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- Los tubos se cultivan a 24 ºC, revisándolos cada día, en caso de no contar con
una estufa de cultivo, se puede mantener los tubos a temperatura ambiente,
remitiéndolos a la brevedad posible al laboratorio más cercano de la red.
CULTIVO DE BIOPSIA:
• Muestra: Tejido
• Material y Equipo requerido: Todo el material requerido para el aspirado y además:
- “Punch sacabocados” estériles de 2 y 4 mm, (de preferencia desechables, se
utilizara el más pequeño en lesiones de cara o partes nobles).
- Bisturí con hoja 20 o 21
- Dos Pinzas estériles
- Una tijera de punta estéril
- Xilocaina al 2%
- Papel filtro
- Mortero o caja Petri
- Viales
• Procedimiento de la realización de la Biopsia:
- Lavar generosamente la lesión con agua
- Escoger un borde representativo y “activo” de la úlcera.
- Desinfectar con alcohol al 70%
- Inyectar 1 mL. de anestésico (Xilocaina al 2%), en la zona escogida en forma de
abanico.
- Introducir el punch, en el borde de la lesión (tomando tejido sano y necrótico)
haciendo rotar suavemente.
- Retirar el punch y pinzar en fragmento, para que con el bisturí o tijera se corte la
base del fragmento y se desprenda la muestra.
- La herida sangrante debe ser presionada con gasa por un mínimo de 5 minutos,
el operador evaluará si existe la necesidad de realizar un o dos puntos de sutura
y cubrir la herida con apositos.
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- El fragmento de tejido se lo deposita en papel filtro para absorber la sangre,
evitar cualquier contaminación.
- Se deposita el fragmento en una caja Petri o un vial que contenga solución salina
más antimicrobianos, se espera 2 horas para continuar el proceso.
- Se tritura la muestra en un mortero estéril (mortero de tubo) añadiendo 0,5 mL
de solución salina con antimicrobianos. De no contar con mortero, se puede
utilizar una caja Petri en la que ayudado por el bisturí se tritura la muestra en 0,5
mL de solución salina y antimicrobianos.
- El resultado del triturado es un homogeneizado rosado que se lo recoge con una
jeringa estéril o pipeta de Pasteur, para luego inocular 2 a 3 gotas por tubo de
medio de cultivo
- El procedimiento debe estar rodeado de medidas para evitar la contaminación
bacteriana y micótica, utilizando campana de flujo laminar o mechero, de
acuerdo a las características del centro donde se procese la muestra.
• Lectura e Interpretación de Resultados:
Si se cuenta con microscopio invertido se puede leer los tubos de cultivo diariamente sin
temor a contaminarlos en el proceso; si se cuenta con microscopios normales se utiliza la
protección del flujo laminar o mechero y con una asa de platino se revisan los tubos cada
48 horas a partir del tercer día (un tubo a la vez por días); se toma una gota del
sobrenadante para su observación al microscopio en búsqueda de promastigotes, la
presencia de formas móviles indica positividad, debiéndose informar detalladamente en la
hoja de resultados (Ver fotografías).
- (+) Presencia de promastigotes.
Los cultivos que permanecen negativos, se los descarta a los 30 días.
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E.4. Inoculación a hámsters (Mesocricetus aureatus):
Este procedimiento se puede realizar de preferencia en trabajo sobre terreno, o búsqueda
activa (en la zona rural) con la finalidad de aislar la cepa; al no existir medidas que
garanticen un aislamiento en tubos de cultivo se utiliza este procedimiento que es más
sencillo si se toman todas las medidas recomendadas.
El material homogeneizado obtenido de la úlcera por medio de la aspiración o biopsia, se lo
inocula al animal de laboratorio por medio de una jeringa de insulina (de 1 mL), inoculando
intradermicamente en el área de la nariz o dorso de las patas traseras.
• Se utiliza Hámster dorados (de preferencia machos) de 150-200 g de peso y mayores a
11 semanas de edad.
• Los animales inoculados deben ser enviados a un bioterio, debidamente identificados,
con atención especial, se los revisa cada semana tratando de detectar en las zonas donde
se ha inoculado, generalmente la presencia de inflamación (enrojecimiento) o la
aparición de una pápula, constituyen evidencia de infección por Leishmania (Ver
fotografías).
• En el Hámster positivo, para excluir una inflamación con la contaminación del proceso
se procede a la confirmación del caso y recuperación de la cepa por medio de:
- frotis de la lesión
- aislamiento por aspiración y resembrado en medios de cultivo
- sacrificio del animal y procesamiento de sus patas
• Al animal negativo, sé lo sacrifica a los 3 meses para proceder a la necropsía para
realizar cultivos de bazo e hígado.
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E.5.Diagnóstico Histopatológico:
El estudio histopatológico de una muestra (biopsia de lesión), solo confirma el diagnóstico
cuando el patólogo reporta la existencia de amastigotes, su sensibilidad es menor al examen
directo y frecuentemente solo se informa como “reacción inflamatoria de tipo
granulomatosa compatible con Leishmaniosis”.
• Material:
- bisturí
- viales (frascos) conteniendo formol al 10%
- etiquetas y ficha de envío de muestras
• Procedimiento:
- Se toma la muestra de una región representativa previamente identificada (borde
de una úlcera en piel o lesión secundaria activa de mucosas).
- Con el bisturí se procede a realizar un corte mínimo que nos permita obtener
parte de tejido sano y borde de la úlcera o lesión activa.
- La fracción de tejido es introducido inmediatamente al frasco que contiene
formol al 20%
- Se rotula la muestra con el nombre del paciente y datos importantes de su
enfermedad y se envía la muestra al laboratorio Regional más cercano
- En el laboratorio de referencia, se procede a la inclusión del pedazo de tejido en
parafina, para su posterior corte con micrótomo, los cortes montados en un porta
objetos, se tiñen con Tinción Universal (hematoxilina –Eosina) y se observan al
microscopio.
• Lectura e Interpretación de Resultados: La histopatología es muy variable en función
a la especie parasitaria, evolución clínica de la enfermedad, etc., por lo que es difícil
señalar parámetros estándar.
• Los procesos de Inmunohistopatologia, con la utilización de anticuerpos policlonales
(53) o monoclonales, permiten un diagnóstico específico y sensible aunque más
costoso.
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E.6.Intradermoreacción de Montenegro (IDR), Leishmanina:
Fundamento :
Es una prueba de hipersensibilidad retardada(inmunidad celular) que pone en evidencia la
presencia o contacto con el parásito, Al introducir antígeno en la cara anterior, tercio
medio del antebrazo, se produce una reacción tisular a las 48 a 72 hs. Que se manifiesta por
induración en el sitio de la inoculación.
Es una herramienta complementaria para el diagnostico
Fundamento principio del procedimiento:
Se recomienda utilizarla en centros de I nivel periféricos o sobre terreno en los siguientes
casos:
- En pacientes con sospecha de la enfermedad
- En pacientes con duda diagnóstica, con lesión activa de más de 4 semanas de
evolución.
- Pacientes con lesiones tórpidas o atípicas.
- Pacientes en estadio latente con enfermedad antigua o cicatrizada, que presenten
signo sintomatología cutánea mucosa.
• Material y reactivos:
- Leishmanina de 30 ug?ml (Ag obtenidos a partir de promastigotes)
- Jeringa estéril de 1 ml (insulina o tuberculina)
- Alcohol al 70%
- +Algodón
- Regla graduada en mm
- Bolígrafo
• Procedimiento:
- Desinfectar con alcohol al 70% la región de la cara anterior, tercio medio del
antebrazo.
- Inyectar vía intradérmica 0.1 ml de la leishmanina en la superficie escogida.
- Llenar la ficha epidemiológica y el cuaderno de registro con los datos del
paciente y marcar el perímetro de la zona de inoculación con el bolígrafo
poniendo la fecha.
- Recomendar al paciente las siguientes observaciones: No tocar ni rascarse la
zona, no emplear cremas, alcohol u otras sustancias en la zona, no frotarse en el
área de la punción, no beber bebidas alcohólicas
El paciente que esta infectado, presenta una reacción de hipersensibilidad al antígeno de la
leishmanina, que se manifiesta con induración, edema y enrojecimiento.
• Lectura e interpretación del resultado:
Se debe leer entre las 48 a 72 horas de inyectado el antígeno
El paciente que esta infectado, presenta una reacción de hipersensibilidad al antígeno de la
Leishmanina, que se manifiesta con induración, edema y enrojecimiento.
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Lectura:
- Se delimita el área de induración utilizando un bolígrafo, marcando la periferia o
borde de la induración determinado con la yema de los dedos en los cuatro
cuadrantes; también se puede buscar con el bolígrafo un área de resistencia en
un trazado de la periferia hacia el punto de inoculación.
- Se procede a medir el diámetro solamente del área indurada (pápula) por medio
de una regla graduada en mm; debe evitarse confusión con el área eritematosa
que generalmente es más amplia.
Si el diámetro de la induración es de 5 mm o mayor se considera la IDRM positiva.
Algunas veces la reacción es tan fuerte que puede haber necrosis en el punto de inoculación
(9-33-35-36).
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E.7.Prueba Inmunoenzimática (ELISA):
La prueba de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) es una prueba sensible que
nos permite detectar y cuantificar anticuerpos en fluidos biológicos, principalmente suero
sanguíneo (20, 26, 46, 63).
El antígeno (Ag) se lo fija (adsorbe) a una superficie sólida (placa de poliestireno); es
reconocido por el anticuerpo específico (Ac) existente en el suero del paciente, esta
reacción antígeno-anticuerpo de revelado por un conjugado que esta constituido por una
anti-inmunoglobulina humana marcada por una enzima (ej: peroxidasa); posteriormente se
adiciona el sustrato no cromático (ej:peróxido de hidrogeno), el cual, por acción de la
enzima es transformado en un producto coloreado y soluble que se puede leer en forma
visual o con un fotocolorimetro para determinar la densidad óptica.
Las principales características de la enzima a usarse son:
- debe ser estable
- debe presentar alta actividad específica
- debe ser de fácil unión covalente al antígeno o al anticuerpo.
• MUESTRA: Suero
• MATERIAL Y EQUIPO REQUERIDO:
- Antígeno: proteínas solubles de promastigotes de Leishmania sp.
- Sueros:
*Sueros control positivo, con título de anticuerpos conocido.
*Sueros control negativo.
*Sueros de muestras problema de los pacientes
- Conjugado: inmunoglobulinas de carnero o cabra anti inmunoglobulinas
humanas marcadas con exima-IgG y anti-IgM humanas, marcadas con la enzima
peroxidasa.
- Tampón fosfato salino (PBS) 0.01 M, pH 7.2
- Tween 20 al 0.05%
- Tampón carbonato-bicarbonato 0.06 m, pH 9.6
- HCL 2 N o H2SO4 2 N
- KOH 0.1 N
- Sustrato soluble: peróxido de hidrógeno y ortophenilendiamina OPD) como
cromógeno
- Albúmina bovina sérica (BSA) al 1% o leche en polvo descremada al 5% para
bloqueo de sitios activos libres de la placa
- Micropipeta multicanal (200 uL)
- Micropipetas (20 a 200 uL)
- Placas de microtitulación de poliestireno.
- Cámara húmeda (papel absorbente humedecido con agua dentro de un envase
plástico cerrado)
- Puntillas de pipetas para 20, 100 y 200 uL, puntas descartables.
- Refrigerador
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- Estufa a 37grados centígrados
- Lector ELISA para microplacas
- Impresora para lector ELISA
• PROCEDIMIENTO:
- Diluir el antígeno en tampón carbonato-bicarbonato 0.06 M, pH 9.6
- Sensibilizar las placas colocando 100 ul del antígeno diluido en cada pocillo de
la placa.
- Colocar las placas en cámara húmeda e incubar a 37ºC por 2 horas o en
refrigeración (4C) por 18 horas.
- Lavar 3 veces con PBS -Tween 20 al 0.05% por 10 minutos cada vez.
- Adicionar 200 ul de solución BSA al 1% o leche en polvo descremada al 5%
(diluido en tampón carbonato-bicarbonato 0.06 M. pH 9.6) en cada pocillo e
incubar en cámara húmeda a 37ºC por una hora. Esto evitará reacciones
inespecíficas.
- Lavar 3 veces con PBS-Tween 20 al 0.05% por diez minutos cada vez.
- Diluir los sueros problema al doble a partir de 1/10 en PBS-Tween 20 al 0.05%
(1/10, 1/20, 1/40,1/80, ...); colocar 100 uL en cada pocillo e incubar en cámara
húmeda a 37ºC por dos horas.
- Lavar 3 veces con PBS -Tween 20 al 0.05% por 10 minutos cada vez con una
leve agitación.
- Adicionar 100 uL de conjugado e incubar en cámara húmeda a 37ºC por una
hora. Previamente, diluir el conjugado según su título en PBS-Tween 20 al
0.05% .
- Lavar 3 veces con PBS - Tween 20 al 0.05% por 10 minutos cada vez.
- Colocar rápidamente 100 uL del sustrato recién preparado e incubar en
oscuridad (lejos de la luz), por 30 minutos a temperatura ambiente.
- Detener la reacción adicionando 100 uL de HCL 2N o H2SO4 2N en cada
pocillo.
- Realizar la lectura utilizando un lector de ELISA con filtro de 492 nm.
• LECTURA E INTERPRETACION DE RESULTADOS:
En caso que la muestra sea positiva, se forma el complejo antígeno-anticuerpo específico,
manifestado por un producto coloreado y soluble.
- Resultado Cuantitativo: Se obtiene midiendo las densidades ópticas (grados de
absorbancia) de los productos solubles, mediante el lector de ELISA
(espectrofotómetro).
=el blanco debe dar una lectura inferior a 0.100
=los sueros negativos dan lecturas menores a 0.200.
=los sueros positivos son mayores a 0.200
• FACTORES DE ERROR:
Los resultados falsos positivos y falsos negativos suelen deberse a reacciones inespecíficas:
- Reacciones cruzadas con otros tripanosomideos, principalmente Trypanosoma.
- Bloqueo inadecuado de las placas.
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- Antígenos y/o conjugados mal titulados.
- Solución cromógena preparada con demasiada anterioridad (más de 15 min).
- Paciente con factor reumatoide (FR) positivo ó anticuerpos antinucleares
(ANAS).
- Placas de microtitulación inadecuadas.
• OBSERVACIONES: Esta técnica debe ser estandarizada por cada laboratorio
- Las concentraciones óptimas de los antígenos y los conjugados deberán ser
determinadas por titulación en bloque.
- Las muestras de sueros deberán ser trabajadas por duplicado y diluidas en serie a
partir de 1/10.
- En la realización de cada prueba se utilizarán tanto los sueros controles positivos
de título conocido como los sueros negativos diluidos en serie. Esto permitirá
determinar los títulos de las muestras en estudio.
- El volumen de los componentes, así como los tiempos de incubación de las
distintas etapas de la técnica de ELISA, pueden variar de acuerdo a la
estandarización que realice cada laboratorio.
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E.8.Inmunofluorescencia indirecta (IFI):
Esta prueba permite detectar la presencia de anticuerpos específicos anti Leishmania (IgG e
IgM) en suero de pacientes, donde los promastigotes de Leishmania (antígenos) son
adheridos a un portaobjetos. El complejo Ag Ac revelado con isotiocianato de fluoresceína
es visualizado al microscopio de inmunofluorescencia.
Con promastigotes de Leishmania (antígenos), adheridos en un. En caso de ser positiva la
reacción antígeno-anticuerpo es revelado con isotiocianato de fluoresceína es visualizada
con el microscopio de inmunfluorescencia por medio de la adición de una antiinmunoglobulina
humana marcada con isotiocianato de fluoresceína, la reacción
fluorescente da un color verde manzana brillante a los promastigotes (ver fotografía).
• Muestra suero sanguíneo de un minimo de 2ml de sangre.
• MATERIAL Y EQUIPO REQUERIDO:
- Antígeno: promastigotes de Leishmania sp. Fijado en placa
- Sueros:
*Sueros control positivo con título conocido de anticuerpo.
*Sueros control negativo
*Sueros problema de pacientes con sospecha de Leishmaniosis
- Conjugado: anti-Inmunoglobulinas humanas marcada con isotiocianato de
fluorescencia.
- Tampón fosfato salino (PBS) pH 7.2
- Tampón fosfato salino (PBS) pH 7.2 – Tween 80 a 1%
- Azul de Evans.
- Glicerina tamponada, pH 8.5
- Placas de microtitulación de poliestireno.
- Tubos de hemolisis para dilución de suero.
- Papel filtro.
- Cámara húmeda (placa petri conteniendo papel absorbente húmedo).
- Microscopio de fluorescencia
• PROCEDIMIENTO PREPARACION DE ANTIGENO:
- Se requiere una línea constante de cultivo de promastigotes de Leishmania.
- Micropipetas / tips descartables
- Jarros couplin
- El momento de máximo crecimiento (7 a 8 días), se toma la parte liquida del
medio y se la centrifuga a 2500 rpm/10 minutos.
- Se descarta el sobrenadante y se lava el sedimento con PBS, dos veces, por
medio de la centrifugación a 2500 r.p.m. por 10 minutos.
- Descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento con PBS-formalina al 2%
y se deja reposar durante 24 horas.
- Descartar el sobrenadante y lavar el sedimento con PBS, dos veces, por medio
de la centrifugación a 2500 r.p.m. por 10 minutos.
- Descartar el sobrenadante y diluir el sedimento de la centrifugación final en PBS
hasta obtener de 25 a 30 parásitos por campo microscópico (objetivo de 40 X).
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- Se depositan 10 uL de la solución obtenida en cada campo en que están
divididas las láminas de microscopía; dejar secar a temperatura ambiente.
- Se guardan los porta objetos (láminas con Ag) en cajas porta-láminas y se
almacenan a – 70ºC ó a –20ªC, hasta su uso.
• PROCEDIMIENTO
- Descongelar las placas necesarias, dejándolas a temperatura ambiente por una
hora.
- Se retiran un número de láminas con antígeno del congelador de acuerdo a los
requerimientos y se las deja a temperatura ambiente por una hora.
- Hacer las diluciones correspondientes con PBS en tubos de hemólisis (1/20,
1?40, 1/80, 1/160)
- Se colocan 20 uL de cada dilución del suero sobre las áreas de la lámina que
contiene el antígeno fijado; es necesario llevar un protocolo (anotación) de la
localización de los sueros problema y controles en los pocillos.
- Se incuban las láminas en cámara húmeda y estufa a 37ºC, por 30 minutos.
- Se retiran las láminas de la estufa y se lavan 3 veces con PBS:
Primer Lavado: con una pizeta que contiene PBS se lavan las láminas evitando
que el chorro caiga directamente sobre las muestras.
Segundo Lavado: colocar las láminas en recipientes (Koplin o caja Petri)
cubriéndolas con PBS por 10 minutos, luego descartar el PBS.
Tercer Lavado: se procede como en el segundo lavado.
- Utilizando papel filtro retirar cuidadosamente el exceso de PBS del contorno de
las preparaciones.
- Colocar sobre cada área que contiene el antígeno, 20 uL del conjugado e incubar
en cámara húmeda a 37ºC por 30 minutos. Previamente se diluye el conjugado
según su título en tampón PBS-Tween 80 al 1% o azul de Evans al 0.2%
- Lavar como se indica en párrafos anteriores.
- Se seca la lámina cuidadosamente con papel filtro (como se indica
anteriormente), luego se coloca glicerina tamponada e inmediatamente se cubre
con laminilla cubre objetos.
- La lectura en microscopio de inmunofluorescencia se realiza inmediatamente
con objetivo de 40 X.
• LECTURA E INTERPRETACION DE RESULTADOS:
REACCION POSITIVA:
- La presencia de anticuerpos contra las leishmanias en el suero dan lugar a la
formación del complejo antígeno-anticuerpo específico revelado por la
coloración fluorescente color verde manzana.
- El suero es titulado considerando el valor mayor de dilución que presente
fluorescencia nítida en toda la superficie del parásito.
Se reporta el titulo de anticuerpos considerando la mayor dilución que presente dilución
nítida en la superficie del parásito.
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REACCION NEGATIVA:
- En las reacciones negativas no hay fluorescencia, el parásito presenta una
coloración café rojiza.
- El umbral de reactividad para anticuerpos totales generalmente es una dilución
de 1/40.
FACTORES DE ERROR:
Las reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ser causadas por:
- Reacciones cruzadas con Tripanosoma cruzi.
- Conjugados de título inadecuado.
- Mezcla de distintos sueros.
- Conjugados y sueros control mal conservados.
- Iluminación deficiente del microscopio (lámpara de iluminación gastada).
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E.9. ENVIO DE MUESTRAS Y RESULTADO:
• ENVIO DE LAMINAS:
En el caso de tener un paciente con sospecha de Leishmaniosis (lesión primaria) en Nivel I,
deberá hacerse un mínimo de 2 láminas por lesión:
- Una se procesará en el Nivel I
- La segunda se remitirá con el diagnóstico presuntivo y la ficha clínica -
epidemiológica respectiva al laboratorio de referencia regional para su control
de calidad.
• ENVIO DE MATERIAL CULTIVADO Y SUEROS:
La muestra, tomada siguiendo las recomendaciones de la presente guía debe enviársela
tomando todas las medidas de bioseguridad debido a que el material es altamente riesgoso,
solo se recomienda el manejo en investigación o en laboratorios de Nivel III y IV.
El tubo conteniendo la muestra debe ser colocado en forma vertical, envuelto al algodón
dentro de una cajita de cartón, en cuyo exterior se colocará una flechita indicando la
posición en que se debe mantener la caja. Incluir ficha con datos clínicos y epidemiológicos
del paciente, la efecha y asegurarse que llegara a su destino en el menor tiempo posible; no
refrigerar.
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• INFORME DE RESULTADOS:
El resultado del diagnóstico será remitido en dos copias:
- al Programa de Control de las Leishmaniosis de la Dirección de Vigilancia
Epidemiológica o Dirección de Control de enfermedades.
- A los remitentes del Nivel I, para el tratamiento del paciente y la
correspondiente inclusión en la Historia Clínica para fines estadísticos y
epidemiológicos.
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MINISTERIO DE SALUD Y PREVISIÓN SOCIAL
Red Nacional de Laboratorios de Salud (Leishmaniosis)
Nombre y apellidos: ...............................................................................................
Edad: ...................................... Municipio: ...................................
Distrito: ......................... Área: ................ Sector: ........................................
Servicio de Salud: .................................................................................................
Responsable del Programa: .................................................................................
Examen solicitado.................................................................................................
Fecha: ..................................................................................................................
RESULTADOS
• Descripción de a muestra:
______________________________________________________________
• Frotis:
( ) Negativo ( ) Positivo, ................cruces
Interpretación del frotis:
-Resultado Negativo: (-) No se observan formas parasitarias en 1.000 campos observados, o en un mínimo de
30 minutos de observación.
-Resultado: (+) observación de ocasionales o escasos amastigotes solos o en pequeños grupos en forma
intracelular (Macrófagos) o extracelular, 1 a 10 parásitos en 1.000 campos observados.
-Resultado (++) observación entre 1 a 10 amastigotes en 100 campos observados en forma intra o
extracelular.
-Resultado: (+++) se observan abundantes amastigotes en nidos intra y extra celulares, 1 a 10 amastigotes en
10 campos observados.
-Resultado: (++++) se observan de 1 a 10 parásitos por campo
-Resultado (+++++) se observan de 10 a 100 parásitos por campo
-Resultado (++++++) se observan más de 100 parásitos por campo
________________________________________________________________
• Intradermo reacción de Montenegro (Leishmanina)
( ) Negativo ( ) Positivo, ........ milímetros
La lectura se realiza a las 48 o 72 horas y se considera positivo si la induración es mayor a 5
milímetros.
_______________________________________________________________
• Biopsia (Histopatologia)
______________________________________________________________
• Inmunofluorescencia indirecta: (IFI)
• Enzimo inmuno ensayo (ELISA):
_______________________________________________________________
CONCLUSIONES:
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G. MERITO FOTOGRAFICO:
Diseño de la carátula Mollinedo S. y Aranda R.; Formas clínicas de Leishmaniosis
presentes en Bolivia
Fotografía 20.- Dr. Bermúdez; Tubos Vacutainer con medio NNN, para realización de
cultivo en casos especiales en el I Nivel de atención.
Todas las restantes fotografías fueron realizadas por el Dr. Sergio Mollinedo.
Fotografía 1.- Toma de muestra por “punción rotación” por medio de palo (escarba
dientes), para realizar frotis en búsqueda de amastigotes, tobillo izquierdo, Hospital Virgen
de Chaguaya, Bermejo, Tarija.
Fotografía 2.- Toma de muestra por “punción rotación” por medio de palo (escarba
dientes), para realizar frotis en búsqueda de amastigotes, pierna izquierda, Palos Blancos,
La Paz.
Fotografía 3.- Toma de muestra por “raspado” con borde posterior de lanceta, en borde de
la úlcera en codo izquierdo, para realización de frotis y búsqueda de amastigotes, Hospital
Virgen de Chaguaya, Bermejo, Tarija.
Fotografía 4.- Toma de muestra por “raspado” con borde posterior de lanceta, en borde de
la úlcera en pierna, para realización de frotis y búsqueda de amastigotes, Hospital Virgen de
Chaguaya, Bermejo, Tarija.
Fotografía 5.- Presión entre dos dedos del borde de la úlcera (halo inflamatorio o rodete),
hasta que se vuelva pálida (isquemia), teniendo listo el bisturi
Fotografía 6.- Corte con bisturí y raspado en el borde de la úlcera en halo inflamatorio o
rodete.
Fotografía 7.- Toma de muestra para frotis por medio de “Punción Aspiración” en borde de
la úlcera
Fotografía 8.- Materiales para realización de biopsia (punch biopsy descartable y mortero)
Fotografía 9.- Biopsia del borde activo de la úlcera
Fotografía 10.- Tubos con medio de cultivo NNN
Fotografía 11.- Técnico realizando lectura al microscopio de frotis teñidos con Giemsa, en
búsqueda de amastigotes, delante de el tiene láminas de referencia.
Fotografía 12.- Rosaceas (grupos de promastigotes unidos por sus flagelos) en medio de
cultivo.
Fotografía 13.- Animal de laboratorio (Hamster) con lesiones en pata delantera y hocico
Fotografía 14.- Patas de animal de laboratorio (Hamster) tras haber sido inoculado con
Leishmania amazonensis con importantes lesiones “en guante de boxeador”
Fotografía 15.- Nidos de amastigotes en corte de tejido observados al microscopio
Fotografía 16.- Inoculación de la IDR de Montenegro en tercio medio, cara anterior de
antebrazo, formación del habon
Fotografía 17.- Medición de la reacción cutánea (induración) de la IDR de Montenegro a
las 72 horas.
Fotografía 18.- Promastigotes observado en microscopio de Inmunofluorescencia, después
de realización de la técnica de (IFI).
Fotografía 19.- Envío de placas (láminas de frotis), para su lectura o control de calidad
Fotografía 21.- Tinción Giemsa, Técnicos diluyendo la solución madre; Riberalta, Beni
Laboratorio Nacional de Parasitología y Entomología
(LANPE) Página 39 07/12/2003

H.BIBLIOGRAFIA:
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ANEXO 1: REACTIVOS DE COLORACION:
Tinción Giemsa:
• Solución GIEMSA de stock o solución madre:
- Giemsa, colorante en polvo ............. 0,75 g
- Alcohol metílico puro ...................... 65 mL
- Glicerina pura .................................. 35 mL
Se disuelve el polvo de giemsa en el alcohol y la glicerina y la solución se la guarda
en un frasco oscuro (color ámbar) con perlas de vidrio dentro, bien tapado y deberá
agitarse de 6 a 10 veces al día para que se mezcle completamente hasta obtener una
mezcla homogenea; al tercer día podrá usarse previa filtración del preparado.
• Solución de Trabajo o Giemsa diluido :
- Solución Giemsa de stock .................................. 1 mL
- Agua destilada o Buffer fosfato pH 7,2 a 7,4 ..... 9mL
De acuerdo a la cantidad de placas a procesar se sugiere preparar una cantidad de reactivo
adecuada a cada necesidad, mezclar antes de usar.
• Solución Buffer Fosfato PBS pH 7.2-7.4 ( Agua Mineral):
- Na HPO4 ..................................................... 6.0 g
- Kh2po4 ......................................................... 5.0 g
Mezclar las sales, pesar 1 g de la mezcla y distribuir en pequeños tubos o viales.
Disolver el contenido de cada uno de estos tubos en un litro de agua destilada. Este buffer
tendrá un pH de 7.2 a 7.4. Debido al problema que implica la obtención de solución Buffer
hemos hecho experiencias con diferentes aguas minerales comerciales , teniendo buenos
resultados cuando esta tiene un pH próximo a 7,2 y 7,4, por lo que recomendamos su
utilización.
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ANEXO 2. MEDIOS DE CULTIVO
En nuestro recorrido a nivel nacional, hemos podido apreciar que nuestro personal del
Sistema nacional de Salud tiene notable capacidad para realizar estas pruebas, solamente le
faltaba la guía técnica, por lo anotado describiremos en detalle las técnicas de aislamiento
de las Leishmanias.
Para el aislamiento por cultivo de las leishmanias requerimos de 3 componentes:
• SOLUCION FISIOLOGICA 0.85%: Si no tiene solución fisiológica, prepara tu propia
solución
- ClNa .................................................. 0.85 g
- Agua destilada ................................... 100 g
Diluir y autoclavar.
• SOLUCION STOCK DE ANTIBIOTICOS :
- Sulfato de Estreptomicina ....................... 0.5 g
- Penicilina Sódica ..................................... 0.5 g
- Agua destilada estéril ............................... 10 mL
Usar 1 ml de la solución para 100 ml de solución salina.
• MEDIO NNN:
- Bacto agar ............................................. 1.4 g
- Cloruro de sodio .................................... 0.6 g
- Agua destilada ....................................... 90 mL
- Sangre defibrinada de conejo ................. 13.5 mL
- Solución stock de antibióticos ............... 1 mL
La sangre de conejo se obtiene por punción cardiaca, esta se vierte en un matraz o
balón estéril, el cual, contiene perlas de vidrio. Para desfibrinar la sangre se agita
suavemente con movimientos rotatorios, durante 10 minutos. Separar 15 mL en una
probeta estéril.
PREPARACION :
- Diluir el agar y autoclavar a 121ºC por 20 minutos.
- Dejar enfriar a temperatura ambiente; cuando alcance los 56ºC
aproximadamente, agregar los 15 mL de sangre desfibrada y 1 mL de la
solución stock de antibióticos.
- Homogenizar y repartir aproximadamente 1 mL del medio en tubos de cultivo
de 13 x 100 con tapa rosca.
- Colocar los tubos en plano inclinado y dejar al medio ambiente por 2 horas.
- Controlar si hay contaminación bacteriana en estufa a 37ºC por 24 horas
- Conservar los tubos en refrigeración (4ºC) hasta el momento de uso.
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