Técnicas en el laboratorio de autoinmunidad.
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VI JORNADA DE<br />
FORMACIÓN<br />
INTERHOSPITALARIA<br />
DEL LABORATORIO<br />
CLÍNICO
3. TÉCNICAS EN EL LABORATORIO<br />
DE AUTOINMUNIDAD<br />
PATRICIA MORAIS FERREIRA<br />
RI. BIOQUÍMICA CLÍNICA
PRINCIPALES TÉCNICAS DE<br />
INMUNOANÁLISIS<br />
Aglutinación<br />
Inmunoprecipitación <strong>en</strong> medio líquido<br />
Turbidimetría<br />
Nef<strong>el</strong>ometría<br />
Inmunodifusión doble<br />
Contrainmuno<strong>el</strong>ectroforesis<br />
Inmunofluoresc<strong>en</strong>cia<br />
Citometría <strong>de</strong> flujo<br />
Inmunoanálisis con indicadores marcados<br />
ELISA<br />
Inmunotransfer<strong>en</strong>cia<br />
Western blot, Slot blot
AGLUTINACIÓN<br />
Primeras técnicas empleadas <strong>en</strong> los estudios <strong>de</strong><br />
<strong>autoinmunidad</strong>.<br />
Antíg<strong>en</strong>o particulado + Acs agregados<br />
macroscópicos con aglutinación.
Se realiza g<strong>en</strong>eralm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> placa, también <strong>en</strong> tubo.<br />
Se mezcla la susp<strong>en</strong>sión <strong>de</strong> células o partículas<br />
con <strong>el</strong> suero. Se hace oscilar la placa durante unos<br />
minutos y se observa la aglutinación.<br />
V<strong>en</strong>tajas:<br />
facilidad <strong>de</strong> realización<br />
no equipami<strong>en</strong>to<br />
Desv<strong>en</strong>tajas:<br />
baja s<strong>en</strong>sibilidad<br />
dificultad <strong>de</strong> cuantificar
APLICACIONES<br />
Detección d<strong>el</strong> factor reumatoi<strong>de</strong> isotipo IgM<br />
aglutina partículas recubiertas con IgG humana.<br />
Determinación anticuerpos contra <strong>el</strong> núcleo<br />
(ANA).<br />
Algunos anticuerpos específicos <strong>de</strong> órgano.<br />
Anticuerpos contra la actina.<br />
Anticuerpos contra los espermatozoi<strong>de</strong>s.
INMUNOPRECIPITACIÓN<br />
Antíg<strong>en</strong>o soluble + Anticuerpos<br />
precipitación
ZONA DE EQUIVALENCIA
INMUNOPRECIPITACIÓN<br />
EN MEDIO LÍQUIDO<br />
TURBIDIMETRÍA<br />
Mi<strong>de</strong> la disminución <strong>de</strong> la int<strong>en</strong>sidad <strong>de</strong> la luz cuando<br />
atraviesa una solución proporcional a la cantidad y<br />
tamaño <strong>de</strong> las partículas.<br />
NEFELOMETRÍA<br />
Mi<strong>de</strong> la luz dispersada a diversos ángulos por la<br />
susp<strong>en</strong>sión particulada proporcional a la conc<strong>en</strong>tración<br />
<strong>de</strong> partículas d<strong>el</strong> medio.
INMUNOPRECIPITACIÓN EN<br />
GELES
INMUNODIFUSIÓN DOBLE<br />
Patrón <strong>de</strong> id<strong>en</strong>tidad<br />
Patrón <strong>de</strong> disparidad<br />
Patrón <strong>de</strong><br />
semiid<strong>en</strong>tidad
CONTRAINMUNOELECTROFORESIS<br />
Migración <strong>el</strong>ectroforética<br />
Atg (-) ánodo (+)<br />
Ac (+) cátodo (-)<br />
Más s<strong>en</strong>sible que la inmunodifusión<br />
Cualitativa<br />
ANODO (+)<br />
CATODO (-)
INMUNOFLUORESCENCIA<br />
Emplea anticuerpos que llevan unidos compuestos<br />
fluoresc<strong>en</strong>tes o fluorocromos.<br />
Excitación Emisión<br />
Isotiocianato <strong>de</strong> fluoresceína 488nm 530nm<br />
Rodamina B 545nm 585nm<br />
Ficoeritrina 488nm 576nm<br />
‣ directa<br />
‣ indirecta
INMUNOFLUORESCENCIA<br />
INDIRECTA<br />
Aparición fluoresc<strong>en</strong>cia pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong><br />
autoanticuerpos<br />
Patrones <strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>cia<br />
posibilidad <strong>de</strong><br />
ori<strong>en</strong>tar y caracterizar <strong>el</strong> autoanticuerpo<br />
Corte <strong>de</strong> tejido<br />
Antiinmunoglobulina<br />
marcada
V<strong>en</strong>tajas:<br />
posibilidad <strong>de</strong> discriminar <strong>en</strong>tre diversos<br />
patrones<br />
bu<strong>en</strong> método <strong>de</strong> escrutinio<br />
Desv<strong>en</strong>tajas:<br />
interpretación subjetiva<br />
marg<strong>en</strong> <strong>de</strong> refer<strong>en</strong>cia<br />
baja s<strong>en</strong>sibilidad<br />
difícil <strong>de</strong> estandarizar<br />
no es posible la automatización
ELISA<br />
Enzimoinmunoanálisis<br />
conjugación d<strong>el</strong> anticuerpo con un <strong>en</strong>zima que produce<br />
una reacción cuyo producto pue<strong>de</strong> ser medido<br />
espectofotométricam<strong>en</strong>te.<br />
Enzimas:<br />
peroxidasa <strong>de</strong> rábano<br />
fosfatasa alcalina<br />
B-galactosidasa<br />
G6PD
ELISA INDIRECTO<br />
+<br />
+<br />
E<br />
E<br />
suero<br />
antianticuerpo<br />
marcado<br />
Espectrofotometría<br />
450nm<br />
E<br />
E<br />
sustrato
Evaluación cuantitativa<br />
-curva <strong>de</strong> saturación <strong>de</strong> los calibradores :<br />
absorbancia <strong>de</strong> cada calibrador fr<strong>en</strong>te a su<br />
conc<strong>en</strong>tración.<br />
-la conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong> autoanticuerpos se<br />
obti<strong>en</strong>e al leerla <strong>en</strong> la curva <strong>de</strong> calibración.<br />
Evaluación cualitativa<br />
DOCut-off = DOCP* Factor
INMUNOTRANSFERENCIA<br />
La transfer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> proteínas o `blotting´ supone<br />
la inmovilización <strong>de</strong> las proteínas sobre<br />
membranas sintéticas ya sea mediante<br />
transfer<strong>en</strong>cia o mediante aplicación directa.<br />
Detección reacción antíg<strong>en</strong>o-anticuerpo:<br />
Métodos radioquímicos<br />
ionizantes.<br />
Enzimas peroxidasa, fosfatasa alcalina<br />
emit<strong>en</strong> radiaciones<br />
Reacción <strong>de</strong> quimioluminisc<strong>en</strong>cia y radiografía
WESTERN BLOT
SLOT BLOT
CITOMETRÍA DE FLUJO<br />
Tecnología que permite la <strong>de</strong>terminación<br />
simultánea <strong>de</strong> varios autoanticuerpos <strong>en</strong> células <strong>en</strong><br />
susp<strong>en</strong>sión mediante <strong>el</strong> empleo <strong>de</strong> fluorocromos..<br />
Utiliza conjuntos <strong>de</strong> microesferas <strong>de</strong> látex<br />
marcadas internam<strong>en</strong>te con difer<strong>en</strong>tes<br />
proporciones <strong>de</strong> dos fluorocromos.
iotina<br />
Atg<br />
suero<br />
estreptavidina-ficoeritrina<br />
576 nm
PARÁMETROS<br />
Dispersión frontal captada por la l<strong>en</strong>te d<strong>el</strong><br />
<strong>de</strong>tector Forward Scatter (FSC). En posición frontal<br />
respecto a la fu<strong>en</strong>te <strong>de</strong> luz. R<strong>el</strong>acionado con <strong>el</strong><br />
tamaño <strong>de</strong> la partícula.<br />
Dispersión lateral captada por <strong>el</strong> <strong>de</strong>tector Si<strong>de</strong><br />
Scatter (SSC). Medida r<strong>el</strong>ativa <strong>de</strong> la complejidad<br />
interna <strong>de</strong> la célula.<br />
Fluoresc<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> los dos fluorocromos internos <strong>de</strong><br />
las microesferas.<br />
Fluoresc<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> los conjugados unidos a las<br />
microesferas (<strong>de</strong>tectores <strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>cia).
láser Argón 488nm<br />
complejidad<br />
si<strong>de</strong> scatter<br />
FL1<br />
FL2<br />
FL3<br />
FL4<br />
forward scatter<br />
forward scatter<br />
tamaño
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