Funktionale Zelllinien durch neue ... - BIOspektrum

390 WISSENSCHAFT · SPECIAL: ZELLBIOLOGIE
Zellsysteme
Funktionale Zelllinien durch neue
Immortalisierungsprotokolle
TOBIAS MAY1 , HANSJÖRG HAUSER2 , DAGMAR WIRTH2 1INSCREENEX GMBH, BRAUNSCHWEIG
2HELMHOLTZ-ZENTRUM FÜR INFEKTIONSFORSCHUNG, BRAUNSCHWEIG
Cell lines are immortal cultures of cells that are used in research as well
as for production of pharmaceuticals. Currently available cell lines are
derived from normal and tumorous tissue of humans and diverse animal
species, however, with considerable loss of specific properties. The development
of new immortalization protocols has led to a significant improvement
of the properties of the resulting cell lines. These retain specific
properties and activities that include functional grafting.
10.1007/s12268-012-0199-3
© Springer-Verlag 2012
Verwendung von Zellen
ó Zellen sind unerlässliche Werkzeuge in
Forschung und Produktion. Sie werden
Tab. 1: Primäre Zellen und Zelllinien: Einsatz und Eigenschaften.
Forschung
• Genfunktionsanalysen
• Analyse von zellulären Vorgängen (z. B. Signaltransduktion)
• ...
Biotechnologie
• Virus/Vakzinproduktion
• Medikamentenentwicklung
– Validierung von Zielstrukturen
– Identifizierung von aktiven Substanzen
– Validierung
– Toxikologische Untersuchungen
• Produktion therapeutischer Proteine (z. B. Antikörper)
Therapie
• Zelltherapie
• Tissue Engineering
sowohl in der Grundlagenforschung als auch
in der angewandten Forschung verwendet. So
erlauben sie die Aufklärung von Signalwegen
primäre Zellen immortalisierte Zellen
+ physiologisch „authentisch“
+ funktionelle Transplantation
– begrenzte Reproduzierbarkeit
– - begrenzt verfügbar
– heterogene Zellpopulation
– begrenzt kultivierbar
– eingeschränkte Physiologie
– keine funktionelle Transplantation
– nicht für alle Zelltypen möglich
+ unbegrenzt verfügbar
+ klonierbar, homogene Zellpopulationen
+ kontrollierte genetische Manipulation
oder Differenzierungsprozessen, sie eignen
sich für die Untersuchung von biochemischen
Vorgängen und helfen, dynamische Prozesse
(quantitativ) zu verfolgen.
In der angewandten Forschung werden sie
in der gesamten Wertschöpfungskette der
Wirkstoffentwicklung verwendet. Sie unterstützen
die Target-Identifizierung und sind
essenzielle Werkzeuge für die Suche und Optimierung
von Wirkstoffkandidaten. Weiterhin
fungieren Zellen als Produktionsfabriken, um
therapeutische Wirkstoffe wie Zytokine oder
Antikörper herzustellen. Darüber hinaus werden
Zellen als solche bereits als therapeutische
Agenzien z. B. bei Knochenmarkstransplantationen
eingesetzt.
Vorhandene Zellsysteme
Zellen, die direkt dem Gewebe entnommen
und in Kultur gebracht werden, bezeichnet
man als primäre Zellen. Derzeit werden primäre
Zellen insbesondere dann eingesetzt,
wenn ein Testsystem mit einer in vivo ähnlichen
Physiologie benötigt wird (Tab. 1). Dieser
Vorteil geht jedoch mit verschiedenen
Nachteilen einher, zu denen die Limitation
der Zellzahl aufgrund der begrenzten Proliferationskapazität,
die schwierige und kostenintensive
Kultivierung und eine signifikante
Varianz des Zellmaterials von verschiedenen
Spendern gehören. Auf der anderen
Seite stehen immortalisierte Zellkulturen
in Form von Zelllinien: Diese Zellsysteme sind
unbegrenzt verfügbar, klonierbar, genetisch
manipulierbar und leicht handhabbar. Ihr
Nachteil ist, dass sich ihre Physiologie meist
gravierend von der in vivo-Situation unterscheidet.
Der Verlust der Funktionalität bei Standardzelllinien
beruht darauf, dass diese Zellen
entweder aus Tumormaterial gewonnen
wurden, durch die Überexpression von viralen
Onkogenen etabliert wurden oder durch
spontane Mutagenese (3T3-Protokoll). All diese
Veränderungen der Zellen sind von einer
erhöhten Mutationsrate begleitet, die langfristig
eine Instabilität des genetischen Materials,
aber auch eine hohe Adaptationsfähigkeit
bedingt. Die Instabilität der Zelllinien
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wird durch lange Kultivierungszeiten verstärkt.
Dies ist ein wichtiger Grund dafür, dass
sich der zelluläre Phänotyp in Standardzelllinien
deutlich von dem in vivo-Phänotyp
unterscheidet.
Alle in vitro-Zellkultivierungssysteme leiden
darunter, dass die Zellen ihrer natürlichen
Umgebung beraubt sind. Dies betrifft
sowohl das Fehlen des funktionalen Zell-Zell-
Kontakts wie auch die physiologischen Bedingungen
der unmittelbaren Umgebung. Neuerdings
versucht man zunehmend erfolgreich,
dies durch dreidimensionale Kultivierung,
Ko-Kultur mit anderen Zelltypen und das Einstellen
von Gas- und Nährstoffbedingungen
nachzustellen.
Entwicklung neuer Zelllinien mit
verbesserten Eigenschaften
Seit einigen Jahren wird versucht, die vorteilhaften
physiologischen Eigenschaften von
primären Zellen mit den Vorteilen von Zell -
linien, insbesondere deren Verfügbarkeit, Stabilität
und Homogenität zu kombinieren. Ein
wichtiger Schritt in diese Richtung war die
Immortalisierung von primären Zellen mittels
der katalytischen Untereinheit der humanen
Telomerase (hTert) [1]. Durch Überexpression
von hTert wird eine Verkürzung der Telo mere
verhindert, was ein wesentlicher Grund für
die limitierte Proliferationskapazität von primären
Zellen ist. Die Funktionalität der so
etablierten Zelllinien ist den auf herkömmlichem
Wege etablierten Zelllinien deutlich
überlegen. So konnte beispielsweise gezeigt
werden, dass mittels hTert immortalisierte
Endothelzellen ebenso wie adulte mesenchymale
Stammzellen weitgehend ihre Eigenschaften
bis hin zur in vivo-Funktionalität
erhalten [2, 3]. Allerdings können mittels
hTert nicht alle primären Zelltypen immortalisiert
werden [4].
Wir haben eine Methode entwickelt, die es
ermöglicht, neue Zelllinien aus verschiedenen
Geweben und Organismen zu etablieren.
Hierfür haben wir Gene identifiziert, die in
der Lage sind, primäre Zellen zur Proliferation
zu bringen, ohne dass weitere Mutationen für
die Immortalisierung notwendig sind. Diese
Gene werden mit rekombinanten Viren als
Transfervehikel in die primären Zellen eingebracht.
Anschließend werden die transduzierten
Zellen expandiert und selektiert.
Nicht-transduzierte Zellen werden entweder
durch Selektion auf ein ko-tranduziertes
Resistenzgen eliminiert, oder sie werden
durch ihre begrenzte Teilungsrate in Mischkulturen
mit den erfolgreich transduzierten,
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392 WISSENSCHAFT · SPECIAL: ZELLBIOLOGIE
A
C
Tab. 2: Übersicht über die Immortalisierung verschiedener Zelltypen
Zelltyp Immortalisierung
konstitutiv konditional
Fibroblasten
Endothelzellen
Osteoblasten
murin embryonal + +
murin Ohr + +
human Vorhaut + +
murin Lunge + +
murin Leber + +
human Lunge + +
human Nabelschnur + +
human Knochen + n. d.
hämatopoietische Stammzellen
murin Knochen + –
n. d.: nicht bestimmt
kontinuierlich proliferierenden, Zellen ausgedünnt.
Mit diesem Verfahren können innerhalb
von drei Monaten nach Transduktion der
Primärzellen neue Zelllinien gewonnen werden.
Diese neuen Zelllinien werden auf ihre
Funktionalität überprüft. Die bisher erhaltenen
Analysen zeigen vielversprechende
Ergebnisse, die beispielhaft in Abbildung 1
D
B
˚ Abb. 1: Biochemische und funktionelle Eigenschaften neuer Zelllinien. A, Kumulative Populationsverdoppelung von primären humanen Osteoblasten
und einer daraus etablierten humanen Osteoblastenzelllinie (immortalisierte Osteoblasten). B, Analyse von osteoblastenspezifischen Funktionen in der
immortalisierten Osteoblastenzelllinie. Analysiert wurden die Aktivität der Alkalischen Phosphatase (blaue Färbung der Zellen, links) sowie Kalziumeinlagerungen
(Alizarin-Rot-Färbung der Zellen, rechts). C, Ausbildung von gefäßähnlichen Strukturen durch konditional immortalisierte humane Endothelzellen
in vitro. D, Ausbildung von Gefäßen durch konditional immortalisierte humane Endothelzellen nach Implantation in die Maus. Die Detektion der
mit Luciferase markierten humanen Endothelzellen erfolgte durch eine Antikörperfärbung gegen Luciferase (rechts).
dargestellt und in Tabelle 2 zusammengefasst
sind.
Wachstumskontrollierte Zelllinien
Für zahlreiche Fragestellungen ist eine kontrollierte
Proliferation von Zelllinien wünschenswert.
Diese beinhalten z. B. die Synchronisierung
des Zellzyklus, das Konstant-
halten der Zellzahl während der Produktionsphase
in biotechnologischen Prozessen,
aber auch die Kontrolle der Teilungsrate nach
Transplantation von Zellen bei regenerativen
Anwendungen. Tatsächlich können Zelllinien
mit anpassbarer Proliferationsrate generiert
werden, indem die Aktivität der jeweiligen
Immortalisierungsgene z. B. durch Exzision
oder Temperaturänderung zeitlich begrenzt
wird [5–7] (Übersicht in [8]). Wir konnten
zeigen, dass eine reversible Immortalisierung
auch durch Verwendung von extern steuerbaren
Transkriptionsmodulen erzielt werden
kann (Abb. 2A). Eine besonders strikte Proliferationskontrolle
erlauben synthetische,
autoregulierte Transkriptionsmodule (Abb.
2B–D). Bei maximaler Konzentration des
Induktors ist das Expressionsmuster autoregulierter
Module nicht von dem der graduellen
Regulationsmodule zu unterscheiden. Bei
limitierenden Konzentrationen werden die
autoregulierten Module jedoch bimodal, das
heißt nur in einer Subpopulation der Zellen,
aktiviert, wobei die Expressionshöhe jedoch
in allen aktivierten Zellen maximal ist [9].
Mit dieser Methode haben wir reversibel proliferierende
Zelllinien hergestellt, deren
Wachstum nur durch die Zugabe des Induk-
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tors Doxycyclin gesteuert wird [4, 10]. In
Anwesenheit von Doxycyclin proliferieren
diese Zelllinien unbegrenzt. Kultiviert man
die Zellen dagegen in Abwesenheit von Doxycyclin,
so stellen sie die Proliferation ein –
können aber reaktiviert werden, sobald wieder
Doxycyclin gefüttert wird (Abb. 2C, D).
In der arretierten Phase können die Zellen je
nach Zelltyp bis zu über 50 Tage gehalten
werden. Am Beispiel von humanen Endothelzellen
konnten wir zeigen, dass auch diese
Zellen ihre zelltypspezifischen Eigenschaften
und Funktionen behalten und sogar
im Tiermodell gefäßähnliche Strukturen ausbilden
(Abb. 1C, D). Mit diesen neu entwickelten
Immortalisierungstechnologien können
somit Zellsysteme etabliert werden, die
die in vivo-Physiologie sehr viel besser widerspiegeln
und somit sowohl in der Grundlagen-
als auch in der angewandten Forschung
den Aufbau aussagekräftiger zellbasierter
in vitro-Tests ermöglichen. Langfristig bieten
sie die Möglichkeit, neue Therapiekonzepte
zu erarbeiten. ó
Literatur
[1] Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M et al. (1998) Extension
of life-span by introduction of telomerase into normal human
cells. Science 279:349–352
[2] Simonsen JL, Rosada C, Serakinci N et al. (2002)
Telomerase expression extends the proliferative life-span and
maintains the osteogenic potential of human bone marrow
stromal cells. Nat Biotechnol 20:592–596
[3] Yang J, Nagavarapu U, Relloma K et al. (2001) Telomerized
human microvasculature is functional in vivo. Nat Biotechnol
19:219–224
[4] May T, Butueva M, Bantner S et al. (2010) Synthetic gene
regulation circuits for control of cell expansion. Tissue Eng
Part A 16:441–452
[5] Noguchi H, Kobayashi N, Westerman KA et al. (2002)
Controlled expansion of human endothelial cell populations
by Cre-loxP-based reversible immortalization. Hum Gene Ther
13:321–334
[6] Rybkin II, Markham DW, Yan Z et al. (2003) Conditional
expression of SV40 T-antigen in mouse cardiomyocytes facilitates
an inducible switch from proliferation to differentiation.
J Biol Chem 278:15927–15934
[7] Westerman KA, Leboulch P (1996) Reversible immortalization
of mammalian cells mediated by retroviral transfer and
site-specific recombination. Proc Natl Acad Sci USA 93:8971–
8976
[8] Botezatu L, Sievers S, Gama-Norton L et al. (2011) Genetic
aspects of cell line development from a synthetic biology perspective.
Adv Biochem Eng Biotechnol 127:251–284
[9] May T, Eccleston L, Herrmann S et al. (2008) Bimodal and
hysteretic expression in mammalian cells from a synthetic
gene circuit. PLoS ONE 3:e2372
[10] May T, Hauser H, Wirth D (2004) Transcriptional control
of SV40 T-antigen expression allows a complete reversion of
immortalization. Nucleic Acids Res 32:5529–5538
Korrespondenzadresse:
Dr. Hansjörg Hauser
Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung – HZI
Abt. Genregulation und Differenzierung
Inhoffenstraße 7
D-38124 Braunschweig
Tel.: 0531-6181-5000
Fax: 0531-6181-5002
Hansjoerg.Hauser@helmholtz-hzi.de
BIOspektrum | 04.12 | 18. Jahrgang
A
C
˚ Abb. 2: Wachstumskontrolle in immortalisierten Zellen. A, Schema der kontrollierten Expansion
von Zellen im aktivierten (+) und inaktivierten Status (–). B, Darstellung einer autoregulierten
Immortalisierungskassette; nach Aktivierung (mit Doxycyclin) werden der Transaktivator rtTA
sowie das Immortalisierungsgen vom induzierbaren P TET -Promotor exprimiert. C, Zellwachstum
von konditional immortalisierten embryonalen Fibroblasten in An- bzw. Abwesenheit von Doxy -
cyclin. Die Färbung erfolgte durch Kristallviolett. D, Das An- bzw. Abschalten der Proliferationsgene
kann zu beliebigen Zeitpunkten (wiederholt) erfolgen und führt zum Wachstum bzw. Stillstand
der Kultur. Dox: Doxycyclin. Weitere Erklärungen im Text.
AUTOREN
B
D
Tobias May
1996–2001 Biochemiestudium, Universität Halle-Wittenberg. 2005 Promotion in der
Gruppe von Dr. D. Wirth am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung. 2005–2011
Postdoc in der Abteilung Genregulation und Differenzierung am Helmholtz-Zentrum für
Infektionsforschung. Seit 2011 Mitgeschäftsführer InSCREENeX GmbH, Braunschweig.
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Hansjörg Hauser
1968–1973 Studium der Lebensmitteltechnologie und Ernährungswissenschaft an der
Universität Hohenheim. 1977 Promotion an der Universität Konstanz in der Gruppe von
Prof. Dr. R. Knippers. 1978–1980 Postdoc mit Prof. Dr. G. Schütz am MPI für Molekulare
Genetik, Berlin, und am DKFZ, Heidelberg. 1981–1985 wissenschaftlicher Angestellter
an der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung (GBF), Braunschweig. 1986–
1994 Leiter der AG Genetik von Eukaryonten. Seit 1994 Leiter der Abteilung Genregulation
und Differenzierung, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig.
Dagmar Wirth
1982–1987 Chemiestudium an der TU Braunschweig. 1991 Promotion in der Gruppe
von Prof. Dr. J. Bode. 1991–1996 Postdoc in der AG Hauser der GBF in Braunschweig.
1996–1998 freiberuflich tätig in der biomedizinischen Forschung. 1999–2003 wissenschaftliche
Mitarbeiterin der Medizinischen Hochschule Hannover. Seit 2004 wissenschaftliche
Mitarbeiterin am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung; dort seit
2007 Leiterin der AG Modellsysteme für Infektion und Immunität.