Praktikum Mikroskopie/Forensische Mikroskopie

Praktikum Mikroskopie/Forensische Mikroskopie – SS 2012
Versuch A: Auflichtmikroskopie
1. Theoretische Grundlagen
1.1 Lichtmikroskopie
Das Lichtmikroskop setzt sich aus zwei verschiedenen optischen Elementen zusammen,
die das zu untersuchende Objekt in zwei Stufen vergrößert. Das Objektiv ist das dem
Gegenstand zugewandte Linsensystem, welches heutzutage aus bis zu 15 Einzellinsen
besteht und die erste Vergrößerungsstufe bildet. Durch das Objektiv entsteht ein
vergrößertes, umgekehrtes, reelles Bild in der Brennebene des Okulars. Das Okular ist das
dem Auge zugewandte Linsensystem, welches das Zwischenbild des Objektivs in der
zweiten Vergrößerungsstufe als Lupenschaltung zum virtuellen Endbild nachvergrößert
(Abb.1).
Abb. 1: Abbildung durch ein Mikroskop 1
Vergrößerung, Auflösung und Kontrast des Endbildes sind entscheidend für die Qualität
des Mikroskops.
1 P.v. Sendenhorst, Uni Hamburg
Hochschule
Bonn-Rhein-Sieg
University
of Applied Sciences
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Versuch A: Auflichtmikroskopie
Fachbereich
Angewandte Naturwissenschaften
Versuchsvorschrift Mikroskopie
Versuch A – Auflichtmikroskopie
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Vergrößerung: Die Vergrößerung des Objektivs wird durch eine Maßstabszahl oder den
Abbildungsmaßstab ausgedrückt, welche das Größenverhältnis des Zwischenbildes zum
Präparat angibt. Die Nachvergrößerung wird durch die Lupenvergrößerung des Okulars
bestimmt, bezogen auf eine Betrachtungsentfernung von 25 cm (= Bezugssehweite des
Menschen). Die Gesamtvergrößerung der Abbildung ergibt sich aus der Multiplikation der
Maßstabszahl und der Lupenvergrößerung. Manchmal beinhaltet der Tubus ein weiteres
Linsensystem, dessen zusätzliche Vergrößerung (Tubusfaktor) berücksichtigt werden muss.
Auflösungsvermögen: Wichtiger noch als die Vergrößerung des Mikroskops ist sein
Auflösungsvermögen, denn eine reine Vergrößerung des Präparates ohne eine Zunahme
an Informationen des vergrößerten Bereiches ist nicht von Nutzen. Diese Art der
Vergrößerung, die keine neuen Erkenntnisse des vergrößerten Bereiches mit sich bringt,
wird auch leere Vergrößerung genannt. Laut Abbe über die Bildentstehung im Mikroskop ist
eine Darstellung der Objektstruktur im sekundären Bild nur durch das Entstehen von
Beugungsspektren des beleuchteten Objektes möglich. Kann also durch das Objektiv nur
das zentrale ungebeugte Licht durchtreten, so erkennt man im Mikroskop nur eine
gleichmäßig helle Fläche ohne jede Struktur. Die Struktur wird deutlicher, je mehr
Ordnungen des gebeugten Lichtes vom Objektiv erfasst und zur Abbildung verwendet
werden.
Unter dem Auflösungsvermögen d wird der Abstand zweier Objektpunkte verstanden, der
gerade noch als getrennt wahrnehmbar ist. Das Auflösungsvermögen beim menschlichen
Auge liegt bei

Abb.2: Numerische Apertur von Objektiven; A: Trockenobjektiv; B: Ölimmersionsobjektiv 2
Abb.3: Unterschiedliche Öffnungswinkel an Objektiven 3
Kontrast: Auch bei ausreichender Vergrößerung und guter Auflösung ist ein mikroskopisches
Objekt nur dann gut sichtbar, wenn der Kontrast stark genug ist, d.h. wenn sich
das Objekt aufgrund von Helligkeits- und Farbunterschieden deutlich von seiner Umgebung
abhebt. Diese Objekte werden auch Amplitudenobjekte genannt. Objekte, die sehr
kontrastarm sind und die Intensität des durchscheinenden Lichtes kaum verändern, können
mit einem normalen Durchlichtmikroskop nicht betrachtet werden. Aufgrund ihrer höheren
optischen Dichte jedoch kommt es beim Durchgang des Lichtes zu einer
Phasenverschiebung, die mit Hilfe des Phasenkontrastverfahrens sichtbar gemacht werden
kann. Diese Objekte werden Phasenobjekte genannt.
Einteilung und Kennzeichnung der Objektive: Objektive werden nach ihrer
chromatischen Korrektur (Korrektur der Abbildungsfehler) in Achromate, Fluorite und
Apochromate eingeteilt. Die Vorsilbe Plan- bedeutet, dass das Objektiv auch die
Bildfeldwölbung korrigiert. Achromate korrigieren die chromatische Aberration im gelben
und grünen Bereich, Apochromate im blauen, gelben und roten Bereich. Fluorite verringern
die chromatische Längsabweichung. Alle charakteristischen Größen, wie Apertur und
vorgeschriebene Deckglasdicke müssen durch Gravur auf der Objektivfassung
gekennzeichnet sein (Abb.4).
2 E. Bast; Mikrobiologische Methoden
3 http://www.mikroskopie.de
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Abb.4: Objektiv mit 100- facher Vergrösserung, Apertur = 0,75
Mikroskopobjektive für Auflicht sind am Zusatz “Epi“ zu erkennen. Sie unterscheiden sich
von den Objektiven für Durchlicht hauptsächlich in zwei Eigenschaften:
1. Ihre Linsenoberflächen sind besonderes gut entspiegelt, damit das von der Leuchte
kommende Licht nicht in Richtung Okular reflektiert wird.
2. Diese Objektive sind für “unbedeckte Objekte“ ausgelegt (Oberflächenproben werden
ohne Deckgläschen betrachtet).
1.2 Auflichtmikroskopie-Verfahren
Auflicht: Am häufigsten wird in den Naturwissenschaften das Durchlichtverfahren
verwendet. Ist das Präparat jedoch undurchsichtig oder besitzt ein größeres Volumen, so
wird die Auflichtmikroskopie angewendet (Metallproben, Kunststoffe, Keramik). Hier kann
zwischen der Hellfeld- und Dunkelfeldmikroskopie unterschieden werden.
Bei der Hellfeldmikroskopie (HF) ist die Beleuchtung fast senkrecht über dem Objekt
angebracht. Das Feld erscheint also hell bis auf die Stellen, an denen das Licht durch
Brechung, Beugung oder Reflexion an der Oberfläche des Objektes soweit abgelenkt wird,
dass es vom Objektiv nicht mehr erfasst werden kann.
Bei der Dunkelfeldmikroskopie (DF) sind die Beleuchtungsstrahlen stärker geneigt. Das
Objektfeld erscheint dunkel, bis auf die Stellen, an denen ebenfalls durch Reflexion,
Brechung oder Beugung die Strahlen so abgelenkt werden, dass sie vom Objektiv erfasst
werden können. Die Blendung des Auges wird hier vermieden, so dass kleinere
Objektteilchen besser wahrgenommen werden können.
Abb. 5: Schematische Darstellung der Strahlenführung im
a) Hellfeld, b) Hellfeld mit Prisma c) Dunkelfeld
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Differentieller Interferenzkontrast: Am häufigsten wird der Differentielle
Interferenzkontrast (DIC) nach Nomarski benutzt. Der Lichtstrahl wird vor dem Durchgang
durch das Objektiv durch ein spezielles Prisma (Wollaston Prisma) in zwei Teilstrahlen
zerlegt, die auf zwei verschiedenen Punkten der Objektoberfläche reflektiert werden, d.h.
sie sind leicht versetzt wodurch von jedem Punkt der Oberfläche eine Art Zwillingsbild
erzeugt wird. Bei der Rückführung dieser um einen kleinen, also differierenden Betrag
versetzten nun miteinander interferierenden Strahlen führen durch Höhenunterschiede
unterschiedliche Amplituden zu einer Kontrastierung. Feinste Oberflächentopographien
können so sichtbar gemacht werden. Die zwischen diesen beiden Strahlen auftretende
Phasendifferenz kann durch das am Mikroskop befindliche eingeschobene Wollastonprisma
kontinuierlich verändert werden. (Bild 6)
Abb. 6: Prinzipieller Strahlengang im Differentiellen Interferenzkontrast
Im Gegensatz zu der Durchlichtvariante bei der die DIK Anordnung aus zwei
Wollastonprismen, Kondensor und Objektiv bestehen muss bei der Auflichtvariante das
Objektiv die Kondensor Aufgabe übernehmen und das Wollastonprisma sowohl die Teilung
als auch die Vereinigung der reflektierten Strahlen ermöglichen.
Stereomikroskope: Diese Mikroskope besitzen zwei Tuben mit je einem Objektiv und
einem Okular, die im Winkel zwischen 14°-16° zueinander angebracht sind und dadurch die
räumliche Darstellung des Präparates ermöglichen. Im Gegensatz zu anderen
Mikroskopen, bei denen der Tiefenschärfebereich zugunsten der höheren Apertur recht
gering ist, verzichtet man beim Stereomikroskop auf stark vergrößernde Objektive, um eine
erhöhte Tiefenschärfe zu erreichen. Durch den zweifachen getrennten Strahlengang wird
ein wirkliches dreidimensionales Bild erzeugt. Größere Proben mit ausgeprägter
Topographie können so ohne vorhergehende Präparation untersucht werden. Im Gegensatz
zur „Monomikroskopie“ kann hier die Vergrößerung stufenlos gewählt werden um Ebene für
Ebene zu fokussieren und somit gleichmäßig zu analysieren.
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Messmikroskope: Messmikroskope werden zur unmittelbaren Messung von Strecken und
kleinen Winkeln verwendet. Ihre Vergrößerung ist eher mäßig. Als Messmittel werden in der
Brennebene des Okulars Strichmarken, Teilungen oder Kreuze angebracht.
2. Beispielhafte Konfiguration eines Auflichtmikroskops
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1. Okular
2. Binokularer Fototubus
3. Fotoausgang für Fotokamera
4. Schubstange zum Umschalten des Strahlengangs
5. Auflichteinrichtung
6. Leuchtfeldblende
7. Aperturblende
8. Filterschieber
9. Beleuchtungsquelle
10. Stativ
11. Lampenspannungsanzeige
12. Regler Beleuchtungsstärke
13. Ein/ausschalter
14. Reflektorschieber H
15. Reflektorschieber H DIC (oder H D)
Abb.7: Bestandteile des Mikroskops 5
5 Werkfoto Axiotech, Carl Zeiss
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16. Neutralfilter
17. /
18. Filterschieber
19. Reflektorschieber HD DIC
20. Kompensator Pol
21. Kompensator DIC
22. Schutzschieber
23. Deckel
24. Schieber DIC Campens
25. Schieber DIC
26. Kreuztisch
27. Deckel
28. Objektivrevolver
29. Koaxialtrieb
30. Koaxialer grob/ Feintrieb
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3. Versuchsdurchführung und Aufgabenstellung
Einführung in folgende Verfahren der Mikroskopie anhand spezieller Proben
- Hellfeld
- Dunkelfeld
- DIC
In diesem Versuch sollen verschiedene Arten der Mikroskopie auf ihre Funktionsweise hin
miteinander verglichen werden. Zur Verfügung hierfür stehen ein Stereomikroskop, ein
Auflichtmikroskop (Hell- und Dunkelfeld, DIC).
Nach der Einführung in die Handhabung der Mikroskope und ihrer einzelnen
Kontrastverfahren wird es Ihre Aufgabe sein an Hand unterschiedlicher Proben festzustellen
welche Verfahren sich für welches Material, bzw. welcher Präparationsvariante am Besten
eignen. Hier sind die Hauptkriterien der Informationsgrad der Darstellung, der sich aus
Topographieinformation, Aussagen über die Phasenzusammensetzung, Partikeldarstellung
oder auch Grad der Artefakte zusammensetzt.
4. Literaturangaben
1 P.v. Sendenhorst, Uni Hamburg
2 E. Bast; Mikrobiologische Methoden
3 http://www.mikroskopie.de
4 Werkfoto Carl Zeiss
5 Werkfoto Axiotech, Carl Zeiss
Folgende Leistungen müssen zum erfolgreichen bestehen des Praktikums erbracht werden:
1. Jeder Studierende muss das im Anhang befindliche Protokoll ausgedruckt mitbringen
und bis zum Ende des Praktikums testierfähig ausfüllen!
2. Der Arbeitsplatz ist sauber und aufgeräumt.
3. Jeder Studierende muss das schriftliche Nachtestat, welches 15 Minuten vor Ende des
Praktikums stattfindet erfolgreich (mit max. drei Fehlern) bestehen!
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5. Bedienungsanleitung für die unterschiedlichen Verfahren
5.1 Hellfeld
Reflektorschieber HD DIC in Stellung Hellfeld bringen(Kennzeichnung H muss
sichtbar sein)
Kontrastreiches Präparat auf den Objekttisch legen
Binokulartubus anhand der aufgedruckten Skala oder durch Probieren auf den
Augenabstand des Beobachters einstellen. (Hinweis: die Okularblenden im
Tubus müssen einen Kreis bilden)
Aperturblende durch Ziehen der Schubstange halb schliessen
Leuchtfeldblende durch Verdrehen des Stellrades schließen
Durch Drehen des Grob/Feintriebes die Leuchtfeldblende im Sehfeld scharf
stellen
Mit den beiden Zentrierschrauben das Blendenbild in die Sehfeldmitte bringen
Leuchtfeldblende öffnen bis deren Bild gerade aus dem Sehfeld verschwindet
Mit dem Feintrieb auf das Präparat fokussieren
Bildhelligkeit anpassen
Bitte achten Sie darauf, dass die Bildhelligkeit nicht mit der Aperturblende geregelt wird, da
diese ausschließlich für die Einstellung des Kontrastes verwendet wird.
5.2 Dunkelfeld
5.3 DIK
Licht – oder Dämpfungsfilter entfernen bzw. auf Durchgang schalten
Reflektorschieber auf Position Dunkelfeld ,Kennzeichen D, positionieren
Leuchtfeldblende und Aperturblende vollständig öffnen
Beleuchtungsstärke anpassen
Objekt fokussieren
Wichtig: Vor dem Wechsel von Dunkelfeld auf Hellfeld immer die
Beleuchtungsstärke reduzieren
Licht – oder Dämpfungsfilter entfernen bzw. auf Durchgang schalten
Reflektorschieber in DIC Stellung schieben
Stark reflektierendes Objekt auf den Objekttisch auflegen und fokussieren
Schutzschieber gegen den Kompensator DIC austauschen und auf erste Stufe
einrasten (Kompensator ist noch inaktiv)
Schieber DIC bis zum Anschlag einschieben
Objekt fokussieren
Großer Rändelrad am Schieber DIC verdrehen, bis die Feldmitte am dunkelsten
erscheint
Kleines Rändelrad so verdrehen, bis das Sehfeld eine einheitliche
Helligkeitsverteilung aufweist (hier muss manchmal zwischen dem großen und
dem kleinen Rad probiert werden)
Mit dem großen Rändelrad den günstigsten Kontrast einstellen
Für die Umwandlung von Graukontrasten in Farbkontraste den Kompensator
ganz einschieben
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Namen: _________________ ________________ _________________
Matr.-Nr: _________________ _________________ _________________
Studiengang: CM □ Nat. For. □
1. Ziel des Praktikums
2. Versuchsdurchführung
Hochschule
Bonn-Rhein-Sieg
University
of Applied Sciences
(Verwendete Geräte, Proben, Vorgehensweise)
3. Diskussion der Ergebnisse
4. Zusammenfassung / Fazit
Fachbereich
Angewandte Naturwissenschaften
Versuchsprotokoll Mikroskopie
Versuch A – Auflichtmikroskopie
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Versuch A: Auflichtmikroskopie

Vergleichen Sie die drei Kontrastverfahren in zwei frei wählbaren Vergrößerungen anhand der
3 gegebenen Proben.
Material Vergrößerung Verfahren Kommentar
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Versuch A: Auflichtmikroskopie

Material Vergrößerung Verfahren Kommentar
Der Arbeitsplatz ist sauber und aufgeräumt.
Testat
Datum:________________ Unterschrift:________________________________________
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Versuch A: Auflichtmikroskopie