Charakterisierung von Urease - funnycreature.de

Biochemisches
Biochemisches
Grun Grundpraktikum
Grun praktikum
Versuch Versuch Nummer Nummer GG-03
G 03 03: 03
Charakterisierung Charakterisierung von von Urease
Urease

Versuch Nummer G-03 03 BC-Grundpraktikum
Inhalt:
I. Theoretische Grundlagen.................................................................................. 2
II. Versuchsziele, Aufgaben ................................................................................... 3
a) Ansetzen verschiedener Lösungen ............................................................................. 3
b) Bestimmung der günstigsten Verdünnung................................................................... 3
c) Aktivitätsbestimmung der Urease................................................................................ 3
d) Einfluß von Cu 2+ -Ionen und Cystein auf die Ureaseaktivität ........................................ 3
III. Versuchsdurchführung...................................................................................... 4
e) Benötigte Lösungen .................................................................................................... 4
f) Günstigste Verdünnung .............................................................................................. 4
g) Aktivitätsbestimmung .................................................................................................. 4
h) Einflußfaktor Cu 2+ auf die Aktivität............................................................................... 5
IV. Meßergebnisse ................................................................................................... 5
a) Meßwerte.................................................................................................................... 5
b) Beobachtungen........................................................................................................... 6
V. Auswertung......................................................................................................... 6
a) Enzymaktivität............................................................................................................. 6
VI. Diskussion .......................................................................................................... 7
a) Aktivität .......................................................................................................................7
b) Einfluß von Cu 2+ -Ionen................................................................................................ 7
VII. Anhang ................................................................................................................ 8
Meßwerte der Extinktionen................................................................................................. 8
Auswertung der Steigungen ............................................................................................... 8
Diagramm 1 ....................................................................................................................... 9
Diagramme 2-5 ................................................................................................................ 10
Michaelis-Menten (Diagramm 6) ...................................................................................... 12
Lineweaver-Burk (Diagramm 7)........................................................................................ 12
pH-Werte ......................................................................................................................... 13
Diagramm 8 ..................................................................................................................... 13
Diagramm 9 ..................................................................................................................... 13
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Versuch Nummer G-03 03 BC-Grundpraktikum
I. Theoretische Grundlagen
Urease ist eine Desaminase und katalysiert die Hydrolyse von Harnstoff zu Carbaminsäure
und Ammoniak. Carbaminsäure zerfällt spontan zu Ammoniak und Kohlensäure:
(H2N)2CO + H2O H2NCOOH + NH3
H2O
NH3 + H2CO3
Bei allen in der Natur vorkommenden Ureasen enthält das aktive Zentrum zwei Nickelionen,
die über die Carboxylatseitenkette eines ungewöhnlichen Lysinrestes miteinander verbunden
sind. Außerdem ist das eine Nickelion mit zwei Histidin-Resten und einem Wassermolekül
koordiniert, das andere ebenfalls mit zwei Histidin-Resten, dem gleichen Wassermolekül
und zusätzlich einem Aspartat-Rest:
Für die Katalyse der Harnstoffspaltung wurde folgender Mechanismus postuliert:
Harnstoff wird an ein Nickelion gebunden,
während das Wassermolekül mit dem zweiten
Nickelion koordiniert bleibt. Ein in der Nähe
des aktiven Zentrums befindlicher Histidin-Rest
bewirkt die Abspaltung eines Protons vom
Wasser; es entsteht eine nucleophile OH-
Gruppe, die das Carbonyl-C-Atom des
Harnstoffs angreift. Daraus resultiert ein
tetraedrischer Zwischenzustand, der durch
beide Nickelionen koordiniert ist. Eine weitere
im Zentrum positionierte Base gibt ein Proton
an das Intermediat ab, so daß Ammoniak
abgespalten werden kann. Zugleich entsteht
Carbamat, das durch Wasser ersetzt und
dadurch freigesetzt wird.
Für die Aktivität der Urease sind vor allem intakte Cystein-SH-Gruppen von Bedeutung.
In der Zelle werden diese durch das Reduktionspotential und die Anwesenheit anderer SH-
Gruppen vor der Oxidation geschützt. Oxidation bedeutet die Bildung von inaktiven Disulfidbrücken:
2 Enz-SH → Enz-S-S-Enz + 2 H⋅
aktiv inaktiv
Unter Einfluß von Schwermetallionen entstehen ebenfalls inaktive Mercaptidderivate, wie
z.B. mit Silberionen:
Enz-SH + Ag + -> Enz-S-Ag + + H +
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Versuch Nummer G-03 03 BC-Grundpraktikum
Der Anwesenheit von zweiwertigen Schwermetallionen, die über eine Aktivierung von
Sauerstoffmolekülen auch die Bildung von Disulfidbrücken beschleunigen, wird durch Zugabe
von EDTA entgegengewirkt. Es bildet mit diesen Ionen Komplexe, die sehr stabil sind.
Der Zusatz von SH-haltigen Reagenzien wie Dithiothreitol oder 2-Mercaptoethanol verhindert
die Oxidation der Cysteine im Enzym, da diese Stoffe eher oxidiert werden können.
Strukturformeln der SH-haltigen Hilfssubstanzen:
HOC H2
C
H 2
SH HSC H2
Mercaptoethanol Dithiothreitol
Die Gehaltsbestimmung erfolgt über den sog. gekoppelten optischen Test, bei dem nicht die
eigentlich zu untersuchende Reaktion die Meßdaten liefert, sondern eine zweite Hilfsreaktion
(Indikatorreaktion). In diesem Fall wird ein zweites Enzym, die Glutamatdehydrogenase
benötigt. Sie setzt unter Ammoniakverbrauch !-Ketoglutarat in Glutamat um:
(H2N)2CO + H2O + 2 H + CO2 + 2 NH4 +
2 NH4 + + 2 !-Ketoglutarat + 2 NADH 2 Glutamat + 2 H2O + 2 NAD +
Die Komponente, die spektroskopisch bestimmt wird, ist das Redoxpaar NADH " NAD +.
Durch die Reduktion des NAD + zu NADH erscheint eine zusätzliche Absorptionsbande bei
340 nm, während NAD + lediglich bei 240 nm ein Maximum
aufweist. Durch die Extinktionsänderung kann
daher auf die Menge des vorhandenen NADH und
somit auf die umgesetzte Menge Harnstoff geschlossen
werden. Hierbei ist die Stöchiometrie zu beachten, da
pro Mol Harnstoff zwei Mol Ammoniak gebildet und
daher 2 Mol NADH oxidiert werden. Eine wichtige
Voraussetzung ist allerdings, daß die Indikatorreaktion
wesentlich schneller verläuft, als die zu indizierende; dies ist hier jedoch der Fall.
II. Versuchsziele, Aufgaben
OH H
a) Ansetzen verschiedener Lösungen
b) Bestimmung der günstigsten Verdünnung
C
H
c) Aktivitätsbestimmung der Urease
C C SH
H2
OH
d) Einfluß von Cu 2+ -Ionen und Cystein auf die Ureaseaktivität
(Die Isolierung und Reinigung der Urease sowie die Bestimmung der Proteinmenge
entfielen aus zeitlichen Gründen. Statt dessen wurde für alle Versuche eine Merck-
Urease-Stammlösung verwendet, die vom Assistenten angesetzt wurde.)
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Versuch Nummer G-03 03 BC-Grundpraktikum
III. Versuchsdurchführung
e) Benötigte Lösungen
Dem Skript entsprechend wurden die folgenden Lösungen angesetzt:
Lösung Zusammensetzung
Lösung 1 0.6 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan in 60 ml Wasser
lösen, mit 1 N HCl auf pH 8.0 einstellen und mit Wasser
auf 100 ml auffüllen
Lösung 2 1.825 g !-Ketoglutarat in 40 ml Wasser lösen, mit 5 N Na-
OH auf pH 5 bringen und auf 50 ml mit Wasser auffüllen.
Haltbarkeit bei –20° C: einige Monate
Lösung 3 10 mg NADH-Na2 in 1 ml Wasser lösen. (täglich frisch ans.)
Reagentienmix für 20
Messungen
23 ml Lösung 1
+0.1 ml Lösung 2
+0.6 ml Lösung 3
+0.3 ml Wasser (täglich frisch ansetzen)
Harnstofflösungen 0.7 M; 0.5 M; 0.3 M; 0.2 M; 0.1 M; 0.07 M; 0.05 M; 0.03 M.
BSA-Stammlösung 1.5 mg Rinderserumalbumin werden in einem ml bidest.
Wasser gelöst.
Glutamat-Dehydrogenase
aus Rinderleber:
Lösung in 50%
Glycerin (v/v),
< 10 µg NH4 + / ml
f) Günstigste Verdünnung
Lösung unverdünnt verwenden
Die Originallösung von Boehringer ist stabil bei 4° C. Nach
einiger Zeit kann eine leichte Trübung auftreten.
Es sollten für mehrere Verdünnungen der Urease-Stammlösung die Geschwindigkeit
der Extinktionsänderungen ermittelt werden. Dafür wurde die folgende Verdünnungsreihe
aufgestellt: 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40.
Je 0.01 ml dieser Lösung wurden an Lösungen zugefügt:
Reagentienmix 1.2 ml
GlDH-Lösung 0.02 ml
Wasser 0.22 ml
Die Küvetten wurden verschlossen und nach einer halben Stunde mit 0.3 M Harnstofflösung
beschickt. Anschließend wurde bei 366 nm alle 15 s die Extinktion gemessen.
Nach 150-180 s sollte die Reaktion abgeschlossen sein, d.h. die Extinktion ändert
sich nicht mehr. Aber schon nach der ersten Meßreihe stellten wir fest, daß sogar die
unverdünnte Urease-Lösung sehr langsam reagierte. Daher führten wir nur die erste
Extinktionsauswertung mit 0.3 M Harnstoffzusatz durch (s.u.).
g) Aktivitätsbestimmung
Wie unter b) beschrieben werden die Extinktionen der verschiedenen Harnstofflösungen
(je 50 µl) bei Zugabe von unverdünnter Urease-Lösung bestimmt. Es werden
die gleichen Mengen an Lösungen genommen, die gleiche Zeit gewartet und ebenfalls
bei 366 nm alle 15 s die Extinktion gemessen.
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Versuch Nummer G-03 03 BC-Grundpraktikum
h) Einflußfaktor Cu 2+ auf die Aktivität
Auch hier müssen zunächst Lösungen angesetzt werden:
Lösung Zusammensetzung
Lösung A
Zur Herstellung einer 0.1 M Cysteinlösung pH 5.8
werden 1.76 g L-Cysteiniumchlorid-Monohydrat in
bidest. Wasser gelöst und mit 0.1 M KOH, 0.01 M KOH
und 0.1 M Essigsäurelösung auf pH 5.8 eingestellt.
Anschließend wird die Lösung in einen 100 ml Meßkolben
überführt und auf 100 ml mit dest. Wasser
aufgefüllt.
Lösung B 0,1 M CuS04-Lösung (steht aus)
Lösung C
100 g Harnstoff werden in 500 ml bidest. Wasser gelöst.
Anschließend werden 8.33 ml Lösung B zugesetzt
und die Lösung auf pH 6 eingestellt. Dann überführt
man in einen 1000-ml-Meßkolben und füllt auf 1000 ml
mit bidest. Wasser auf.
Mit Hilfe dieser Lösungen werden folgende Ansätze hergestellt:
Ansatz Zusammensetzung
Ansatz 1
In einen 50-ml-Erlenmeyerkolben werden 50 mg
Merck-Urease (5 U/mg) eingewogen und 10 ml Lösung
A zugesetzt. Anschließend wird die Lösung mit
0.1 M KOH, 0.01 M KOH und 0.1 M HOAc auf pH 6
gebracht.
Ansatz 2 In einen 50-ml-Erlenmeyerkolben werden 50 mg
Merck-Urease (5 U/mg) eingewogen und anschließend
in 10 ml bidest. Wasser gelöst. Dann wird die Lösung
auf pH 6 eingestellt.
Ansatz 3
In einen 50-ml-Erlenmeyerkolben werden 10 ml Lösung
A pipettiert und die Lösung auf pH 6 eingestellt.
Ansatz 4 In einen 50-ml-Erlenmeyerkolben werden 10 ml bidest
Wasser gegeben.
Je 30 ml Lösung C werden in vier 100-ml-Erlenmeyerkolben pipettiert. In den ersten
Erlenmeyerkolben wird eine pH-Elektrode eingetaucht und zur Zeit t=0 Ansatz 1
hinzugegeben und vermischt. Dann wird über einen Zeitraum von 3 Minuten der
pH-Wert am pH-Meter verfolgt. Entsprechend wird mit den Ansätzen 2, 3 und 4 verfahren.
IV. Meßergebnisse
a) Meßwerte
Die während der Messungen aufgenommenen Daten sind als Ausdruck vor den Diagrammen
angefügt.
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Versuch Nummer G-03 03 BC-Grundpraktikum
b) Beobachtungen
Bei der pH-Wert-Bestimmung konnten keine besonderen Gerüche festgestellt werden.
V. Auswertung
a) Enzymaktivität
Das erste Diagramm stellt graphisch die aufgenommenen Extinktionswerte dar. Die
linearen Anteile sind wegen besserer Übersicht in den Diagrammen 2-5 noch einmal
wiedergegeben.
In Diagramm 6 ist die Auswertung nach Michaelis-Menten zu sehen. Dafür wurde
die Substratkonzentration gegen die Reaktionsgeschwindigkeit aufgetragen. Letztere
erhält man aus der Extinktion über das LAMBERT-BEERsche Gesetz:
Hierbei sind E die Extinktion, c die Konzentration des
Substrats (NADH), # der molare Extinktionskoeffizient
(=3.5⋅103l⋅mol-1⋅cm-1), ⇔
E = c ⋅ d ⋅ ε
E
c =
ε ⋅ d
d die Schichtdicke der Küvette
(=1 cm) und v die Reaktionsgeschwindigkeit; $t ist
⇔
∆c
∆E
v ≡ =
∆t
2
⋅ ε ⋅ d ⋅ ∆t
das Zeitintervall. Der Faktor 2 ist der oben erwähnte
Korrekturfaktor der Stöchiometrie.
Wichtig ist die Berücksichtigung der Konzentrationsveränderung des Substrats durch
die Zugabe der einzelnen Lösungen. Da insgesamt immer 1.5 ml Lösung untersucht
wurden, ergibt sich folgende Substratkonzentration:
c0
⋅ 0. 01 ml 1
[ S ] = = c0
⋅
1.
5 ml 150
-1
( in mol ⋅ l )
Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit vmax ist durch die Asymptote der Reaktionsgeschwindigkeit
gegeben und die Michaelis-Menten-Konstante Km durch die Sub-
vmax
stratkonzentration bei v = .
2
Das siebte Diagramm ist eine alternative Darstellung der Werte; beim Lineweaver-
Burk-Plot werden die reziproken Werte von [S] und v gegeneinander aufgetragen.
Aus dem Achsenabschnitt erhält man vmax. Mit diesem Wert kann man über die Steigung
Km errechnen:
1 1
=
v vmax
K m
+
vmax
1
⋅
[ S]
Als letztes Diagramm sind die pH-Werte aufgetragen.
Die Auswertung der Diagramme ergab folgende Werte:
Art Werte
vmax
K m
-6
−1 −1
10 mmol ⋅ l ⋅ s
−1
µ mol ⋅ l
Michaelis-Menten 0.313 0.034
Lineweaver-Burk 0.29 0.029
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Versuch Nummer G-03 03 BC-Grundpraktikum
VI. Diskussion
a) Aktivität
Die durch die beiden Auftragungen erhaltenen Werte sind sehr ähnlich. Leider liegt
uns kein Vergleichswert aus der Literatur vor, so daß die Richtigkeit nicht festzustellen
ist.
b) Einfluß von Cu 2+ -Ionen
Ansatz 1: Der pH-Wert steigt, weil die Urease den Harnstoff zu Ammoniak umsetzt.
Es tritt also keine Störung der Enzymaktivität auf: Das zugesetzte Cystein fängt
die Kupferionen ab und verhindert so eine Oxidation der Protein-SH-Seitenketten
(siehe auch I.). Die dadurch entstehenden Protonen sind demnach in geringerer
Konzentration vorhanden.
Ansatz 2: Aufgrund des geringeren pH-Werts (~5) der Lösung C sinkt der pH-Wert
zunächst. Eigentlich sollte er weiter sinken, da die Urease durch die Ionen denaturiert
und dabei Protonen freisetzt. Bei den Messung hingegen steigt der pH-Wert
nach einer Minute wieder an, da eventuell noch intakte Urease Ammoniak gebildet
haben könnte.
Ansatz 3: Auch hier sollte der pH-Wert sinken, bedingt durch die bei der Disulfidbrückenbildung
freigesetzten Protonen.
Ansatz 4: Erwartet wird ein Anstieg des pH-Wertes, da folgende Reakion stattfindet:
SO4 2- + H2O → HSO4 2- + OH- Eventuell wurden die Ansätze 3 und 4 vertauscht, weil beide genau entgegen der
Erwartung verliefen.
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Versuch Nummer G-03 03 BC-Grundpraktikum
VII. Anhang
Meßwerte der Extinktionen
Harnstoff-Konzentrationen in mol/l
t/s 0.7 0.5 0.3 0.2 0.1 0.07 0.05 0.03
0 0.539 0.582 0.604 0.614 0.609 0.612 0.612 0.631
15 0.524 0.568 0.597 0.606 0.607 0.580 0.593 0.618
30 0.512 0.560 0.588 0.600 0.600 0.574 0.588 0.611
45 0.499 0.549 0.576 0.597 0.592 0.569 0.580 0.608
60 0.478 0.535 0.565 0.590 0.584 0.561 0.578 0.600
75 0.452 0.518 0.550 0.574 0.570 0.552 0.567 0.590
90 0.424 0.495 0.537 0.565 0.559 0.542 0.559 0.581
105 0.394 0.470 0.527 0.560 0.552 0.532 0.551 0.570
120 0.362 0.445 0.499 0.542 0.547 0.520 0.539 0.560
135 0.330 0.415 0.470 0.520 0.530 0.508 0.530 0.548
150 0.297 0.387 0.441 0.487 0.511 0.489 0.516 0.535
165 0.269 0.358 0.412 0.459 0.493 0.473 0.500 0.520
180 0.241 0.330 0.388 0.434 0.479 0.450 0.482 0.506
195 0.217 0.301 0.360 0.402 0.456 0.430 0.465 0.490
210 0.196 0.275 0.335 0.375 0.433 0.409 0.446 0.475
225 0.178 0.251 0.314 0.356 0.410 0.392 0.428 0.459
240 0.165 0.227 0.290 0.334 0.388 0.373 0.411 0.442
255 0.154 0.207 0.271 0.311 0.366 0.357 0.393 0.425
270 0.144 0.188 0.247 0.290 0.344 0.336 0.376 0.409
285 0.138 0.174 0.230 0.264 0.323 0.316 0.358 0.392
300 0.134 0.161 0.211 0.239 0.303 0.296 0.342 0.375
315 0.130 0.150 0.196 0.216 0.283 0.284 0.323 0.359
330 0.127 0.141 0.180 0.200 0.265 0.270 0.307 0.344
345 0.126 0.133 0.168 0.180 0.248 0.257 0.292 0.328
-0.00202 -0.00186 -0.00177 -0.00164 -0.00140 -0.00121 -0.00115 -0.00109
Die roten Zahlen stellen die Werte dar, die für die lineare Anpassung verwendet
wurden. Die Steigungen (grün) beziehen sich ebenfalls auf diese Werte. Die graphische
Auftragung befindet sich auf der nächsten Seite.
Auswertung der Steigungen
0.7 0.5 0.3 0.2 0.1 0.07 0.05 0.03
Steigungen: -0.00202 -0.00186 -0.00177 -0.00164 -0.00140 -0.00121 -0.00115 -0.00109
v/10 -6 mmol*l -1 *s -1
0.288 0.265 0.252 0.235 0.201 0.173 0.164 0.156
[S]/µmol*l -1
4.6667 3.3333 2.0000 1.3333 0.6667 0.4667 0.3333 0.2000
1/v /l*s*10 -6 mol -1
0.003 0.004 0.004 0.004 0.005 0.006 0.006 0.006
1/[S] /l*mol -1
0.21 0.30 0.50 0.75 1.50 2.14 3.00 5.00
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Versuch Nummer G-03 03 BC-Grundpraktikum
Diagramm 1
(Diagramm „Extinktionen“ aus Excel-File)
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Versuch Nummer G-03 03 BC-Grundpraktikum
Extinkti
Extinkti
Diagramme 2-5
0.600
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
0.700
0.600
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
Diagramm 2
0 50 100 150 200 250 300
Diagramm 3
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Zeit in s
lin. A npassung 0.7 M
lin. A npassung 0.5 M
45 95 145 195 245 295 345
Zeit in s
lin. A npassung 0.3 M
lin. A npassung 0.2 M

Versuch Nummer G-03 03 BC-Grundpraktikum
Extinkti
Extinkti
0.700
0.600
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
0.600
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
Diagramm 4
75 125 175 225 275 325
Diagramm 5
135 185 235 285 335 385
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Zeit in s
Zeit in s
lin. A npassung 0.1 M
lin. A npassung 0.07 M
lin. A npassung 0.05 M
lin. A npassung 0.03 M

Versuch Nummer G-03 03 BC-Grundpraktikum
v/10 -6 mmol*l -1 *s -1
Michaelis-Menten (Diagramm 6)
0.350
vmax
0.300
0.250
0.200
0.150
0.100
0.050
0.000
Km 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
Lineweaver-Burk (Diagramm 7)
1/v /l*s*10 -6 mol -1
Auftragung nach Michaelis-Menten
Auftragung nach Lineweaver-Burk
0.007
0.006
0.005
0.004
0.003
0.002
0.001
0.000
[S] in µmol*l -1
-5 -3 -1 1 3 5 7
1/[S] /l*µmol -1
- 12 -

Versuch Nummer G-03 03 BC-Grundpraktikum
pH-Werte
Diagramm 8
pH
pH
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
Diagramm 9
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
Ansatz
t / s 1 2 3 4
0 6.0 6.0 6.0 7.4
10 7.2 5.5 3.2
20 7.6 5.0 3.4 4.1
30 7.7 5.0 3.5
40 7.9 5.0 3.5 3.6
50 7.9 5.0 3.6 3.6
60 8.0 5.1 3.6 3.6
70 8.1 5.1 3.6
80 8.2 5.1 3.6 3.6
90 8.2 5.2
100 8.3 5.3 3.6 3.6
110 8.3 5.3
120 8.4 3.9 3.6
130 8.4 5.4
140 8.4 4.0
160 8.5 5.3 4.0
180 8.5 4.0
200 8.5 5.4
0 50 100 150 200
Z e it in s
0 50 100 150 200
Z e it in s
- 13 -
3
4
1
2