Öl abbauende Bakterien in X-OIL TEX Matten - TU Bergakademie ...

Versuche zur Anreicherung und Isolierung Öl-abbauender Sporenbildner
zum Einsatz in Öl aufsaugenden Matten (X-OIL ® TEX)
Cindy Seifert
TU Bergakademie Freiberg
Abstract
X-OIL ® TEX is an oil absorbing material that consists of recycled leather granules with a textile cover.
To optimize the useful life of the mats they should be implied with oil-degrading microorganisms.
Some former investigations had been done, but just with negative results. In this work a preloaded soil
was used to enrich microorganisms with first, the ability to degrade lubricating oil and second to build
spores. For selecting such microorganisms a minimum medium was used, that doesn’t contain an other
carbon source apart from the admitted oil. To select the spore forming organisms the enrichment
cultures was pasteurised at 80°C. It was able to show that the preloaded soil from the soil clean-up
plant (Bauer & Mourik, Roßwein) contains oil degrading organisms. It was also possible to enrich oil
degrading and heat-resistant microorganisms in liquid media but it was not successful on oil
containing agar.
1. Einleitung
Die Firma PMG Spezitex Chemnitz vertreibt unter der Bezeichnung X-OIL ® TEX bioaktive
Ölbindematten in textiler Umhüllung. Es handelt sich hierbei um Ölbindematten mit einer Füllung aus
recyceltem Ledergranulat und einer Ummantelung aus Polypropylen. Die Ölbindematten sind überall
dort einsetzbar, wo durch regelmäßige Tropfverluste und Leckagen von Mineralölen eine
Verschmutzung des Bodens vermieden werden muss.
Die Firma wirbt damit, das dass recycelte Ledergranulat mit ölabbauenden Mikroorganismen
impliziert ist, welche dazu in der Lage sind, das aufgenommene Öl zu verwerten, die Verwendungszeit
der Matten zu verlängern und eine Wiederverwendbarkeit ermöglichen. Herkömmliche Ölbindemittel
(meist gezielt konstruierte synthetische Faserstoffe) werden nach dem Vollsaugen auf konventionelle
Weise (unterschiedlich je nach Einsatzzweck) mit der Endstufe Verbrennung entsorgt. Der Wirtschaft
stehen ebenfalls Reinigungsmittel zur Verfügung, durch die biologisch abbaubare Tenside mit
Bakterien kombiniert werden, die sowohl die Emulsion von Öl als auch den Abbau verschiedener
Ölbestandteile ermöglichen sollen. Durch den Einsatz von Recyclingmaterial und die Kombination mit
Mikroorganismen soll eine Optimierung und Mehrfachnutzung der Ölbinder erreicht werden. [1]

Die Bedingungen, unter denen die Mikroorganismen im Hinblick auf den Ölabbau aktiv sind, sind
bisher noch nicht befriedigend geklärt. Durch den Fachbereich Textil- und Ledertechnik der
Westsächsischen Hochschule Zwickau (FH) wurde bereits ein Ölabbautest durchgeführt [1]. Sie
verwendeten Matten die zuvor mit ölabbauenden Mikroorganismen von der Firma
ASA-Spezialenzyme GmbH besprüht worden waren. Über die Art der Mikroorganismen war nichts
bekannt. Die Matten mit den Lösungen waren bereits 3 Monate gelagert. Der Test erfolgte über die
tägliche Wägung der zu 50% mit Öl vollgesaugten und besprühten Matten über einen Zeitraum von 4
Wochen. Es konnte kein Abbau nachgewiesen werden.
Da die trockene Lagerung der Matten nicht mit den Wachstums- und den Überlebensbedingungen der
meisten Bakterien vereinbar ist, bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit darin ölabbauende
Mikroorganismen aus bereits mit Mineralöl kontaminiertem Boden anzureichern und zu isolieren,
welche Überdauerungsformen bilden oder auf andere Weise trockenresistent sind, damit die
biologische Aktivität der Matten auch über einen längeren Zeitraum sichergestellt werden kann. Von
den Zugesetzten Bakterien darf dabei keine Gesundheitsgefährdung ausgehen.
Beide Fähigkeiten, sowohl der Abbau von Öl (-komponenten) als auch die Bildung von Sporen, sind
keine Selbstverständlichkeit für Mikroorganismen, kommen jedoch in der Natur häufig vor und sind in
der Literatur hinreichend beschrieben. Bei der Literaturrecherche konnten jedoch keine
Mikroorganismen Stämme gefunden werden die beide Fähigkeiten in Kombination aufweisen. Durch
selektive Anreicherungsversuche sollte es jedoch möglich sein Mikroorganismen zu finden die dazu in
der Lage sind.
2. Material und Methoden
Boden
Der für die Anreicherungsversuche verwendete Boden stammt ursprünglich aus dem Glaswerk Pirna
vom Gelände der Gasanstalt. Am 10.11.2004 wurde eine Probe aus dem Bodensanierungswerk der
Firma Bauer und Maurik Umwelttechnik GmbH (Anlage Hirschfeld) entnommen. Eine Analyse
(Durchführung: Umweltanalytik Dr. Rietzler & Kunze, Freiberg) ergab einen Mineralölgehalt von
2500 mg/kg (Diesel-/Schmierölgemisch).
Eine zweite Bodenprobe (aus Rositz vom 22.11.2001) stammte von Nicole Popp, der Boden war
tiefgefroren bei – 80°C.

Öl
Bei dem für die Anreicherungsversuche verwendeten Öl handelt es sich um ein handelsübliches
Motorenöl mit der Bezeichnung: BayWa Mineralöle, HDC 1540, HD-Motorenöl, SAE 15 W-40.
Flüssigmedium
Zusammensetzung des Minimalmediums (MM): dest. Wasser, 0,2-fach PP-Puffer, 0,2-fach Salzlösung
(Sl 50). Das Medium für die Ansätze in den OxiTop ® -Flaschen enthielt außerdem noch 10 mM CaCl 2 .
Die Salzlösung wurde nach dem autoklavieren des Mediums steril zugegeben.
Agar-Platten
Der Mineralsalz-Agar enthielt 15g/l Agar-Agar, 10 ml/l PP-Puffer (20-fach), 400 µl/l Salzlösung (50-
fach), 200 µl/l Öl (autoklaviert) und dest. Wasser. Die Salzlösung und das Öl wurden nach dem
autoklavieren zugegeben. Um das Öl zu verteilen wurde das Medium auf der Heizplatte unter
ständigem rühren nochmals aufgekocht.
Lösemittelplatten
Herstellen einer 2%-igen Öllösung in Aceton/Hexan (1:1 v/v) nach den Angaben von Heitkamp et. al
[4] und anschließendes ausplattieren von 200 µl auf die schon vorhandenen Platten (MM, MM + Öl).
Damit das Lösungsmittel (mögliche C-Quelle) verdampfen kann wurden die Platten für 3 Tage bei
Raumtemperatur aufbewahrt.
Mikroskopie
Phasenkontrastmikroskopie mit 400-facher Vergrößerung (40-fach Objektiv CP-Archromat)
OxiTop ® -System
Die Untersuchung der autochthonen Mikroorganismen auf ihre Fähigkeit, das verwendete Öl
abzubauen, wurde über die Sauerstoffzehrung mit dem OxiTop ® -Meßsystem durchgeführt.
Beim aeroben Abbau findet eine Umsetzung des organischen Kohlenstoffs mit O 2 zu CO 2 statt. Die
spezifischen Eigenschaften der Gase erlauben deren Untersuchung mit verhältnismäßig einfachen
Mitteln. So führen Verbrauch und Bildung gasförmiger Reaktionspartner zu Druckänderungen die
mittels Manometer (z.B. Warburg-Gerät) oder mit Drucksensoren (OxiTop ® -System) gemessen
werden können.
Beim respirometrischen Verfahren beziehen die Mikroorganismen in der Probe ihren Sauerstoff aus
dem gelöst Sauerstoff und aus dem eingeschlossenen Luftvorrat über der Probe. Die Bestimmung der
Sauerstoffzehrung mit dem OxiTop ® -System beruht auf einer Druckänderung in der gasdicht

verschlossenen Messflasche. Die Umwandlung von Druckwerten in elektrische Signale in den
Sensoren beruht auf dem piezoelektrischen Effekt.
Das System besteht aus der Probenflasche mit einem definierten Volumen, sowie dem
OxiTop ® -Messkopf, einem Köcher mit CO 2 -Absorber (hier: NaOH-Plätzchen) und einem
Magnetrührstab. Der von den Mikroorganismen benötigte Sauerstoff wird in der gerührten Flasche aus
dem Luftraum ständig nachgeliefert. Das beim Abbau gebildete CO 2 wird in den Luftraum abgegeben
und an den NaOH-Plätzchen im Köcher absorbiert. Der Druck in der Messflasche sinkt durch die
Abnahme der O 2 -Menge. Die vom Sensor erfasste Druckminderung ist ein Maß für den O 2 -Verbrauch
in der Probe. [5]
Jeweils 100 ml Minimalmedium und 8g (Rositz) bzw. 10g (Pirna) Boden wurden in 8 braune
OxiTop ® -Flaschen gegeben. Die Hälfte der Ansätze wurde 20 Minuten lang bei 80°C im Wasserbad
pasteurisiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 50 µl Öl, wobei den negativ Kontrollen kein Öl
zugegeben wurde. Die Inkubation erfolgte 40 Tage lang im OxiTop-Schrank bei 20°C. Nach 5; 12 und
26 Tagen wurden die OxiTop ® -Flaschen mit dem nicht pasteurisierten Boden aus Rositz neu belüftet.
Die Flaschen mit dem nicht pasteurisierten Boden aus Pirna wurden nur 1-mal (nach 5 Tagen) neu
belüftet. Am 13 Tag erfolgte eine Probenahme (20 ml) aus der Flasche mit dem nicht pasteurisierten
Boden aus Pirna (mit Öl). Die Probe wurde in einen Schikanenkolben überführt und 5 Minuten bei
80°C pasteurisiert. Nach der Zugabe von 20 µl Öl erfolgte die Inkubation bei 30°C im Schüttler.
Bei den pasteurisierten Ansätzen war die Sauerstoffzehrung so gering das kein Belüften notwendig
war. Nach der Laufzeit von 40 Tagen erfolgte die Animpfung von 19 ml Minimalmedium mit 1 ml
Probenüberstand aus den OxiTop ® -Flaschen mit dem Boden aus Pirna. Jeweils 1 Ansatz wurde bei
80°C für 5 Minuten pasteurisiert, ein zweiter nicht. Die Zugabe des Öls erfolgte danach.
Flüssiganreicherungen
Parallel zu den Respirationsversuchen in den OxiTop ® -Flaschen, wurden Flüssiganreicherungen im
Schikanenkolben durchgeführt. Dazu wurden zunächst, in einem Becherglas, 30g der Bodenprobe
Pirna in 300 ml PP-Puffer (0,2-fach) suspendiert und 10 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Nach
dem abfiltrieren durch einen Papierfilter erfolgte die Zugabe von 1,2 ml Salzlösung (50-fach). Da die
Lösung noch sehr trüb war erfolgte eine Zentrifugation des Ansatzes bei 100 g für 30 min. Der
Überstand wurde nochmals gefiltert und anschließend 2 mal 30 Minuten bei 500 g abzentrifugiert, was
jedoch nicht zur gewünschten Klärung der Lösung führte. Da durch eine Erhöhung der
Zentrifugationsgeschwindigkeit die Gefahr bestanden hätte das auch die Mikroorganismen aus der
Lösung abzentrifugiert werden, wurde der bräunlich trübe Überstand ohne weitere Behandlung
verwendet. Je 20 ml des Überstandes wurden in 100 ml Schikanenkolben pipettiert. 2 Ansätze wurden
10 min bei 80°C im Wasserbad pasteurisiert. Im Anschluss daran wurden zu einem dieser Ansätze

sowie zu einem nichtpasteurisierten Ansatz 20 µl Öl pipettiert. Beim 5. Ansatz erfolgte die Zugabe
von 20 µl Hexadekan (C 16 H 34 ), als evtl. leichter verwertbares Substrat. Nach einer Inkubationszeit von
3 Wochen wurde jeweils 2 mal 1 ml (aus den Ansätzen mit Öl) in 19 ml frisches Minimalmedium
überimpft. Zu einem der beiden Ansätze wurden 20 µl Öl zugegeben, der andere diente als negativ
Kontrolle. Ob ein Wachstum der Mikroorganismen stattfindet wurde über die Trübung des Mediums
geprüft.
In der Folgezeit wurden die Ansätze, in denen sich Mikroorganismen vermehrt hatten, mehrfach
überimpft und pasteurisiert.
Um festzustellen ob die Trübung des Mediums nur durch eine Emulgierung des Öls zustande kommt
wurden 20 ml Minimalmedium mit 20 µl Öl versetzt und unter denselben Bedingungen, wie die
anderen Ansätze, inkubiert.
Zu Beginn aller Anreicherungsversuche wurde nicht steril gearbeitet, da das Ziel lediglich darin
Bestand Öl abbauende und Sporen bildende Mikroorganismen zu finden, d.h. es war nicht zwingend
notwendig das die dazu fähigen Mikroorganismen aus einer der beiden Bodenproben stammen
müssen.
Isolierung
Um Reinkulturen zu erhalten wurde ein kleiner Teil der Kultur 10 - ² in 0,9 %-iger Saline verdünnt und
davon 100 µl auf Öl haltigen Agar-Platten ausplattiert.
Die erhaltenen Kolonien wurden entweder mit der 3-Strichmethode vereinzelt oder in Saline
suspendiert und anschließend erneut ausplattiert.
3. Ergebnisse und Diskussion
Die Auswertung der Druckänderung ergab die in Abbildung 1 und 2 dargestellten Kurven. Bei der
Bodenprobe aus Rositz (Abb.1) ist der Sauerstoffverbrauch (Druckabnahme) bei den beiden Ansätzen
mit Öl viel geringer als bei den Ansätzen ohne Öl. Was darauf schließen lässt, dass das zugegebene
Motorenöl den Metabolismus der vorhandenen Mikroorganismen nachteilig beeinflusst. In den
beobachteten 4 Wochen konnte auch keine Adaption an das neue Substrat beobachtet werden. Der
stärkere Sauerstoffverbrauch bei den nicht pasteurisierten Ansätzen ist auf die höhere Anzahl an
Mikroorganismen zurückzuführen, da durch das pasteurisieren der anderen Ansätze nur der Anteil an
hitzeresistenten Mikroorganismen überlebt hat. Bei den Ansätzen mit dem Boden aus Pirna ist der
gegenteilige Fall zu beobachten (Abb.2), hier ist der Sauerstoffverbrauch (Druckabnahme) in den
Ansätzen mit Öl höher. Dadurch ist zu vermuten, das Mikroorganismen vorhanden sind, die zusätzlich
zu den im Boden enthaltenen Substraten auch Bestandteile des Motorenöls für ihren Stoffwechsel
verwerten können.

0
-50
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
-100
-150
Druck in hPa
-200
-250
-300
-350
-400
-450
-500
Zeit in min
pasteurisiert, ohne Öl
nicht pasteurisiert, ohne Öl
pasteurisiert, mit Öl
nicht pasteurisiert, mit Öl
Abb.: 1 Druckabnahme in Abhängigkeit von der Zeit, bei der Bodenprobe aus Rositz
-10
-30
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
-50
Druck in hPa
-70
-90
-110
-130
-150
-170
Zeit in min
pasteurisiert, ohne Öl
nicht pasteurisiert, ohne Öl
pasteurisiert, mit Öl
pasteurisiert, mit Öl
Abb.: 2 Druckänderung in Abhängigkeit von der Zeit, bei der Bodenprobe aus Pirna
Bei den Anreicherungen in Flüssigkultur konnte eine deutliche Trübung der Ansätze mit Öl
beobachtet werden. Die Ansätze ohne Ölzugabe (negativ Kontrolle) zeigten wie vermutet keine
Trübung. Die Zugabe von Hexadekan, anstatt Motorenöl, bewirkte nur eine leichte Trübung des
Flüssigmediums, was darauf hin deutet, dass das Hexadekan für die Mikroorganismen kein leichter zu
verwertendes Substrat darstellt.

Ebenfalls positive Ergebnisse lieferten die Anreicherungen aus der OxiTop ® -Flasche mit dem Boden
aus Pirna (mit Öl, nicht pasteurisiert). Die Anreicherung aus der zweiten OxiTop ® -Flasche mit dem
Boden aus Pirna (mit Öl, pasteurisiert) lieferte dagegen negative Ergebnisse, hier konnte keine
Trübung der Flüssigkulturen beobachtet werden. Betrachtet man den Verlauf der beiden oberen
Kurven in Abbildung 2, so ist nur eine geringere Differenz zwischen den beiden Kurvenverläufen zu
erkennen. Die Gesamtdruckänderung innerhalb der 40-tägigen Laufzeit beläuft sich nur auf 9 hPa im
Ansatz ohne Öl bzw. 13 hPa im Ansatz mit Öl, dies deutete schon darauf hin das nur sehr wenige
stoffwechselaktive Mikroorganismen enthalten waren.
Auf den Agar-Platten waren grundsätzlich 2 verschiedene Kolonieformen zu erkennen, zum einen
runde, weiße Kolonien mit glattem Rand und zum anderen weiße, wurzelförmig verzweigte Kolonien
(Abb. 3). Die runden Kolonien waren auf den meisten Platten zu finden, die wurzelförmigen kamen
nur auf einer Platte vor. Sie stammen aus dem Ansatz mit Boden aus Pirna, der gleich zu Beginn der
Anreicherung pasteurisiert wurde und nach dem überimpfen in frisches Medium ein zweites mal
pasteurisiert wurde. Es ist jedoch anzumerken, das beim mikroskopieren des ersten Ansatzes keine
Mikroorganismen erkannt werden konnten. Da zu Versuchsbeginn mit unsterilem Öl gearbeitet wurde
ist es möglich das die angereicherten Mikroorganismen direkt aus dem Öl und nicht aus der
Bodenprobe stammten.
Abb.: 3 Aufnahme der wurzelförmig verzweigten Kolonien auf MM + Öl Agar
Bei dem Versuch die Kolonien zu vereinzeln, wurde festgestellt das die Mikroorganismen sowohl auf
den Platten mit Öl als auch auf den Platten ohne Öl gleichgut wachsen. Es wurde deshalb vermutet das
sich das Öl schlecht im Medium verteilt und so für die Mikroorganismen nicht nutzbar ist. Daher
wurde versucht das Öl mit Hilfe eines Lösungsmittels auf den Platten zu verteilen. Doch auch dieser
Versuch scheiterte. Auf den so behandelten Agar Platten sind erst nach gut 2 Wochen sehr kleine
Kolonien zu erkennen gewesen, was vermuten lässt, das nicht verdampfte Lösemittelreste das
Wachstum der Bakterien hemmen. Man kann aber davon ausgehen das sich die Mikroorganismen

nicht bzw. nicht ausschließlich von Bestandteilen des Agars ernähren, da in den Flüssiganreicherungen
mit Minimalmedium ohne Öl kein Wachstum beobachtet werden konnte.
Ein mögliche Ursache für das geringe Wachstum der Mikroorganismen, auf Platten mit und ohne Öl,
könnte darin zu finden sein, das die ausplattierte Lösung aus den Flüssigkulturen mit Öl stammt und
somit etwas Öl mit ausplattiert worden ist.
Auf Grund der durchgeführten Experimente kann man davon ausgehen, dass die vorhandenen
Flüssigkulturen Mikroorganismen enthalten die zum einen dazu in der Lage sind Bestandteile des
Motorenöls als Energie- und Kohlenstoffquelle zu nutzen und zum anderen hitzeresistente
Dauerformen bilden. Da das verwendete Minimalmedium keine Kohlenstoffquelle enthielt, müssen
die darin wachsenden Mikroorganismen zwangsläufig Bestandteile des zugegebenen Motorenöls als
Kohlenstoffquelle nutzen. Die vorhandenen Kulturen sind mehrfach im Wechsel pasteurisiert und
überimpft worden, wobei die neuen Flüssigkulturen immer wieder angewachsen sind.
4. Ausblick
Da die Bakterien nicht erfolgreich auf den Öl haltigen Platten kultiviert werden konnten, soll als
nächster Schritt die Isolierung von Einzelkolonien auf 0,1-fach NB (nutrient broth) oder LB Platten
erfolgen. Die auf diesen nicht selektiven Platten wachsenden Einzelkolonien sollen anschließend auf
aktiven Ölabbau und Hitzeresistenz geprüft werden indem sie wieder in (selektivem) Minimalmedium
angezogen und pasteurisiert werden. Die Überprüfung der Fähigkeit zum Ölabbau kann dabei wieder
über die Trübung des Mediums oder über die Sauerstoffzehrung in den OxiTop ® -Flaschen erfolgen.
Die so erhaltenen Reinkulturen sollen dann mit Hilfe der PCR (Polymerase chain reaction) und
anschließender Sequenzierung identifiziert werden. Für die Identifizierung werden die erhaltenen
Sequenzen mit einer Datenbank verglichen. Für den Fall das sich unter den isolierten Stämmen
pathogene befinden, können diese nicht für den Einsatz auf X-OIL-TEX ® -Matten in Betracht gezogen
werden. Ob die isolierten und somit potentiell geeigneten Mikroorganismen auch unter realen
Bedingungen dazu in der Lage sind das Öl zu verwerten, müsste ebenfalls noch in weiteren
Untersuchungen geprüft werden.
weitere mögliche Lösungsansätze
Bei allen vorangegangenen Untersuchungen wurde das Hauptaugenmerk auf die Isolierung von
Bakterien gelegt. Ein möglicher Einsatz von Pilzen wurde bisher noch nicht in Betracht gezogen. In
der Literatur sind verschiedene Pilzarten beschrieben die in der Lage sind Kohlenwasserstoffe zu
verwerten, z.B. der Weißfäulepilz Phanerochaete chrysosporium. [2,3]

P. chrysosporium ist ein sehr effektiver Ligninabbauer dessen unspezifisches Enzymsystem darüber
hinaus auch in der Lage ist eine Reihe von toxischen und kanzerogenen Substanzen, mit ähnlichen
Substrukturen wie die des Lignins, zu spalten (z.B. Polyzyklische aromatische Kohlenstoffe (PAK),
Benzo(a)pyrene, Dioxine, Furane, Polychlorierte Biphenyle (PCB), Aniline).
Abb.: 4 Phanerochaete chrysosporium, hymenium and basidia, CBS 316.75. a. hymenium with cystidia, 500 x ;
b. branching pattern of basidiogenous hypha, 1100 x ; c. lateral basidium, 2000 x ; d-e. basidia with more than
four sterigmata; d. 2800 x ; e. 3500 x ; f. basidium with six spores, maturing in two groups of three, 2500 x .
5. Literaturverzeichnis
[1] Anders / Heßberg; Bericht gemäß Vereinbarung zw. dem
Sächsischen Textilforschungsinstitut Chemnitz e.V. und der Fachbereich Textil- und
Ledertechnik der Westsächsischen Hochschule Zwickau (FH) vom 02.08.2003
[2] Brodkorb / Legge; “Enhanced biodegradation of phenanthrene in oil tar-contaminated
soils supplemented with Phanerochaete chrysosporium”; AEM 1992, Vol. 58, No. 9,
p. 3117-3121
[3] Bumpus; “Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by Phanerochaete
chrysosporium”; AEM 1989, Vol. 55, No. 1, p. 154-158
[4] Heitkamp, Franklin, Cerniglia "Microbial metabolism of polycyclic aromatic
hydrocarbons: Isolation and characterization of a pyrene-degrading bacterium" AEM
1988, Vol.54, No. 10, p. 2549-2555
[5] Süßmuth / Eberspächer / Haag / Springer; Mikrobiologisch-Biochemisches Praktikum,
2. Auflage 1999, Thieme Verlag
[6] Thelen, Regine „Anzucht und Einsatz von Phanerochaete chrysosporium (Weißfäulepilz)
- Abbau von Abwasserinhaltsstoffen“, 8 UWSF (1) 16-22 (1996)
[7] http://ip.library.uu.nl/cbs/sim24/content.htm (01.07.2005)