Signalmechanismen der epithelialen Proliferation und - OPUS ...

Ergebnisse
Da die Expression des GFP-Proteins keinen Rückschluss auf die interferierende
Funktionalität der exprimierten Mutante zulässt, wurde deren Wirkung mittels Stimulation
durch ein stark NF-κB aktivierendes, proinflammatorisches Zytokin überprüft. Dazu wurde
TNF-α ausgewählt, da es NF-κB über den klassischen Weg der IKK/IκBα/NF-κB Kaskade
aktiviert und so deren Untersuchung ermöglicht. Die Zelllinien wurden mit 100ng/ml TNF-α
stimuliert, zu verschiedenen Zeitpunkten lysiert und im Western Blot analysiert. In HaCaT
Zellen zeigt sich die Degradation des Inhibitors von NF-κB, IκBα, bereits nach 10 bis 20
Minuten (Abb.5.4: Wildtyp und Leervektor), wobei das resynthetisierte Protein nach circa 60
Minuten in ähnlicher Menge wie zu Anfangs wieder vorlag. Deutlich ist im Versuch bereits
nach 10 Minuten die Degradation von IκBα zu erkennen und im Zeitverlauf (30, 45 und 60
Minuten) kehrt die Bande wieder zurück, was durch die Resynthese von IκBα, welches
selbst ein Zielgen von NF-κB ist, erklärbar wird.
Abb. 5.4: Funktionelle Charakterisierung der HaCaT und NHK Linien, welche stabil
interferierende Mutanten aus dem NF-κB Signalweg exprimieren.
Stabile HaCaT Linien wurden nach 7 tägiger Selektion mit 200µg/ml Zeozin für die
angegebenen Zeitperioden mit 100ng/ml TNF-α inkubiert und Totallysate wurden
gewonnen. 20µg Probenlysat wurde auf ein SDS-Gel (12,5%) aufgetragen und
anschließend geblottet. Geblockt wurde in 5% Milchpulver/PBST. Die IκBα
Degradierung wurde mittels IκB –Antikörper im Western Blot detektiert.
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