Signalmechanismen der epithelialen Proliferation und - OPUS ...

Diskussion
herangezogen. SC-514 wurde als indirekter Inhibitor von NF-κB in Fibroblasten beschrieben,
wobei in Versuchen das humane T-cell lymphotropische Virus Typ I Protein, Tax, nicht mehr
das Tumorsupressorgen p53 inhibieren konnte (Jeong et al., 2005a).
Durch die Verwendung dieser Inhibitoren in Keratinozyten ließ sich der äußerst leicht durch
äußere Stimuli oder Stress induzierte Prozess der Differenzierung, welcher schon alleine
durch den Vorgang der retroviralen Infektion teilweise ausgelöst werden kann, untersuchen.
In Titrationsexperimenten (vgl. Abb. 5.5) konnte für primäre Keratinozyten eine Konzentration
von 20µM für BAY 11-7082 und für 200µM für SC-514 festgelegt werden. Bei diesen
Konzentrationen zeigen beide Inhibitoren eine deutliche Blockade der Phosphorylierung von
IκBα. Eine weitere Erhöhung der Konzentration empfiehlt sich aufgrund des Lösungsmittels
DMSO und der eigentlichen toxischen Wirkung der Inhibitoren selbst nicht.
Mit diesen Versuchsansätzen war es möglich, die Modulation der NF-κB Aktivität in
Keratinozyten zu analysieren. Durch die Expression von dominant negativen Mutanten von
IκBα und IKK2 bzw. der Verwendung von synthetischen Inhibitoren für diese Proteine konnte
eine komplette Blockade des NF-κB Signalwegs erzielt werden (vgl. Abb. 5.4 und Abb. 5.5)
Inflammatorische Genexpression wird durch NF-κB Inhibierung verhindert. TNF-α
spielt eine wichtige Rolle in der angeborenen Immunität und der inflammatorischen
Feindabwehr (Gloire et al., 2006). So werden durch die Bindung von TNF-α an den
korrespondierenden Rezeptor intrazelluläre Signalwege aktiviert, unter ihnen auch das
IKK/IκBα/NF-κB-Modul (Baud and Karin, 2001). Zu den frühen, ein bis vier Stunden nach
Stimulation durch TNF-α regulierten Genen gehören Zytokine, Apoptose-relevante Proteine,
aber auch für den Verhornungsprozeß bedeutsame Proteine (Banno et al., 2004).
Denk et al. konnten 2001 die Abhängigkeit des gesamten TNF-induzierten
proinflammatorischen Genexpressionprofils von der Aktivierung von NF-κB durch den IκB
Kinase Komplex in Endothelzellen zeigen (Denk et al., 2001a).
In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von TNF-α auf die inflammatorische Antwort
von Keratinozyten durch die Inhibition von NF-κB mittels retroviraler Transduktion dominant
negativer Mutanten und durch den Einsatz synthetischer Inhibitoren analysiert. Als eines der
Zielgene von NF-κB nach TNF-α Stimulation diente der Oberflächenrezeptor ICAM-1. Bei
Untersuchung der Expression von ICAM-1 (Abb. 5.6) im Durchflusszytometer 14 Stunden
nach Stimulation sieht man deutlich unterschiedliche Expressionsmuster. So zeigt sich eine
deutliche Aktivierung der ICAM-1 Expression in den Wildtyp- und Vektor-Keratinozyten. Eine
Expression von ICAM-1 konnte durch die undegradierbare mut IκBα und die dominant
negative Form IKK2 KD inhibiert werden. Zellen, welche die konstitutiv aktive Form IKK2 EE
und auch die dominant negative Isoform für IKK1 exprimierten, zeigten bereits eine basale
Expression von ICAM-1. In diesen Zelllinien konnte mittels TNF-α keine weitere Expression
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