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• Das Vorliegen signifikanter Mengen ungebundener Antikörper am Ende des Waschvorgangs, entweder durch ein Übermaß an Serum oder durch unzureichendes Waschen, kann die Tauglichkeit des Assays, an sensibilisierte Beads gebundenes IgG nachzuweisen, beeinträchtigen und zu fehlerhaften Ergebnissen führen. • Eine Probe positiver und negativer Kontrollseren sollte Bestandteil aller Tests sein, um festzustellen, ob technische Fehler oder Versagen der Reagenzien vorliegen. • Keine Komponenten aus verschiedenen Chargen mischen. Testverfahren: 1. Während die übrigen Komponenten weiterhin bei 2 °C bis 8 °C im Dunkeln gelagert werden, den Waschpuffer vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20 °C bis 24 °C) anwärmen. In der Zwischenzeit das Plattenformat-Blatt verwenden, um jedem zu analysierenden Serum bzw. Kontrollserum eine Position auf der Platte zuzuweisen. Die im Kit mitgelieferten Kontrollseren werden verwendet, um ein breit reaktives positives Alloserum und ein negatives Serum zu illustrieren. 2. Die ohne Zuweisung verbliebenen Vertiefungen der Filterplatte mit der adhäsiven Plastikabdeckung abdecken. Anschließend die benötigten Vertiefungen mit 100-300 µl destillierten Wassers anfeuchten. Nach 2-5 Minuten das Wasser durch vorsichtiges Aspirieren der Platte mittels einer Vakuumpumpe entfernen. (Siehe Empfehlungen des Herstellers für den korrekten Gebrauch.) 3. Die HLA-Beads kurz (30 Sekunden lang) durch Zentrifugieren des Röhrchens bei 600 – 800 x g aufbereiten, um Beads oder Flüssigkeit vom Deckel oder von den Wänden der Flasche zu entfernen. Gründlich vortexen (~1 Minute), um die Beads gleichmäßig zu resuspendieren. 4. 40 µl Waschpuffer in jede Testvertiefung der Filterplatte geben, anschließend 12,5 µl Patientenserum oder Kontrollserum und beides vermischen. 5. 5 µl HLA-Beads in jede der zugewiesenen Vertiefungen geben. Die HLA-Beads alle 2 Minuten erneut vortexen, um die Beads in Suspension zu halten, während sie verteilt werden. VORSICHT: Es ist wichtig, die Beads resuspendiert zu halten, um sicherzustellen, dass ausreichend Beads in die Vertiefungen verteilt werden und um geringe Zählzeiten zu gewährleisten. Unzureichendes regelmäßiges Vortexen führt zum Absetzen der Beads am Boden des Röhrchens. Dadurch wird eine abweichende Menge von Beads in die Vertiefungen verteilt, was Durchlaufzeiten und Analysenergebnisse negativ beeinflussen kann. 6. Die Platte mit adhäsiver Plastikabdeckung verschließen und anschließend in Folie bzw. in eine Kiste packen, um sie vor Licht zu schützen. 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (20—24 °C) im Dunkeln auf einer rotierenden Plattform (200 Umdrehungen pro Minute) inkubieren. Nicht verwendete Anteile Kontrollseren und Beads für den zukünftigen Gebrauch bei 2 °C bis 8 °C im Dunkeln wieder einlagern. 7. Das Konjugat mit Waschpuffer verdünnen und im Dunkeln aufbewahren (5 µl Konjugat zu 45 µl Waschpuffer pro Probe). Zum Ausgleich von Pipettierverlusten ist es hilfreich, eine (1) zusätzliche Gabe von verdünntem Konjugat anzufertigen. Bis zur Verwendung mit Folie abdecken und/oder im Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahren. Den nicht verwendeten Anteil Konjugatkonzentrat für den zukünftigen Gebrauch bei 2 °C bis 8 °C im Dunkeln wieder einlagern. 8. Nach der 30-minütigen Inkubation die adhäsive Plastikabdeckung entfernen und 100 µl Waschpuffer in jede Vertiefung geben. Durch leichtes Klopfen an die Seite der Platte mischen und die Platte vorsichtig aspirieren. VORSICHT: Übermäßiger Vakuumdruck kann dazu führen, dass Beads an der Membran kleben und Probenfehler verursachen. Den geringstmöglichen zum Aspirieren der Proben erforderlichen Vakuumdruck anwenden. 9. 250 µl Waschpuffer in jede Vertiefung geben, aspirieren und noch zweimal wiederholen, um drei Waschdurchgänge zu erreichen. VORSICHT: Unzureichendes Waschen kann die Tauglichkeit des Konjugats, an sensibilisierte Beads gebundenes IgG nachzuweisen, beeinträchtigen und zu falsch-negativen Ergebnissen führen. 10. 50 µl verdünnten Konjugats in jede Vertiefung geben. Die Platte mit Folie abdecken oder in eine Kiste packen, um sie vor Licht zu schützen. Auf eine rotierende Plattform stellen (bei 200 Umdrehungen pro Minute) oder alle 5-10 Minuten vorsichtig vortexen. 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur (20 °C bis 24 °C) inkubieren. 11. Unter Verwendung einer sauberen Pipettenspitze 150 µl Waschpuffer in jede Vertiefung geben und vermischen, um die Beads zu resuspendieren. 12. Mit dem Luminex-Gerät gemäß den Empfehlungen des Herstellers die Daten sammeln. Verzögerungen von mehr als 3 Stunden können die Gefahr erhöhen, falsch-positive bzw. falsch-negative Reaktionen zu erhalten. Den nicht verwendeten Anteil Waschpuffer für den zukünftigen Gebrauch bei 2 °C bis 8 °C wieder einlagern. QUALITÄTSKONTROLLE Die Qualitätskontrolle des LMX-Assays ist durch die Einbeziehung von vier Kontroll-Beads (ein positives Kontroll-Bead und drei negative Kontroll-Beads) in das Testsystem integriert. Die negativen Kontroll-Beads (CON) messen den Hintergrund des Assays und werden eingesetzt, um das Signal der HLA-Beads zu normalisieren. Diese Beads sollten niedrige MFI-Werte zeigen. Die beobachteten Bereiche der negativen Kontroll-Beads finden sich im losspezifischen Datenblatt. Außerhalb des Bereichs liegende Daten sollten sorgfältig untersucht werden. Das positive Kontroll-Bead (Probe 77) ist mit menschlichem IgG beschichtet und muss mit dem positiven und mit dem negativen Kontrollserum MFI-Werte > 10.000 ergeben. Wenn die Kontrollen Werte von < 10.000 MFI ergeben, ist möglicherweise das Assay nicht Seite 4 von 6 LC1003IVDDE.11 (12/13)
ausreichend gewaschen oder das Konjugat beeinträchtigt. Patientenstichproben können mit dem positiven Kontroll-Bead (Probe 77) einen breiten Aktivitätsbereich aufweisen, müssen jedoch ein Signal von > 3500 MFI ergeben. Ist kein Serum vorhanden, zeigt Probe 77 ein starkes Signal, während die restlichen Beads einen Durchschnitt von etwa 50 MFI oder weniger aufweisen. Wenn eine Teststichprobe ein ähnliches Wertmuster zeigt, wurde die Stichprobe möglicherweise versehentlich ausgelassen. Diese Stichproben sollten wiederholt werden. Alle Kits enthalten positives und negatives Kontrollserum, beide dienen als externe Assay-Kontrollen und müssen bei jedem Testdurchlauf berücksichtigt werden. Das positive Kontrollserum muss für Probe I-01 und Probe II-01 ein positives Ergebnis aufweisen. Das negative Kontrollserum muss für alle Beads ein negatives Ergebnis aufweisen. Der Assay muss entsprechend den Empfehlungen in der Packungsbeilage und unter Einhaltung aller vorgeschriebenen Qualitätskontrollverfahren gemäß den Vorschriften der jeweiligen Zulassungsbehörden durchgeführt werden. ERGEBNISSE Zur Feststellung, ob eine Testprobe positiv für Klasse I- oder Klasse II-HLA-spezifische Antikörper ist, wird zunächst jedes einzelne HLA- Bead daraufhin untersucht, ob es positiv oder negativ für IgG-Antikörper ist. Zur Feststellung, ob ein bestimmtes HLA-Bead positiv ist, zuerst die MFI des einzelnen Beads durch die MFI für jedes Negativkontroll-Bead (CON1, CON2, CON3) teilen. Von diesen Quotienten den Hintergrund-Anpassungsfaktor (BAF) für die entsprechende Bead/CON- Kombination subtrahieren. Der BAF ist ein vordefiniertes MFI-Verhältnis für jede Bead/CON-Kombination zur Kompensation von auf Bead- Variation zurückzuführenden Hintergrund. Siehe dazu das mit dem Kit gelieferte chargenspezifische Aufzeichnungsblatt. Beispiel: individueller Bead-MFI – (BAF) = angepasstes Verhältnis 1 Negativkontroll-Bead 1 (CON1) MFI individueller Bead-MFI – (BAF) = angepasstes Verhältnis 2 Negativkontroll-Bead 2 (CON2) MFI individueller Bead-MFI – (BAF) = angepasstes Verhältnis 3 Negativkontroll-Bead 3 (CON3) MFI Für PROBE I-01 und PROBE II-01 weist ein positiver Wert bei irgendeiner der Berechnungen auf eine positive Bead-Reaktion hin. Bei allen anderen Beads weist ein positiver Wert bei mindestens zwei der Berechnungen auf eine positive Bead-Reaktion hin. Ein negativer Wert bei allen drei Berechnungen weist auf eine negative Bead-Reaktion hin. Bewertung von Testproben- Eine Probe gilt als positiv für Klasse I-HLA-spezifische Antikörper, wenn mindestens eines der sieben (7) Klasse I-HLA-Beads positiv ist. Eine Probe gilt als positiv für Klasse II-HLA-spezifische Antikörper, wenn mindestens eines der fünf (5) Klasse II-HLA-Beads positiv ist. Eine Probe gilt als negativ für HLA-spezifische IgG-Antikörper, wenn alle HLA-Beads sich als negativ erweisen. GRENZEN DES VERFAHRENS Diese Testergebnisse dürfen nicht die einzige Grundlage für eine klinische Entscheidung sein. Fehlerhafte Ergebnisse können durch bakterielle Kontamination der Testmaterialien, unzureichende Inkubationszeiten, unzureichendes Waschen der Beads, Einwirkung von Streulicht auf das Konjugat oder Weglassen von Testreagenzien oder -schritten auftreten. Das Vorliegen von Immunkomplexen bzw. sonstigen Immunoglobulinaggregaten in der Patientenprobe kann eine erhöhte unspezifische Bindung zur Folge haben und fehlerhafte Ergebnisse in diesem Assay verursachen. Mit diesem Produkt werden IgG-Antikörper nachgewiesen, die lymphozytotoxisch sein können oder auch nicht. Die nachgewiesenen Antikörper sind diejenigen, welche innerhalb der Population verfügbarer, auf dem Aufzeichnungsblatt gelisteter Antigene reaktiv sind. LifeScreen Deluxe besteht aus besonderen Luminex-Beads, zu denen Klasse-I-HLA- und Klasse-II-HLA-Glykoproteine konjugiert werden. Für PROBE I-01 werden affinitätsgereinigte HLA-Klasse-I-Glykoproteine von den Thrombozyten von 100 Nordamerikanern europäischer Herkunft, 100 Nordamerikanern afrikanischer Herkunft und 100 Nordamerikanern hispanischer Herkunft gewonnen. Die aus EBVtransformierten B-Lymphozyten affinitätsgereinigten und an die PROBE I-02 bis I-07 angefügten HLA-Klasse-I-Glykoproteine sind auf dem chargenspezifischen Aufzeichnungsblatt erfasst. Für PROBE II-01 werden affinitätsgereinigte HLA-Klasse-II-Glykoproteine, die bei der Herstellung dieses Produkts verwendet werden, von den EBV-transformierten B-Lymphozyten gewonnen, die folgende HLA-Klasse-II- Antigene repräsentieren: DR1, DR4, DR7, DR8, DR9, DR10, DR11, DR12, DR13, DR14, DR15, DR16, DR17, DR18, DR103, DR51, DR52 und DR53. Die aus EBV-transformierten B-Lymphozyten affinitätsgereinigten und an die PROBE II-02 bis II-05 angefügten HLA-Klasse-II- Glykoproteine sind auf dem chargenspezifischen Aufzeichnungsblatt erfasst. Einige IgA, IgM und Antikörper niedriger Avidität oder mit niedrigem Titer sowie Antikörper gegen seltene Allele werden mit LIFECODES LifeScreen Deluxe-Assays nicht nachgewiesen. Wegen der Komplexität des HLA-Testvorgangs sollte nur geschultes Personal mit der Überprüfung der Dateninterpretation betraut werden. Die Bestimmung der Antikörper-Spezifität mithilfe von LIFECODES LifeScreen Deluxe-Kits muss die Ergebnisse aller Beads berücksichtigen, einschließlich derjenigen, die an oder nahe der Nachweisgrenze liegen. Kenntnisse der Patientengeschichte und der kreuzreaktiven Gruppen können bei der Zuordnung der Spezifität zu einem bestimmten Serum nützlich sein. Seite 5 von 6 LC1003IVDDE.11 (12/13)
Seite 1 und 2: Immucor Transplant Diagnostics, Inc
Seite 3: D. Reinigung bzw. Vorbereitung für

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